Apuntes de Inmunologa. Curso 2005-06.

Tema 9

TEMA 9: HIBRIDOMAS Y TCNICA DE FUSIN CELULAR. Anticuerpos monoclonales y sus aplicaciones. Anticuerpos monoclonales obtenidos por ingeniera gentica.
OBJETIVOS 1. Definir qu es un anticuerpo monoclonal 2. Saber como se producen 3. Reconocer las ventajas e inconvenientes de su produccin y uso comparados con los sueros tradicionales 4. Conocer las aplicaciones que se ven mejoradas con el empleo de anticuerpos monoclonales OBTENCIN DE ANTICUERPOS Existen dos tipos de anticuerpos (desde el punto de vista de este tema): 1. Policlonales (Sueros) Se obtienen inmunizando animales de experimentacin (conejos, cabras, quidos, etc.) con el antgeno deseado, siguiendo un protocolo adecuado, tras el que se extrae sangre y se obtiene el suero donde estarn los anticuerpos dirigidos frente al antgeno con el que se ha realizado la inmunizacin (frente a todos sus determinantes antignicos) y frente a otros antgenos a los que se haya enfrentado el animal 2. Monoclonales Los anticuerpos monoclonales son aquellos producidos por un clon, es decir, por un grupo de clulas derivados de una nica clula y, por lo tanto, con caractersticas idnticas (en nuestro caso lo que nos interesa es que todas producen el mismo anticuerpo) Ambos poseen ventajas e inconvenientes Tabla 1:

ANTICUERPOS MONOCLONALES vs. POLICLONALES POLICLONALES Mezcla heterognea Variacin lotes Irrepetibles Se necesitan antgenos puros Baratos Fcil produccin MONOCLONALES Qumicamente puros Predecibles Produccin ilimitada No se necesitan antgenos puros Caros Produccin costosa y larga Demasiado especficos A veces isotipo inadecuado
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ANTICUERPOS MONOCLONALES La descripcin de la tcnica de produccin de anticuerpos monoclonales supuso la concesin del premio Nobel de Medicina (1984) a:

Csar Milstein

George Khler

CONSIDERACIONES INICIALES La mayora de los antgenos poseen multitud de determinantes antignicos que desencadenan la produccin de anticuerpos especficos frente a ellos El organismo reacciona frente a todos, por lo que en el suero se encontrar una mezcla heterognea de anticuerpos Frente a antgeno inoculado Frente a otros antgenos PROTOCOLO PRODUCCIN (SISTEMA TRADICIONAL) DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

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PASOS

1. Inmunizacin Del mismo modo que en la obtencin de suero, el primer paso es el de inmunizar al animal con el antgeno deseado La fuente de clulas productoras de anticuerpos es el bazo: o o o Tras inmunizacin el animal es eutanasiado y se extrae el bazo El bazo se macera y se obtienen los linfocitos. Los linfocitos mueren en cultivo tras 8 das (aproximadamente)

2. Clulas de mieloma En el laboratorio se dispone de lneas estables de mieloma (en definitiva linfocitos tumorales que, actualmente no secretan anticuerpos completos ni ninguna de sus partes). Estas clulas se multiplican de forma continua. Se han seleccionado lneas de mieloma incapaces de producir el enzima Hipoxantina-Guanosina-Fosforribosil-Transferasa (son por lo tanto HGPRT -) (caracterstica muy importante en las posterior seleccin celular) o Este enzima es esencial en la ruta exgena o de salvamento para la produccin de cidos nucleicos en el caso en que se bloquee la va tradicional (endgena) o Cuando se bloquea la ruta principal (con aminopterina por ejemplo) la clula recurre a la va de salvamento empleando las enzimas HGPRT y timidina quinasa para producir cidos nucleicos.

Slo existen lneas de mieloma de ratn y de rata adecuadas para la produccin de anticuerpos monoclonales. Las lneas humanas hasta el momento no son adecuadas

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3. Fusin Deseamos obtener una clula con las caractersticas de los tipos celulares descritos en los pasos 1 y 2: o Produccin de anticuerpos (linfocitos B) o Multiplicacin in vitro (clula de mieloma) Para ello realizamos la denominada fusin Histricamente han existido multitud de agentes fusionantes Hoy da: electrofusin y, sobre todo, POLIETILNGLICOL (PEG) PEG: o Gran afinidad por el H2O o Cuando se aade a la mezcla de linfocitos y clulas de mieloma secuestra el agua o Sin agua se produce la desorganizacin de la membrana celular o Al rehidratar se produce la verdadera fusin, las membranas de las clulas adyacentes se pueden unir formando una clula hbrida. o

o El proceso de fusin no es selectivo ni tiene una eficacia del 100%, por lo que tras la fusin existe una mezcla de poblaciones celulares (citamos las que nos interesan para este tema): a. b. c. d. e. Linfocitos sin fusionar Clulas de mieloma sin fusionar Hbridos linfocito x linfocito Hbridos mieloma x mieloma Hbridos mieloma x mieloma

o Las poblaciones a) y c) morirn tras 8 das de cultivo o La poblacin e) es la que nos interesa o Debemos eliminar las poblaciones b) y d) ya que al estar acostumbradas a crecer in vitro pueden sobreponerse a la poblacin de inters (e)
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o Para ello aadimos tras realizar la fusin un suplemento al medio de cultivo de los productos de la fusin que contiene Hipoxantina-Aminopterina-Timidina (HAT). La aminopterina bloquea la sntesis endgena de cidos nucleicos. Las poblaciones b) y d) morirn al carecer de enzima HGPRT. La poblacin e) sobrevive al aportar el linfocito B la capacidad de sintetizar esta enzima

4. Seleccin de hibridomas de inters Tras distribuir los productos de la fusin (en medio selectivo) en placas de cultivo de 96 pocillos (similares a las de ELISA que se utilizan en prcticas), y dejar que las clulas se multipliquen, debemos localizar en qu pocillos existen hbridos que secretan anticuerpos frente al antgeno con el que se realiz la inmunizacin Para ello se recurre a tcnicas inmunolgicas habituales como, por ejemplo, un ELISA indirecto similar al que se realiza en las prcticas de la asignatura, brevemente: o Las placas estn tapizadas con el antgeno o Posteriormente se aade el sobrenadante (medio de cultivo) del pocillo donde hay crecimiento celular, donde se encontrarn los anticuerpos en el caso de que haya hbridos productores de anticuerpos especficos frente al antgeno o Si los hay se unirn al antgeno, y al aadir posteriormente el conjugado (anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratn marcado con peroxidasa) y ms tarde el sustrato, aparecer color

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5. Clonacin o Aunque hayamos detectado los pocillos donde hay clulas productoras de anticuerpos de inters, no sabemos si con ellas existen otras clulas que secretan otro tipo de anticuerpos. Debemos separar las que buscamos o Para ello se realiza la clonacin, que consiste, bsicamente, en realizar diluciones hasta que, estadsticamente, tengamos una alta probabilidad de que en algunos pocillos slo se encuentre una clula. Por lo tanto todas las que se deriven de ella secretarn el mismo anticuerpo. Este proceso (de clonacin) se repite 2 3 veces, con la necesaria prueba de deteccin por ELISA (tal y como se ha descrito ms arriba) entre clonacin y clonacin. Tras clonar ya podemos hablar de anticuerpo monoclonal, antes no.

6. Caracterizacin y produccin en gran escala o Una vez caracterizados los anticuerpos (determinacin isotipo, afinidad por el antgeno, reactividades cruzadas con otros antgenos, etc.) se debe producir en gran escala o Existen dos mtodos principales: o Cultivo in vitro: se hace crecer clones en botellas de cultivo o en biorreactores y en el medio de cultivo se encontrarn los anticuerpos o Produccin in vivo: se inoculan los clones en la cavidad abdominal de ratones previamente tratados intraperitonealmente con una sustancia irritante. En la ascitis que se produce se encuentran los anticuerpos mucho ms concentrados que en el caso anterior

QU MEJORA CON EL EMPLEO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES?

En principio todo lo que se base en una reaccin antgeno-Anticuerpo: Sistemas de deteccin de base inmunolgica
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Terapia frente al cncer? Falta de Anticuerpos monoclonales de origen humano Estudios en microbiologa Etc.

PREGUNTAS 1. Qu es un anticuerpo monoclonal? 2. Por qu las clulas de mieloma empleadas para la obtencin de hibridomas son HGPRT-? 3. Por qu es necesario clonar? 4. Por qu existen problemas para el empleo de anticuerpos monoclonales con fines teraputicos en medicina humana y veterinaria?

BIBLIOGRAFA 1. Abbas, A.K. Inmunologa Celular y molecular. 2002. Traduccin de la cuarta edicin en ingls (Cellular and molecular immunology). McGrawHill-Interamericana, Madrid. 2. Kuby, J. Immunology. 1992. W.H. Freeman and Company, Nueva York. 3. Snchez-Vizcano, J.M. Curso de introduccin a la inmunologa porcina. http://www.sanidadanimal.info/inmuno/inicio.htm 4. Fuente de imgenes: http://www.whfreeman.com/kuby

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