UNIVERSITATEA DE TIIN E AGRONOMICE I MEDICIN VETERINAR FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

MICROORGANISME UTILIZATE LA OB INEREA AMINOACIZILOR

CUPRINS
Capitol Pagina

1. Introducere...2 2. Caracterizarea general a microorganismelor...4 2.1. Microorganisme erucariote.5 2.1.1. Morfologia fungilor...5 2.1.2. Producerea de proteine de ctre fungi5 2.2. Microorganisme procariote.6 2.2.1. Morfologia bacteriilor...6 3. Metabolosmul bacterian.7 3.1. Considera ii generale. Catabolism. Anabolism 7 3.2. Catabolismul proteinelor i al aminoacizilor.7 3.3. Anabolismul .8 3.3.1. Biosinteza aminoacizilor cu ajutorul microorganismelor.9 4. Microorganisme utilizate la ob inerea de aminoacizi.. ..11 Bibliografie.....16

1. Introducere

Multe procese biotehnologice pot fi considerate ca avnd un nucleu alctuit din trei componente n care o parte se ocup cu obinerea celui mai bun agent biologic pentru o anumit funcie sau proces, a doua parte creeaz cel mai bun mediu pentru ca, agentul biologic s funcioneze, i a treia parte se ocup cu separarea i purificarea unui produs sau a unor produse eseniale din procesele de fermentaie. n majoritatea exemplelor efectuate pn acum, cea mai eficient, stabil i convenabil form de agent biologic pentru un proces biotehnologic este un organism ntreg i din acest motiv, cea mai mare parte a biotehnologiei se nvarte n jurul proceselor microbiene. Microorganismele pot fi vzute att ca fixatori primari ai energiei fotosintetice ct i ca sisteme pentru producerea schimbrilor chimice n aproape toate tipurile de molecule organice sintetice i naturale. mpreuna, ele au un imens lot de gene ce ofer un poten ial aproape nelimitat, biosintetic i degradant. Mai mult, microorganismele pot avea rate de cretere extrem de rapide fa de organismele mai mari cum ar fi plantele i animalele. De aceea, cantit i mari de produse pot fi obinute n condiii de mediu corespunzator, n perioade scurte de timp.1 Diversele microorganisme utilizate n microbiologia industrial aparin principalelor tipuri cunoscute: bacterii, fungi (drojdii i mucegaiuri) i microalge. Microorganismele folosite n industrie trebuie s posede urmtoarele caracteristici: S fie culturi pure, att lipsite de alte microorganisme vizibile la microscop, ct i lipsite de virusuri; S cresc rapid i viguros dup inoculare, pentru a ob ine cantit i mari de inocul, nainte de procesul industrial; S creasc pe un substrat ieftin, pe care s l transforme n cea mai mare parte si ntr-un timp ct mai scurt;

Vamanu A., Popa O., Cmpeanu G., Cmpeanu S., Vamanu E., Cmpeanu C., Biotehnologii microbiene, vol.2

S tolereze cantitai mari de produs final fr sa l metabolizeze, permind acumularea lui n mediu i separarea uoar de al i produi; S nu produc substane toxice; S manifeste rezisten la contaminare, fie prin capacitatea de cretere la pH sczut sau la temperaturi ridicate, fie prin elaborarea rapid de inhibitori microbieni;

S fie stabile genetic, adic s-i conserve n timp caracterele biochimice, fr riscul variaiilor genetice.

Microorganismele care ndeplinesc aceste condiii pot fi izolate din natur sau obinute din colecii de culturi.

2.

Caracterizarea general a microorganismelor

Celula este unitatea de baz a organismelor vii, multe dintre acestea fiind unicelulare, n timp ce altele sunt multicelulare, fcnd posibil specializarea celular. Toate celulele conin un fluid (matricea de baz), nconjurat de o membran citoplasmatic, alcatuit n principal din lipide i proteine. Acestea conin, de asemenea, acizi nucleici, cruii fizici ai informaiei genetice, alturi de ribozomi, care sunt implicai n sinteza proteic. Celulele se impart n dou categorii: procariote (fig.1), caracteriznd grupurile archae i eubacterii, i eucariote (fig.2), ce cuprind fungii, protozoarele, algele si alte plante, precum i animale.2

Fig. nr.1. Celula bacterian

Fig. nr.2. Celula eucariota

Matei, F., Microbiologie aplicat

2.1. Microorganisme eucariote

2.1.1. Morfologia fungilor
Fungii sunt organisme eucariote care posed un nucleu nconjurat de o membran nuclear i nucleoli. Respiraia celular are loc n mitocondriile prezente n citoplasm care prezint un sistem elaborat al membranei interne. Studiul fungilor face obiectul micologiei, care este cea mai veche disciplin de microbiologie. Este recunoscut de mult timp rolul fungilor n descompunerea materiei organice i de aceea ei sunt considerai asemanatori cu mucegaiurile. Fungii dispun de o mare varietate de forme i mrimi, dar ei sunt mpar i i n doua grupuri, mucegaiuri i drojdii. Mucegaiurile se refer la fungii filamentoi i micelieni, care sunt forma i dintr-o reea de filamente nunite hife. Drojdiile sunt predominant fungi unicelulari, de form rotund, oval sau alungit. Drojdiile formeaz rar structuri multicelulare, spre exemplu, Candida boidinii, formeaz lanuri celulare numite pseudomicelii sau pseudohife.

2.1.2. Producerea de proteine de ctre fungi Datorit faptului c celula de Escherichia coli poate produce endotoxine i pirogeni cu efecte secundare n produsele farmacologice, au fost cercetate alte specii ca gazde pentru clonarea de gene. Primul fung care a avut succes a fost drojdia Saccharomyces cerevisiae, deoarece nu produce toxine i elimin produii n mediul de cultur. Kluyveromyces lactis a fost gasit ca o gazd eficient pentru sinteza i secre ia de prochimozin bovina. Acesta este convertit ntr-o enzim de importan comercial n nchegarea laptelui, chimozina, utilizat n industria brnzeturilor. Hansenula polymorpha este de asemenea utilizat ca gazd pentru producia de proteine heteroloage. De asemenea cateva specii de Aspergillus, un gen important n tehnologia de fermentaie pentru secreia eficient a diferitelor enzime, sunt utilizate ca gazde pentru expresia genelor mamiferelor.

2.2. Microorganisme procariote

2.2.1. Morfologia bacteriilor
Bacteriile reprezint un grup de microorganisme procariote, unicelulare, de dimensiuni microscopice, cu morfologie variat i cu un echipament enzimatic mai mult sau mai pu in complex n funcie de specie. Fiecare bacterie prezint o form i dimensiuni caracteristice, dar supuse, mtre anumite limite, variabilitaii n funcie de condiiile mediului nconjurtor, de vrsta celulelor, iar pentru unele specii i de etapele ciclului lor evolutiv. Forma i dimensiunile bacteriilor sunt elemente importante pentru diferen ierea i clasificarea lor. Morfologia tipic a bacteriilor este dat de aspectul pe care l prezint celulele tinere, active din punct de vedere fiziologic, n condiii favorabile de mediu. n general, la bacterii, se disting trei tipuri morfologice fundamentale: Cocoid (rotund); Bacilar (alungit-cilindric); Spiralat (cilindrice, alungite, dar care prezint curburi ale axului longitudinal)

3. Metabolismul bacterian
3.1.

Considera ii generale. Catabolism. Anabolism

Celula bacterian, dei simpl ca structur, reprezinta un sistem complex i organizat, capabil s si sintetizeze propriile macromolecule, plecnd de la monomeri cu greutate molecular mic. Energia necesar sintezelor celulare este asigurat, la cele mai multe bacterii, de oxidarea enzimatic a substratului lor nutritiv. Metabolismul bacterian poate fi, deci, definit ca totalitatea reaciilor biochimice prin care energia i substan ele biogene sunt luate din mediu i utilizate pentru biosinteza componen ilor celulari i cretere sau pentru alte activit i vitale (micare, luminiscen ). Reaciile biochimice specifice metabolismului se ncadreaz n dou tipuri de ci metabolice. Reaciile prin care se elibereaz energia (exergonice) constituie catabolismul sau procesele de dezasimilaie, iar reaciile prin care se consum energie (endergonice) corespund anabolismului sau proceselor de asimilaie. Creterea celulei este rezultatul unei stnse interdependen e dintre procesele metabolice, deoarece o parte din energia eliberat n urma catabolismului i unii metaboli i intermediari cu un numr variabil de atomi de carbon sunt utilizai n biosinteza macromoleculelor celulare.

3.2.

Catabolismul proteinelor i al aminoacizilor

Proteinele din mediul ambiant, sau de cultur, din cauza moleculelor lor mari, nainte de a ptrunde n celula bacterian, sunt hidrolizate enzimatic n peptide cu molecul mic. Enzimele proteolitice (exoenzime) sunt raspunztoare de hidroliza proteinelor n peptide, iar peptidazele (endoenzime) hidrolizeaz peptidele n aminoacizi. Ansamblul reaciilor care asigur hidroliza proteinelor pn la aminoacizi poart numele de proteoliz. Bacteriile care posed proteaze exocelulare i care sunt capabile s utilizeze proteinele ca unic surs de azot i chiar de carbon, se numesc proteolitice. Din acest grup fac parte att bacterii aerobe (Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, unele tulpini de stafilococ i streptococ) ct i bacterii anaerobe, dintre care unele foarte active ( Clostridium

histolyticum, Clostridium sporogenes). Proteazele bacteriene prezint un interes industrial deosebit att n industria pielriei, textil i a detergen ilor ct i n industria alimentar i farmaceutic. Polipeptidele rezultate n urma aciunii proteazelor, vor fi hidrolizate, n continuare, n aminoacizi sub aciunea pentidazelor endocelulare. Unele specii bacteriene, aerobe i anaerobe, lipsite de proteaze, posed numai peptidaze ceea ce le permite folosirea peptonei ca unica sursa de N i C. Aminoacizii eliberai n urma proteolizei sunt folosii n proteinosintez iar surplusul va fi catabolizat pe mai multe ci din care dezaminarea i decarboxilarea sunt cele mai importante.

3.3.

Anabolismul

Structurile eseniale ale celulei bacteriene sunt constituite dintr-un numar mare de macromolecule, pe care celula trebuie s-i sintetizeze plecnd de la monomerii mediului de cultur sau de la cei furnizai de cile metabolismului intermediar. Macromoleculele celulare sunt polimeri constituii dintr-un numr variabil de monomeri identici (homopolimeri) sau diferii (heteropolimeri), dispui linear sau ramificat. Prin hidroliz, polimerii elibereaz subunitaile (monomerii) constituente ceea ce dovedete c ei se formeaz prin reacii de deshidratare i c monomerii se asambleaz prin legturi anhidrice. ncorporarea lor n polimer (Tabelul nr.1).3 Tabelul nr. 1. Activarea monomerilor Polimerul Proteine Polizaharide Acizi nucleici Monomerul Aminoacizi Monozaharid Nucleozide monofosfat Monomer activat Aminoacil-AMP Aminoaci-ARNt MonozaharidNDP Nucleozide trifosfat Agentul activator ATP,ARNt NTP (nucleozid trifosfat) ATP Tipul de legtur Peptidic Glicozidic Fosfodiester n biosintez monomerii sunt n prealabil activai prin cuplarea lor cu o molecul macroergic, dupa care are loc

3.3.1. Biosinteza aminoacizilor cu ajutorul microorganismelor

3

Vamanu A., Popa O., Cmpeanu G., Cmpeanu S., Vamanu E., Cmpeanu C., Biotehnologii microbiene, vol.1

Aminoacizii necesari pentru sinteza proteinelor de ctre microorganisme pot fi gsii ca atare, n mediu, de unde provin, de regul, din aciunea enzimelor proteolitice extra- sau intracelulare. n cazul microorganismelor cultivate pe medii cu azot anorganic sau cu un numr restrns de aminoacizi, toi aminoacizii sau respectiv cei care lipsesc, trebuie sintetizai n cursul metabolismului. Obinerea de aminoacizi cu ajutorul microorganismelor are urmatoarele particularitai: - Asemenea celor mai multe ci biosintetice, cile de biosintez ale celor aproximativ 20 de aminoacizi sunt, n cea mai mare parte, diferite de cele utilizate pentru degradare i se realizeaza prin intermediul unor secvene multienzimatice diferite, dintre care unele sunt foarte complexe; - Cile biosintezei sunt intricate cu cele ale catabolismului, deoarece muli acizi organici, care aparin metabolismului intermediar al glucidelor, sunt folosii ca precursori ai aminoacizilor; - Cu excepia histidinei, care urmeaz o cale de biosintez izolat, ceilali 19 aminoacizi naturali sunt derivai pe cai biosintetice ramificate, avnd ca punct de plecare un numr relativ mic de precursori metabolici care pot fi grupai n funcie de originea lor biosintetica n 6 familii (Tabelul nr. 2.). Aceasta modalitate de biosintez prezint o serie de avantaje decurgnd n primul rand, din faptul ca un numar limitat de compusi servesc ca substrat pentru sinteza tuturor aminoacizilor, spre exemplu: oxalilacetatul este folosit pentru biosinteza a 6 aminoacizi, -cetoglutaratul pentru 4, iar piruvatul pentru 3. n acelai timp, acest mecanism limiteaza numarul enzimelor (aproximativ 100) care participa la formarea aminoacizilor naturali si favorizea intrarea in joc a mecanismelor de reglare (represia sintezei si retroinhibitiei), cand formarea sau functia lor este inutila. In sfarsit, frecvent, caile metabolice ale biosintezei unor aminoacizi sunt partial comune ca, de exemplu, cele pentru familiile oxalilacetat si piruvat.

Tabelul nr. 2. Precursorii pentru biosinteza aminoacizilor 9

Precursorul Piruvat Oxalilacetat

Aminoacizii produi Alanina, valina, leucina Acid aspartic, asparagina, metionina, treonina, izoleucina, lizina Glutamat, glutamina, arginina, prolina serina, glicocol, cisteina Fenilalanina, tirozina, triptofan Histidina

Numele familiei Piruvat Aspartat

-cetoglutarat 3-fosfoglicerat Fosfoenolpiruvat eritrozo-4fosfat Fosforibazil-pirofosfat + ATP

Glutamat Serina Aromatica ----

Cile de biosintez au fost precizate cu ajutorul mutantelor bacteriene auxotrofe pentru unul sau mai multi aminoacizi, la care pierderea unei enzime dintr-o secventa metabolica conduce ca regula generala - la acumularea in mediu a precursorului imediat al etapei afectate de mutatie. De asemenea, un rol important in elucidarea acestor cai a avut-o urmarirea repartizarii atomilor marcati (14C) in produsul final al biosintezei sau in intermediarii sai, precum si izolarea si purificarea enzimelor care catalizeaza diferitele etape ale procesului. S-a demonstrat ca nevoile nutritive ale bacteriilor auxotrofe pentru un anumit aminoacid pot fi satisfacute nu numai de acest aminoacid, ca atare, ci i de precursorii si.

4. Microorganisme utilizate la ob inerea aminoacizilor

10

Microorganismele difer n ceea ce privete capacitatea lor de a sintetiza aminoacizi. Unele bacterii (de exemplu: Leuconostoc mesenteroides ) nu pot crete decat dac gsesc n mediu 16 aminoacizi diferii. Acest categorie de microorganisme nu se poate dezvolta decat n mediile bogate n aminoacizi preformai, prin descompunerea substanelor de proveniena proteic. Alte bacterii, ca E. coli, pot sintetiza toi aminoacizii necesari pornind de la NH3. Dei cele mai multe microorganisme necesit o forma redus de N, ca amoniacul, numeroase bacterii i fungii pot utiliza, ca i plantele superioare, nitriii sau nitraii. Biosinteza aminoacizilor pune dou probleme fundamentale, reprezentate de sinteza scheletelui format din atomi de C i fixarea gruparii NH2. n unele cazuri, de exemplu, n sinteza alaninei de la piruvat, se sintetizeaz n primul rand scheletul de C, iar gruparea NH2 este adaugat ulterior printr-o reacie de transaminare.

Fig. 3. Sinteza alaninei de la piruvat n alte cazuri, scheletul de C deriv direct de la intermediari ai ciclului acizilor tricarboxilici, de exemplu, ac. aspartic de la oxalilacetat i ac. glutamic de la cetoglutarat. La randul lor, aceti doi aminoacizi devin precursori ai altor aminoacizi. Biosinteza aminoacizilor aromatici ( L-tirozina, L-fenilalanina i L-triptofanul) este foarte complicat i este iniiat printr-o condensare ntre fosfoetanolpiruvat (PEP) i eritrozo-4-fosfat, pentru a produce un intermediar fosforilat cu 7 atomi de C. Acesta sufera o ciclizare, pentru a forma acid 5-dehidroquinic, care devine ciclul aromatic al produilor finali. Adiia unei noi molecule de PEP la un ultim intermediar hidroaroatic acidul 5-fosfoshikimic furnizeaz atomii de C pentru lanurile laterale ale tirozinei si fenilalaninei. Produsul acestei a doua condensri, acidul chorismic 11

este situsul primei divergene metabolice. n continuare, el poate fi convertit fie la acid prefenic, precursorul fenilalaninei i al tirozinei, fie la acid antranilic, precursorul triptofanului.4 Biosinteza Histidinei urmeaz o cale complet independent i este realizat de 9 enzime, care asigur formarea acestui aminoacid, pornind de la 5-fosforibazil-1-pirofosfat (PRPP), ATP i glutanin. Este probabil calea cea mai complicat din cauza naturii intermediarilor i a faptului c se suprapune unei pari din sinteza ciclului purinic. Acest fenomen este ilustrat i de originea atomilor de carbon i azot din structura moleculei histidinei, dintre care 5 atomi de carbon deriva de la riboz, un atom de la glutamin i un fragment C-N de la ATP, prin desfaurarea ciclului adenin al acestuia (fig.4). Restul ciclului adenin al ATP poate fi reciclat, prin introducerea n calea de sintez a purinei i n refacerea ATP.

Fig. 4. Originea atomilor de C i N din structura histidinei (5 atomi de C de la riboz) Aceast cale, numai aparent neeconomic, asigur o conexiune intim ntre biosinteza histidinei i cea a nucleotidelor purinice: ATP este degradat n cursul sintezei histidinei, dar produsul acestei degradri poate reintra n calea de sintez a purinei ntr-o etap relativ avansat a procesului respectiv. Biosinteza ob inerii acidului glutamic. Acidul L-glutamic este primul aminoacid obinut prin biosinteza. Este folosit n terapeutic n tratamentul unor afeciuni ale sistemului nervos central, n realizarea unor preparate farmaceutice antialergice i n boli de nutri ie.

Zarnea, G., Tratat de microbiologie general, vol.2

12

Cel mai important microorganism producator este Micrococcus glutamicus cu caracteristici comune genului Corynebacterium i Brevibacterium, i anume: bacteria n form de bacili scurti, Gram + , imobili, aerobi; necesit biotin ca factor esenial de cretere. Forma bacteriilor variaz n funcie de compoziia mediului. Alte microorganisme producatoare pot fi Brevibacterium flavum i Brevibacterium lactofermentum. Biosinteza acidului glutamic de ctre Corynebacterium glutamicum se realizeaz pornind de la glucoz i ioni de amoniu. Glucoza este oxidat la citrat, iar acesta mai departe la -cetoglutarat (prin ciclul Krebs) care, prin aminare reductiv, se transform n acid glutamic. n cursul oxidrii de la citrat la -cetoglutarat, intervin doua NADP-dehidrogenaze specifice acestui microorganism, care actioneaz cuplat. Microorganismul poate folosi pentru degradarea glucozei pn la piruvat att ciclul glicolizei, ct i pe cel al pentofosfa ilor. n condiii de aerare predomin calea pentofosfailor, favoriznd acumularea acidului glutamic. n condiii anaerobe, predomin ciclul glicolizei i n acest caz se formeaz acid lactic. De aici reiese importana deosebit pe care o are aerarea de-a lungul procesului. n afar de condiiile de aerare, alt factor important este coninutul de biotin. Aceast vitamin are rol cheie n biosinteza i acumularea glutamatului n mediu. Un con inut maxim de biotin determin o cretere maxim a microorganismelor, dar descrete cantitatea de glutamat; invers, un con inut sczut de biotin, mergnd pn la deficient, determin acumularea unor cantiti mari de glutamat. Biosinteza producerii Lizinei. Lizina este un aminoacid utilizat n cantiti importante n alimentaia animalelor i a omului. Lizina a fost izolat n 1889 din hidrolizat de protein de ctre Drechsel. Se cunosc dou procedee de obinere a acestiu aminoacid: sinteza n dou etape i sinteza direct. Sinteza n dou etape se bazeaz pe obinerea, n prim etap, a acidului diaminopimelic, utiliznd o mutant de E. coli pornind de la glucoz, n cultur sub agitare i aerat. n a doua etap, acidul diaminopimelic obinut este supus aciunii unui al doilea microorganism. Enterobacter aerogenes, care posed diaminopimelic-decarboxilaz, enzim ce produce decarboxilarea acidului diaminopimelic la lizin; cultura de Enterobacter aerogenes este supus aciunii agenilor chimici (butanol, toluen) sau fizici (ultrasunete) pentru a elibera enzima. Sinteza directa este cea mai utilizat metod i folosete un singur microorganism. Pornind de la Corynebacterium glutamicum i utiliznd ca agen i mutageni radia ii UV sau , s-au obinut o serie de mutante biochimice, toate fiind mutante auxotrofe pentru diferii aminoacizi. Cea mai 13

util este o mutant de homoserin si biotin. Se utilizeaz i mutante auxotrofe de homoserin sau mutante reglatoare de Brevibacterium lactofermentum. La Corynebacterium glutamicum si Brevibacterium exist dou puncte critice, n care biosinteza poate fi limitat: 1. Producerea aspartatkinazei, a crei activitate poate fi inhibat printr-o inhibiie feed-back de prezena simultan a unui exces de lizin i treonin in mediu. Nici unul dintre aminoacizi nu exercita inhibiie separat, ci numai impreun; 2. Devierea de la homoserin, prin homoserin-dehidrogenaz. Pentru a fi eliminate aceste dou blocri printr-o singur mutaie, exist trei modalitai: Utilizarea mutantelor auxotrofe de homoserin sau homoserin-dependente; Utilizarea mutantelor sensibile la treonin sau metionin; Utilizarea mutantelor rezistente la un analog al lizinei: S-2-(aminoetil)-L-cisteina.

n prezent, prin tehnologiile de biosintez se obine un numr mare de aminoacizi, iar elucidarea mecanismului de biosintez a permis ridicarea randamentului n faza de fermentaie i optimizarea lui. Unii aminoacizi, printer care acidul L-aspartic, L-fenilalanina, sunt obinui prin procese enzimatice de bioconversie; alii, printre care L-izoleucina, L-triptofan, sunt produi n prezena unor precursori specifici, iar a treia clas de aminoacizi, printre care acidul L-glutamic, Llizina i L-valina se ob in prin fermenta ii submerse. Cei mai activi productori de aminoacizi de uz terapeutic sunt bacteriile din genul Arthrobacter, Mycobacterium, Micrococcus, Corynebacterium. La ora actual, producerea de aminoacizi se realizeaz cu tulpini slbatice (prototrofe), obinndu-se acidul L-glutamic, L-valina, D,L-alanina, L-Pro; cu mutante auxotrofe de aminoacizi, cnd se produc Lys, Tre, Leu, Pro, Val, Asp; cu mutante auxotrofe de biotin, rezultatul fiind acid L-glutamic; cu mutante reglatoare: Lys, Tre, Arg, Met; pornind de la precursori de biosintez. Ali aminoacizi importani pentru industria farmaceutic, produi cu ajutorul microorganismelor sunt: L-cisteina obinut cu tulpini capabile s hidrolizeze acidul 2-amino-2tiozolin-4-carboxilic: Pseudomonas sp., E.coli, Bacillus brevis, Micrococcus sodenonsis; L-alanina, obinut cu Pseudomonas dacunhae; L-arginina, utiliznd tulpini de Corynebacterium glutamicum i Bacillus subtillis; L-glutamina cu mutante de Brevibacterium flavum; L-izoleucina, cu Serattia marcescens, Corynebacterium glutamicum sau E. coli.5
5

Matei, F., Microbiologie aplicat

14

15

BIBLIOGRAFIE

1. Zarnea, G., Tratat de microbiologie general, vol.2, Editura Academiei Republicii Socialiste Romnia, Bucureti,1984, pag. 262-265 2. Florentina Matei, Microbiologie aplicat, Editura Printech, Bucureti, 2011, pag. 1315, 167-170. 3. Vamanu Adrian, Popa Ovidiu, Cmpeanu Gheorghe, Cmpeanu Sorin, Vamanu Emanuel, Cmpeanu Carmen, Biotehnologii microbiene, vol.1, Editura Ars Docendi, Bucureti 2003, pag. 13-15, 23,25,39,79,91,105-107 4. www.stireal.edu.md/biologie/candidat/microbiologie_ind.pdf 5. www.referateok.ro/referate/117_1211462183.doc

16