1 Qué es y con qué objetivose practica la

cromatografíade caPa fina

1.1 ¿Está muerta la cromatografía de capa fina? ¡Vivala cromatografíade capa fina!
En ocasiónde un congresosobrecromatografía de capa fina de alta eficacia(de la cual
hablaremosmás adelante)R. E. Kaiserpresentóen 1985,y bajo el mismotítulo,nuevos
de un antiguométodo[1].A principios
desarrollos de losañossetentaparecíaquelosrápidos
avancesen la cromatografía líquidade columna(ColumnLiquidChromatography, CLC)y
especialmente en la cromatografía líquidade alta eficacia (HPLC) podían desplazara la
cromatografíade capafina(CCF,TLC). Perono nosdejemosconfundir el por nombre: la CCF
es un método de cromatografialíquidacomo también lo es la CLC. Bajo el nombre
"Cromatografía Planar"unarevistaespecializada se dedicaexclusivamente desdeprincipios
de 1988a éste,todavía joven,antiguo procedimiento. Si la máxima "publish or perish"(publica
o desaparece)expresaalgoacercade la viabilidadde los métodos analíticos,entonces la Fig.
1 muestraun crecienteatractivode la CCF desde principios de los años ochenta. Una
formación práctica debe tener esto en cuenta - y por ello hemos escrito esta introduc-
ción.

1.2 Un principiofabuloso:separaciónpor adsorción[3]

tenÍauna
Éraseunavezun reypoderosoque reinabaen un paíslejano.Comoes de esperar,
con el hombremásfuerley vigorosode su
hermosahijaa la que queríacasarprecisamente
reino.Pero¿cómoencontrarlo?.

r970 r973 1976 rg79

científicassobreCFC/HPTLCentrelos años
de frecuenciasde publicaciones
Fig. 1: Distribución
1967-86 (búsqueda realizadaen ChemicalAbstracts)[2].
Hizollamara todoslos sabiosde su reinoy les pidióconsejo.Fuédificilya que los sabios
oadecíantodos de faltade creatividad. Exceptouno llamadoCromos.Ésteteniauna idea
"Majestad",
original: "al
dijo, oestede vuestroreinofluyeun río impetuoso. paraun
Utilizadlo
superconcurso. Haced que ingenieros
vuestros fijenen el ríoestacasseparadas regularmen-
te,suficientemente altasy gruesasparaqueun nadadorpuedaasirlas.Si arrojáisentoncesun
hombreal río,podráasirsea la estacay mantenerse sujetoa ellahastaque la corrientelo
arrastre.Lo llevaráhastala próximaestaca,dondetambiénse agarrará. Cuantomásfuerte
sea el hombre,más a menudoy durantemás tiempoconseguirámantenerse agarrado.Si
habéisfijadosuficientes estacasentreel principioy el final,con toda seguridadllegaráa la
meta primeroel hombremás débil y en últimolugarel hombremás fuerte.Va a ser una
apasionante carreraparavuestrossubditos."
hizoacondicionar
Elrey,siempreabiertoa nuevasideasdeportivas, el recorridode la carrera.
No debíaganarel más rápidosino el más lento.Yasí sucedió.De esta maneratan simple,
de sangrese buscóal vencedor,
elegantey sin derramamiento quiense casócon la hijadel
rey.
Loseruditosdel deportellamaronal riofasemóvil,a lasestacasfaseestacionaria y al tiempo
que un atletanecesitabaparaefectuarel recorrido,tiempode retención, ya que retención
equivalea agarrarse o permanecer.Yen honoral sabioconsejerodel rey llamaronal nuevo
depode "Cromatografía".Ycomo estos conceptos sonabantan científicos, un buendía los
se dieroncuentade lasfabulosasposibilidades
científicos del nuevodeporle.No enviaronal
recorridoaspirantesa la manode la hijadel reysinosustanciasquímicas.En lugarde un rÍo
impetuosoeligieronun disolvente comofasemóvil.Sustituyeron lasestacaspor sustancias
adsorbentes comoel gel de síliceo el óxidode aluminio.Ycomo puedeverseen estebreve
libro.aún hov hacencromatoqrafías.

r," ." ,
7

I t':,-t:,

10
1.3 Gómo empezótodo [4]
YaentiemoosdeAristóteles se utilizabanlosefectosadsorlivosde distintastierrasparatratar
el agua de mar.La paternidad (y la denominación)de las separaciones "cromatográficas"
corresponde con toda justiciaal botánicorusoMichailT.TSWEETquien, en un congresoen
1903,describiópor primeravez la separación de colorantesde plantas.Sus experimentos
con cromatografÍasde columnase muestranen la Fig.2: En la partesuperiorderechase
distinguenunasbandascoloreadas correspondientesa loscolorantesde lashojasseparados
sobrecarbonatocálcico.

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f_, -r
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t{
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.,4 1 .l
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1 ,l

N
a
t

Fig.2: Primeraparatode cromatografía parala separación de hojas,segÚnla

de colorantes
publicacióndeTSWETTde 1906. Las pequeñas columnas (2)se llenaban
cromatográficas con
carbonato cálcicoy se utilizaban (250- 300mbafl.Eltubohorizontal
bajounaligerasobrepresión
en (1)servíaparatransmitir la presión Lacromatografía
a un máximode hasta5 minicolumnas. de
baja presión[4],tambiénutilizada por TSWETT, se muestraen (4).

Pasaronaproximadamente 30 añoshastaquefue reconocida la utilidadde la cromatografía

de adsorción comotécnicaanalítica (porR.KUHNy colaboradores, en 1931).Pocosañosmás
tarde,unosinvestigadores rusostrasladaron el principioa capasdelgadasde adsorbentes.
STAHL[5] y KIRCHNER[6] desarrollaron a partir de aquí la cromatografía de capa fina.
Y esta cromatografía de adsorciónse muestraapropiadasobretodopara la separaciónde
sustancias lipófilas.
En contraposición,otro principio,el de la cromatografía de partición,se
muestraapropiadoparala separaciónde sustanciashidrófilas,como los aminoácidosy
azúcares, por ejemplosobrepapelo sobregel de síliceimpregnada con agua.
Desde1934lacompañía Merckha participadoen estaevolución y ha contribuído,
sobretodo
a travésdeldesarrollode materiales y
estandarizados de sistemas de separación preparados,
especialmente
a la aplicaciónrutinariade la cromatografía, la CCF [7].

1' 1
1.4 ¿Quéconsiguela cromatografíade capa fina?
La CCFno debetemerla comparación con otrosmétodoscromatográficos (ver1.1).Quien
deseeprofundizaren estetemapuedeconsultar[1,8,9].Enestaintroducción se haoptadopor
indicaral usuariolos casosen los que la CCF es más apropiadaque otros métodos.Si se
contestaafirmativamente a una o más de las siguientespreguntasse debe recurrira las
placasde CCF.
(1) ¿Sequiereverla separación cromatográfica íntegrapudiendoapreciaral mismotiempo,
por ejemplo,la bondadde la separación, la relaciónde componentes de la mezclay la
formacióneventualde colas(manchasarrastradas o "tailing")?
(2) ¿Se quiereevitarla contaminación por muestrasanterioresutilizandoel sistemade
separaciónuna únicavez?
(3) ¿Sedeseapoderelegirlibremente el disolvente parala muestra(yaque éstese evapora
totalmenteantesde iniciarla separaciónpropiamente dicha)?
(a) ¿Sedeseapoderelegircualquierfaseestacionaria entrelasdisponibles en el mercado,
pudiéndolas modificarfácilmente y sin que presentenproblemasde preparación de la
fase?
(5) ¿Essatisfactorio que avancensolamentealgunoscomponentes y que otros,conside-
radosno impodantes, permanezcan inmóvilesen el punto de partida?
(6) ¿Se desea optimizarla separaciónrápiday económicamente, pudiendomodificar
fácilmentelas fasesmóvily estacionaria?
(7) ¿Sedeseaproseguir la separación de un cromatograma, unavezterminado,efectuando
una nuevacromatografÍa perpendicular a la primeray obteniendoademásuna mejor
separación(CCFbidimensional)?
(8) ¿Sebuscaun métodode "screening" (procedimiento parala preselección de sistemasde
separación adecuados), que puedatransferirse al campopreparativo utilizandoplacas
de capa gruesao columnas?
(9) ¿Sedeseasepararel mayornúmeroposiblede muestrassimultáneamente, ahorrando
asítiempoy costesademásde eluiralavez las sustancias estándarbajocondiciones
idénticas?
(10) ¿Sedeseaelegirentretantossistemasde deteccióncomosea posibie,eventualmente
utilizablesde maneraconsecutiva y, en casode detecciónUV adquirirsoloun detector
paravariospuestosde trabajocromatográficos (yaque,en general,la detecciónde los
cromatogramas terminadospuedeesperar)?
(11) ¿Sedeseaemplearun métodode detecciónsencilloy que abarquemuchassustancias
(la extinciónde la fluorescencia)?
La preguntade si la CCFes mejorqueotrosmétodosno se plantea.La CCFy la cromatografía
de columnase complementan una a la otra.La CCF es especialmente adecuadapara los
principiantes, para los laboratoriosde formaciónprofesional, para el controlrápido del
desarrollo de lassíntesisy parael controlde medicamentos en la farmacia.Paranivelesde
exigencia elevadosen cuantoa eficiencia y reproducibilidad existenen el mercadosistemas
de alta eficacia(HPTLCo CCFAE),aparatosde aplicación,cubetas de separacióny
detectoresque tienenuna eficienciaabsolutamente comoarable a la de otrosmétodos.No
cabe duda sin embargoque es precisotener un mínimode conocimientos básicosy de
experienciaprácticapara ulilizarcon éxito la CCF,ya que existennumerososfactoresque
influyensobrela separación en este"sistemacromatográfico abier1o". El lectordebe por lo
tanto familiarizarse en el capítulo2 de este librocon los asoectosmás relevantesde la CCF.
Sóloentoncesconvienepasara los experimentos (losejemplosse encuentran en el capítulo
4). En el capítulo3 se describirála realizaciónprácticade la CCF.

12
2 Entre bastidores:¿cómofunciona la separaciónpor
cromatogratía de capa fina?

2.1 Principiosde la separación:equilibriosde adsorcióny partición.

Acordémonos del cuentodel rey y su hermosahija.Nos enseñóque la cromatografía se
fundamenta por
en generalen la distintaafinidadde lassustancias unafase y
estacionariauna
fasemóvil,por el sorbentey el eluyente.
Aplicamosunasustanciadisueltasobreunaplacade capafina.¿Quéexperimenta durantela
separación? por un tiempo
Es arrastradapor la fase movil,se fija a la fase estacionaria
determinado, de nuevo,y así sucesivamente.
es arrastrada De este modo,la sustanciase
retarda,se frena respectoal frente de la fase móvil.De hecho,tanto más cuanto más
preferentemente Así se separantambiénlas sustancias
se ancleen la faseestacionaria. de
afinidadparecidapor ambasfases:aunqueestasdiferencias seanpequeñas,conducena
elucionesdistintassi actúanel suficientenúmerode veces.La Fig. 3 muestralos dos
principiosbásicos en que se fundamentanlas distintasafinidades:los equilibriosde
adsorcióny de paftición.
de la manerasiguiente:
Estosfenómenosse describenfisicoquímicamente
Enlaadsorción,lassustanciasdisueltasen la fase móvilse acumulan(seadsorben)en la
superficiede un sorbente,p. ej. alúmina.
La parliciónaparecepor la distintasolubilidaden dos fasesinmiscibles.
En la cromatografíade particiónlassustanciasdisueltasen la fasemóvilse distribuyen entre
esta fasey unasegunda, fluída,adheridaa un soportefijo (p. ej. gel de silicaen fasereversa
(RP)o celulosa).
Paraambos equilibriosy para bajas concentraciones de una sustanciaA (pocosUg de
muestra)es válidala relaciónsimplificada:
c" :K
C-

dondeC"y C. sonlasconcentraciones de lasustanciaAen lasfasesestacionaria

de equilibrio
y móvilrespectivamente.
La Fig.4 muestragráficamente estarelación.Cuandola concentración de la sustanciaen la
fasemóviles alta(cercanaa la concentraciónde saturación)dejade serválidaestarelación
La curva,llamadaisoterma,se dobla.
simplificada.
La Fig.5 muestraclaramenteel efectodelvalorde K en el compodamientocromatográficode
dossustancias Ay B.Como puede a
observarse, mayor K mayor de
afinidad la por
sustancia la
faseestacionariay menor velocidad de elución.
Debemosreconocerque este tratamientoes muy simplificado.En la bibliografíase
encuentrantratamientos teóricosmás detallados[9-13].Todo usuariosabe sin embargo
tambiénque la teoríasólo permitepredecira grandesrasgosel comportamiento realde las
sustancias.La cromatografíaes todavíauna ciencia marcadamente empírica(verCap.2.3),

IJ
 La componenteA permanecepre-
ferentemente en la suoerficiede la
fase estacionaria(adsorción)o bien
en la fase líquidaestacionaria(par-
tición),mientrasque la sustanciaO
permanece preferentementeen la
fase móvil.

Al fluirnuevafasemóvil,lasmolécu-
las que se encontrabanen el elu-
yente son transporladasmás lejos.
Alcanzanunafaseestacionaria sóli-
da o líquidatodavíano ocupada,la
cual adsorbe o bien disuelvede
nuevopreferentemente a la compo-
nenteA.
Al mismo tiemoo, las moléculas
previamenteadsorbidaso disueltas
en la fase estacionariaoasan a la
+ oo fase móvil y son transportadasotro
trecho.

Trasmúltiplesrepeticionesde estos
procesoslas dos sustanciasse han
*- &t
oo I
separado. Las moléculasO, que
permanecenpreferentementeen la
M fase móvil, avanzan más rápida-
menteque las moléculasA.
En otras palabras: el R¡ de A es
me n o ro u e e l d e O.

A
Fig.3: Fenómenosde equilibrioen el procesocromatográfico: adsorción(A)y parlición(B).G :
soporlede la capa (placade vidrio),O : superficiede la faseestacionaria,
M : fasemóvil,S = fase
estacionaria.

14
 "'|

,+l --a
il = x"^-:

Cm
' Il-r.'1- ^ 3 = KA- 0,3

Fig. 4: Relaciónentre las concentraciones de

equilibriode una sustanciaen la fase móvily en fig. S: Oepend""",ude la velocidadcromato-
la fase estacionaria.La curva reoresentadase gráfica de avance de dos sustanciasA y B
llamaisotermade sorción. (arriba)con las isotermasde sorción (abajo).

C": Concentración de equilibriode la sustan-

cia A en la fase estacionaria
G. : Concentración de equilibriode la sustan- C.,,= Concentraciónde saturación de la fase
cia A en la fase móvil. estacionaria

debidoen partea que, parala mayoríade sistemas,contribuyena la separación

tanto los
procesosadsortivoscomo los de paftición.
Los procesosde particiónaparecentípicamente al combinarsopofteshidrofílicos impreg-
nados de solventespolares,especialmente agua o mezclasacuosas,con un solvente
orgánicomenospolarcomofasemóvil.Paraalgunosfineses conveniente inverlirla relación:
un portadorhidrofobizado
se saturacon un disolventeorgánico,y una mezclaacuosasirve
comofasemóvil.Estavariantese denominadisposición en fasereversa(reversed phase)y se
hablade materialesRP
En generalpuedeafirmarseque los procesosde adsorciónson adecuadospara separar
componentes de polaridaddidtintae isómerosestructurales cuyasenergíasde interacción
con un mismoadsorbente seandistintas.Los procesos de permitenla separación
partición
p.
de sustanciasde distintasolubilidad, ej. en una seriehomóloga.
Losprocedimientos
hastaahoranombrados y la
se basan,comohemosvisto,en la adsorción
oaftición.
Existeademásla cromatografía de intercambioiónicoque utilizafasesestacionarias
con
gruposcargadospositivao negativamente adecuadaparala separación
y es especialmente
de cationesy anionesasí como de proteínas.
de gel-permeación
La cromatografía (GPC)separasustanciassegúnel tamañomolecular.
Paraello se empleancomo fase geleshinchadosque presentanhuecosbien
estacionaria
definidos.

2.2 Parámetrospara describir la eficacia de la separación.

La primerainformaciónque proporciona terminadoes el compoftamiento
un cromatograma
de eluciónde las sustanciasseparadas.
Se expresamedianteel parámetroR1(en inglés,relateto front):
Distanciaentreel puntode partiday la manchade la sustancia
Rr :
Distanciaentreel puntode partiday el frentedel eluyente
La posiciónde la manchade la sustanciase toma en su puntomás intenso(generalmente
el
centro).
El Rt se consideraun valorsólo orientativodebidoa los numerososfactores,difícilmente
controlablessimultáneamente, que influyenen la retención.Una sustanciaeluídabajo
condiciones idénticaspuedeemplearse comopatrónparadeterminar unvalorrelativode R,el
R, o R",:
Distanciaentreel punto de partiday la manchade la sustancia
F"t =
Distanciaentreel puntode partiday la manchade la sustanciapatrón
Al contrariodel Rr,que es <1, el R"tpuedesertambién>1. La Fig.6 muestraunavez más
cómo se determinanambosparámetros.
Fig.6
La eficaciade separacióndel sistema de CCF se manifiestaen el ensanchamientoque
experimenta la manchaaplicadade la sustanciaa lo largodel recorridocromatográfico.

de Rr(A)y de R",(B).
Fig.6: Esquemapara la determinación
A Parámetro R1 B Parámetro R"

Frentedel
eluyente

Patrón @

Sustancia @
Sustancia @

Puntode Puntode
partida parlida

b - Recorrido:Sustancia Recorrido:Sustancia
F"_: ^o
"' a Recorrido:Estándar a Recorrido:Eluyente

16