INTRODUCERE N CULTURILE DE CELULE I ESUTURIVEGETALE Sfritul mileniului doi se caracterizeaz printr-o puternic implicare a biotehnologiein viaa omului, n toate

domeniile de activitate. Cu ajutorul metodelor biotehnologice s-aufcut progrese uriae n crearea de noi genotipuri de plante i rase de animale cu nsuirifavorabile i cu randamente sporite fa de materialul de la care s-a plecat.Dezvoltarea biologiei moleculare din ultima jumtate de secol s-a fcut, n principal, pe organisme simple ca mod de organizare (bacterii, drojdii, alge, etc.), organismeunicelulare. Odat cu abordarea organismelor pluricelulare trebuia verificat dac noiunileacumulate anterior erau valabile i dac existau i alte procese specifice modului complex deorganizare. Cunoscndu-se comportamentul organismelor simple, cercettorii au nceput s segndeasc la cultura pe medii artificiale a unor poriuni de plante sau chiar celule. Problemacare a aprut a fost aceea a meninerii viabilitii acestor celule, de la prelevarea de pe plantamam pn la trecerea pe mediu nutritiv artificial sau mai departe pn la regenerarea(refacerea) unei noi plante.Ajungerea la cultura in vitro nu a fost aa de simpl cum s-a presupus fiind necesar mult timp i multe cercetri, la nceput fr succes, dar apoi totul s-a clarificat.n 1882, Sachs a fost cel care a elaborat teoria conform creia plantele i sintetizeazsubstanele ce determin formarea organelor, substane ce au o dispunere polar, iar primelencercri de culturi de esuturi au fost fcute n 1902, de ctre Haberland, din nefericire, frrezultatele dorite. Primele rezultate privind cultura de celule i esuturi ncep s apar din anul1922, cnd Knudson reuete germinarea seminelor de orhidee in vitro Iar Robbins obine prima cultur de esut de rdcin n condiii artificiale.Pe baza conceptului de totipoten celular, conform cruia fiecare celul conineinformaia genetic necesar obinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, nanul
1

1952 Morel i Martin au stabilit i au perfecionat o metodologie de cultivare pe mediiaseptice a explantelor meristematice caulinare, obinnd prin creterea in vitro a acestora plante sntoase, libere de viroze, pornind de la plante mam contaminate cu diferite viroze.n acest mod se produce material de plantat devirozat, cu o rat de multiplicare ntr-un ritmimposibil de imaginat prin utilizarea tehnicilor tradiionale de nmulire vegetativ, evitndu-se i degenerarea soiurilor din cauza infeciilor virale, transmisibile prin nmulire vegetativ.n anul 1962, dup muli ani de studii i ncercri, Murashige i Skoog, au reuit selaboreze un mediu de cultur considerat ca fiind de baz , care cu mici modificri poate fiutilizat pentru aproape toate tipurile de culturi de esuturi.Reuita experienelor lui Coking n 1960 privind izolarea enzimatic a protoplatilor dinmezofil foliar, a fcut posibil obinerea unor populaii mari de protoplati iar apoi producereade hibrizi somatici.Anul 1966 este considerat drept nceputul etapei moderne a cercetrilor privind culturade explante vegetale in vitro. Aceast etap s-a caracterizat, n primul rnd prin elaborarea detehnici eficiente n generarea, cultivarea i fuzionarea protoplatilor vegetali. Cu ajutorul protoplatilor, odat cu descoperirea noilor tehnici (electrofuziune, vectori virali transmitoride gene izolate) s-au obinut plante rezistente la aciunea unor ageni stresani cum ar fi: pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc.Att pe continentul american ct i pe cel european sau asiatic, culturile in vitro suntfolosite n special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat de multiplicareaspeciilor arboricole ornamentale i fructifere, dar i pentru realizarea de noi genotipuri saumai ales pentru regenerarea celor create prin inginerie genetic.

CULTURILE IN VITRO 1. DEFINIIE, CARACTERIZARE IAPLICABILITATE 1.1. Definiie n sens general, prin cultura in vitro se nelege creterea pe medii artificiale, ncondiii de asepsie deplin i de factori ambientali bine controlai, a unor organe, pri deorgane, esuturi sau celule vegetale. Reuita culturii depinde de o multitudine de factori i estevizibil n momentul n care explantul crete.Explantul, numit i inocul, este poriunea de plant (organ, esut, celul) care sedesprinde de pe planta donor (planta mam), i se inoculeaz n condiii sterile pe un mediuartificial de cultur. Evoluia explantului este dirijat de operator n funcie de scopul urmrit.Acesta poate evolua formnd o nou plant (sau mai multe plante - neoplantule), prinstimularea dezvoltrii organelor aeriene (tulpina i frunzele) i a rdcinii, sau poate formacalus, prin stimularea nmulirii nedifereniate a celulelor.Explantul constituie unitatea vie ce conine n celule ntreaga informaie genetic a plantei mam i pe baza totipotenei este capabil de a regenera una sau mai multe planteidentice cu planta donor.Totipotena, este nsuirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce i de aforma o plant identic cu planta mam. Teoretic fiecare celul vie este totipotent, ns n practic s-a observat c nu toate celulele au capacitatea de a-i exprima acest caracter, datorit pe de o parte diferenierii celulare i mbtrnirii, iar pe de alt parte gradului mare despecializare al acelor celule.Astfel, s-a demonstrat practic c, ntr- plant matur, celulele specializate careconstituie esuturile, de exemplu: traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la carelipsete citoplasma i nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptulc ntreaga informaie genetic a celulei totipotente se afl n cromozomii din nucleu.La plantele cormofite, odat cu naintarea n vrst, o parte din celule i
3

pierdcapacitatea de totipoten sau aceasta se reduce foarte mult. Rmn, ns, anumite zone n careactivitatea celulelor este intens, avnd loc diviziunea i formarea aproape continu de noicelule. Aceste celule sunt mici n dimensiuni, poligonale, bogate n citoplasm, au vacuolmic i nucleu mare dispus central i prezint o membran celulozic, formnd esutul cudenumirea de meristem. Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creterii n lungime i grosimea plantelor, fiind dispuse terminal att n tulpin ct i n rdcini. 1.2 Caracteristicile culturilor in vitro Spre deosebire de multiplicarea tradiional, unde se opereaz cu semine sau poriunimari de plant (marcote, butai, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, deordinul milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplati), explante care n condiiinormale de cultur nu ar reui s creasc opunnd rezisten agenilor patogeni isintetizndu-i singure substanele nutritive necesare.Din acest motiv, pentru reuita culturii de celule i esuturi se cer respectateurmtoarele condiii:-prepararea unui mediu de cretere care s asigure o bun nutriie heterotrof a explantului, prin asigurarea sursei de carbon organic uor accesibil explantelor; -asigurarea i controlarea factorilor de mediu (temperatur, lumin, umiditate) n limiteleoptime pentru fiecare specie, soi i faz de cretere, n funcie de cerinele acestora i scopulurmrit;-stimularea creterii i diferenierii sau dediferenierii organelor prin utilizareacorespunztoare a substanelor stimulatoare de cretere;asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro , prin dezinfeciamaterialului vegetal, sterilizarea mediului i a vaselor de cultur, precum i efectuarea tuturor operaiilor n hota cu flux de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare.
4

1.3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro Datorit spectrului larg de probleme la care culturile in vitroau rspuns afirmativ, suntutilizate n prezent n agricultur, silvicultur, farmacie, industria alimentar, industria uoar,etc. n agricultur, n general i n horticultur n special, culturile de esuturi i celule suntfolosite pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorareaspeciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei horticole, pentru obinerea de metaboliisecundari.Avantajele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim:-asigur multiplicarea clonal rapid a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornindde la cantiti mici de material vegetal. Teoretic, se asigur o multiplicare exponenial, princare n circa 6 luni se pot obine 1 milion de plante;-se poate produce material sditor liber de viroze i micoplasme, material mai viguros, precoce i productiv;-necesit spaii mici de cultur i se valorific bine spaiul din laborator prin cultura pevertical pe 3-5 nivele suprapuse;-obinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante de esuturigenerative (cu n cromozomi);-d posibilitatea obinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro , hibrizi caren condiii normale sunt imposibil de obinut;-selecia de plante rezistente la stres, boli i duntori;-se evit efectul sezonier de pepinier;-se pot obine semine artificiale;-se pot obine plante pe rdcini proprii evitnd astfel cheltuielile de altoire;-asigur multiplicarea clonal a portaltoilor care nu nrdcineaz n condiii normalede cultur;-asigur pstrarea materialului n faza de plantul pn la primirea unor comenziferme de multiplicare.Cu toate aceste avantaje, exist specii care nu rspund bine la cultura in vitro i care,deocamdat rmn s fie nmulite tradiional.Exist ns i cteva impedimente n utilizarea acestei metode pentru nmulirea nmas a plantelor, cum ar fi:-necesitatea unui laborator cu dotrile minime: instalaii i aparate

indispensabileactivitilor de micropropagare, care sunt costisitoare;-necesitatea unui personal specializat n multiplicarea clonal i manipularea in vitro ;-utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi i puin accesibili tuturor unitilor de producie;-nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu rspundla metodele cunoscute de multiplicare;-exist riscul apariiei i multiplicrii mutaiilor recesive, cu afectarea autenticitiisoiurilor; crete i este apoi nlturat fiind ulterior altoit pe alt portaltoi. Dup mai multe altoiri altoiulncepe s prezinte caracterele juvenile, ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butire.La culturile in vitro , s-au observat fenomene similare la meristeme. Prima frunzulice se formeaz are caractere juvenile (prima frunzuli a meristemului la vi de vie arecaracteristici similare celei dezvoltate din smn, de asemenea, i la orhidee meristemeledezvolt, n cultura in vitro , protocorm identic cu cel obinut din smn). Rejuvenilizareaobservat este deseori obinut din prima subcultur, ns uneori sunt necesare mai multesubculturi pentru a obine aceste efect, n funcie de specie.ntoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorat supresiei de informaii citoplasmaticesau datorit diminurii considerabile a acestora determinnd astfel posibilitatea regenerrii denoi celule. Mecanismele exacte ce determin aceste fenomen nu sunt nc pe deplincunoscute. Se pare c citochininele sunt implicate, cel puin parial, n acest proces, dar ele nuacioneaz singure.Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci cnd plantele donor sunt n stadiul reproductiv. Se pare c schimbrile ce apar n ritmul defuncionare al meristemelor este favorabil i determin n esuturi un echilibru optim culturii in vitro .Se pot obine culturi din esuturi prelevate de la plante aflate n stadiul de senescen,dar rezultatele sunt n general slabe sau incomplete.

2.Selecia explantelor n funcie de vrsta explantului Problemele legate de vrsta explantului apar la speciile perene n care se poatedistinge un stadiu activ i unul lent, latent, ntre care reaciile fiziologice sunt diferite. Astfel, primele experimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele lemnoase, au euat atuncicnd s-a ncercat iniierea unei culturi de esuturi din meristeme prelevate de pe ramuri nvegetaie, dar au avut succes atunci cnd s-a pornit de la meristeme prelevate din muguridorminzi.De-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimb. Primvaraorganele cresc i analizele relev prezena regulatorilor de cretere de tipul auxinelor,giberelinelor i citochininelor. Vara transportul fitohormonilor prin vasele conductoare sediminueaz, iar toamna se sintetizeaz inhibitorii creterii. De aceea, nu e surprinztor faptulc explantele, prelevate de la aceeai plant n perioade variate ale vegetaiei, vor darspunsuri diferite chiar dac vor fi plasate pe acelai tip de mediu.De aceste considerente trebuie s se in seama atunci cnd se are n vederemicropropagarea speciilor lemnoase. Unele explante au tendina de a nrdcina uor atuncicnd sunt prelevate n anumite faze de vegetaie, n special dac sunt excizate n perioada devegetaie, cnd concentraia de auxin este maxim.La speciile cunoscute deja ca recalcitrante la cultura in vitro , pentru realizarearejuvenilizrii se poate supune planta mam, pentru o perioad scurt, unui tratament cutemperaturi sczute, unui regim de lumin particular sau unui tratament cu fitohormoni pentrumodificarea echilibrului lor intern n vederea stimulrii rizogenezei. 2.1.Selecia explantelor n funcie de amplasarea plantei donor Dup determinarea stadiului i perioadei optime explantele pot fi prelevate. Dup tipulde organizare a fragmentului ce urmeaz a fi cultivat in vitro se pot lua n considerare doucazuri:
7

Explantele ce au o structur rudimentar sau organizat, cum e cazul mugurilor,apexurilor caulinare, meristemelor i apexurilor florale, sunt cele mai utilizate pentru iniiereaunei culturi de esuturi, deoarece acestea sunt receptive i ridic cele mai puine probleme,genernd cu uurin, n condiiile unui mediu de cultur adecvat, structuri organizate (deexemplu, organe). Dac mediul de cultur nu este potrivit poate tulbura funciile explantuluii conduce la dediferenierea celulelor, genernd calus.Utilizarea acestui tip de explante este similar unei microbutiri i este tehnica celmai des folosit atunci cnd se urmrete micropropagarea pe scar larg a unei specii.Interesant de amintit este faptul c explantele posed un fel de memorie a tipului decretere ce l-au prezentat in vivo , acest fenomen fiind n special ntlnit la speciile lemnoase.La mai multe plante la care corelaiile de cretere sunt puternice, explantele provenite dinramuri laterale au generat plante cu rdcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor planteculcate la pmnt i nu erecte. Unele cercetri au evideniat faptul c aceast memorieaparine celui mai apropiat internod de lng meristem.2.Explantele constituite din diferite tipuri de esuturi, cum ar fi fragmente de tulpin,frunze, flori i fructe, crora, inoculate pe mediu de cultur, li se induce o reversie completcu scopul de a restaura capacitatea celulelor de a se divide i de a-i ctiga din noucapacitatea organogenic.Pentru aceste explante, n funcie de specie, s-a dovedit c toate prile plantei suntcapabile s urmeze procesul dediferenierii conducnd spre o nou organizare structural. Dar,n acest caz, diferenele ntre specii sunt uriae. Unele specii, cum ar fi violetele de Parma,sunt capabile s regenereze din toate prile plantei (peiol, limb, rdcini, petale, stamine, polen, ovule), alte specii sunt mai recalcitrante, cum ar fi Actinidia sinensis , la care rezultatenotabile au fost obinute doar din fragmente de tulpin. Unele specii sunt total recalcitrante,nereuindu-se iniierea culturii de esuturi din explantele amintite, iar la unele conifere s-areuit obinerea de propaguli doar din
8

cotiledoane.n general, cele mai bune rezultate au fost obinute, la cele mai multe specii, dinfragmente de limb foliar i tulpini tinere. 2.2 Selecia explantelor n funcie de mrimea i natura acestora Mrimea explantului ce urmeaz a fi cultivat prezint cea mai mare importan. Cu ctexplantul este mai mare cu att echilibrul endogenic al acestuia este mai determinant imediul de cultur va avea o influen limitat. n cazul explantelor de dimensiuni micidirecionarea acestuia n sensul dorit se face mai uor, deoarece explantul este receptiv lasubstanele din mediul de cultur, i anume la regulatorii de cretere existeni.Explantele organizate cuprind n general un nod, un apex sau un mugure (solzii protectori sunt nlturai), fiind o unitate suficient de complet pentru care mediul va favorizacreterea, sau n cazul diferenierii axilare, va bloca creterea apical. Pentru meristemele cetrebuie s aib dimensiuni foarte mici, exist o mrime minim ce conine domulmeristematic cu dou primordii foliare. Sub aceast mrime supravieuirea explantului estefoarte dificil i pierderile sunt mari, peste aceast dimensiune, rspunsul la cultura in vitro este mult mai bun , ns n detrimentul eliminrii virusurilor.Dimensiunile explantelor variaz ntre 5 i 10 mm, ceea ce corespunde uneimanipulri uoare a materialului vegetal, sub aspectul excizrii sau prelevrii, fasonrii iinoculrii acestora. De exemplu, prin cultivarea pe acelai mediu de cultur, a mai multefragmente de peiol de Saintpaulia , de 1,5; 3; 5 i 7 mm, s-a observat c doar fragmentele de peste 3 mm au generat plantule normale. Fragmentele de 1,5 mm au generat dou tipuri derezultate: unele explante s-au vetejit, iar altele au format doar rdcini. Fr ndoial, n ultimul caz, auxinele prezente n mediu au jucat cel mai important rol, pe cnd n cazulfragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat n joc i fitohormonii endogeni.Se pot fasona explante din diferite tipuri de esuturi: epidermal, cortical, parenchimmedular, dar i rspunsurile vor varia. Cel mai
9

regenerativ tip de esut este cel epidermal.esuturile corticale i cambiale prezint de asemenea rezultate bune, dar rmn deseori nstadiul de calus. Parenchimul medular este esutul cel mai puin regenerant, aceste esuturi cer o armonizare perfect ntre regulatorii de cretere, un exemplu fiind dat de Skoog, care afolosit mduv de tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre auxine i citochinine.Din esuturi epidermale de cteva straturi grosime a fost posibil orientarea regenerriispre stadiul caulogenic (lstari), rizogenic (rdcini), calusogenic sau reproductiv. Acestexperiment confirm ipoteza unei activiti crescute a fitohormonilor asupra explantelor dedimensiuni reduse.Cel mai mic explant este constituit dintr-o singur celul, cum e cazul protoplatilor izolai mecanic sau enzimatic. Protoplatii sunt capabili de a se divide i a reproduce plante,dar nun sunt capabili de inducerea meristemelor florale. 2.3 RSPUNSUL EXPLANTELOR N CULTUR Prima problem ce trebuie rezolvat, atunci cnd se iniiaz o cultur in vitro estemeninerea viabilitii (pe lng problema asepsiei) explantului. Deseori se poate observa,dup fasonarea explantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor ce vin n contact directcu mediul de cultur, fenomen datorat oxidrii substanelor fenolice sintetizate n mediu,oxidare ce are efect toxic asupra celulelor vegetale. Mai mult, celulele moarte pot diminua sauanula schimburile dintre explant i mediul de cultur. Nu toate speciile prezint fenomenul de brunificare a explantelor, deoarece la aceste specii problema este parial rezolvat prin imersiaexplantelor ntr-o soluie antioxidant (soluie de acid ascorbic cu acid citric n proporie de0,5 % respectiv 0,05%), imediat dup fasonarea acestuia sau prin adiia n mediul de cultur aunor substane adsorbante sau detoxificante, cum ar fi crbunele activ (1 pn la 4 g/l) sau polivinilpirolidon (5 pn la 10g/l).Odat

10

rezolvat aceast problem este necesar orientarea explantului, n funcie denatura sa, n direcia dorit de operator. 2.4. Explante cu structur rudimentar Explantele din aceast categorie pot fi cultivate prin dou metode.Prima metod const n inducerea creterii apicale prin adiia n mediul de cultur afitohormonilor din clasa auxinelor i/sau a giberelinelor, foarte rar se pot aduga icitochinine, ntotdeauna ntr-o doz foarte mic.Dup iniierea pe acest tip de mediu se observ apariia unor formaiuni calusare la baza explantelor. Este de dorit ca aceste explante s rmn de dimensiuni mici, deoarecedac acest calus crete n dimensiune, ceea ce deseori se ntmpl, indic existena unuidezechilibru ntre substanele minerale sau fitohormonii din mediul de cultur. Dup formareacalusului, ce are rol protector (asemeni calusului format la o ran) se formeaz primafrunzuli, apoi prima rozet de frunze i mai trziu are loc elongarea tulpinii (axului principal). Aceste etape morfogenice pot avea loc pe acelai tip de mediu la unele speciiornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe dou medii succesive, la speciile lemnoase. Primulmediu va iniia creterea, putnd fi utilizat ulterior i pentru propagarea fragmentelor cu unnod (microbutire). Al doilea mediu, mbogit cu auxine (cel mai frecvent, acidul indolilacetic), servete ca mediu de nrdcinare ( Actinidia , mr, numeroase specii lemnoase). Cultura plantelor superioare in vitro Posibilitatea de a cultiva celule izolate i, mai ales, de a realiza culturi de protoplati, permite unele manipulri genetice (fuziuni celulare, transfer de gene), imposibil de realizat n alte condiii. Practicarea culturii in vitro presupune existena unui spaiu amenajat i echipat n acest scop, a unor vase din sticl sau material plastic, a mediilor de
11

cultur adecvate i, desigur, a materialului biologic, sub form de celule, esuturi, organe sau plante. Asepsia (absena microorganismelor) este o condiie sine qua non a reuitei fiecrei culturi in vitro. Deoarece mediile nutritive folosite cu aceast ocazie le ofer condiii foarte bune de dezvoltare, bacteriile i ciupercile invadeaz culturile in vitro ntr-un timp foarte scurt dac nu se asigur asepsia spaiilor de transfer, vaselor de cultur, mediului, instrumentelor i materialului biologic adecvat. Dup J. Huang (1982), sursele de infecie pot fi:
-

aerul, care conine o mare cantitate de microorganisme sub form de spori; esutul vegetal, la suprafaa cruia se pot gsi ciuperci i/sau bacterii; corpul uman, care vehiculeaz pe piele sau prin aerul expirat numeroase

microorganisme. Sterilizarea se poate realiza prin dou tipuri de metode:

-

fizice, folosind vapori de ap sub presiune (121C), aer uscat fierbinte

(180C) ori iradierea (raze ultraviolete sau gamma) - metode care distrug microorganismele - sau efectund filtrarea sub presiune, care elimin microorganismele al cror diametru depete 0,22 microni;
-

chimice, care constau n tratamente cu compui sterilizani, cum sunt

hipocloritul de sodiu sau calciu, alcoolul, clorura mercuric, diversele produse bactericide i fungicide. Pentru funcionarea eficient a unui laborator de culturi in vitro, este nevoie de spaii repartizate, amenajate i echipate corespunztor pentru executarea urmtoarelor activiti:
12

prepararea pregtirea,

mediilor de cultur; prin splare i sterilizare, a sticlriei necesare pen tru prepararea

mediilor i realizarea culturilor;

depozitarea sticlriei, substanelor

chimice, mediilor nutritive,

etc.;
iniierea

i transferul culturilor; culturilor, n condiii de temperatur controlat (17- 27C) i

incubarea

fotoperioad. Dotarea minim a unui asemenea laborator include:

-

lupe binoculare; microscoape inversate; balane de precizie (0,01 g) i analitice (0,0001 g); pH-metru; autoclave; maini de splat sticlria; etuve pentru sterilizat sticlria; dulapuri climatizate; mese cu flux de aer laminar, orizontal sau vertical; frigidere, congelatoare; aparate pentru distilat i demineralizat apa.
13

Cultura in vitro poate fi practicat n vase de sticl sau din material plastic de forme i mrimi diferite. Vasele din sticl utilizabile att pentru prepararea mediilor ct i pentru cultur sunt cele existente n cele mai multe laboratoare: baloane Erlenmayer, pahare Berzelius, pipete, cilindrii gradai, baloane cotate, vase Petri. Vasele de cultur din sticl nu trebuie s elibereze cationi toxici. Din aceast cauz, se recomand folosirea celor confecionate din sticl Pyrex sau borosilicat (Badea, E 2001).

Figura 12. Vase de cultur i sticlrie de laborator

Dei scumpe, vasele de cultur din material plastic au nceput s nlocuiasc vasele de sticl, deoarece prezint numeroase avantaje. Calitatea materialului face posibil att confecionarea unor recipiente foarte variate ca form i dimensiuni, absolut adaptate cerinelor, ct i sterilizarea acestora la 121C. n laboratoarele comerciale, se recurge ns i la borcane din sticl obinuit, folosite n mod curent pentru ambalarea alimentelor. Pregtirea sticlriei ocup un loc important n activitatea unui la borator de cultur in vitro. Din aceast cauz, spaiul destinat splrii i sterilizrii trebuie echipat corespunztor, cu surse de ap deionozat, distilat i bidistilat, ca i cu diferite tipuri de etuve. Sticlria uscat se sterilizeaz prin expunerea la aer
14

fierbinte (180C), timp de 2-3 ore, n etuve. O serie de alte materiale (filtre, ap distilat, capace din material plastic, dopuri din bumbac sau tifon) se sterilizeaz prin autoclavare (cu vapori de ap sub presiune), timp de 15 -20 de minute, la 121C (Badea, E., 2001).2.4.1. Medii de cultur in vitro Un mediu de cultur in vitro are o component anorganic, constituit din sruri minerale i o component organic, ce include carbo- hidrai, vitamine i substane reglatoare ala creterii. Mediile folosite pentru culturi statice conin i un agent gelifiant, care de obicei, este agarul. Apa folosit pentru prepararea mediilor trebuie s fie purificat, deionizat, distilat, filtrat. Diferii cercettori au studiat cerinele de elemente minerale ale esuturilor cultivate i au elaborat medii cu compoziii bine definite care le poart numele: White, Murashige i Skoog, Gamborg, Schenck i Hildenbrandt, Nitsch, etc. Componenta anorganic a mediilor de cultur in vitro include elementele eseniale pentru creterea plantelor, la care se adaug uneori, aluminiul i nichelul. n funcie de cantitile care se gsesc n diferitele formule de mediu, acestea se mpart n:
-

macroelemente (N, P, K, S, Mg, Ca) microelemente (B, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo, Al, I, Fe).

Toate elementele sunt incluse n mediu sub form de sruri, alese ndeosebi dup criteriul solubilitii. Componenta organic. Celulele i esuturile cultivate in vitro nu sunt autotrofe, adic nu sunt capabile s sintetizeze carbohidrai prin asimilarea CO 2 n timpul fotosintezei. Din aceast cauz, n mediile n care sunt cultivate trebuie
15

introdus zaharoz, ntr-o concentraie de 2- 3%. In culturile de celule sau de esuturi in vitro, absena sau insuficiena unor vitamine constituie tot atia factori limitativi ai creterii, drept pentru care n mediile de cultur se adaug n mod curent tiamin (B1) - 0,1-10,0 mg/l, acid nicotinic (PP) - 0,1-5,0 mg/l, piridoxin (B6) - 0,1-1,0 mg/l. Se mai utilizeaz biotina (H), cholina, acidul folie (M), acidul pantotenic, riboflavina (B2) i, frecvent, m-inositolul. Dintre cele cinci clase de reglatori de cretere (fitohormoni sau hormoni vegetali) existeni n plante, numai dou - auxinele i citochininele - se folosesc n mod frecvent. Mult mai rar se recurge la gibereline i extrem de rar la acidul abscisic (Schrott, M., 1995). Fitohormonii orienteaz procesele de dezvoltare in vitro. De exemplu, tipul de morfogenez dintr-o cultur depinde de concentraiile auxinelor i citochininelor i de raportul dintre aceste categorii de hormoni. Mai precis, o valoare mare a raportului auxin/citochinin favorizeaz rizogeneza, embriogeneza i calusogeneza, iar o valoare mic - proliferarea mugurilor axilari i organogeneza, direct sau indirect. Au fost semnalate ns i cazuri n care rspunsurile culturilor in vitro la apprtul de fitohormoni n mediu nu au fost cele ateptate. De exemplu, s-a constatat c, la unele specii lstrirea axilar este favorizat de prezena auxinei n cantiti ce depesc nivelul citochininei, formarea cluului fiind indus numai de auxine (Gegenbach, B., 1975). Auxinele - AIA, AIB (acidul indolil butiric), ANA (acidul naftil acetic) sau 2,4-D (acidul 2,4 diclorofenoxiacetic) - sunt folosite n concentraii de 0,01-10,0 mg/l. Citochininele - kinetina, BAP (benzii aminopurina), 2IP (2 izopentenil adenina) i zeatina - sunt adiionate n mediu n cantiti ce oscileaz ntre 1 i 10 mg/l. Giberelinele nu sunt eseniale pentru cultura plantelor in vitro. In general, ele induc alungirea intemodurilor i creterea meristemelor. De asemenea, se folosesc frecvent pentru germinarea embrionilor, deoarece induc ieirea din laten.
16

Tabelul 4 Compoziia celor mai importante medii folosite pentru cultura in vitro Compoziia MS Nitsch (1972) 950 720 220 185 150 68 27,8 37,3 25 10 10 0,25 0,025 100 0,5 0,5 5 0,05 0,5 2 20000 Bs Gamborg 2500 (1976) 134 150 250 27,8 37,3 13,2 3 2 0,75 0,25 0,025 0,025 100 100 10 10 30000 Schenk i Hildebran dt (1972) 2500 200 300 400 15 20 13,2 5 1 1 0,1 0,2 0,1 100 5 0,5 5 30000

mediului (Murashige Sruri minerale KNO3 i 1900 Skoog, NH4NO3 1650 (NH4)?S04.H 1962) CaCI?.2H70 440 0 ? 2PO4 NH4H MgS04.H20 370 NaH2P04.H2 kh,po4 170 FeS04 .7H20 27,8 0 Na2EDTA 37,3 MnS04.4H?0 22,3 H3BO3 6,2 ZnS04.7H20 8,6 Kl 0,83 Na?Mo04.2 0,25 CUS04.5H20 0,025 CaCI 0,025 H22.6H 0 20 Vitamine m-lnositol 100 0,1 Thiamina Piridoxina 0,5 Acid 0,5 HCI Biotina HCI Acid folie nicotinic Glicina 2 Zaharoz 30000

De obicei, tipul de cultur i implicit de explant, determin tipurile i concentraiile hormonilor ce vor fi folosii. De exemplu, explantele care sintetizeaz auxina nu mai necesit adiionarea n mediu a acestui hormon pentru alungirea i/sau diviziunea celulelor (Wess, L., 2000). Din acest punct de vedere, pot exista urmtoarele tipuri de culturi:
17

culturi care nu culturi care au culturi care au

necesit nici un hormon; nevoie numai de auxine; nevoie numai de citochinine;

culturi care au nevoie att de auxine, ct i de citochinine.

Celulele cultivate sunt capabile s sintetizeze toi aminoacizii necesari. Totui, includerea unor aminoacizi n mediul de cultur, separat sau n amestecuri, poate favoriza creterea, deoarece constituie o surs de azot mai accesibil celulelor dect aportul de azot anorganic. Creterea in vitro poate fi stimulat i prin adugarea n mediul de cultur a unor extracte organice, hidrolizate proteice, endosperm lichid din nuci de cocos, extracte de drojdii, de cartof i tomate, etc. Marea lor variabi- litate, de la o surs la alta, limiteaz ns folosirea acestor extracte la cazurile n care nu au fost obinute rezultate pozitive cu medii definite chimic. Agarul - un polizaharid extras din algele genului Gelidium - este cel mai folosit agent de gelificare a mediilor de cultur, deoarece se dizolv n ap la 90C, iar prin rcire sub 40C formeaz un gel transparent, mai mult sau mai puin solid, n funcie de concentraie, puritate, marc i pH. Soluia de agar poate fi turnat, pipetat, dar odat gelifi- cat, trebuie renclzit (la microunde sau n bain-marie), pentru a se li- chefia din nou. Concentraia agarului n mediile de cultur in vitro este de 5-10 g/l. Prepararea mediului de cultur necesit sticlrie curat, ap de calitate corespunztoare, substane chimice pure i o atent dozare a tuturor componentelor. Este o etap esenial, erorile de preparare a mediului de cultur fiind printre cauzele majore ale eecurilor.
18

Mediile de cultur se pot prepara astfel:

-

din amestecuri de sruri, sub form de pudr, preambalate (productori:

K.C. Biological Inc. i Gibco Inc. din S.U.A., Flow Laboratory, din Scoia);
-

din soluii stoc, de zece sau de o sut de ori mai concentrate (n funcie de

solubilitatea substanei i de concentraia final n mediul de cultur), pstrate n frigider, la 4-5C;

-

cntrind, una cte una i dizolvnd srurile prevzute n reeta tipului de

mediu dorit. nainte de .sterilizare, dup adugarea zaharozei i a hormonilor termostabili, se ajusteaz valoarea pH la cote cuprinse ntre 5,0 i 6,5. Sterilizarea componentelor termostabile se face prin autoclavare, iar cea a componentelor termolabile, prin filtrare sub presiune pozitiv. Mediile i apa distilat pot fi autoclavate la 121C i un timp variabil n funcie de volum: 20 de minute pentru volume de 20-50 ml, 25 de minute n cazul volumelor de 250-500 ml i 35 de minute pentru volume de 500-5000 ml. Presiunea nu trebuie s depeasc 1 atmosfer, pentru a nu favoriza descompunerea zaharozei sau a altor componente. Prin filtrare, se sterilizeaz vitaminele, aminoacizii, extractele vegetale, enzimele, unii hormoni (AIA, GA3), antibioticele. Se pot utiliza filtre de unic folosin, ataate la o sering ce conine lichidul. Pentru volume mai mari, se pot folosi fi ltre la care se adaug membrane filtrante standard existente pe pia. n asemenea cazuri, filtrul se ataeaz la un vas colector. Unitatea filtrant se sterilizeaz prin autoclavare. Soluia sterilizat se adaug n mediul de cultur care a fost autoclavat i rcit (la 45-50C), cu o pipet steril. Volumul de lichid trebuie s conin cantitile prevzute de reeta pentru soluia final.

19

Tabelul 5 Tratamente aplicate pentru sterilizare Orga Semin nane e Fruct r e, Tulpi flori na Pretratamente Tratamente imersia n alcool (70%) Imersia n timp de 10-20 de Splarea cu vat secunde mbibat n alcool Splarea cu ap (70%) soluie de Imersia n Ca(CIO) 2 soluie de de (10%), timp Imersia n NaClO 20-30(2%), de Posttratame Trei splri nte cu ap
m ti m distilat

steril m jj w"

curent; tergerea cu timp soluie dede de 10 minute Organe vat Splarea Imersia n mbibattimp n alcool NaClO (2%), minute de rendelungat cu ap (70%) tergerea fetei curent superioare cu alcool (70%)

Frunz zerv e

soluie de de timp de 5-30 Imersia n ase splri NaClO (2%), minute soluie de timp de 20-30 cu ap

HgCfe (0,1%), distilat de minute Pregtirea materialului vegetal presupune eliminarea timp de 1 bacteriilor, steril ciupercilor i altor microorganisme, toate acestea necesitnd minut o sterilizare de suprafa complet, fr a afecta ns integritatea materialului vegetal. n general, materialul vegetal provenit din cmp este extrem de greu de sterilizat. Din aceast cauz, se recurge frecvent la obinerea lui n laborator, asigurndu-se un mediu aseptic nc din faza de germinare. Un protocol standard de sterilizare include urmtoarele etape:
- splarea - imersia

cu ap curent;

ntr-o soluie sterilizant (hipoclorit de sodiu sau de calciu); cu ap distilat steril.

- splarea

De obicei, contaminrile devin vizibile dup 7 -10 zile. Exist ns

20

contaminani interni care nu se manifest timp de mai multe subcultivri. Timpul de sterilizare i concentraia soluiei sterilizante se aleg pentru fi ecare material experimental n parte. Sterilizarea materialului vegetal se face n hote cu flux laminar. Tot aici, se repartizeaz i mediul n spaiile de cultur (dac nu a fost repartizat nainte de sterilizare). Iniierea unei culturi in vitro presupune: confecionarea explantelor din material vegetal sterilizat, folosind instrumente sterile; trecerea explantelor n vasele de cultur prin inocularea la suprafaa mediului i transferarea n dulapurile sau camerele climatizate. La intervale regulate de timp se fac subcultivri, adic se transfer cluurile, lstarii, embrionii, etc. pe medii proaspete (Badea, E., 2001).

21

Tabelul 6 Tipuri de culturi in vitro ___________ Tipul de cultur Scopul Cultura de embrioni Scurtarea ciclului de ameliorare Prevenirea avortrii embrionilor Cultura de meristeme Cultura de apexuri fr muguri Cultura de preformai calus/celule n Depirea incompatibilitii Eliminarea patogenilor (virusuri, postzigotice Producerea haploizilor bacterii, ciuperci) Clonarea plantelor Lstrirea axilar pentru obinerea donare Surs de explante pentru Conservarea germoplasmei Stocarea adventive Izolarea mutantelor Clonarea planielor prin formarea Obinerea poliploizilor mugurilor sau embrionilor

Cultura Clonarea prin formarea organelor i noduriexplantelor Crioprezervarea cluurilor plantelor libere de virusuri

suspensie variantelor Cultura de antere i Obinerea Producerea haploizilorsomaclonale i liniilor mi- crospori Cultura de ovule i flori excizate Cultura de protoplati Cultura de protoplati, celule, esuturi i organe Selecia mutantelor Producerea homozigotice Producerea plantelor Depirea incompatibilitii pre i metaboliilor supermasculesecundari Selecia mutantelor postzigotice Prevenirea absciziei Hibridarea somatic i crearea florilor Realizarea fecundrii in vitro cibrizilor Transferul de gene i crearea Studii de frtopatologie: ptrunderea i variabilitii somaclonale replicarea virusurilor; interaciunea gazd-parazit, etc. Studii de fiziologie: studierea ciclului celular; studierea metabolismului; n funcie de gradul de organizare, culturile in vitro pot fi: efectele stresului abiotic, etc. - organizate (plante ntregi, embrioni, organe), realizate mai ales i n scopul Experimente de biologie molecular micropropagrii;
-

inginerie genetic: izolarea genelor;

neorganizate (cluuri,studierea suspensii), funcionrii realizate mai promotorilor; ales pentru selecia transferul genelor, etc.
22

mutantelor, izolarea protoplatilor, etc.;

-

neorganizate/organizate, care permit parcurgerea etapelor:

explant -> calus/suspensie embrioni/muguri -> plante.

Cu alte cuvinte, acest tip de culturi fac posibile dediferenierea i rediferenierea. Tipurile de culturi in vitro mai pot fi clasificate i n funcie de natura materialului vegetal n:
-

culturi de plante (obinute prin germinarea seminelor, embrionilor sau prin

nrdcinarea lstarilor);
-

culturi de embrioni; culturi de organe (apexuri, rdcini, antere, etc.); culturi de explante (poriuni de organe, esuturi, etc.); culturi de calus (n care esuturile difereniate dedifereniaz i produc o

mas de celule numit calus);

-

culturi de celule n suspensie (cluuri sau explante de diferite origini,

cultivate n mediu lichid, agitat, care genereaz o mas de celule izolate i de agregate celulare mici);
-

culturi de protoplati (celule lipsite de peretele celular).

2.5. Regenerarea plantelor din celule cultivate in vitro Celulele plantelor posed dou caracteristici pe care se bazeaz
23

biotehnologiile, cu toate aplicaiile lor:

-

pot fi cultivate in vitro, pe medii sintetice; pot regenera organisme complete, capabile s se reproduc. Aceast a doua

caracteristic, numit totipoten, este proprie numai plantelor superioare, ceea ce demonstreaz c programul de difereniere este flexibil, orice celul difereniat putnd deveni, n anumite condiii, totipotent. Cultura in vitro este un ansamblu de tehnici care presupune folosirea unor elemente de asepsie i realizarea unui mediu perfect controlat. Pe un mediu nutritiv sintetic, se pot cultiva plante ntregi, organe, fragmente de organe, esuturi i bineneles, celule izolate i protoplati. Materialul vegetal folosit p entru iniierea culturilor in vitro poart numele de explant. Atunci cnd se realizeaz culturi de fragmente de organe sau culturi de celule pe medii adecvate, n condiii controlate de lumin, temperatur i umiditate, prin aciunea componentei hormonale a mediului se induce dediferenierea celulelor difereniate, care ncep apoi s se divid. Organul i pierde treptat structura, n decursul a 3-4 sptmni.

24

Bibliografie
1. www.referat.ro 2. www.agbioview.org 3. www.bioresurse.ro 4. Bonciu Elena, Iancu Paula 2011 - Noiuni de bioinginerie i biotehnologii. Strategii i aplicaii, Editura Sitech 5. Popa,L. 1988 Ingineria Genetic Editura. tiinific i enciclopedic, Bucureti

25