Veleuilite u Poegi Poljoprivredni odjel Smjer: Vinogradarstvo Vinarstvo Voarstvo

ZAVRNI RAD Tema: Virusi i viroze vinove loze

Predmet: Fitopatologija

Student: Maja Far Broj indeksa: 249/02

Mentor: mr.sc. Brankica Svitlica

U Poegi, svibanj, 2009. godine

SADRAJ Uvod....3 1.VIRUSI.............................................4 1.1. Povijest virologije........5 1.2. Osnovne karakteristike virusa ......6 1.3. Graa virusa.....7 1.3.1. Oblik virusnih estica....8 1.3.2. Veliina virusnih estica................................8 1.4. Viroidi i satelitni virusi.....9 2. NAINI NA KOJE SE PRENOSE VIRUSI....10 2.1 Mehaniki prijenos virusa .......11 2.2. Prijenos virusa vegetativnim razmnoavanjem virusa11 2.3. Prijenos virusa insektima..............................11 2.3.1. Odnos virus vektor ima nekoliko sluajeva..12 2.3.2. Lisne ui....12 2.3.3. Prijenos virusa kornjaima..................................14 2.3.4. Prijenos virusa nematodama..............................14 2.4. Prijenos virusa gljivicama.15 2.5 Prijenos virusa sjemenom....16 2.6. Prijenos virusa polenom...16 2.5. Prijenos virusa Vilinom kosicom (cuscuta spp.)...16 3. OSNOVNI SIMPTOMI VIRUSNIH INFEKCIJA.........17 3.1. Lokalni simptomi.......17 3.2. Sistemini simptomi......18 3.2.1. Sistemini simptomi nastali zbog promjena u boji..18 3.2.2. Sistemini simptomi nastali zbog histopatolokih promjena.....19 3.2.3. Sistemini simptomi nastali zbog patomorfolokih promjena..21 4. LABORATORIJSKA TESTIRANJA BOLESTI VINOVE LOZE.23 4.1. Dijgnostika na terenu....23 4.2. Seroloka testiranja ELISA......24 4.3. Molekularna testiranja PCR.....26 4.4. Bioloko indeksiranje....27 4.5. Pouzdanost laboratorijskih testiranja.....27 4.6. Selekcija i rukovanje uzorcima....28 4.6.1. Upute za uzimanje uzoraka i testiranje na bolesti..29 5.VIROZE VINOVE LOZE.........30 5.1. Klasifikacija virusa.31 5.2. Taksonomija virusa na vinovoj lozi (prema Walter et Martelli, 1966.)......32 5.3. Virusi infektivne degeneracije.....34 5.3.1. Sindrom deformacije lia lepeza lista........35 5.3.2. Sindrom ukasto smeeg mozaika vinove loze........36 5.3.3. Virus mozaika guarke ......36 5.4. Virus uvijenosti lista......37 5.5. razni tipovi naboranosti drveta vinove loze...38 5.6. Manje vani virusi i njima sline parazitske bolesti.........40 5.6.1. Priraslice (enacije) na listovima (grapevine enation) ..........................40 5.6.2. Nekroza ilica lista (vein necrosis)....40 4

5.6.3. Mozaik uz glavne ile lista (grapevine vein mosaic disease) .............41 5.6.4. arena pjegavost lista (grapevine fleck disease) ..41 5.7. Viroidne bolesti vinove loze.....42 5.7.1. uta pjegavost (vein speckle) ..........42 5.8. Fitoplazme - infektivne utice vinove loze .......42 6. OSNOVNE MJERE SUZBIJANJA VIRUSNIH ZARAZA....45 6.1. Uklanjanje i izbjegavanje izvora zaraze .......45 6.2. Suzbijanje vektora .......46 6.3. Spreavanje virusnih infekcija kultiviranjem otpornih biljaka ....46 6.3.1. Certifikacija...... 47 6.4. Glavni termini koji se danas upotrebljavaju u oznaavanju otpornosti biljaka .....48 Zakljuak ........49 Literatura ....50

Uvod Virusi uzrokuju bolesti u ovjeka, ivotinja i u biljaka. Bitno se razlikuju od svih parazitskih bolesti. Zahvaljujui molekularnoj biologiji otkrivene su mnoge bitne osobine virusa, ali jo su uvijek velika nepoznanica. Virusi uzrokuju mnogo vanih biljnih bolesti, koji uzrokuju ogromne gubitke u prinosima, proizvodnji i kvaliteti u svim dijelovima svijeta. Do danas je opisano vie od 700 biljnih virusa, od toga 60 - ak na vinovoj lozi. Za razliku od gljivinih oboljenja koje se uspjeno suzbijaju, okoti zaraeni virusima ne mogu se izlijeiti. Jednom zaraena biljka zaraena je cijeli ivotni vijek, time daje slabiji ili nikakav urod. Viruse nije lako otkriti u biljkama. Simptomi mogu biti vie ili manje izraeni, a neki se ak mogu zamijeniti drugim bolestima. Uzrokuju razne promjene : deformacija biljnih dijelova, arenilo listova, krljanje biljaka te druge promjene. Mnogi bakterijski virusi mogu posve razoriti bakterijsku stanicu u kojoj paratiziraju, a na mnogim bakterijskim osobinama se temelje biotehnoloki procesi. Biljne viroze u modernom poljodjelstvu vrlo brzo mogu poprimiti epidemijske razmjere, i sve su prisutniji ograniavajui imbenici u biljnoj proizvodnji. Zbog toga je kod podizanja novih nasada bitno, da je sadni materijal sanitarno zdrav. Kod vegetativno razmnoavanih nasada, kao vinove loze provode se preventivno mjere; proizvodi se cijepljeni sadni materijal sa zdravstvenim statusom, koji je kompatibilan sa ekonomskom isplativou. Zbog nekontrolirane domae i internacionalne trgovine (posebno poslije 2. svjetskog rata), sanitarno nekontrolirani sadni materijal je uzrokovao distribuciju infektivnih bolesti i njihovih agenasa, virusa, viroida i intracelularnih prokariota po cijelom svijetu. Karantenske mjere nisu dovoljne da zaustave irenje, no moderna tehnologija je razvila uinkovite alate, za proizvodnju sanitarno poboljanog sadnog materijala, otkrivanjem infektivnog agensa i uspostavljanjem uinkovite certifikacijske sheme.

1. VIRUSI
Naziv virus dolazi od latinske rijei virus to znai otrov. Bolesti uzrokovane virusima zovemo viroze, a znanost o virusima naziva se virologija. Virusi su najmanji i najjednostavniji mikroorganizmi koji nemaju staninu grau. Nalaze se na najniem stupnju organizacije ivih sustava. Metaboliki su neaktivni i na granici su ive i neive prirode . Virusi uzrokuju mnogo bolesti koji su od internacionalne vanosti. Uzrokuju bolesti u ovjeka, ivotinja i u biljaka, a napadaju i bakterije i druge mikroorganizme. Meu ljudskim i ivotinjskim virusima su osobito poznate: boginje, djeja paraliza, gripa, hepatitis, prehlada, bjesnoa, slinavka, ap, uta groznica, HIV-AIDS, SARS te mnoge druge bolesti. Definicija virusa prema Fraenkel Conrat 1988. godina (1.): Virusi su zarazni uzronici (estice) koji sadre samo jedan tip nukleinske kiseline: DNA ili RNA; njihova je nukleinska kiselina umotana u proteinski omota izgraen od jednog ili nekoliko proteina; kod nekih virusa oko proteinskog omotaa dolazi sloeno graena ovojnica izgraena od proteina, lipida i ugljikohidrata; virusi su sposobni svoju nukleinsku kiselinu prenositi od jednog do drugog domaina; sposobni su, dalje, nametnuti stanici domaina svoju genetiku informaciju, zbog ega se mogu koristiti enzimatskim ustrojem domaina za svoje razmnoavanje; neki virusi mogu svoju nukleinsku kiselinu ugraditi na vie ili manje reverzibilan nain u DNA domaina te tako postati latentni ili perzistentni: neki su od takvih virusa sposobni transformirati genom stanice domaina i ometati njezin kontrolni mehanizam rasta, te uzrokovati tumore.

1.1. Povijest virologije 1886. je Adolf Mayer opisao mozaik duhana i uspio sokom zaraenih biljaka reproducirati simptome. 1892. ruski mikrobiolog Dimitrije Josifovi Ivanovski je prouavajui mozainu bolest duhana, utvrdio da se radi o esticama manjim od bakterija, i njemu se pripisuju zasluge da je otkrio viruse. 1898. mikrobiolog Martinus Williem Beijerinck je izvodei identine pokuse, utvrdio da se radi o novom tipu infektivnog uzronika. 1935. W. M. Stanley uspijeva izolirati virus (TMV) u istom stanju. 1937. Bawden i Pirie otkrivaju da u grai virusa mozaika duhana (TMV), osim proteina, ima i nukleinska kiselina. 1939. promatrana je virusna estica Kausche, Pfankuch i Ruska. Nakon toga slijedi dvadesetogodinje razdoblje brojnih drugih otkria koji su se ticala fizike grae biljnih virusa. Iako su virusi otkriveni krajem 19. stoljea oni su se u prirodi javili mnogo ranije. Iz brojnih opisa bolesti koje su harale davnim civilizacijama moe se zakljuiti da su neke od njih bile virusne prirode. Primjerice prema sauvanim opisima i crteima bolesnih ljudi, vidi se da je ve u 10. stoljeu prije Krista u kini postojala virusna bolest koja bi opisom odgovarala velikim boginjama. Na crteima starih Egipana vidi se da su ljudi u to doba bolovali od djeje paralize. I Aristotel ( 4. st . pr. Krista ) spominje bjesnou pasa. Postoje opisi biljnih bolesti iz 8. stoljea za koje se utvrdilo da su virusnog podrijetla. U 16. stoljeu u Nizozemskoj su na cijeni bili tulipani koji su na laticama imali bijele ili ukaste pruge (virus arenila cvijeta tulipana). Gotovo stotinu godina prije Ivanovskijevog otkria engleski lijenik Jenner zapazio je da ene koje muzu krave esto obolijevaju od blagog oblika boginja, koje su sa kravljeg vimena prele na ruke ena. Ta bolest nije imala tetne posljedice za ene ali je Jenner zapazio da su te ene bile kasnije zatiene od velikih boginja koje su pogubne za ovjeka. Dakle muzaice su bile na neki nain cijepljene ili vakcinirane (lat. Vacca = krava) blagim kravljim boginjama koje su uzrokovale imunost (otpornost) organizma na prave, velike boginje. 1798. godine nainjeno je cjepivo (TMV) pod elektronskim mikroskopom,

protiv velikih boginja. Isto tako je L.Pasteur (1885.) nainio cjepivo protiv bjesnoe, a i ne znajui da bolest uzrokuje virus. 1.2. osnovne karakteristike virusa: virusi su obligatni paraziti; submikroskopske su veliine (samo se virus velikih boginja ovjeka moe vidjeti dobrim svjetlosnim mikroskopom); prolaze kroz bakterijski filtar umnaaju se samo u ivoj stanici odgovarajueg domaina (ne razmnoavaju se); nemaju vlastiti fermentni sustav niti izmjenu tvari (metabolizam); otporni su prema antibioticima.

Svi obvezatni paraziti stanine grae crpe iz ive stanice domaina tvari, koje ukljuuju u svoj metabolizam i tako osiguravaju svoje ivotne funkcije. Budui da virusi nemaju vlastiti metabolizam ne mogu se neposredno koristiti sastojcima iz stanice domaina, oni zato mogu preusmjeriti metabolizam domaina prema stvaranju novih virusnih estica. Kada virusna estica dospije u stanicu domaina, ona se rastavlja na sastavne dijelove (protein i nukleinsku kiselinu). Virusna nukleinska kiselina primorava da stanica domaina svoje ivotne funkcije usmjerava na sintezu pojedinih dijelova virusnih estica. Sastavljanjem tih dijelova nastaju nove virusne estice. Virus sve to mu nedostaje za reprodukciju uzima od stanice domaina (energiju, mnoge enzime, aminokiseline, nukleotide i dr.). Specijalizirani su patogeni tako da neki parazitiraju samo u bakterijskim stanicama (bakteriofagi), neki samo u animalnim stanicama (animalni virusi), a neki samo u biljnim stanicama (biljni virusi). Virusi nemaju staninu grau, pa se za tijelo virusa kae da ini esticu, odnosno virusnu elementarnu esticu. Samo ona virusna estica koja je potpuna i moe se razmnoavati odnosno koja moe uzrokovati zarazu, zove se virion. Dakle virion je kompletna virusna estica koja s moe razmnoavati.

Dok antibiotici mogu biti vrlo efektivni protiv bolesti koje uzrokuju bakterije, nemoni su protiv virusa. Borba protiv virusa oslanja se na cjepiva u kojima se nalaze uzgojena antitijela koja olakavaju simptome i potiu obrambeni sustav. 1.3. Graa virusa :

slika 1 - graa: A) neovijenog i B) ovijenog tipa virusa

1. kapsida , 2. nukleinska kiselina , 3. kapsomer , 4. Nukleokapsid , 5. Virion , 6.ovojnica , 7. projekcije ili peplomere Virusnu esticu (virion, 5) ini nukleokapsida (4) koja se sastoji od nukleinske kiseline (DNA ili RNA) (2) i sadri nasljedne upute potrebne za umnoavanje virusa, tvori virusni genom. Za infekcioznost virusa znaajna je; Kapsida (1) proteinska ljuska koja obavija nukleinsku kiselinu. Graena je od kapsomera (3) i nositelj je virusnih antigena. Kod sloenijih virusa kapside su obavijene virusnom ovojnicom (6), osim proteina sadri jo i lipide i ugljikohidrate od kojih je ovojnica graena.

10

Iz nje stre glikoproteinski izdanci (7) kojima se virus prihvaa na stanicu primatelja. Takvi su npr. virusi gripe, bjesnoe i HIV. U kemijskom smislu biljni virusi su nukleoproteidi, sastoje se od jednog tipa nukleinske kiseline (DNA ili RNA) i bjelanevina (proteina). Dok se u staninim organizmima nalaze uvijek obje vrste nukleinskih kiselina DNA i RNA kod virusa dolazi samo jedna od njih. Zahvaljujui istraivanju virusa doznalo se da i RNA moe biti nosilac genetske informacije. Nukleinske kiseline su graene od nukleotida. Nukleotidi su graeni od purinske i pirimidinske baze, eera; riboze u RNA i deoksirboze u DNA, i ostataka fosfatne kiseline. Jedan dio proteina izgrauje kapsidu (graevni proteini), i odreuju oblik virusa; kod poduenih oblik valjka, a kod poliedrinih oblik pravilnog poliedra. Drugi dio proteina su virusni enzimi (funkcionalni enzimi). Sloeniji virusi koji sadre ovojnicu sadre vie vrsta proteina. Najvei dio mase virusnih estica otpada na proteine. U esticama biljnih virusa mogu se nai i anorganski i organski kationi te znatne koliine vode. 1.3.1. Oblik virusnih estica Produeni oblik - zavojit (helikalni) ili spiralni; virusi tapiastog ,nitastog oblika, kapsomeri su razliitih veliina Okruglasti - izometrini (poliedrini) ili kubini; kuglasti virusi, jednaki kapsomeri.

Slika. 2 - Kuglasti virusi

slika 3 - tapiasti virusi

slika 4 - nitasti virusi

1.3.2. Veliina virusnih estica Virusi su submikroskopskih veliina, i ne mogu se vidjeti bez elektronskog mikroskopa. Njihove dimenzije variraju od svega nekoliko desetaka nm do preko dvije tisue nm. Nanometar (nm), je milijunti dio milimetra.

11

Viroidi i satelitni virusi Viroidi - viroidi su infektivne estice manje od virusa. Gole su jer ne posjeduju kapsidu. To su jednolanane krune molekule RNA koje su infektivne i uzrokuju bolesti viih biljaka. Ne upravljaju sintezom proteina jer su suvie mali. Viroidna RNA dosta je stabilna i neobino infekciozna; izraunato je da u 1g ukupne RNA, koja je izolirana iz biljke inficirane viroidom, ako se razrijediti u gotovo 2 milijuna litara vode takva otopina ostaje infekciozna. Prvi puta su otkriveni 1984, iznimno su uestali i distribuirani su irom svijeta. Satelini virusi virusi koji se ne mogu se razmnoavati samostalno, bez pomoi odreenih drugih virusa (virus pomaga), a mogu stvarati vlastiti proteinski omota. Virusne satelitne RNA su gole molekule RNA i ne mogu stvarati vlastiti proteinski omota, dolaze unutar omotaa virusa pomagaa.

12

2. NAINI NA KOJE SE PRENOSE VIRUSI

Neki vaniji ivotinjski i ljudski virusi se mogu iriti preko aerosola. Virusi imaju sposobnost da uu u ivotinjsku stanicu direktno, stapajui se sa staninom membranom. Infekcija virusima ostvaruje se pasivno. Biljni virusi se ne mogu apsorbirati na povrinu biljne stanice. Razlog tomu je injenica to se na povrini biljne stanice nalazi kutikula ili kutinizirani slojevi, te vrsta stanina stjenka na kojima nema receptora za koje bi se virusne estice mogle vezati. Isto tako, biljni virusi nisu u stanju probiti stanije biljke i ui u unutranjost stanice. Oni ulaze u stanicu domaina pasivno preko rana u epidermi biljnih stanica, pa se zbog toga za biljne viruse kae da su paraziti rane. Da bi opstali, virusi se kao obligatni paraziti moraju sa vremena na vrijeme prenositi sa zaraenih biljaka na zdrave, nezaraene biljke. Ako se virus nalazi u jednogodinjoj ili dvogodinjoj biljci, on e se morati ee prenositi na zdrave biljke nego ako se nalazi u nekoj viegodinjoj biljci. Prenoenje virusa sa bolesne na zdravu biljku preko rana naziva se mehanikim prijenosom virusa. U prirodi on se zbiva posredovanjem ivotinjskih ili biljnih organizama; ti organizmi probijaju staninu epidermu radi uzimanja soka kojim se hrane. Za razliku od pseudogljiva, bakterija i nekih gljiva kojima je neophodna kap vode u poetnoj fazi infekcije, virusima nije potrebna voda. Svi organizmi koji prenose viruse s jedne biljke na drugu nazivaju se vektorima. Mehaniki prijenos u prirodi bez sudjelovanja vektora, to jest, neposrednim kontaktom bolesne i zdrave biljke, ogranien je samo na neke viruse.

13

2.1. Mehaniki prijenos virusa U prirodi se na ovaj nain virusi ne ire esto. Neki se virusi mogu mehaniki prenijeti s inficirane na zdravu biljku kad se listovi inficirane biljke za vrijeme vjetrovita vremena trljaju o listove susjednih zdravih biljaka. Mehaniki je prijenos mogu i preko kontakta korijena zdrave biljke s korijenom zaraene biljke. Ako se u tlu nau ostaci tkiva zaraenog ili ak same virusne estice apsorbirane na tlo, mlade sadnice esto e se inficirati tim virusom. Infekcija nastaje tako, to se korjenii otete za vrijeme probijanja kroz grube estice tla. ea je pojava da se virusi mehaniki prenose za vrijeme agrotehnike obrade usjeva. Na primjer neki se virusi mogu prenijeti kontaminiranim rukama, odjeom i alatom. 2.2 Prijenos virusa vegetativnim razmnoavanjem biljaka Ljudi su najuinkovitiji prijenosnici virusnih bolesti preko premjetanja i razmnoavanja reznica, cijepljenjem, lukovicama, gomoljima. Budui da veina virusa uzrokuje sisteminu (sveobuhvatnu) infekciju, svaki biljni dio sadri virus, i cijepljenjem se viroza prenosi na potomstvo. Na ovaj nain virusi se ire ne samo lokalno nego i interkontinentalno. 2.3. Prijenos virusa insektima Meu organizmima koji prenose viruse (vektori) najvie je insekata. Oko 94% vrsta pripada razredu Arthropoda (lankonoci) , a 6% razredu Nematoda (crvi); veinu artropodnih vektora (oko 99%) ine insekti. Vie od 70% insekata koji prenose biljne viruse pripada redu Homoptera (jednokrilci). Tom redu pripada i porodica Aphididae (lisne ui) iji su lanovi najvaniji prenosioci biljnih virusa, no tu su jo i cvrci, crvci, titasti moljci, cikade, stjenice, iz reda Cloeptera (kornjai), iz reda Acarina i porodice Eriophydae - grinje, red Thysanoptera resiari (tripsi)

14

2.3.1. Odnos virus vektor ima nekoliko sluajeva: Veza koja se zbiva unutar usnog ustroja insekta gdje se virus apsorbira i onda oslobaa u razliite biljne stanice dok se insekt hrani. Insekt gubi virus ubrzo nakon to se hranio nezaraenom biljkom. Takva veza se stoga naziva kratkotrajna. Druga veza je trajna ili cirkulativna. Virus cirkulira unutar vektora i isputa se preko lijezda slinovnica. Vektor se treba hraniti nekoliko sati na zaraenoj biljci dok se virus ne prenese u vektor. Jednom kada vektor postane virulentan ostat e jo neko vrijeme. U nekim sluajevima virus se razmnoava unutar vektora i takva veza se naziva propagativna.

Slika 5 - lozin zeleni cvrak, slika 6 - teta od cvrka na vinovoj lozi, slika 7 - resiar ili trips

2.3.2. Lisne ui Lisne ui su najvaniji prenosioci virusa. Hrane se biljnim sokom. Siui sok zaraenih biljaka (u prvom redu iz lista), one mogu prenositi biljne viruse na tri naina: na neperzistentan, semiperzistentan i perzistentan nain, pa zbog toga govorimo o neperzistentnim, semiperzistnimn i perzistentnim virusima.
Slika 8 - Lisna u

15

a) Neperzistentan nain prijenosa virusa Virus ulazi u insekta za vrijeme njegova hranjenja biljnim sokom. Vrijeme uzimanja virusa vrlo je kratko; ono moe trajati od samo nekoliko sekundi do nekoliko minuta. Virus se moe prenijeti na zdravu biljku odmah nakon to je insekt rilcem probio epidermu biljke (faza inokuliranja virusa). Insekti razmjerno brzo nakon naputanja inficiranih biljaka (obino unutar etiri sata) gube sposobnost daljnjeg inficiranja drugih biljaka. To se dogaa zato to se nerezistentni virusi zadravaju na usnim dijelovima insekta; ti se virusi ne razmnoavaju u unutranjosti insekta. Smatra se da je nerezistentan nain prijenosa virusa u biti pasivan proces; u njemu se virus prenosi preko usnih dijelova kukca, koji su kontaminirani virusom. b) perzistentan nain prijenosa virusa Virusi koji se prenose lisnim uima na perzistentan ili cirkulativan nain imaju ove osobine: Faza stjecanja virusa traje dugo. Iako neke ui mogu prenijeti pojedini rezistentan virus nakon to je faza stjecanja virusa na inficiranoj biljci trajala razmjerno kratko (pr. 20 minuta), ipak prijenos je mnogo uspjeniji ako vrijeme stjecanja virusa traje izmeu est i dvanaest sati. Insekt ne moe odmah nakon uzimanja virusa prenijeti virus na biljku; kod te vrste prijenosa postoji latentni period koji traje 12 ili vie sati. U tom razdoblju insekt, iako sadri virusne estice, ne moe ih prenijeti na zdravu biljku. Nakon latentnog perioda insekt je sposoban u duljem razdoblju inficirati zdrave biljke. On moe najmanje sedam dana biti izvor virusnih zaraza. To je vrijeme, meutim, obino znatno due, a katkad insekt, nakon to je jednom stekao virus, moe cijelog ivota ostati izvor zaraza. Rezistentan virus zadrava se u insektu u svim razvojnim stadijima koji se smjenjuju u insektovom ivotnom ciklusu; ta je pojava poznata pod nazivom transstadijalni prijenos virusa. Rezistentni ili cirkularni virusi mogu se podijeliti u dvije kategorije: jednu kategoriju ine virusi koji se ne razmnoavaju u insektu to su nepropagativni virusi. 16

Za razliku od takvih virusa, neki se rezistentni virusi mogu razmnoavati u insektu a to su propagativni virusi. Katkada te propagativne rezistentne viruse vektori prenose preko jajaaca na svoje potomstvo. Taj se tip prijenosa virusa naziva transovarijalnim prijenosom. c) Semiperzistentan nain prijenosa virusa Ima virusa, koji se po nainu prijenosa lisnim uima nalaze izmeu nerezistentnih i rezistentnih virusa. To su semiperzistentni virusi. Oni su neperzistentni po tome to ne cirkuliraju unutar svojih vektora. No, njihov vektor zadrava sposobnost da ih stalno kroz tri-etiri dana prenosi. Vektor moe stei virus za 30 minuta, ali je prijenos obino znatno uspjeniji ako je hranjenje vektora na inficiranoj biljci trajalo nekoliko sati. Ono to je zajedniko semiperzistentnim i perzistentnim virusima jest to da jedni i drugi dolaze u floemu. Zbog toga kod oba tipa virusa vektor mora svojim rilcem probijati duboko u biljno tkivo da bi uzeo virus i da bi ga poslije na isti nain prenio u druge biljke. Do pojmova nerezistentan, semirezistentan i rezistentan dolo se istraivanjem prijenosa virusa lisnim uima. 2.3.3. Prijenos virusa kornjaima Prenose oko 45 razliitih biljnih virusa, zanimljivo je to da nemaju usni ustroj za sianje ve za grizenje. Do danas su poznate etiri skupine koje se prenose kornjaima : to su virusi iz rodova: Bromovirus, Comovirus, Tymovirus i Sobemovirus. 2.3.4. Prijenos virusa nematodama

Slika 9 - Nematoda : Xiphinema indeks, slika 10 - guke na korijenu vinove loze

17

Nematode su najbrojniji viestanini organizmi na zemlji. Spadaju u valjkaste crve, i paraziti su bilja, insekata i ivotinja. U razredu nemathelminthes klasificirano je oko 20 000 vrsta. Veliine su od 300 mikrona do preko 8 metara, no veina su veliine od 400 mikrona i 5 milimetara. U svakom cm tla nalazi se od 5 100 raznih vrsta nematoda. Nematode koje ive u zemlji vani su vektori biljnih virusa. Oni se hrane sadrajem stanica biljnog korijenja. Glavni dio njihova usnog ustroja je u obliku stileta (bodlji) kojim probijaju povrinu korijena i pomou kojeg siu sadraj stanice. Na tim mjestima nastaju zadebljanja - ''guke'' (slika10). Zaraene nematode se hrane od biljke do biljke i na taj nain ire bolest, no ire se i preko zemlje i vode. Virusi koje prenose nematode se zovu NEPO virusi (nematode transmitted polyhedral shaped), pliedrinoga mnogoplonog oblika. U tu skupinu su svrstani: virus lepezastog lista vinove loze (GFLV), virus mozaika guarke (ArMV), virus crnih prstenova rajice (TBRV), virus prstenaste pjegavosti maline (RV), latentni virus prstenaste pjegavosti jagode (SRLV) i virus ukasto smeeg mozaika (GCMV). Kod nas su u vinogradima i vonjacima utvrene vrste Xiphinema indeks i Longidorus, koje su inae prenositelji virusa infektivne degeneracije vinove loze. 2.4. Prijenos virusa gljivicama

Prijenos virusa je povezan sa stvaranjem zoospora u ciklusu gljivice. Gljivice koje prenose viruse su obligatni paraziti na korijenu biljaka. Postoje dva naina stvaranja zoospora i dva naina prijenosa virusa. U prvom sluaju; gljivica inficira stanice korijena inficiranog virusom i na njima stvara zoosporangije, u zoosporangijima se stvaraju zoospore (pokretne spore) koje posjeduju jednu ciliju za koju se virus privrsti. Zoospore izlaze iz biljnih stanica i plivaju kroz smjesu vode i tla i privruju se za korijen druge zdrave biljke. U drugom sluaju; gljivice se mogu pri spolnom razmnoavanju fuzionirati u parove i stvoriti zigote koje mogu ui i stanice korijena i stvoriti mirujue spore u kojima se virus pritaji i eka da gljivice doekaju povoljne uvijete za klijanje, kada proklijaju stvaraju se zoospore preko kojih se virus prenosi na korijen biljke.

18

2.5.

Prijenos virusa sjemenom

Prijenos virusa sjemenom ima veliku vanost ne samo za irenje virusa nego i za kontinuirano odravanje tetnih virusnih bolesti biljaka u prirodi. Virusi se prenose sjemenom preko razliitih dijelova sjemenke. Neki se prenose preko sjemene ljuske (teste); kod tih sjemenki dolazi do (povrinske) kontaminacije sjemenke, pa se virus moe eliminirati ako se takve sjemenke tretiraju nekim kemijskim sredstvima, pr. fosfatima. Neki se drugi virusi mogu takoer nai na povrini nezrelih sjemenki. No, nakon pune zrelosti, kad se sjemenke dobro osue, virus nestaje s njihove povrine. Drugi nain prijenosa virusa sjemenom jest prijenos preko sjemenog zametka (embrija) biljke. Takav prijenos imaju virusi koji ulaze u embrionalne stanice. Veina biljnih virusa koji se prenose sjemenom, prenose se preko embrija, pa je to najvaniji nain prijenosa virusa sjemenom. Zna se da je za prijenos virusa preko embrija nuno da se matina biljka rano u svojem ivotu inficira virusom. Do zaraze u tom sluaju mora doi prije cvatnje i prije nego biljka stvori enske gamete. Iz toga proizlazi da se infekcija zbiva preko enskih gameta. U pogledu prijenosa virusa od matine biljke na zametak jo je dosta nejasnoa. 2.6. Prijenos virusa polenom

Neki se virusi mogu prenositi polenom zaraenih biljaka. Inficirani polen pri opraivanju zdravih biljaka moe zaraziti enske gamete. Vjerojatno je da virusi koji se prenose polenom ulaze u jajnu stanicu zajedno s mukim gametama kroz peludovu cjevicu. 2.7. Prijenos virusa vilinom kosicom (cuscuta spp.)

To je parazitna biljka, koja svojim korjenastim prihvataljkama (haustorijama) ulazi u tkivo domaina i povezuje sa njegovim ilnim sustavom. Ovaj nain prijenosa nema gospodarko znaenje.

19

3. OSNOVNI SIMPTOMI VIRUSNIH INFEKCIJA

Svi simptomi jedne bolesti naziva se sindrom. Virusi uzrokuju raznolike simptome na zaraenoj biljci, od nevidljivih do smrti biljke. Mnogi virusi vinove loze uzrokuju smanjenje produktivnosti i kasnije dozrelosti. Virusi mogu inficirati vinovu lozu bez da biljka pokazuje neke oite simptome (latentni ili spavajui virusi). Jaina razvoja simptoma virusa i utjecaja na biljku ovisi o virusnoj vrsti, vrsti biljke i okoliu. Latentni virus moe postati virulentan, uslijed promjena u okoliu ili razmnoavanja na razliite podloge. Simptomi mogu biti slabo uoljivi pa je potrebno provesti testiranja, da bi se detektirao virus u biljci. Simptomi kao to su odbacivanje mladica, ubrzano propadanje loze, prestanak rasta, kasnije cvjetanje, kasno i slabo dozrijevanje groa su jasnije vidljivi. Simptomi se javljaju na liu, grou, i trsu, a to su: crvenilo lia na crvenim sortama vinove loze, krai internodiji, arenilo lia, fascijacija trsa, dvostruka koljenca (internodiji), neumjeren rast iz sporednih pupova, rastresiti grozdovi sa malim i velikim bobicama, kovranje lia u jesen, izbrazdanost drveta i td. Vanjski simptomi su promjene na biljci koji se vide golim okom. Razlikuju se dvije vrste vanjskih simptoma: lokalni i sistemini simptomi. 3.1 Lokalni simptomi Javljaju se na mjestu gdje je virus uao u biljku. Na tom se mjestu javljaju klorotine (ute) ili nekrotine (smee) promjene koje se nazivaju lokalne lezije. Postoje tri vrste lokalnih lezija : klorotine lokalne lezije, nekrotine i prstenaste lokalne lezije. - Klorotina lokalna lezija je maleni dio tkiva koji je neto svjetlije boje od okolnog tkiva, a nastaje zbog smanjenja koliine klorofila i smanjenja broja kloroplasta u stanici. - Nekrotina lokalna lezija sastoji se od uginulih stanica pa su srebrnasto sive, sivkastosmee ili smekasto crne boje. Neke su obrubljene klorotinom zonom, a kod nekih se nakuplja antocijan u obliku prstenastih obruba. - Prstenasta lokalna lezija se sastoji od klorotinog ili nekrotinog prstena unutar kojeg se nalazi normalno zeleno tkivo.

20

3.2 Sistemini simptomi Odraz su sveope infekcije biljke, a simptomi se javljaju na mlaim, neinokuliranim listovima, dok stariji listovi ne pokazuju sistemne simptome. Ti simptomi su dosta raznoliki i svrstavaju se u tri osnovne skupine: oni koji su nastali zbog promjena u boji, oni koji su posljedica histopatolokih promjena (promjene u stanicama), i oni koji nastaju zbog patomorfolokih promjena. 3.2.1. Sistemini simptomi nastali zbog promjena u boji: Mijenja se boja lista, gubi se klorofil ta pojava naziva se kloroza. Pevladavaju crvena ili uta boja koje potjeu od pigmenata karotenoida ili naknadno sintetiziranih pigmenata antocijana. Najei simptomi koji se javljaju kao posljedica promjena u boji biljke su: Prosvjetljenje ila, je ujedno i prvi simptom sistemine virusne infekcije, a javlja se na najmlaim dijelovima biljke: ile na listu postaju ute ili prozirne tako da se jako istiu osobito ile drugog i treeg reda. Kako bolest napreduje prosvjetljenje ila ubrzo iezava, a pojavljuju se drugi trajni sistemni simptomi; Mozaik nastaje kad se mali ukastozeleni, uti ili ak bijeli dijelovi lista jednolino izmjenjuju sa zelenim dijelovima lista. Mozaik je najei simptom virusnih zaraza biljaka, pa su po tom simptomu mnogi virusi dobili ime (virus mozaika guarke). Pjegavost ine okruglaste pjege svjetlije boje koje su nejednolino rasprostranjene po listu; klorotine pjege nemaju otar rub pa postupno prelaze u normalno zeleni dio plojke. Ako pjege imaju oblik prstenova, tada se pjegavost naziva prstenastom pjegavou. Prstenaste se pjege sastoje od sredinjeg normalnog dijela koji je okruen prstenastom klorotinom ili nekrotinom zonom. arenilo, simptom gdje svjetlija podruje zauzimaju velike dijelove lista. Simptom vrpastih ila se javlja kada se sa obje strane veih lisnih ila utica je simptom koji se javlja u obliku jednoline kloroze (uenja) cijele

javlja jednolino iroka vrpca tamnije boje. lisne plojke. utice osim virusa, mogu izazvati i razni drugi imbenici (mikroorganizmi, poremeaji u ishrani )

21

- Crtiavost, ovaj simptom se sastoji od klorotinih ili nekrotinih ara u obliku duih ili kraih crta. - arenilo cvijeta, ploda i sjemena uzrokuju mnogi virusi, a osobito oni koji uzrokuju mozaine simptome na listu. Nastaju svjetlije are ili pruge zbog gubitka antocijana; (virus arenila cvijeta tulipana). 3.2.2. Sistemini simptomi nastali zbog histopatolokih promjena Morfoloke promjene u tkivu pod utjecajem virusnih infekcija mogu nastati iz vie razloga: Zbog poremeaja u dijeljenju stanica (histogene promjene), zbog poremeaja u rastu i oblikovanju stanica (histotrofine promjene), zbog pojave nastajanja novih tkiva (neoplazmatske promjene), zbog nastajanja posebnih patolokih izraslina (strukturne promjene i zbog uginua stanice (nekrogene promjene) A) Simptomi nastali zbog histogenih promjena Virusna infekcija moe uzrokovati pojaanu diobu stanica (hiperplazija), a najee promjene su: Enacije,* To su izrasline sline malenim listiima, koje se obino javljaju na donjoj epidermi lista, a ponekad i na laticama. Anatomski su graene kao list, odnosno latica. Tumorske izrasline, Tumorska tkiva uzrokuje virus tumora rane, tumorsko Mesnatost biljne plojke, uzrokuje virus utice eerne repe. uti dijelovi Ispupenja i nabranost lisne plojke, takve promjene nastaju kada pojedini Zastoj u rastu, nastaju zakrljali dijelovi biljke zbog smanjene brzine tkivo se razvija na mjestu ozljede biljke koja je inficirana virusom. biljke su odebljali i krhki. dijelovi lista pojaano rastu. Ispupenja nastaju zato jer tkivo oko njih raste normalno. dijeljenja inficiranih stanica.

Entuslat koji je nastao koji je izrastao; ex(e) + natus sum izrasti iz unutranjiosti

22

Izoblienje biljnih dijelova. Ne samo da virusne infekcije koe ili pospjeuju diobu stanica ve u nekim sluajevima potpuno zaustavljaju dijeljenje stanica. Nastaju promjene u izgledu, a tri su najea simptoma kao posljedica tih promjena na biljci: Lepezavost lista, nastaje zbog izostanka stvaranja parenhimskog tkiva izmeu glavnih ila, na rubu se stvaraju duboki urezi pa list poprima izgled lepeze. (virus lepeze lista vinove loze) Nitavost lista, javlja se kod rajice ili na kunjaku koji su zaraeni virusom mozaika krastavca: prestaje se stvarati parenhimsko i drugo lisni tkivo, a od plojke ostaje samo sredinje rebro s neto malo okolnog tkiva. Zbog toga list poprima nitast oblik. Uginue biljke, ako abortivne promjene zahvate sve biljne organe, tada biljka ugine. Nije esta pojava. B)Simptomi nastali zbog histotrofinih promjena Stanice se pod utjecajem infekcije poveavaju (hipertrofija), a ponekad i smanjuju (hipotrofija). Hipertrofija nastaje u hiperplastinih stanica u vidu lokalnih zadebljaja (enacije i tumori), do hipotrofije, smanjenja dolazi u klorotinim dijelovima mozainih listova. C)Simptomi nastali zbog neoplazmatskih promjena U inficiranim biljkama se stvaraju nova tkiva. D)Simptomi nastali zbog metaplazmatskih promjena To su promjene kada se jedan tip tkiva preobraava u drugi tip poprimajui novu grau i funkciju. Preobrazba parenhimskog tkiva u meristemsko tkivo, stvara se pluto. To je u biti obrambena reakcija biljke na virusnu infekciju. Svrha pluta je izolacija arita virusa. I tumori rane su posljedica pretvorbe floemskog parenhima u meristemske stanice koje se dijele i stvaraju tumorsko tkivo. Preobrazbom jednog tipa stanica u drugi tip mijenja se i funkcija tkiva. - Lignizacija (odrvenjavanje) stanine stjenke parenhimnih stanica.

23

E) Simptomi nastali zbog strukturnih promjena Tile, tiloza, su izrasline u ksilemskom tkivu. Tile urastaju u lumen traheja ili traheida i na taj nain spreavaju protok vode kroz njih. Tilozu uzrokuju virusi koji uzrokuju utice. F) Simptomi nastali zbog nekrogenih promjena Nekroze uzrokuju uginue stanica. Razlikujemo lokalne i sistemne nekroze. Lokalne nekroze ili lokalne lezije. Javljaju se kod preosjetljivih ili hipersenitivnih biljaka koje reagiraju na virus tako da njene stanice odmah nakon infekcije uginu, a virus se iz mrtvih stanica ne moe iriti u okolna tkiva. Sistemine nekrotine are mogu obuhvatiti samo pojedine dijelove biljke ili pojedina tkiva. Ako se nekroza proiri u druga tkiva i pri tome zahvati vrni meristem biljka e uginuti. 3.2.3. Sistemini simptomi nastali zbog patomorfolokih promjena To su najvidljivije promjene, odnosno simptomi na virusno inficiranoj biljci, a posljedica su prethodno opisanih histopatolokih uinaka. Ove promjene zahvaaju svaki biljni organ i mijenjaju njegov oblik, veliinu, poloaj i druge osobine. - Morfoloke promjene na korijenu Smanjenje korijena, na korijenu pod utjecajem virusa tumora rane moe uzrokovati tumorske izrasline, na korijenu se moe razviti veliki broj malih korjenia; bolest bradatost korijena. - Morfoloke promjene na stablu Skraenje internodija stabljike, a kasniji simptom zastoj u rastu. Kod virusa lepezastog lista vinove loze internodiji mogu biti toliko blizu da izgledaju kao dvostruki, a iz takvih nodija izbijaju izdanci koji zbog abnormalnosti nodija stvaraju rozetu izbojaka. Krastavost stabla, jamiavost stabla te tumorske izrasline. - Morfloke promjene na listu Listovi su deformirani, to je posljedica poremeaja u rastu pojedinih dijelova lista. Uvijenost lista, nitavost lista, enacije i prijevremeno opadanje listova. - Morfoloke promjene na cvijetu Cvjetovi mogu biti sitniji i izoblieni. 24

- Morfoloke promjene na plodu Plodovi mogu biti sitniji i malobrojniji, mogu prijevremeno otpadati , neki virusi uzrokuju sterilnost i slabo zametanje plodova. Neki virusi ak razgrauju plodnicu, odnosno plod, tako da su sjemenke izloene vanjskim utjecajima.

25

4. LABORATORIJSKA TESTIRANJA BOLESTI VINOVE LOZE

Za dijagnosticiranje problema u vinogradima, koriste se laboratorijska testiranja. Otkrivanjem zaraenog sadnog materijala pomae se uzgajivaima da izbjegnu irenje bolesti na nove vinograde. U prolosti detekcija virusa na vinovoj lozi je uvelike postignuta napornim i sporim biolokim testovima. Danas, mnogi od vanijih loznih virusa se mogu detektirati brzim laboratorijskim testovima. Tim testovima je mogue detektirati i bolesti koje uzrokuju gljive i bakterije. Kako se radi o virusnoj bolesti, tonu dijagnozu nije mogue odrediti na osnovi simptoma, ve samo koritenjem adekvatnih serolokih ili molekularnih tehnika u laboratoriju. Tehnike koje je mogue koristiti u dokazivanju biljnih virusa su imunodifuzija, ELISA, hibridizacija nukleinskih kiselina i lanana reakcija polimeraze. Najpraktinija i najee koritena metoda dokazivanja biljnih virusa je ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. 4.1 dijagnostika na terenu Dijagnosticiranje loznih bolesti moe biti naporno. Simptomi u polju su rijetko jedinstveni za odreenu bolest. Ponekad zaraena loza ne pokazuje nikakve simptome koji bi mogli indicirati na zdravstveni status. Dok u nekim sluajevima bolesti vinove loze pokazuju jasne simptome, pa ih je lake otkriti na terenu. Mnogo ee, poseban skup simptoma moe rezultirati veim brojem uzroka. Pr. Crveno lie moe biti najava virusne bolesti, gljivina bolest korijena, nedostatak hranjiva, fiziko oteenje, ili oteenje hranidbom crva, insekata, glodavaca. Slino i opeklina moe biti simptom nedostatka vode, opekotina od sumpora ili teta nastala prskanjem. Kod mnogih virusnih bolesti vinove loze dijagnostiki simptomi se javljaju u odreeno godinje doba. Uvijanje lia pr. simptom je crvenilo lia na crvenim vonim sortama u kasno ljeto i jesen. Pregledom tih voaka u proljee neemo nai naznake bolesti.

26

Zimi za vrijeme spavanja vinove loze praktiki je nemogue dijagnosticirati virusnu bolest na terenu, a to je vrijeme rezanja loze za razmnoavanje. Vinova loza zaraena nekim agensom bolesti (posebice virusima), moda nikada ne pokae neke oite simptome. Koncentracija agensa koji uzrokuju bolest moe biti niska pa se ne razvijaju nikakvi simptomi, ili infekcija moe biti na sorti koja je tolerantna na tu odreenu bolest. Takve latentne infekcije se mogu otkriti samo pouzdanim metodama testiranja. Ovo je vana okolnost kada se sakuplja drvo za razmnoavanje novih sorata. 4.2. Seroloka testiranja (ELISA) Seroloke metode se koriste reakcijama antitijela sa agensima bolesti, obino virusima ili bakterijama. Antiserum se proizvodi tako to se najprije proieni pripravak biljnog patogena virusa, ili bakterije ubrizga u ivotinju (obino zeca). ivotinja reagira na taj strani materijal tako to stvara antitijela. Ta antitijela reagiraju samo na patogen koji se koristio za stvaranje antitijela. Antitijela se onda proiavaju iz krvi i dobiva se antiserum koji se dalje koristi u dijagnostikim testiranjima. Najuobiajeniji seroloki test koji se koristi je ELISA, enzimski vezana imunoloka kiselina. To je metoda u kojoj se osim antitijela i virusa upotrebljavaju jo i enzimi. ELISA metoda : virusna antitijela adsorbiraju se na stjenku zdenia u kojem e se zbiti seroloka reakcija, dodaje se virus koji se vee na adsorbirana protutijela, dodaje se konjugat protutijelo enzim koji se vee na virusnu esticu (koja je ve ranije reagirala s protutijelom adsorbiranim na povrini zdenia), dodaje se enzimski supstrat zbog ega se on oboji (obino u uto). Izmeu pojedinih faza nevezana protutijela i virus se uklanjaju ispiranjem.

27

Pozitivna reakcija

antigen (virus) se spaja s antitijelom

antitijelo se Enzimska reakcija spaja s antigenom sa supstratom reagira (virusom) utom bojom

Antitijelo se spaja dodan je blokirajui dodan je biljni sok sa dnom zdenca agens da popuni prostor iz uzorka koji nije vezan sa antitijelom

dodano je antitijelo sa privrenim enzimom

dodan je supstrat

Negativna reakcija

Ako antigen nije dodano je antitijelo, dodan je supstrat ali prisutan u biljnom soku, ali nema nema prisutnog ne dolazi do spajanja antigena na koji bi enzima, boja se se vezao ne pojavljuje

strelice oznaavaju ispiranje

Slika 11 - ELISA metoda, pozitivna i negativna reakcija

Elisa testiranja se koriste za detektiranje bolesti vinove loze uzrokovanih virusima i bakterijama. Elisa testovi su prilino jednostavni za provoenje i mogu omoguiti rezultate u samo jedan ili dva dana. Da bi ELISA bila uspjena u laboratoriju moraju biti dostupni antiserumi za sve bolesti, a uzorci za testiranje moraju biti uzeti sa prikladnog tkiva, i u odreeno doba godine, uz to moraju biti i u dobrom fizikom stanju. Nedostatak je taj, da se nisu proizveli antiserumi za sve viruse vinove loze. Dakle ako je loza i zaraena ba tim virusom za koji ne postoji antiserum, virus nee biti otkriven. To je sluaj kod nekih virusa uvijanja lia. Drugi problem serolokih testiranja je istoa antiseruma. Kod nekih sluajeva antiserum moe reagirati na vie od jednog virusa, ili na neku drugu komponentu biljke, na primjer biljni sok koji je bio prisutan sa virusom kada se proizvodio antiserum. To moe dovesti do zbunjujuih rezultata ili lanih pozitivnih rezultata ako antiserum reagira na neto drugo a ne na virus. Dobar laboratorij bi trebao provoditi kontrolu u svakom testu i savjetovati klijente o tome koji ELISA test na patogen je sklon tom problemu.

28

4.3. Molekularna testiranja - PCR lanana reakcija polimeraze To je laboratorijska tehnika koja oponaa postupak prepisivanja DNA (replikaciju) koja se odvija u svakoj ivoj stanici. PCR tehnologiju je zamislio Kary Mullis, a razvio tim znanstvenika Cetus Corporation. Metoda je prvi puta opisana 1985. godine i od tada se smatra jednim od najmonijih orua u molekularnoj biologiji. Za ovo revolucionarno otkrie Dr. Mullis je 1993. godine dobio Nobelovu nagradu za kemiju. PCR je patentom zatiena tehnologija. U klinikoj dijagnostici dovoljan je mali uzorak koji sadri genetiki materijal (DNA) iji genski zapis se kopira u velikom broju primjeraka stvarajui dovoljnu koliinu za otkrivanje prisustva pojedinog virusa, bakterije ili promijenjenog gena vlastitih stanica. Ne oslanja se na reakcije antitijela, ve testira specifian molekularni slijed koji je jedinstven za odreeni patogen. PCR tehnika : izrezuje se sekvencija (gen) DNA koji se eli istraiti i umnaa nekoliko milijuna puta tako da se moe opaziti na gelu. PCR postupak : izrezana se dvolanana DNA u prisutnosti oligonukleotidnih poetnica (primers) zagrijava da bi se lanci odvojili. Nakon toga pripravak se hladi; na odreenoj temperaturi, na svaki od odvojenih lanaca se vee svojom komplementarnom sekvencijom po jedna poetnica (na suprotnim krajevima lanaca); potom na odreenoj temperaturi djeluje termostabilna DNA polimeraza (enzim) koja omoguuje poetnicama da kopiraju svaki od dvaju lanaca izrezane DNA; zatim slijedi ponovno zagrijavanje koje omoguava odvajanje lanaca novonastalih dvolananih DNA. Sukcesivnim ciklusima denaturiranja i sintetiziranja novih lanaca postie se logaritamsko umnoavanje izrezane DNA ( 2,4,8,16,32,64). Openito, svaki novi ciklus udvostruuje iznose DNA. PCR se moe koristiti za detekciju patogena u vinovoj lozi zato to svaki virus, bakterija ili gljivica ima svoj vlastiti jedinstveni genetiki kod. U prolom desetljeu, molekularna znanost je identificirala genetike markere za mnoge patogene. Komercijalno testiranje PCR trenutno je dostupno za mnoge virusne i bakterijske patogene vinove loze.

29

Znaaj PCR metode je vrlo veliki, kako u podruju genetikih eksperimenata tako i u istraivanjima na podruju molekularne biologije te u biotehnologijama. Meu brojnim vanim podrujima primjene PCR-a su: arheologija, kriminalistika, utvrivanje oinstva, genetika, biotehnologija i klinika dijagnostika.

Slika 12 - Termocikler

4.4. Bioloko indeksiranje Prije pouzdanih laboratorijskih testova za detekciju patogena koristilo se bioloko indeksiranje. Indeksiranje se odvija u staklenicima u proljee i sastoji se od trljanja ekstrakta iz loze koja se testira, na lie osjetljive indikator biljke. Ako je koji virus prisutan u ekstraktu test biljke, indikator biljka e razviti simptome za nekoliko tjedana. Za terensko indeksiranje potrebno je 2 godine. Indikatori su cijepovi sa pupovima od loze koja se testira. Oni su posaeni u polju i promatraju se 2 sezone . Iako je indeksiranje vrlo naporno i zahtijeva dosta vremena, jo je uvijek korisna metoda za lozu koja je vrijedna i potrebna je velika sigurnost u dijagnostici. 4.5. Pouzdanost laboratorijskih testiranja Niti jedna dijagnostika metoda nije savrena. Sve ove opisane metode mogu proizvesti lani pozitivni ili lani negativni rezultat. Lani pozitivni se dogaa kada biljka nije bolovala od odreene bolesti ali rezultati pokazuju da je bolest bila prisutna. To se obino dogaa zbog kontaminacije ili pogrenog obiljeavanja uzoraka. Pogreke se mogu dogoditi i na terenu kada se sakupljaju uzorci ili u laboratoriju kada uzorci stignu. Kontaminacija se posebice odnosi na PCR zbog osjetljivosti testiranja. Samo nekoliko bakterija ili virusnih estica prenesenih iz jednog uzorka na drugi moe dovesti do lanih pozitivnih ili negativnih rezultata.

30

Kod ELISA testova lani pozitivni rezultati se dogaaju ako antiserum reagira na biljne komponente u aditivu. Lani negativni rezultati su uobiajeniji nego lani pozitivni. Lani negativni se mogu dogoditi i zbog toga to u uzorku koji je dan na analizu nema agenasa bolesti ili se uzorkom pogreno rukovalo, pa uzorak nije bio u dobrom stanju kada je stigao u laboratorij. Virusne infekcije su obino neravnomjerno rasprostranjene u vinogradu. ak na samoj lozi mogu biti prisutni na samo pojedinim dijelovima. Ako je tkivo koje se alje u laboratorij bilo sa zaraene biljke, ali sa mjesta koji nije sadravao virus rezultat e biti lano negativan. Lano negativni rezultati mogu se dogoditi uslijed raznih problema u laboratoriju koji obavljaju procedure testiranja. Dobar laboratorij ukljuuje kontrolu njihovih testova. 4.6. Selekcija i rukovanje uzorcima Uzimanje uzoraka sa odreenih dijelova biljke u odreeno doba godine moe uvelike poveati pouzdanost testiranja na bolesti. Na primjer kod testiranja vinove loze na lepezu lista, sakupljaju se izdanci u proljee. Virus je toplinski osjetljiv pa je preko ljeta njegova koncentracija u lozi vrlo niska i testiranja su nepouzdana. Za pouzdanost rezultata takoer je bitno pravilno rukovanje i slanje uzoraka. U glavnom uzorci bi se trebali dostaviti u laboratorij to je mogue bre. Ako su uzorci bili izloeni neumjerenoj vruini, suenju ili su predugo uvani nee biti mogue dobiti pouzdane rezultate. U glavnom , to je poslan vei broj uzoraka iz vinograda na testiranje, vea je pouzdanost rezultata. Treba imati na umu da u jednom vinogradu moe biti vie od jednog virusa, a mogue je da loza u nekim vinogradima bude zdrava iako su zaraena virusom ili vie virusa. Pozitivni rezultati iz laboratorija mogu se uglavnom smatrati tonima. Lani pozitivni nisu uobiajena pojava, osim ako nije dolo do znaajnijih problema u laboratoriju. No ako se sumnja na problem, zato to su svi uzorci ispali pozitivni treba razmisliti da se ponovno provedu. Ukljuujui zdravi uzorak zajedno sa bolesnima. Negativni rezultati su na drugu ruku ograniene vrijednosti, i to zato to je nejednaka distribucija agenasa bolesti u vinovoj lozi, a i koncentracija se mijenja tokom godine. Lani negativni rezultati su uestali. Treba imati na umu da negativni rezultati ne znae da loza nije zaraena sa bolesti. Ako se sumnja na bolest loze, a rezultati testiranja budu negativni ne treba odustati od postavljanja dijagnoze. 31

Treba uzeti u obzir dokaze kao to je ponaanje loze i simptomi,a onda poduzimati daljnja testiranja dok se ne otkrije uzrok. Ako koristimo laboratorijska testiranja za lozu za razmnoavanje potrebna je vea opreznost. Podloge vinove loze bi se trebale dvije godine testirati ELISA metodom i PCR testovima. Ovim testovima se ne mogu ocijeniti cjelokupno zdravlje vinove loze, oni mogu pomoi u otkrivanju da li je ili nije loza zaraena nekim od patogena na koji se testira. Testovi nisu dostupni za sve znane bolesti loze pa tako, niti jedan cijep ne moe biti krajnje deklariran kao virus free. Ipak tehnologije koje se koriste u laboratoriju za dijagnosticiranje pouzdanije su nego to su bile nekada. 4.6.1. Upute za uzimanje uzoraka i testiranje na bolesti

BOLEST

KADA TESTIRATI

UZORAK TKIVA ive mladice u

ELISA

PCR

Lepeza lista i drugi nepovirusi

Najbolje u proljee,a moe i u jesen i zimu

proljee;odsjeak mladice sa trskom za kambij u jesen i zimu Peteljke u kasno ljeto i jesen;

Pouzdano u proljee

Pouzdano u proljee, manje pouzdano u jesen i zimu

Pouzdano u kasno ljeto i jesen

Pouzdano u kasno ljeto, jsen i zimu

Uvijenost lista

Kasno ljeto jesen i zima

odsjeak mladice sa trskom za kambij u jesen i zimu

Iljebljenost drveta podloge rupestris Cijelu godinu

Peteljke, lie ili kambijski odsjeci Peteljke, lie ili Nije dostupno Jedino za GVA, Najbolje pouzdan u proljee Mladice i mlado lie u proljee,odsjeak mladice u jesen i zimu Pouzdano u proljee Pouzdano u proljee, jesen i zimu GVA, GVB, GVD Pouzdano

vitivirusi

Proljee, jesen i zima

kambijski odsjeci

arena pjegavost lista

Prolje e, jesen i zima

32

5. VIROZE VINOVE LOZE

Virusne i virusima sline bolesti i druge infektivne bolesti vinove loze su uzrokovane raznim intracelularnim patogenima. Bolesti su rasprostranjene po cijelom svijetu gdje god se uzgaja vinova loza. Iako se agensi virusa mogu iriti prirodno putem vektora (nematode, lisne ui, kukci), glavni i najznaajniji nain irenja ovih bolesti je preko zaraenog sadnog materijala. Virusi vinove loze veoma su rasprostranjeni. Do danas je otkriveno i opisano vie od 60 razliitih viroza na vinovoj lozi. Mogu uzrokovati ozbiljnije posljedice na zdravlje vinove loze, urod i kvalitetu vina. Zbog promjena koje nastaju u zaraenom trsu, neki trsovi pokazuju veu osjetljivost na niske temperature i smanjuje se urod. Virusi mogu i utjecati na kvalitetu vina uzrokujui smanjenje postotka eera, kiselina i slabo razvijanje boje. Smanjenje uroda 5 10% nije neuobiajeno za viroze vinove loze, ali ak i malo tete na urodu e s vremenom porasti, uzrokujui znaajnije ekonomske gubitke. Simptomi nisu uvijek oiti. Neke viroze imaju relativno karakteristine simptome pa se lako mogu prepoznati, dok drugi simptomi viroza mogu ukazivati na neke druge uzronike koji imaju sline simptome. Tekoe u detektiranju virusnih infekcija mogu voditi do ubrzanog irenja virusno inficiranog materijala preko razmnoavanja. Ako se koriste zaraene reznice za razmnoavanje cijeli vinogradi mogu biti zaraeni. Na zaraenim podlogama ili reznicama pri proizvodnji cijepova je oteano stvaranje kalusa.

33

Klasifikacija virusa Biljni virusi se svrstavaju u virusne skupine na osnovi zajednikih svojstava. Johnson 1927.,: Ime virusa se odreuje narodnim imenom domainske biljke u kojoj je neki virus prvi put naen i nazivom glavnog simptoma koji virus uzrokuje na toj biljci (1.). Budui da su imena virusa u veini sluajeva prilino dugaka, virolozi ih krate; obino se uzimaju poetna slova rijei koje ine ime tog virusa ali na engleskom jeziku. Tako je za engleski naziv lepeza lista vinove loze grapevine fan leaf kratica GFLV. Stvaranje takvih kratica nije slubeno standardizirano. Pedesetih i ezdesetih godina klasifikacijski sustav biljnih virusa se temeljio na: obliku virusne estice, tipu i koliini nukleinske kiseline, organizaciji genoma i tipu vektora. Taj je klasifikacijski sustav bio u uporabi sve do 1993. Dananja klasifikacija biljnih virusa svrstava se u redove, porodice i rodove, u obzir se uzima i oblik virusne estice, tip i koliina nukleinske kiseline, organizacija genoma i tip vektora. U klasifikaciji biljnih virusa samo je jedan dio virusa svrstan u porodice. Drugi dio je nesvrstan i izvan je postojeih porodica. Osim toga, postoje i oni virusi koji nisu klasificirani ni u rodove. Za sada je uspostavljen samo jedan red (sufiks virales) u biljnoj virologiji i to je red Mononegavirales koji obuhvaa dvije porodice (sufiks viridae) : rhabdoviridae i bunyaviridae; porodica obuhvaa srodne rodove. Naziv roda ima sufiks virus, a obuhvaa jednu ili nekoliko srodnih virusnih vrsta. Pojam vrsta predstavlja pojedini virus koji se toliko razlikuje od slinih virusa da se moe sigurno identificirati. No virusna vrsta se ne oznauje latinskom nomenklaturom, nego narodnim opisnim imenom pr. Virus mozaika duhana. Kao to vidimo u klasifikaciji iz 1966. godine virusi su se svrstavali u porodice rodove i vrstu.

34

5.2. Taksonomija virusa na vinovoj lozi (prema Walter et Martelli, 1966.) a)virusi razvrstani u porodice i rodove

Porodica
Bromoviridae 1. 2. 3. Bunyaviridae Comoviridae

Rod
alfamovirus Cucumovirus Ilarvirus Tospovirus fabavirus

Vrsta
Alfa mozaic (AMV) Cucumber mosaic virus (CMV) Grapevine line pattern (GLPV) Tomatto spotted wilt (TSWV) Broadbean wilt (BBWV) Artichoke Italian latent (AILV) Arabis mozaic (ArMV) Blueberry leaf mottle (BBLMV) Grapevine fanleaf virus GBLV Grapevine chrom mosaic (GCMV) Grapevine fanleaf (GFLV) Grapevine Tunisian ringspot (GTRV) Peach rosette mosaic (PRMV) Raspberry ringspot (RRV) Tabacco ringspot (TRSV) Tomato ringspot (ToRSV) Tomato black ringspot (TBRV)

4.

Tombusviridae

Tombusvirus Carmovirus

Petunia asteroid mosaic (PAMV) Grapevine algerian latent (GALV) Carnation mottle (CarMV)

5.

Closteroviridae

Closterovirus

Grapevine leafroll associated 1 (GLRaV- 1) Grapevine leafroll associated 2 (GLRaV- 2) Grapevine leafroll associated 3 (GLRaV- 3) Grapevine leafroll associated 4 (GLRaV- 4) Grapevine leafroll associated 5 (GLRaV- 5) Grapevine leafroll associated 6 (GLRaV- 6) Grapevine leafroll associated 7 (GLRaV- 7)

35

b)virusi razvrstani u rodove

Porodica

rod Sobemovirus

vrsta Sowbane mosaic (SoMV) Tabacco necrosisi (TNV) Potato X (PVX) Tobbaco mosaic (TMV) Grapevine A (GVA) Grapevine B (GVB) Grapevine C (GVC) Grapevine D (GVD) Grapevine berry inner necrosis (GIBNV)

Necrovirus Potexvirus Tobamovirus Trichovirus

Capillovirus . Furovirus Presunto nuovo genere Nema imena

Virus bez naziva Grapevine labile rod-shaped (GLRSV) Grapevine fleck (GFkV) Grapevine asteroid mosaic (GAMV)

c)nerazvrstani virusi

porodica

rod

vrsta Grapevine ajinashika

. .

(GAV) Grapevine stunt (GSV)

36

5.3. VIRUSI INFEKTIVNE DEGENERACIJE Pod pojmom infektivne degeneracije podrazumijeva se niz simptoma na vinovoj lozi u ijoj etiologiji moe sudjelovati nekoliko europskih NEPO virusa . To su virusi poliedrinoga oblika koje prenose nematode (xiphinema indeks i longidorus). Ova grupa ukljuuje najmanje 13 razliitih bolesti koje uzrokuju viroze na vinovoj lozi. U ovu skupinu su svrstani: virus lepezastog lista vinove loze (GFLV), virus mozaika guarke (ArMV), virus crne pjegavosti rajice (TBRV), virus prstenaste pjegavosti maline (RV), latentni virus prstenaste pjegavosti jagode (SRLV) i virus ukastosmeeg mozaika (GCMV) . Meu nabrojenima posebno mjesto pripada virusu lepezastog lista (GFLV) (Grapevine fanleaf virus) , jer je proiren u gotovo svim podrujima uzgoja vinove loze. U nas je est naziv iak ili metlica. Lepezatost lista vinove loze Zbog irenja po cijelom svijetu GFLV je najvaniji virus koji inficira vinovu lozu. Svi kultivari i hibridi mogu biti domaini GFLV. Infekcija moe uzrokovati ili brzo propadanje i smrt biljke ili duu bolest sa smanjenim rastom. Simptomi variraju sa virusnom kulturom i osjetljivosti sorte vinove loze. Virus se prenosi nematodama Xiphinema index i Xiphinema longidorus. irenje na vee udaljenosti se dogaa transportom inficiranih biljaka i sadnica. Simptomi koji karakteriziraju ovu bolest ovise o; vrsti virusa (GFLV), o sorti vinove loze i o uvjetima u okoliu. Znakovi bolesti oituju se u tri osnovna sindroma s nizom prijelaza:

Etiolgija gr. (aitia uzrok, povod + logos rije govor), znanost o uzrocima nekog reda pojava NEPO;nematode transmitted polyhedral shaped

37

5.3.1. Sindrom deformacije lia virus lepeze lista GFLV (Grapevine fanleaf virus) Na listovima dolazi do deformacija, asimetrini su, katkad naborani, esto izraeno nazubljenih rubova. Na listovima zbog znatne otvorenosti sinusa lista u dijelu peteljke i istodobnog suenja dijela plojke izmeu glavnih ila na listu, list poprimi izgled lepeze, po emu je bolest dobila ime. Sline se promjene mogu uoiti pri oteenju od herbicida (2,4D ili MCPA). Osim promjene u izgledu, mogu se pojaviti mozaine promjene ili blaga kloroza.
Slika13 - Klorotina lepezatost i deformiranost

Mladice imaju krae internodije, koji rastu cik-cak, katkada su popraeni fascijacijama. Sline promjene na mladicama mogu proizvesti i grinje (calepitrimerus vitis ), tripsi (drepanotrips reuteri, Anaphotrips vitis). U virotinih trsova su gale na listu izazvane grinjama ute boje ,a na zdravom listu zelene. Abnormalne mladice mogu biti spljotene s izraenim bifurkacijama, katkad i s pojavom fascijacija.
Slika14 - fascijacija cvata

Grozdovi su rehuljavi, bobe na grozdu ostaju male kasne u sazrijevanju. Biljke zaraene virusom esto su krljave i daju nii urod. Rehuljavost grozdova karakteristika je i za nedostatak bora, pa treba razluiti jednu pojavu od druge.

fascijacija - nakazna promjena na biljnom organizmu,koja se najee pojavljuje na stabljici,a svojstveno joj je da stabljika-mladica poprima oblik iroke vrpce ili upljeg valjka;moe se pojaviti na grozdu,i cvatu,listu i vitici bifurkacije - raljanje mladica iz jednog koljenca,ravaste dvojne mladice

38

Slika15 - ravanje, bifurkacija

5.3.2. Sindrom ukasto smeeg mozaika vinove loze (uti krom mozaik), GCMV (Grapevine chrome mosaic virus). Zaraeni trs se najlake uoava u proljee. U to doba svi zeljasti organi (listovi,vitice,mladice) mogu biti svijetloute boje. Boja varira intenzitetom posebno na listovima od svijetloute do krom ute. Promjena boje moe zahvatiti cijeli list ili samo dio izmeu ila. Ponekad se pojavljuje uta pjegavost koja moe dobiti oblik prstena ili linija. Promjeni boje mogu se pridruiti i abnormalnosti mladica spomenutih kod lepezastog lista. U ljetnim mjesecima kad se temperature podiu,simptomi virusne infekcije se smanjuju, uti dijelovi starih listova izblijede postajui bjelkasti, i novonastali vrni listovi imaju relativno normalan izgled.
Slika16 - uta pjegavost

5.3.3. virus mozaika guarke - ArMV (Arabis mozaic) Trei sindrom infektivne degeneracije prouzrokuje sline simptome kao GFLV (lepeza lista vinove loze) i esto dolaze zajedno. Uz pojavu kratkih internodija, dvostrukih koljenaca i otro nazubljenih listova, listovi i cvat su potpuno uti, a drvo mladice najee crveno.
Slika17 - Prosvjetljenje ila

Ostale simptome u kompleksu infektivne degeneracije karakterizira utilo u predjelu glavnih ila koje se difuzno iri po plojci u meuilni prostor. Unato promjeni u boji ne dolazi do deformacije lista. Grozdovi su mali i rehuljavi, a mogu i otpasti prije nego dozore. Istraivanja pokazuju da korovi uta vuja stopa (Aristolochia clematitis) i troskot, zubaa (Cynodon dactylon) mogu biti zaraeni virusom lepeze lista vinove loze.

39

U cijelom svijetu , GFLV uzrokuje velike ekonomske gubitke. Osim strogih testiranja materijala za razmnoavanje, uzgajaju se otporne sorte, a uinkovita kontrola vektora je praktiki nemogua. 5.4. UVIJENOST LISTA VINOVE LOZE - GVFL (Grapevine leafroll) Uvijanje lista je vjerojatno najrairenija virusna bolest vinove loze u cijelom svijetu. Taj kompleks virusnih bolesti loze izazivaju klosterovirusi, a u svijetu ih je poznato vie od deset. To su nitaste estice duine 2000nm. Prenose ih titaste ui, najvie sa sadnim materijalom. Najoitiji simptomi pojavljuju se krajem ljeta i poetkom jeseni , ovisno o interakciji domain patogeni okoli. Donji listovi na trsu savijaju se od rubova prema naliju, poprimajui ukruen izgled. Uz te pojave prisutna je tipina promjena boje na plojci lista. Na crnim sortama na plojkama dio izmeu glavnih ila poprime nijanse crvene boje, a u bijelih sorata listovi ute, a glavne ile zadre zelenu boju. Na osjetljivim sortama oplodnja je nepotpuna pa grozdovi ostaju rehuljavi. Bobice su manje i kasne u sazrijevanju. Sve to utjee na kvalitetu sirovine za vino. Bolest je latentna na podlogama koje vuku podrijetlo od amerikih vitis vrsta, ali nakon cijepljenja simptom se manifestira na plemki. Etiologija bolesti je sloena. Prema dananjim saznanjima nitasti virusi (GLRaV) oznaeni brojevima 1 8 mogu sudjelovati u njezinoj etiologiji. Klosterovirus GLRaV2 smatra se meu ostalim vanim agensom inkompatibilnosti nakon cijepljenja na podlogu kober 5BB. Meu nabrojenim virusima najei su ampelovirusi GLRaV - 1 i GLRaV 3, a njihovi prijenosnici su titaste ui. Virus GLRaV - 1 prenose: javorova titasta u; ljivina titasta u i lozina u GLRaV - 1 Je grupa od najmanje 7 seroloki zasebnih virusa koji se pojavljuju na vinovoj lozi, obino kao mijeana infekcija. Svi uobiajeni kultivari i korijenjaci mogu biti domaini virusima, ali na amerikim podlogama obino se ne razvijaju simptomi. Najupeatljiviji simptomi se mogu promatrati na crvenim sortama. Podruje lia crveni sa malom zelenom linijom uz glavne vene. Lie se uvija, a moe se i pojaviti nekroza na gornjoj epidermi. Dozrijevanje kasni a akumulacija ugljikohidrata u grou je smanjena. Kod bijelih sorata simptomi se oituju u laganom uenju lia. 40

GLRaV-1 se obino prenosi cijepljenjem na zaraene podloge koje ne pokazuju simptome. Da bi se kontroliralo irenje potrebno je testirati rasadni materijal. Vektori GLRaV 3 jesu: planococcus ficus, pseudococcus longispinus, pseudococcus affinis, pseudoccocus viburni, pseudoccocus maritimus i vunasta lozina u (Pulvinaria vitis). Za druge GLRa viruse vektori nisu poznati.

Slika 18 - uvijenost lista na bijeloj sorti

slika19 - uvijenost lista na crvenoj sorti

5.5 RAZNI TIPOVI NABORANOSTI DRVETA VINOVE LOZE (Rugose wood complex) Trsovi pogoeni ovom boleu manje su bujni, slabije napreduju, cvjetaju kasnije u proljee, a samo nekoliko godina nakon sadnje trs moe propasti. Karakteristini simptomi su redovito jasno vidljivi samo na podlozi. Rijetko, samo u nekih europskih sorata, pojavljuju se simptomi na podlozi i plemki. U zaraenih pa biljaka na vinove mjestu loze dolazi do inkompatibiliteta, cijepljenja nastaje

dijametralno proirenje plemke s obzirom na podlogu.

Slika 20 - Iljebljenost (izbrazdanost stabla)

41

Podloga ostaje tanja od plemke. Kora stabla trsa je zadebljana i izborana, poprimajui spuvastu strukturu. Ispod kore na povrini drva nastaju dulje ili krae udubine ili fisure koje podsjeaju na ljebove. Tipini sindrom plutavosti kore koji se moe zapaziti na jednogodinjim dijelovima trsa jest zadebljanje i raspuklina na bazalnim meukoljencima mladica. Novija su istraivanja pokazala da se radi o kompleksnoj bolesti koju uzrokuje nekoliko virusa, izazivajui sline simptome. Poznati su sluajevi potpune odsutnosti simptoma u trsova za koje se pouzdano utvrdilo da su zaraeni, a tek se testiranjem utvrdila nazonost patogena. Naboranost drva je kompleksna bolest od nekoliko uzronika koje je mogue identificirati biolokim testom uz pomo za to odreenih drvenastih testnih indikatora. Tako ima etiri tipa, od kojih su za tri poznati uzronici: Plutavost kore vinove loze (CB) corky barc; uzronik je GVB, prenose ga ui Nabornaost drvta podloge Rupestris du lot (RSP); uzronik je GPSPaV, a vektor nepoznat, vjerovatno se prenosi polenom Iljebljenost drveta podloge kober (KSG) uzronika GVA, a prenose ga ui Iljebljenost hibrida LN 33 (LNSG); uzroik kao i vektor nisu poznati.

Slika 21 - klasini simptomi plutavosti kore, u uspoedbi sa zdravom rozgvom

42

5.6. MANJE VANI VIRUSI I NJIMA SLINE PARAZITSKE BOLESTI 5.6.1. Priraslice (enacije) na listovima (Grapevine enation) Bolest ija je etiologija jo uvijek nepoznata, karakterizira je prisutnost proliferacija na donjoj strani mladih listova. Najupeatljiviji simptom su priraslice na naliju plojke. Glavne ile na listu postaju izraajnije, esto blie jedna drugoj zbog ega se list deformira. Listovi s enacijama su u pravilu manji od zdravih, a uz to poprimaju lepezast izgled. Broj listova s enacijama na zaraenom trsu
Slika 22 - enacije

moe jako varirati.

Kad je na listovima malen broj enacija ili ako se enacije pojave samo na malom broju listova, simptomi mogu lako ostati nezapaeni. Te promjene na listovima su uz to esto vezane za uoljivo kanjenje u kretanju vegetacije. Glavna karakteristika te biljne bolesti je ciklino pojavljivanje simptoma, koji se ne pojavljuju svake godine na istoj biljci. To upuuje na vie-manje dug latentni period, ovisno o biotskim i abiotskim imbenicima koji najvjerojatnije utjeu na njihovo pojavljivanje. Navedeni simptomi dosta su rijetko primijeeni na podruju Hrvatske. 5.6.2. Nekroza ilica lista (Vein necrosis) Ta zarazna bolest vinove loze jo se smatra slinom virusu budui da patogeni agens jo uvijek nije odreen. U europske vinove loze (V.vinifera) i u veine amerikih vrsta i njihovih krianaca (podloge), ne uoavaju se nikakvi vanjski simptomi. Karakteristini simptomi se pojavljuju nakon cijepljenja zaraene biljke vinove loze na podlogu V.rupestris V.berlandieri 110R i sastoje se od vrlo uoljive nekroze sekundarnih ila na listu.

proliferation franc. (proliferacija) nicanje, bujanje, umnoavanje

43

Slika 23 - nekroza ilica na indikatoru 110 R

Nekroze su uoljive u poetku na donjoj strani bazalnih listova a potom se proiruju prema gornjim listovima. Ponekad se mogu razviti koncentrine nekrotine zone rairene po rubu listova, na peteljci lista i na mladicama. Mladice na zaraenim trsovima su tanje i slabo odrvenjuju. Zaraene biljke su krljave i teko odolijevaju niskim temperaturama. iri se preko materijala za razmnoavanje. 5.6.3. Mozaik uz glavne ile lista (Grapevine vein mosaic disease) Zbog svoje jo uvijek neodreene etioloke prirode i ta se bolest ubraja u virusima sline bolesti vinove loze V.riparia. Gloire de Montpellier je u poetku zabiljeena kao vrsta jako osjetljiva na infekcije, pa je koritena kao drvenasti indikator. Bolest moe biti latentna u nekih europskih (V.vinifera) sorata i u pojedinih podloga. Simptomi se sastoje od blijeenja plojke, posebno du ilica. Ta pojava nastaje po pravilu u proljee ili u jesen. Posebno je uoljiva na biljkama koje se nalaze u sjeni ili koje su uzgajaju u zatienim prostorijama. Njezino irenje je vezano za zaraene materijale za razmnoavanje. 5.6.4. arena pjegavost lista (Grapevine fleck disease) Na mnogim sortama europske loze kao i podlogama simptomi se

manifestiraju, dakle ostaju latentni. To je vjerojatno i razlogom da se bolest znatno proirila. U nas je bolest dokazana. Simptomi se jasno vide na drvenastom indikatoru Vitis rupestris St. George u obliku prosvjetljavanja sekundarnih ila na plojci. Plojka lista moe biti deformirana i savinuta prema licu lista. Prenosi se cijepljenjem.
Slika 24 - arena pjegavost lista

44

5.7. VIROIDNE BOLESTI VINOVE LOZE 5.7.1. uta pjegavost (Vein speckle) Postoje est viroida vinove loze ali su samo dva zabiljeena : viroid ute pjegavosti 1 i 2 (GYSVd 1 i GYSVd 2), koji su patogeni za vinovu lozu. uta pjegavost prema vanjskim simptomima koje pokazuje je bolest koja je dosta varljiva, a uvjetovana je klimatskim i varijabilnim faktorima. Simptomi se sastoje od nekoliko do ezdesetaka kromskih utih tokica ili fleka rasprenih preko dijela ili cijele lisne povrine, ili su sakupljene oko glavnih ila. Kasnije stanje, znano kao pruganje ila, je pojaano sinerginim utjecajem popratne infekcije od GFLV (lepeze lista vinove loze) i viroida ute pjegavosti tipa 1 (GYSVd 1). Tipina uta pjegavost ne mora biti opasna, iako blijeenje ila ima jako tetan utjecaj na prinos odreenih sorata. Kao i sa drugim viroidima, GYSVd nema vektora, a se prenosi i iri se preko sadnog materijala. Mogu je mehaniki prijenos na druge vinograde preko povrinski zagaenog alata za rezidbu.
Slika 25 - uta pjegavost

5.8. FITOPLAZME INFEKTIVNE UTICE VINOVE LOZE (Grapevine yellows) Pod nazivom infektivne utice vinove loze podrazumijevamo nekoliko uzronika iz skupine fitoplazma koji izazivaju sline promjene na vinovoj lozi. Meu fitoplazmama koje izazivaju utice na vinovoj lozi navode se: Flavescence doree, Bois Noire i Aster yellows. tete su vrlo velike jer zaraeni trsovi propadaju, a oni koji preivljavaju nekoliko godina prije nego se osue, daju manje urode i slabiju kakvou groa za preradu (manje eera i visoke kiseline).

45

Bolest se pojavljuje periodino. Vjerojatno je pojava bolesti povezana s populacijom i pojavom vektora. Razdoblje oka traje obino jednu do dvije godine, nakon kojih dolazi do smirivanja bolesti. Sorte vinove loze su razliito osjetljive. Najosjetljivija sorta je chadonnay, zatim cabarnet sauvignon, frankovka, pinot bijeli, pinot sivi, pinot crni, traminac i td. U junoj Hrvatskoj zaraze su primijeene na sortama plavac mali crni, poip bijeli, grk bijeli i dr. Navedene fitoplazme uzrokuju gotovo identine simptome. Prve patoloke promjene pojavljuju se oko cvatnje, ali mnogo jasniji simptomi pojavljuju se krajem lipnja pa do kraja vegetacije. Znakovi bolesti mogu se pojaviti na cijelom trsu, rjee samo na mladicama jednoga kraka. Biljke sa simptomima ivotare 2 3 godine nakon ega propadaju. Pojedine biljke nakon te ok faze preive te dolazi do samoozdravljenja. Simptomi se pojavljuju na svim zelenim dijelovima vinove loze, ali variraju ovisno o sorti, vremenu infekcije i klimatskim prilikama. Ovisno o osjetljivosti kultivara simptomi mogu biti manje ili vie izraeni. Na zaraenim mladicama svi cvatovi se posue i tako osueni ostaju neko vrijeme na trsu. Nakon zavrene cvatnje simptomi na grozdovima oituju su u gubitku turgora i venuih boba i cijelog grozda. Mladice osjetljivih sorata ako su rano zaraene ostaju
Slika 26 - uenje lia i suenje grozdova

tanke, slabo i nepravilno dozrijevaju, a vrlo esto ostaju zeljaste do kraja vegetacije. Mladice se lako lome, a katkad dolazi do nekroze pupova.

Pri kraju vegetacije na mladicama se najbolje vide simptomi, zbog slabijeg i nejednakog odrvenjavanja mladica to je popraeno neujednaenom promjenom boje na njima. Katkad zakanjele u odrvenjavanju mladica zahvati samo neke internodije. Na mladicama osjetljivih kultivara mogu se pojaviti mala crna uzdignua poput pritia. Nedozrele mladice tijekom zime pocrne i osue se. Na listovima koji su izloeni suncu dolazi do promjene boje.

46

U bijelih sorata u zoni glavnih ila nastaju razliiti stupnjevi promjene boje, od svijetlozelenih do utih, a uz to boja ima specifian metalni odsjaj.
Slika 27 - uenje lia i nekroza uz glavne ile

U crnih sorata nastaju sline promjene, svijetlog do tamnog crvenila na listovima. Uz promjenu boje katkad se pojavljuju nekroze na plojci. Istodobno dolazi do karakteristinog savijanja rubova plojke prema naliju, tako da savijeni list poprimi trokutast oblik. Plojka nije savitljiva i stisnemo li ju, lako puca. U Bois Noire esto se pojavljuje pocrnjenje neodrvenjelih mladica, po emu je bolest dobila ime. Ostali simptomi su manje - vie isti.
Slika 28 - bois noir u crnih sorata

Flavescence doree fitoplazmu prenosi cikada Scaphoideus titanus, a fitoplazmu Bois Noire cikada Hyalesthes obsoletus, Reptalus panzeri; prijenosnik fitoplazme Aster yellows je za sad nepoznat.

Slika 29 - Cikada

slika 30 - jaja cikade poloena pod koru trsa

47

6.OSNOVNE MJERE SUZBIJANJA VIRUSNIH ZARAZA

Da bi se izbjegle infekcije treba saditi samo potpuno virusno testiranu lozu da se smanji rizik od unoenja virusnih bolesti u vinograd. U budunosti bi se mogla oekivati rjeenja s rezistentnim tipovima, koji su ponudili genetiari. Za sada je na selekcionerima i rasadniarima da proizvedu i stave u promet certificirani sadni materijal. Samo takav material je jamstvo sortnosti i zdravstvenog stanja cijepa i osnovna mjera zatite. Radi suzbijanja virusa mogu se poduzimati razne mjere, a to su : preventivne i terapijske mjere. Terapijske mjere kao to je terapija povienom temperaturom se koristi kod selekcije i sanitacije pri proizvodnji cijepova. Kemijske mjere ne daju dobre rezultate i unitavaju samu stanicu u kojoj se virus nalazi. Virusi su kao paraziti iznimno vezani za metabolizam stanice domaina i ako se eli unititi virus, moraju se unititi i fizioloki procesi same stanice. I zbog toga se u suzbijanju i kontroli irenja virusa koriste preventivne mjere a to su: 6.1. Uklanjanje i izbjegavanje izvora zaraze - Uklanjanje korovnih biljaka, koji su esto rezervoari virusa i izvor virusnih zaraza. Stoga korove treba iskorijeniti odgovarajuim kultivacijskim zahvatima i herbicidima (pr. Divlji sirak). - Uklanjanje inficirane loze iz vinograda, - Higijenske mjere u obradi, vano je kada su u pitanju stabilni virusi kao TMV. Treba ukloniti biljne ostatke iz tla, treba voditi rauna o tome da se ne kontaminira odjea, ruke te alat kojim se obrauje. Dezinfekcija alata i ruku se moe obaviti 3 10 % otopinom Na3PO4. - Uporaba bezvirusnog sadnog materijala, vinova loza se razmnoava vegetativno, a ako je izvorna biljka inficirana i ako se od nje uzima vegetativni materijal za razmnoavanje, tada e svi potomci koji potjeu od te biljke biti inficirani. No u nedostatku bezvirusnog izvora, od inficiranog se klona ipak mogu metodom kulture vrnog meristema ili metodom poviene temperature uzgojiti bezvirusne biljke, koje mogu biti izvor bezvirusnog sadnog materijala. Tim se metodama mogu

48

izbjei virusne zaraze sadnog materijala koje se danas lako i brzo ire i meukontinentalno. 6.2. Suzbijanje vektora - Kemijsko suzbijanje vektora: suzbijanje insekata, a suzbijaju se insekticidima. Time se uspjeno suzbijaju virusi koji se prenose na perzistentan nain, jer je potrebno vie vremena dok insekt preuzme virus i zarazi biljku. - Suzbijanje korovskih biljaka koji su domaini virusnih vektora herbicidima. - Suzbijanje nematoda. Obraivanje tla nematocidima, no tim se nainom ne mogu suzbiti sve nematode jer se one nalaze duboko u tlu i neke su izvan domaaja pesticida. - Suzbijanje gljivica, unitavaju se spore gljivica, osobito njihove pokretne spore (zoospore), a preko njih se prenose neki biljni virusi. Za suzbijanje se koriste razliiti pripravci kojima se zadimljuje (fumigira tlo), metil bromid. Suzbijanje spora gljiva fungicidima kao izvora virusnih zaraza i vektora virusa, isplativo je samo kada se obrauju male povrine. 6.3. Spreavanje virusnih infekcija kultiviranjem otpornih biljaka Do otpornih (rezistentnih) sorata dolazi se selekcijom i uzgojem. Razlikuje se genetski kontrolirana (nasljedna) otpornost i steena (inducirana) otpornost. Inducirana otpornost nije nasljedna i biljka ga stjee odgovarajuom obradom prije infekcije. Primjerice, zdrava biljka se inficira blagim sojem virusa i tako biljka razvije otpornost na agresivniju infekciju tim istim ili usko srodnim virusom. Taj se postupak zove ukrina zatita bilja. Inducirana se otpornost isto moe postii tako da se u zaraenu biljku inokulira salicilna kiselina (aspirin), i jo dodatno virus, pa e infekcija biti ograniena ili sprijeena. Pronalaenje otpornih biljaka se temelji na nasljednoj otpornosti. Uporaba virusno otpornih biljaka u spreavanju virusnih infekcija ima prednost pred ostalim nainima suzbijanja viroza. Izbjegava se uporaba insekticida, hrana je zdravija, smanjuje se oneienje okolia a smanjuje se i mogunost da insekti steknu otpornost na insekticide. Uporabom otpornih biljnih sorata na virusne 49

infekcije, suzbijaju se neperzistentni virusi koji se drugim postupcima teko mogu suzbiti

6.3.1. certifikacija Zdravstveno poboljanje se postie kroz selekcije i zdravstvene mjere koje se najbolje istiu u okviru certificiranih programa. Certificirani cijepovi garantiraju: ispravnost vrste, osnovne kvalificirane znaajke i sanitarni status. Takav materijal nosi oznaku VT (virus tested), to znai da nije zaraen virusima niti fitoplazmama koje izazivaju ekonomske tete i posebno je oznaen. Certifikacija se moe definirati kao procedura gdje se kandidat majke biljke koristi kao izvorni materijal za razmnoavanje, i prolazi kroz kontrole i kad god je potrebno tretmane da se osigura istoa i odsustvo patogena. Specificira se propisima odreenim ili potvrenim od ovlatene vladine agencije. Testiranje je predvieno za ove viruse vinove loze: Za sorte 1. lepezasti list vinove loze Grapevine Fanleaf Virus (GFLV) 2. virus mozaika guarke Arabis Mosaic virus (ArMV) 3. virus uvijenosti lista vinove loze Grapevine Leafroll Virus (GLRV) a) uvijenost lista pridrueni virus 1 Grapevine Leafroll associated virus 1 (GLRa V 1) b) uvijenost lista pridrueni virus 3 - Grapevine Leafroll associated virus 3 (GLRa V 3). Za podloge 4. virus arene pjegavosti lista Grapevine Fleck Virus (GFkV) Predvia se i testiranje i analize na prisutnost fitoplazma. 1. flavescence doree (FD) 2. Bois Noire (BN) 3. Aster yellows (AY)

50

6.4. Glavni termini koji se danas upotrebljavaju u oznaavanju otpornosti biljaka: Osjetljivost, biljka je osjetljiva ako je virus lako inficira i ako se lako razmnoava unutar nje. Suprotan pojam otpornosti je rezistentnost (otpornost). Imunost, biljka je imuna na neki virus ako je taj virus ne moe inficirati tj. Kad biljka nije domain toga virusa. Pojam imun se jo upotrebljava kada virus ne moe inficirati samo jednu odreenu sortu neke biljne vrste dok su ostale sorte normalno osjetljive. Rezistentnost, biljka je rezistentna ako je sposobna smanjiti ili sprijeiti razmnoavanje virusa ili ako je sposobna sprijeiti ili odgoditi pojavu prvih simptoma. Dakle rezistentna biljka ne pokazuje simptome bolesti ili pokazuje male simptome. Tolerantnost, ovu osobinu pokazuju biljke koje virus moe zaraziti, ali koje zbog svog genetskog ustroja, pokazuju blage ili gotovo neprimjetne simptome zaraze; u takvim biljkama se virus normalno razmnoava i iri sistemno. Tolerantnost biljke prema virusu je nasljedna otpornost biljke. Za viegodinje biljne vrste to i nije dobro jer onda mogu biti potencijalni izvori zaraze. Hipersenzitivnost ili preosjetljivost , neke biljke reagiraju na virusnu infekciju tako da tkivo, u kojem je dolo do prvotne infekcije, vrlo brzo ugine (nekrotino tkivo). Kod nekih hipersenzitivnih biljaka virus se prestaje dalje iriti kroz uginulo tkivo. Svaranje nekrotinih lokalnih lezija je isto hipersenzitivna reakcija; virus je u leziji ogranien na inokulirane i susjedne stanice koje brzo nakon infekcije uginu. U nekim sluajevima virus je posve ogranien na mjestu lokalne lezije, a u drugim sluajevima se virus brzo iri kroz ilni sustav biljke, uzrokujui nekroze u ilama te brzo uginue dijelova biljke ili smrt biljke. Hipersenzitivnost je nasljedna osobina pa se selekcijom mogu dobiti hipersenzitivne sorte.

51

ZAKLJUAK Ukupni svjetski gubitci u biljnoj proizvodnji, koje uzrokuju sve biljne bolesti zajedno, iznose oko 60 milijardi amerikih dolara na godinu. Glavni uzroci tih gubitaka su gljivine bolesti, a odmah nakon njih virusne bolesti Suvremeno vinogradarstvo se danas susree sa sve veim prisustvom viroza. tete od virusa mogu biti vrlo znaajne i uzrokuju ozbiljne posljedice na zdravlje vinove loze, urod i kvalitetu vina. Urod se smanjuje 5 10%, a virusi mogu utjecati i na kvalitetu vina uzrokujui odgodu akumulacije eera, slabo razvijanje kiselina, i boje. Virusi se sastoje od nukleinske kiseline i proteinskog omotaa, a jedinstveni su u prirodi po tome to, za razliku od svega ostalog ivog, sadre samo jedan tip nukleinske kiseline ili samo DNA ili samo RNA. Jednom kada virus ue u ivu biljku ima sposobnost da reprogramira biljnu stanicu u svoju korist i na taj nain se razmnoava. U vinovoj lozi virusi se ire sistemino, na sve dijelove loze (korijenje i vegetativne dijelove). Jednom zaraena biljka ostaje zaraena cijeli ivot. Na zaraenim trsovima slabiji je porast mladica, rijetko nastupa uginue trsa, a vidljivi simptomi mogu biti vie ili manje izraeni to ovisi o virulentnosti soja i osjetljivosti sorte. Identifikacija virusa vinove loze je vrlo delikatna, a metode koje se primjenjuju (vizualna detekcija, indeksiranje na Vitis indikatore, seroloke metode - ELISA, PCR metoda) se meusobno nadopunjuju. Ljudi su najuinkovitiji prijenosnici virusnih bolesti preko premjetanja i razmnoavanja podloga i plemki koji su zaraeni virusom i gotovim biljem. Veina virusa ima i druge naine irenja putem sjemena, korova, peluda, gljivica. Insekti ili drugi organizmi koji ire virus zovu se vektori. Za razliku od drugih uzronika bolesti virusi se ne mogu suzbijati, mogu se jedino primijeniti preventivne mjere. Osnovni vid borbe protiv virusa vinove loze, je osiguranje zdravog, certificiranog sadnog materijala.

52

Literatura 1. Nikola Jureti; Osnove biljne virologije; kolska knjiga, Zagreb 2002. 2. Nikola Miroevi; Razmnoavanje loze i lozno rasadniarstvo; Golden marketing tehnika knjiga, zagreb, 2007. 3. Milan Maceljski, Bogdan Cvjetkovi, Zvonimir Ostoji, Boena Bari; tetoinje vinove loze; knjiga 54; akovec:Zrinski d.d.,2006. 4. Internet : Ed Weber, Deborah Golino & Adib Rowhani ; Laboratory testing for grapevine diseases; URL:http://www.practicalwinery.com/janfeb02p13.htm. IAM Plant Biotech Unit;Plant pathology webpages; URL:http:// www.boku.ac.at/iam/pbiotech/phytopath/col.html#esfy Site for plant virologist; Descriptions for plant viruses; URL: http://www.dpvweb.net/index.php. Graft transmissible diseases of grapevine; URL: http://www.fao.org Virusi; URL: http://hr.wikipedia.org.wiki / virusi # column one # column one PCR; URL: http://hr.wikipedia.org.wiki / PCR # standardni PCR# standardni PCR Naini irenja virusa; URL: http:// www.biolozi.net/ upload/ Anin_drugi_deo.pdf. Phitoplasma diseases; Ministry of Agriculture and Lands,British Columbia URL: http:// www.gov.bc.phitoplasma.htm , Grape virus diseases; Ministry of Agriculture and Lands,British Columbia URL: http:// www.agf.gov.bc.ca/cropprot/grapeipm/virus Arabis mozaic nepovirus; URL: http:// www.eppo.org/QUARANTINE/virus/Arabis_mosaic_nepovirus Nematodes; URL: http://maths.gla.ac.uk/ nematodes.html Virus diseases; URL: http://wine.edu/virology/virus diseases.html Grapevine disease testing; URL: http://www.mercier-groupe.com

53