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PRACTICA N7

CONTROL MICROBIOLOGICO EN ENLATADOS

I. FUNADAMENTO TEORICO

En general, los microorganismos se asocian con grupos particulares de alimentos. stos pueden sobrevivir al tratamiento trmico requerido para el enlatado o bien contaminar el alimento despus de dicho tratamiento debido a suturas o fugas del envase. Cuando la contaminacin es anterior al tratamiento, es posible predecir el microorganismo responsable si se conocen bien la naturaleza del alimento y las condiciones a las que se ha sometido dicho alimento. Sin embargo, los microorganismos que se introducen por fugas pueden ser muy variados al igual que la composicin de los medios de enfriamiento.

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Tabla. Clasificacin de los alimentos segn su acidez (Cameron y Esty, 1940) y grupos de microorganismos causantes de alteraciones en alimentos enlatados. Grupos segn grado de acidez Productos Grupo 1: poco cidos >5 crnicos Productos marinos Leche Hortalizas Mezclas de Grupo 2: semicid os 4,5 pH 5,0 < < carne vegetales Sopas Salsas Tomates Grupo 3: cidos 3,7 pH 4,5 < < Peras Higos Pia Otras frutas Grupo 4: muy cidos Encurtidos PH 3,7 < Pomelo Zumos ctricos Bacterias esporuladas Bacterias esporuladas Levaduras Mohos no y Aerobios esporulados Anaerobios esporulados Levaduras, mohos y bacterias esporuladas no Rango de pH Grupos de alimento Microorganismos

Segn los requerimientos de calor los microorganismos pueden ser, de menor a mayor exigencia: psicrfilos, mesfilos, termfilos y termodricos, siendo los dos ltimos los que ms interesan desde el punto de vista del tratamiento trmico. Los
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termfilos son capaces de desarrollarse a elevadas temperaturas (55 C y ms), mientras que los termodricos son capaces de resistir el efecto de las altas temperaturas. Sin embargo, los organismos mesoflicos pueden ser termodricos debido a sus esporas, al igual que pueden serlo las esporas de las bacterias termoflicas (Desrosier, 1987). A su vez, Cameron y Esty (1926) clasifican a los organsmos termfilos en dos grupos: termfilos obligados (crecen a 55 C, pero no a 37 C) y termfilos facultativos (crecen a 55 C y a 37 C). Segn las necesidades de oxgeno los microorganismos pueden ser: aerobios (requieren la presencia de oxgeno), anerobios (slo se desarrollan en ausencia de oxgeno o con baja tensin de oxgeno) y anaerobios facultativos. 2. MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS DE ACIDEZ BAJA Y MEDIA 2.1. AEROBIOS ESPORULADOS Los ms difundidos son los del gnero Bacillus, que tiene su origen en el suelo y agua, por lo que casi siempre estn presentes en las materias primas empleadas en conservas. Su temperatura ptima de crecimiento oscila entre los 28 y 40 C para la mayora, aunque existen algunos termfilos, que pueden desarrollarse a 55 C e incluso 70 C. Entre estos podemos encontrar, tanto aerobios obligados, como anaerobios facultativos, estos ltimos capaces de crecer en condiciones de vaco. Los tipos de alteraciones que pueden tener lugar son: la fermentacin simple, la produccin de gas y la de cido y gas. La fermentacin simple es la ms comn y se debe al ataque de los carbohidratos con produccin de cido y sin produccin de gas. B. stearothermophilus y B. coagulans son los principales termfilos causantes de la fermentacin simple. El primero, en productos de baja acidez (guisantes, hortalizas...;no crece con un pH menor de 5), sometidos a un tratamiento trmico relativamente intenso, aunque no GUIA DE LABORATORIO Biol. Ms. C. Alicia Decheco Egusquiza 133
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se produce la alteracin cuando el enfriamiento es rpido y si se realiza el almacenamiento en fro. B. coagulans es acidrico (pH de hasta 4,2) y presenta esporas menos resistentes al calor, por lo que las alteraciones tienen lugar en las carnes enlatadas, ya que el tratamiento trmico para stas es ms bajo que en las hortalizas. Tambin aparece asociado a productos cidos (jugo de tomate), ya que por su bajo pH el tratamiento trmico es ligero. La produccin de gas por aerobios esporulados se debe a la denitrificacin del nitrato en carnes curadas enlatadas, maiz, guisantes, etc. B. cereus y B. mesentericus aparecen en salmn, cangrejos y gambas. B. macerans y B. polymixa forman cido y gas.

2.2. ANAEROBIOS ESPORULADOS Los anaerobios esporulados proceden principalmente del suelo, por lo que se encuentran ampliamente distribuidos en la leche, hortalizas y otros productos alimenticios. Tambin es posible encontrarlos en la carne, ya que algunas especies tambin se desarrollan en los intestinos del hombre y animales. El gnero ms importante es el Clostridium, pudiendo encontrar organismos termfilos y mesfilos. Entre los primeros, los sacarolticos son los ms importantes, produciendo gran cantidad de gas a partir de los carbohidratos, principalmente dixido de carbono e hidrgeno, lo que da lugar al abombamiento de las latas. Estas alteraciones van acompaadas de un olor butrico. No producen cido sulfhdrico. La temperatura ptima de desarrollo se sita alrededor de los 55 C, apareciendo sobre todo en pases clidos, donde las temperaturas de almacenaje pueden sobrepasar los 35 C. Tambin los termfilos pueden ser causantes de una alteracin sulfurosa, en este caso con produccin de cido sulfhdrico.

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Los organismos mesfilos son los segundos en importancia despus de los causantes de la fermentacin simple. Entre estos destaca Clostridium botulinum. Se trata de una bacteria Gram positiva, anaerobia y esporgena, cuyo crecimiento queda inhibido a pH menor de 4,5. Sin embargo, los organismos aerbios de un alimento pueden crecer y usar el oxgeno en un recipiente, creando condiciones anaerobias adecuadas para su desarrollo y en un producto cido puede crecer C. botulinum, si est presente, cuando el cido haya sido utilizado por otros organismos, aumentando el pH. Es el ms resistente de los microorganismos que intoxican los alimentos, por lo que la industria de enlatado admite de forma general que todos los productos no cidos tratados deben cumplir los requerimientos bsicos necesarios para destruir a C. botulinum (esterilizacin durante 2,8 minutos a 121,1 C). En los alimentos correctamente procesados no se produce el desarrollo de esta bacteria, aunque existen alimentos con porciones slidas en los que puede haber heterogeneidad de PH durante cierto tiempo, por lo que debe mantenerse un pH inferior a 4,5 como margen de seguridad. Este microorganismo merece especial mencin debido a su significancia para la salud humana. Se presenta tanto en forma vegetativa como de esporas, siendo estas ltimas la forma importante desde el punto de vista del enlatado de alimentos. La forma vegetativa se destruye fcilmente a temperaturas menores de 100 C, mientras que las esporas, que proceden del polvo y del suelo, pueden sobrevivir 300 minutos de ebullicin a 100 C. stas varan su resistencia al calor, siendo difcil obtener una suspensin de esporas de resistencia uniforme al calor para su estudio. Tiene poderes proteolticos y sacarolticos. La toxina botulina es soluble en agua y extremadamente letal para el hombre (tipos A y B). Las esporas deben germinar para producir una clula vegetativa que produce la toxina, por lo que es poco probable encontrar presente el organismo con su toxina, de forma que el alimento puede ser ingerido por ausencia de indicios de contaminacin (sabor u olor extraos). Dicha toxina es destruida por exposicin durante diez minutos a calor hmedo a 100 C. La determinacin del tipo de toxina se lleva a cabo mediante reacciones antignicas.
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La temperatura ptima de crecimiento de los organismos mesfilos oscila entre los 20 y 50 C (algunos menos y otros ms, aunque generalmente es de 37 C). Segn su capacidad para atacar a los hidratos de carbono pueden ser de dos tipos: proteolticos o putrefactivos y sacarolticos. Los primeros son causantes de alteraciones gaseosas con degradacin del alimento y produccin de compuestos de olor desagradable. stos son ms importantes en los alimentos de acidez baja y media, excepto en el jamn york enlatado, en el cual se producen alteraciones de tipo sacaroltico causadas por C. perfringens. Destacan C. hystolyticum, C. sporogenes y C. bifermentans. Entre los de tipo sacaroltico los ms frecuentes son C. butyricum, C. pasteurianum, C. perfringens y otros. 2.3. LEVADURAS, MOHOS Y BACTERIAS NO ESPORULADAS Los nicos importantes en los alimentos de acidez baja y media son aqullos con resistencia trmica relativamente baja, los que producen alteraciones por fugas en la lata y aqullos que producen alteraciones en la leche condensada y las carnes curadas enlatadas (jamn, bacon, etc.). Entre las levaduras destacan las fermentadoras de la sacarosa que se desarrollan en la leche condensada, ya que este alimento no es sometido a ningn tratamiento trmico, sino que la base de su conservacin radica en su elevado contenido en azcar. Torula globosa, de clulas redondeadas, ocasiona la distensin de las tapas de las latas. Torula lactiscondensis, de clulas ovales, produce una fermentacin muco ms vigorosa, por lo que las latas pueden reventar en pocos das. Aspergillus repens es un moho que da lugar a la formacin de botones en la superficie de la leche condensada. Dentro de las bacterias no esporuladas destacan: - Pseudomonas fluorescens, que poduce rancidez.

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- Streptococcus liquefaciens, que provoca la licuefacin de la gelatina del jamn enlatado. - S. faecicum y S. faecalis, son estreptococos fecales que producen olores y sabores anormales en jamones enlatados. El primero es de mayor inters debido a su mayor termorresistencia. - Las Enterobacteriaceae (coliformes, Aerobacter, Proteus sp., etc.) son responsables del abombamiento del jamn enlatado. 3. MICROORGANISMOS EN PRODUCTOS CIDOS En la mayora de los casos se controlan fcilmente con un tratamiento trmico relativamente corto a una temperatura inferior a los 100 C. 3.1. BACTERIAS ESPORULADAS Podemos encontrar bacterias anaerobias sacarolticas y otras responsables de la fermentacin simple. Dentro de las primeras destacan Clostridium pasteurianum, que produce la alteracin gaseosa de frutas y tomates enlatados y que no se desarrolla a pH inferior a 3,7, y C. butyricum, que afecta tambin a las frutas enlatadas. Bacillus coagulans es responsable de la fermentacin simple en el jugo de tomate enlatado, ocasionando adems sabores anormales. Es termfilo y se desarrolla aun pH de 4,2. B. macerans, produce alteraciones gaseosas en frutas enlatadas y unto a B. polymixa, en hortalizas y frutas enlatadas. 3.2. BACTERIAS NO ESPORULADAS Son bacterias Gram positivas productoras de cido lctico (cocos y bacilos) y algunas son productoras de gas. Pueden desarrollarse con escasa tensin de oxgeno y son responsables de fermentaciones de vegetales. Se destruyen con tratamiento trmico a menos de 100 C.
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Lactobacillus brevis causa una vigorosa fermentacin en Ketchup y productos similares y es formador de gas. Leuconostoc pleofructi produce la alteracin de los jugos de fruta, dando lugar a la formacin de una pelcula de limo en las soluciones de azcar (alteracin de productos de tomate). Leuconostoc mesenteroides da lugar a la alteracin gaseosa de la pia enlatada. 3.3. LEVADURAS Presenta escasa resistencia al calor, por lo que no son frecuentes en enlatados sometidos a tratamiento trmico y s cuando el tratamiento es subtrmico o cuando se producen fugas. Son responsables de la fermentacin de salsas cidas, gelatinas y productos similares cuya conservacin depende de los cidos, el azcar y la sal. 3.4. MOHOS Byssochlamys fulva es la especie de mohos de mayor importancia en los alimentos enlatados cidos. Afecta a frutas enlatadas y embotelladas. Es responsable de la desintegracin de la fruta por descomposicin del material pectnico. Las latas a veces se abomban debido al desprendimiento de dixido de carbono. Su temperatura ptima de crecimiento es de 30-37 C y resulta altamente resistente al calor. Byssochlamys nivea es semejante al anterior y es mucho ms frecuente en la alteracin de fresas enlatadas. Penicillium afecta a las grosellas enlatadas y es altamente termorresistente. Aspergillus tambin es termorresistente y se presenta en las fresas enlatadas. Rhizopus nigricans es responsable de la degradacin de las frutas enlatadas y especialmente del albaricoque.
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Rhizopus stolonifer ocasiona el ablandamiento de los albaricoques enlatados.

II. OBJETIVOS Determinar en muestras analizadas de conservas en lata: Recuento de colonias Anaerobias Termofilas (31 1C). investigacin y Recuento de Enterobacterias. Investigacin y Recuento de Eicrococcus y Leuconostoc Investigacin de Bacillus Investigacin de Clostridium. Recuento de Mohos y Levaduras,

III. MATERIALES Y METODOS

Placas petri estriles (100*15 mm) Pipetas graduadas de 100ml. Embudo de vidrio. Incubadoras reguladoras de 35 y a 55. Cuarto estril o laminar. Microscopio. Potencimetro. Placas con agar CASOY. Placas con agar para aerobios seg. BREWER. cubculo de siembra estril o cabina de flujo

Medios para alimentos de PH < 4.6 ( baja acidez ). Tubos de 200 *25 mm conteniendo 50 ml de caldo- cerebro corazn con 0.1% de almidn soluble ( aerobios).

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Tubos de 200 *25 mm conteniendo 50 ml de caldo- cerebro corazn con 0.1% de almidn soluble y 0.05% cisteina ( anaerobios ).

Medios alternativos: Tubos de 200*25 mm con 50 ml de medio de cultivo PE2( para aerobio y anaerobios ).

Medio para alimentos < 4.6 (cidos). Tubos de 200*25 mm conteniendo 50ml de medio de carne de naranja ( para bacteria y hongos ) . Tubos de 200 * 25 mm conteniendo 20 ml caldo de APT (bacterias cido lctico ). Parafina estril . Solucin de bicloruro de mercurio de 1: 1,000. Alcohol, etlico 70%. Abridor de latas . Vstago de metal con punta en unos de los extremos . Escobilla . Detergente . Recipiente con agente desinfectante . Muestras de enlatados Asa de siembra con mango de kolle Tubos de ensayo Pirex con tapa estriles Placa petri Pyrex estriles Gradilla de tubos Lunas de reloj, esptula y baguetas Vasos precipitados y Erlenmeyers Probetas y Pipetas estriles Mechero Bunsen 140
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de contenido de

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Incubadora Estufa Autoclave Balanza Analtica Jarra de Anaerobiosis.

Reactivos y medios de cultivo Agua destilada Agua Peptonada Caldo Lactosado Caldo Selenito Agar Dextrosa-triptona Agar Saboraud Agar Mc. Conkey Agar SS Agar TSI Agar LIA Agar Cirato

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IV. PROCEDIMIENTO TECNICAS DE EXAMEN Examen externo Adems preliminar.

de anotar el numero del lote , dimensiones de la lata y peso, visual del recipiente par detectar la presencia de corrosin , en los hallazgos

realizar la inspeccin

defectos mecnicos , integridad de las saturas , preformaciones, abolladuras u otras anormalidades que bacteriolgicos. Incubacin prelimar. incubar las latas aparentemente PH de alimentos enlatados. pueden ser tiles

normales segn las condiciones del PH

del producto del examen , de acuerdo a la tabal de rangos normales de - alimentos de PH > 4.6 ( mediana y baja acidez ) incubar a por 10 a 21 das . NOTA : las conservas de carne que llevan 55C . harinas o almidones como ingredientes , incubar adems a - 10 das . Preparacin de la lata. 35C - 50C

- alimentos de PH < 4.6 ( cidos y altamente cidos ) incubar a 55C por 7

a. Retirar la etiqueta lata. b. Lavar con agua jabonosa y con escobilla, enjuagar con abundante agua limpia y secar.

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c. Colocar entre d. Incubar las

dos hojas

de papel

de

filtro limpios

para

detectar

cualquier perdida del producto durante la incubacin . latas a la temperaturas indicadas , durante el periodo las traducen por como lata de incubacin preliminar , agitar las latas cada 2 das separar que presenten manifestacin de crecimiento , que se abombamiento alterada. e. Si al termino del periodo de incubacin , las latas no presentan signos de alteracin realizar control de esterilidad o microfugas y proceder a su examen

Muestreo de latas SI las latas tienen salidas de gas o estas abombadas, se examinan seis y se toman seis latas normales de otro Iote como testigos. Cuando se sospecha tratamiento insuficiente se examina seis a doce latas de cada lote. Las alteraciones por cierre defectuoso es probable se presentan solamente en un numero pequer1o de latas de un lote, por lo que se examinan tantas como sean posibles. Examen fsico Se examinan las costuras y las superficies de las latas. Una sierra de joyero es til para cortar a travs de las costuras. Se anotan los nmeros del lote o cdigo impresos en las etiquetas o estampados en la tapa. PRE -incubacin Se incuban las latas aparentemente sanas durante seis das a 35-37C. As se favorece la multiplicacin de pequeas cantidades de organismos que, de otra forma, pueden pasarse por alto al tomar muestras del contenido. Muestreo del contenido: latas de aspecto normal
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Frotar la parte superior de la lata con algodn y alcohol metlico. Verter 1 mI de alcohol sobre la lata frotada y flamear/a. Esperar que el alcohol, se queme por completo. Si el contenido de lata es lquido, con un punzn de 10 cm. (que se esterilizan en recipientes de hojalata que contienen 10-12 punzones en la estufa de aire) se punciona la superficie flameada mediante un golpe brusco con un martillo. Se lleva una muestra del contenido con una pipeta Pasteur a un medio de cultivo ya un matraz de tapn rosca do para recuentos de grmenes viables si es preciso. Si el contenido es slido se usa un punzn hecho de varilla de bronce de 9-10 mm de dimetro con un extremo estirado en punta. Estos punzones se esterilizan individualmente. Conducir bien el punzn para hacer un orificio grande. Se separa una muestra de la parte central mediante un trozo de tubo de vidrio de 7-8 mm de dimetro externo empujndolo verticalmente hacia el fondo de lata. Se empuja la muestra de la parte central desde el tubo de vidrio hasta un frasco de tapn roscado mediante un trozo de varilla de vidrio de grosor adecuado. Los tubos de vidrio para las muestras y las varillas se esterilizan juntos en cajas de cobre para pipetas. Hago un muestreo del contenido: latas con escape de gases o abombadas Contienen gas a considerable presin y el contenido puede ser peligroso. Se coloca la lata en una bandeja de metal. Frotar con alcohol y flamear como se describe antes. Se invierte un embudo previamente esterilizado sobre la lata. El dimetro del embudo puede ser ligeramente mayor que el de lata. Se pasa una varilla de bronce esterilizada con uno de sus extremos puntiagudo, por el tubo de embudo hasta que se apoye sobre la lata; se sujetan ambos firmemente y se punciona la lata golpeando la varilla con un martillo, quitando despus con suavidad la varilla. El contenido de la lata puede proyectarse con alguna fuerza.,
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pero el embudo y la bandeja impedirn su desimanacin. Antes de quitar el embudo y la varilla de bronce se empuja esta ultime hacia adentro y afuera del orificio de la late varias veces. A veces, un trozo de alimento obtura el agujero por la presin interna de los gases y cuando se introduce un tomador de muestras se proyectan ms gases y alimento. Se toman las muestras con una pipeta Pasteur o con un tomador de muestras, como ya se ha descrito. Despus de tomar las muestras se abre la lata con un abrelatas de uso domestico y se examina el contenido. Examen de extensiones directas Se hacen extensiones teidas por el Gram de la muestra. La presencia de bacilos Gram positivos pueden indicar tratamiento insuficiente; la de cocos, levaduras, etc., cierto defectuosos. Los grmenes que se observan pueden estar muertos, matados durante, el tratamiento, de forma que no debe ponerse mucha seguridad en este examen. Cultivo Para el examen general se siembra agar dextrosa triptona (con prpura de bromocresol como indicador) y se incuba aerobia y anaerobiamente a 22-25 C, 35-37 C, y 55-60 C durante 24-36 horas. Si esta indicado, se siembran tambin los siguientes medios: medio hierro-slfuro (productores de la fetidez sulfhdrica, agar sangre, MacConkey) para grmenes de la putrefaccin, Micrococos, Leuconostoc, etc., medio de leche de Crossley (esporulados de la putrefaccin aerobios y anaerobios), medio de Sabouraud u otros medios mitolgicos (para levaduras y hongos).
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Se hacen extensiones de las colonias que se tian con el Gramo Flora microbiana Se identifican como sigue: 1. Bacilos Gram Positivos a) Termfilos: i. Aerobios: B. stearothermophilus (agriado sin abombamiento) ii. Anaerobios: CI. thermosaccharotyllcum (abombamiento duro) iii. Anaerobios: colonias negras en el medio de sulfuro de hierro: VI. Nigrificans b) Mesfilos: I. II. 2. Aerobios: Bacillus Anaerobios: Clostridium

Bacilos Gram negativos Grupos Pseudomonas - Achromobacter - Enterobacterias.

3.

Cocos Gram positivos Micrococos. Leuconostoc.

4.

Levaduras y hongos

Grmenes patgenos en alimentos enlatados Recientes brotes de fiebre tifoidea y enfermedad estafilococca han llevado a los bacterilogos de alimentos, a las autoridades sanitarias y/os conserveros a revisar sus opiniones sobre la seguridad de los alimentos enlatados, pese a que .estos brotes son muy escasos con relacin a las enormes cantidades de alimentos enlatados consumidos. Los muestreos al azar o de rutina de los alimentos
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enlatados investigando grmenes patgenos, es una tcnica no recomendada. Tan 5% los alimentos de baja acidez, carnes y productos lcteos y algunas verduras enlatadas, pueden permitir el crecimiento de grmenes entericos, estafilococos y botulinicos. Examen para grmenes patgenos Cuando est indicado, se abren las latas con abrelatas estriles y si el alimento es slido se toman muestras de las partes frente a las costuras, especialmente donde se cruzan las costuras de las tapas con la lateral. Se cultiva en medio de Selenito para Salmonelas. CONTROL DE ESTERILIDAD 1. Efectuar el examen de los alimentos enlatados en atmsferas

estriles tomando todas las precauciones de asepsia . 2. Desinfectar la tapa de lata ( por le lado que no lleva impreso el cdigo) , cubriendo con alcohol al 70% , dejando por contacto de - 15 minutos , luego escurrir el exceso de alcohol y flamear . 3. Abrir con abrelatas estril y eliminar totalmente la tapa , reemplazando inmediatamente con la base de una placa petri estril. 4. Transferir apropiados 5 gr o ml de por muestra a tubos con medio de cultivo anaerbica , triplicado para incubacin aerbica y 10

adicionar a estos ltimos parafina estril . 5. Incubar alas mismas temperaturas de incubacin preliminar , as , si las muestra han sido incubadas a 55 C por 35C , incubar los 48 horas por muestra , para 5 das. el examen de 3) excepto en tubos a 35C por 6. Efectuar la 48 horas hasta 5 das , si han sido incubabas a 55 coloracin Gram de la

C , incubar los tubos a

microscopia , si en le examen microscpico , se observa un numero elevado de microorganismos por campo (mas de productos obtenidos por fermentacin , indica psima condiciones 147
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de

higiene durante la elaboracin del producto y/o los

utilizacin de tubos , si hay

materias primas contaminantes . 7. Despus del perodo de incubacin , examinar desarrollo ,. sobre agar Interpretacin Considerar si un tubo es estril si un tubo demuestra desarrollo . aerobio como mximo Realizar para coloracin Gram y observar al anaerobios segn microscopio , a las

si es necesario hacer subcultivos sobre agar Casey , para aerobios y BREWEN , incubar temperaturas adecuadas .

V. RESULTADOS :
1. Enumeracin n de Temofilos Anaerobios. 2. Enumeracin de Clostridium Perfringens. 3. Enumeracin de Bacillus Areus. 4. Enumeracin de Escherichia Coli.

VI. RECOMENDACIONES VII. CONCLUSIONES:

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VIII. CUESTINARIO 1. Medios de cultivo que se utilizan para el anlisis microbiolgico de alimentos enlatados. 2. Flora microbiana 3. Anlisis fisiquimico 4. Que consideraciones en los en productos enlatados. que se realiza en conserva una planta de lata de

productos vegetales y de origen animal. se debe tener en industrial de procesamiento de enlatados?. 5. Consideraciones cuando es tipos de latas contenedores de alimentos, considera una lata defectuosa.

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