Praktikum Mikrobiologi

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Enzim merupakan senyawa organik bermolekul besar yang berfungsi untuk mempercepat jalannya reaksi metabolisme di dalam tubuh tumbuhan tanpa mempengaruhi keseimbangan reaksi. Enzim tidak ikut bereaksi, struktur enzim tidak berubah baik sebelum dan sesudah reaksi tetap. Enzim sebagai biokatalisator dan bagian enzim yang aktif adalah sisi aktif dari enzim. Enzim diberi nama sesuai dengan nama subtrat dan reaksi yang dikatalisis yang biasanya ditambah akhiran ase. Mikroorganisme sebagaimana makhluk hidup lainnya mensintesis dan menggunakan enzim-enzim dalam proses metabolism sel guna mempertahankan kelangsungan hidupnya. Enzim-enzim tersebut ada yang diproduksi secara intrasel maupun ekstrasel, tergantung dari fungsi enzim bagi mikroba sumbernya. Diantara enzim-enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme banyak yang dimanfaatkan oleh manusia dalam berbagai bidang industri seperti industri makanan, farmasi, kimia, kosmetik, pertanian, tekstil, proteksi lingkungan dan sebagainya. Potensi yang besar dari enzim microbial ini telah menarik minat banyak peneliti untuk melakukan skrining/pencarian mikroba potensial penghasil enzim-enzim yang bermanfaat yang selanjutnya dapat dikembangkan di industri. Setiap enzim memiliki aktivitas yang spesifik terhadap substrat tertentu. Oleh karenanya, media skrining yang digunakan harus mengandung substrat yang sesuai dengan enzim target serta indicator warna yang mengikat substrat.adanya aktivitas enzim biasanya ditunjukkan dengan terbentuknya zona spesifik pada media agar skrining yang tampak di sekeliling koloni mikroba penghasil enzim target. Semakin besar indeks zona spesifik yang terbentuk diduga semakin besar pula jumlah dan aktivitas enzim yang dihasilkan oleh mikroba tersebut.

B. Tujuan Praktikum Mengetahui teknik pengujian potensi suatu mikroba penghasil enzim ekstraseluler dengan menggunakan media yang sesuai.

C. Manfaat Praktikum Makalah ini disusun dengan harapan memberikan kegunaan baik secara teoritis maupun secara praktis. Secara teoritis makalah ini berguna sebagai pengembangan enzim ekstraseluler. Secara praktis makalah ini diharapkan bermanfaat bagi mahasiswa sebagai wahana penambah pengetahuan dan konsep keilmuan khususnya tentang enzim ekstraseluler dan pembaca/dosen sebagai media informasi tentang enzim ekstraseluler secara teoritis maupun secara praktis.

Acara Praktikum 8 : Pengujian Potensi Mikroba Penghasil Enzim Ekstraseluler

Praktikum Mikrobiologi

BAB II STUDI PUSTAKA Enzim adalah protein yang berperan sebagai katalis dalam metabolisme makhluk hidup. Enzim berperan untuk mempercepat reaksi kimia yang terjadi di dalam tubuh makhluk hidup, tetapi enzim itu sendiri tidak ikut bereaksi. Enzim adalah katalis hayati. Enzim adalah senyawa organik yang dihasilkan oleh sel-sel hidup. Katalis juga menampakkan spesifiksitas atau kekhususan. Artinya, suatu katalis tertentu akan berfungsi pada hanya suatu jenis reaksi tertentu saja. Enzim dihasilkan didalam sel, beberapa diekskresikan melalui dinding sel dan dapat berfungsi diluar sel. Ada 2 tipe enzim yaitu enzim ekstraselular atau eksoenzim (berfungsi diluar sel) dan enzim intraselular atau endoenzim (berfungsi dalam sel). Fungsi utama eksoenzim adalah melagsungkan perubaha-perubahan seperlunya pada nutrien disekitarnya sehingga memungkinkan nutrien tersebut memasuki sel. Enzim intraselular mensintesis bahan selular dan menguraikan nutrien untuk menyediakan energi yang dibutuhkan oleh sel. Sebagai katalis dalam reaksi-reaksi di dalam tubuh organisme, enzim memiliki beberapa sifat, yaitu: 1. Enzim adalah protein, karenanya enzim bersifat thermolabil, membutuhkan pH dan suhu yang tepat. 2. Enzim bekerja secara spesifik, dimana satu enzim hanya bekerja pada satu substrat. 3. Enzim berfungsi sebagai katalis, yaitu mempercepat terjadinya reaksi kimia tanpa mengubah kesetimbangan reaksi. 4. Enzim hanya diperlukan dalam jumlah sedikit. 5. Enzim dapat bekerja secara bolak-balik. 6. Kerja enzim dipengaruhi oleh lingkungan, seperti oleh suhu, pH, konsentrasi, dan lainlain.

A. Enzim Amilase Amilase (alfa, beta dan glukoamilase) merupakan enzim yang penting dalam bidang pangan dan bioteknologi. Amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber seperti tanaman, binatang dan mikroorganisme. saat ini sejumlah enzim amilae telah diproduksi secara komersial. Penggunaan mikrobia dianggap lebih prosepektif karena mudah tumbuh, cepat menghasilkan dan kondisi lingkungan dapat dikendalikan. Produksi enzim amilase dapat menggunakan berbagai sumber karbon. Contohcontoh sumber karbon yang murah adalah sekam, molase, tepung jagung, jagung, limbah tapioka dan sebagainya. Jika digunakan limbah sebagai substrat, maka limbah tadi dapat diperkaya nutrisinya untuk mengoptimalkan produksi enzim. Sumber karbon yang dapat digunakan sebagai suplemen antara laian: pati, sukrosa, laktosa, maltosa, dekstyrosa, fruktosa, dan glukosa. Sumber nitrogen sebagai suplemen antara lain: pepton, tripton, ekstrak daging, ekstrak khamir, amonium sulfat, tepung kedelai, urea dan natrium nitrat.

Acara Praktikum 8 : Pengujian Potensi Mikroba Penghasil Enzim Ekstraseluler

Praktikum Mikrobiologi

Dalam proses produksi selain bahan baku, maka yang juga perlu diperhatikan adalah mikrobia yang dipakai dan faktor lingkungan. Parameter-parameter yang perlu diperhatikan adalah suhu dan lama inkubasi, kelembapan, pH awal, jumlah inokulum dan sebagainya.

B. Enzim Selulase Selulase adalah enzim terinduksi yang disintesis oleh mikroorganisme selama ditumbuhkan dalam medium selulosa. Selulase termasuk sistem multienzim yang terdiri dari tiga komponen. Untuk menghidrolisis selulosa yang tidak larut atau selulosa kristal diperlukan kerja sinergistik dari ketiga komponen enzim tersebut. Adapun ketiga komponen enzim tersebut yaitu: 1. Ekso--(1,4)-glukanase dikenal sebagai faktor C1. Faktor ini diperlukan untuk menghidrolisis selulosa dalam bentuk kristal 2. Endo--(1,4)-glukanase dikenal sebagai faktor Cx. Faktor ini diperlukan untuk menghidrolisis ikatan -(1,4)-glukosida (selulosa amorf). 3. -(1,4)-glukosidase menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa. Aktivitas selulase disebabkan oleh enzim non hidrolitik C1, hidrolisis selulosa yang telah diaktifkan dilakukan oleh enzim Cx. Menurut hipotesa ini, mikroba yang tumbuh pada selulosa kristal membentuk C1, sedangkan mikroba yang hanya dapat menguraikan selulosa yang telah dilonggarkan oleh asam fosfat atau selulosa tersubstitusi akan kekurangan enzim C1, tetapi banyak menghasilkan enzim Cx. Kerja enzim selulase dihambat dengan adanya glukanolakton dan logam-logam berat seperti tembaga dan merkuri, tetapi penghambatan dengan logam berat ini dapat dinetralisir dengan penambahan sistein, sehingga aktivitas enzim akan kembali normal. Penghambatan oleh glukanolakton lebih banyak terjadi pada substrat selobiosa dan oligosakarida lain yang lebih sederhana, dan lebih kecil pengaruhnya pada substrat selulosa. Sintesa enzim selulase dihambat dengan adanya glukosa dan gula-gula lain yang mudah dimetabolisme dalam media pertumbuhan dan hal ini dikenal sebagai represi katabolit. Induser terhadap sintesa enzim selulase pada mikroorganisme yaitu selulosa, selobiosa, laktosa dan sophorosa, semuanya dapat digunakan sebagai sumber karbon oleh mikroorganisme itu sendiri. Pembentukan selulase secara kontinyu dipengaruhi oleh penyediaan induser aktif secara kontinyu pula sehingga untuk menjadi produsen selulase yang kontinyu perlu digunakan induser yang tidak dapat digunakan sebagai sumber karbon dan juga mempunyai afinitas yang tinggi terhadap protein repressor. Enzim selulase memiliki aplikasi yang luas dan potensial dalam bidang makanan, pakan ternak, tekstil, bahan bakar, industri kimia, industri pulp dan kertas, pengolahan limbah, industri farmasi, produksi protoplas, dan teknik genetik.

Acara Praktikum 8 : Pengujian Potensi Mikroba Penghasil Enzim Ekstraseluler

Praktikum Mikrobiologi

C. Enzim Protease Enzim yang bekerja sebagai katalis dalam reaksi hidrolisis protein disebut enzim proteolitik atau protease. Oleh karena yang dipecah adalah ikatan pada rantai peptida, maka disebut juga peptidase. Ada dua macam peptidase, yaitu endopeptidase dan eksopeptidase. Endopeptidase terbagi menjadi 4 kelompok utama, yaitu protease serin (EC 3.4.21), protease sistein (EC 3.4.22), protease aspartat (EC 3.4.23) dan protease metal (EC 3.4.24). Penamaan tersebut menunujukkan bagian penting dari sisi katalitik enzim. 1. Protease Serin Protease serin adalah endopeptidase yang mempunyai residu sistein reaktif dan pH optimum mendekati netral. Protease serin mempunyai aktivitas maksimum pada pH alkalis. Tiga residu asam amino yang menbentuk catalytic triad yang esensial pada proses katalitik, yaitu His 57, Asp 102 dan serin 195. Tahap pertama terjadi pembentukan intermediet asil-enzim antara substrat dan serin. Pada tahap kedua intermediet asil-enzim dihidrolisis dengan molekul air yang melepaskan peptida dengan gugus OH serin. 2. Protease Sistein Famili protease ini meliputi protease tanaman seperti papain, aktinidin dan bromelain. Pada famili ini, papain merupakan tipe protease yang paling banyak dipelajari. Proses katalisis berlangsung melalui pembentukan intermediet kovalen yang melibatkan residu sistein dan histidin. Pada protease sistein, Cys 25 dan His 159 berperan sama seperti Ser 195 dan His 57 pada protease serin. Ion thiolat lebih nukleofil daripada gugus OH. Ion thiolat distabilkan melalui pembentukan pasangan ion dengan gugus imidazolium . 3. Protease Aspartat Protease aspartat umumnya mempunyai aktivitas katalitik maksimum pada pH asam. Hampir semua protease aspartat termasuk famili pepsin yang meliputi enzim digestif seperti pepsin, chimosin, renin dan protease fungal. 4. Protease Metal Protease metal mengandung ion logam esensial, biasanya Zn dan mempunyai aktivitas optimum didekat pH netral. Enzim ini distabilkan oleh Ca2+ dan dihambat oleh bahan pengkelat yang kuat seperti EDTA. Enzim ini umumnya terdapat dalam mikroorganisme.

Acara Praktikum 8 : Pengujian Potensi Mikroba Penghasil Enzim Ekstraseluler

Praktikum Mikrobiologi

BAB III METODE PENELITIAN

A. Alat dan Bahan Penelitian Alat yang digunakan untuk uji kepekaan bakteri terhadap antibiotika adalah pipetpipet volume steril, tabung-tabung reaksi steril, rak tabung, cawan petri steril, lampu spiritus, inkubator, dan core bor. Dan bahan yang digunakan adalah bakteri T.4.1 (tanah), enzim selulase, enzim amilase, enzim protease, indikator congo red, indikator JKY, dan larutan NaCl 1 M.

B. Cara Kerja Tuangkan agar yang mengandung enzim selulase pada cawan petri steril lalu diamkan hingga mengeras. Setelah mengeras, lubangi bagian tengah agar menggunakan core bor, lalu pipet bakteri T.4.1 menggunakan pipet volume steril dan teteskan pada lubang yang telah dibuat. Hati-hati dalam meneteskan bakteri, jangan sampai bakteri tercecer selain pada lubang karena akan membuat rancu pada saat pengamatan. Lalu inkubasikan selama 24 jam. Setelah diinkubasi, tuangkan indikator congo red, diamkan selama 15 menit, dan buang. Lalu tambahkan NaCl 1 M,diamkan selama 15 menit kemudian buang. Hitung indeks zona spesifik yang terbentuk. Tuangkan agar yang mengandung enzim amilase pada cawan petri steril lalu diamkan hingga mengeras. Setelah mengeras, lubangi bagian tengah agar menggunakan core bor, lalu pipet bakteri T.4.1 menggunakan pipet volume steril dan teteskan pada lubang yang telah dibuat. Hati-hati dalam meneteskan bakteri, jangan sampai bakteri tercecer selain pada lubang karena akan membuat rancu pada saat pengamatan. Lalu inkubasikan selama 24 jam. Setelah diinkubasi, tuangkan indikator JKY, diamkan selama 15 menit, dan buang. Hitung indeks zona spesifik yang terbentuk. Tuangkan agar yang mengandung enzim amilase pada cawan petri steril lalu diamkan hingga mengeras. Setelah mengeras, lubangi bagian tengah agar menggunakan core bor, lalu pipet bakteri T.4.1 menggunakan pipet volume steril dan teteskan pada lubang yang telah dibuat. Hati-hati dalam meneteskan bakteri, jangan sampai bakteri tercecer selain pada lubang karena akan membuat rancu pada saat pengamatan. Lalu inkubasikan selama 24 jam. Hitung indeks zona spesifik yang terbentuk.

Acara Praktikum 8 : Pengujian Potensi Mikroba Penghasil Enzim Ekstraseluler

Praktikum Mikrobiologi

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan Bakteri yang digunakan : Bakteri T.4.1 (tanah) A1. Enzim Selulose Zona Koloni Zona Spesifik (mm) (mm) 1. 11 16 2. 11 17 3. 12 18 4. 12 18 5. 12 16 6. 13 17 7. 12 18 8. 12 17 Rata-rata 11,8750 17,1250 Indeks zona spesifik = 17,1250-11,8750 11,8750 = 0,4421 mm No. Luas zona spesifik = d2 = (5,25)2 = 21,6475 mm2 Luas zona sebenarnya = 17,1250-11,8750 = 5,25 mm

A2. Enzim Amilase Zona Koloni Zona Spesifik (mm) (mm) 1. 18 23 2. 13 24 3. 15 23 4. 15 24 5. 16 23 6. 13 22 7. 16 24 8. 16 23 Rata-rata 15,2500 23,2500 Indeks zona spesifik = 23,2500-15,2500 15,2500 = 0,5246 mm No. Acara Praktikum 8 : Pengujian Potensi Mikroba Penghasil Enzim Ekstraseluler 6

Praktikum Mikrobiologi

Luas zona spesifik

= d2 = (8)2 = 50,2654 mm2

Luas zona sebenarnya = 23,2500-15,2500 = 8 mm

A3. Enzim Protease Zona Koloni Zona Spesifik (mm) (mm) 1. 50 46 2. 37 62 3. 52 59 4. 45 60 5. 46 60 6. 45 60 7. 48 61 8. 48 59 Rata-rata 46,3750 58,3750 Indeks zona spesifik = 58,3750-46,3750 46,3750 = 0,2588 mm No. Luas zona spesifik = d2 = (12)2 = 113,0973 mm2 Luas zona sebenarnya = 58,3750-46,3750 = 12 mm

B. Pembahasan Pada enzim selulase, inokulasi Bakteri T.4.1 menggunakan media Agar dengan ditambahkan CMC (Carboxymethyl Cellulose). CMC berfungsi sebagai sumber selulase. Agar ini adalah media isolasi yang spesifik sehingga disebut media selektif. Media selektif ini digunakan untuk menumbuhkan dan memelihara bakteri tertentu. Sifat khususnya yang hanya menumbuhkan bakteri tertentu membuat hanya bakteri Bakteri T.4.1 saja yang mampu hidup pada media ini. Pada enzim amilase, inokulasi Bakteri T.4.1 menggunakan media Agar dengan ditambahkan pati. Pati berfungsi sebagai sumber amilum. Agar ini adalah media isolasi yang spesifik sehingga disebut media selektif. Media selektif ini digunakan untuk menumbuhkan dan memelihara bakteri tertentu. Sifat khususnya yang hanya menumbuhkan bakteri tertentu membuat hanya bakteri Bakteri T.4.1 saja yang mampu hidup pada media ini. Acara Praktikum 8 : Pengujian Potensi Mikroba Penghasil Enzim Ekstraseluler 7

Praktikum Mikrobiologi

Pada enzim protease, inokulasi Bakteri T.4.1 menggunakan media Agar dengan ditambahkan susu skim. Susu skim berfungsi sebagai sumber laktosa. Agar ini adalah media isolasi yang spesifik sehingga disebut media selektif. Media selektif ini digunakan untuk menumbuhkan dan memelihara bakteri tertentu. Sifat khususnya yang hanya menumbuhkan bakteri tertentu membuat hanya bakteri Bakteri T.4.1 saja yang mampu hidup pada media ini. Hasil yang diperoleh menunjukkan Bakteri T.4.1 mampu tumbuh pada media yang telah diinkubasi selama 1 hari. Namun apabila bakteri tidak tumbuh, hal ini dapat dilihat dari tidak terbentuknya zona bening pada media agar sehingga perhitungan indeks zona spesifik tidak dapat dilakukan. Indeks zona spesifik adalah rasio antara luas koloni bakteri dengan luas zona bening. Nilai indeks zona spesifik menunjukkan optimalisasi aktivitas enzim terhadap substrat. Nilai indeks zona spesifik (IZP) yang baik adalah lebih dari 3 yang menunjukkan aktivitas enzim optimal dalam mengubah sumbernya. Kisaran 1 < IZP < 3 menunjukkan aktivitas enzim tergolong sedang. Sedangkan IZP < 1 menunjukkan aktivitas enzim kurang optimal terhadap sumbernya. Tidak terbentuknya zona bening disebabkan dalam pemindahan bakteri dilakukan terlalu aseptik sehingga bakteri yang diinokulasikan mati dan tidak dapat tumbuh. Cawan agar tidak mengalami kontaminasi.

Acara Praktikum 8 : Pengujian Potensi Mikroba Penghasil Enzim Ekstraseluler

Praktikum Mikrobiologi

BAB V KESIMPULAN

A. Enzim Selulose 1. Indeks zona spesifik 2. Luas zona spesifik 3. Luas zona sebenarnya = 0,4421 mm = 21,6475 mm2 = 5,25 mm

B. Enzim Amilase 1. Indeks zona spesifik 2. Luas zona spesifik 3. Luas zona sebenarnya = 0,5246 mm = 50,2654 mm2 = 8 mm

C. Enzim Protease 1. Indeks zona spesifik 2. Luas zona spesifik 3. Luas zona sebenarnya = 0,2588 mm = 113,0973 mm2 = 12 mm

Acara Praktikum 8 : Pengujian Potensi Mikroba Penghasil Enzim Ekstraseluler

Praktikum Mikrobiologi

DAFTAR PUSTAKA

Radji, Maksum. 2002. Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran. Jakarta: Buku Kedokteran EGC. Pratiwi, Sylvia T. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Penerbit Erlangga.

Acara Praktikum 8 : Pengujian Potensi Mikroba Penghasil Enzim Ekstraseluler

10

Praktikum Mikrobiologi

LAMPIRAN

Enzim Selulase

Enzim Amilase

Enzim Protease

Acara Praktikum 8 : Pengujian Potensi Mikroba Penghasil Enzim Ekstraseluler

11