PERCOBAAN IV: PENENTUAN KADAR KOLESTEROL (METODA CHOD-PAP)

I.

TUJUAN PERCOBAAN Setelah menyelesaikan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat: 1. Menyiapkan pasien untuk pemeriksaan kolesterol dalam darah. 2. Menginterpretasikan hasil laboratorium yang diperoleh.

II.

PRINSIP PERCOBAAN

Kolesterol total ditetapkan langsung di dalam plasma atau serum dengan satu sisi reaksi dimana ester kolesterol dihidrolisis, gugus 3-OH kolesterol dioksidasi, kemudian hydrogen peroksida yang merupakan salah satu hasil reaksi ditetapkan secara enzimatis.
Kolesterol esterase

Ester kolesterol + H20 Kolesterol + O2

kolesterol + asam-asamlemak

Kolesteroloksidase

kolestenon + H2O2
peroksidase

2 H2O2+ fenol + 4-aminoantipyrine

quinoneimine + H20

Absorbansi warna diukur pada panjang gelombang 500nm

III.

TEORI

Kolesterol atau yang disebut juga dengan lemak tak jenuh merupakan substansi seperti lilin yang warnanya putih, kolesterol secara alami sudah ada dalam tubuh kita. Hati adalah yang memproduksi kolesterol, kolesteorol berfungsi untuk membangun dinding sel dan juga untuk membuat hormonhormon tertentu. Sebenarnya tubuh manusia sudah bisa menghasilkan kolesterol sendiri, namun karena manusia mengkonsumsi makan-makanan yang

mengandung lemak sehingga menyebabkan seseorang kadar lemak dalam tubuhnya sangat berlebih.Penyakit jantung dan penyakit pembuluh darah merupakan penyakit yang disebabkan oleh kadar kolesterol yang berlebihan dalam darah. Hal itubisa terjadi karena kolesterol yang berlebih akan membentuk bekuan dan plak yang akan menyumbat arteri dan akhirnya memutuskan aliran darah ke jantung yang akan menyebabkan serangan jantung, dan ke otak akan menyebabkan stroke. Jadi agar terhindar dari serangan jantung sangat disarankan untuk mengontrol kadar kolesterol dalam tubuh kita. Jika seseorang pernah mengalami serangan jantung atau pembedahan baypass,kadar kolesterolnya harus diperiksa secara rutin. dengan

menjaga kolesterol agar tetap wajar merupakan jaminan terbaik untuk terhindar dari penyumbatan pembuluh darah arteri. Kadar kolesterol sendiri terbagi menjadi dua bagian yaitu:

Kolesterol HDL singkatan dari High-Density Lipoprotein, HDL adalah kolesterol baik karena mempunyai kemampuan untuk

membersihkan pembuluh darah arteri. Kolesterol LDL singkatan dari Low-Density Lipoprotein, LDL adalah kolesterol jahat yang membuat endapan dan menyumbat

pembuluhdarah arteri (Ridwanaz, 2010 )

Kolesterol adalah lemak yang sebagian besar dibentuk oleh tubuh sendiri terutama di dalam hati. Fungsi kolesterol adalah sebagai bahan pembentuk berbagai jenis hormonsteroid antara lain hormon

estrogen,progesteron, dan androgen.

Juga merupakan prvitamin D yang

terdapat di jaringan bawah kulit. Dengan pertolongan sinar matahari, terutama sinar ultravioletnya, pro vitamin D itu diubah menjadi vitamin D. Fungsi

kolesterol berikutnya adalah sebagai bahan pembentuk asam empedu dangaram empedu. Bila kadar kolesterol dalam darah tinggi dapat menyebabkan timbulnya atherosklerosis yaitu kolesterol mengendap di dinding pembuluh darah membentuk plak, sehingga saluran darah menyempit dan mengeras lama-lama terjadi penyumbatan. Apabila penyumbatan terjadi di pembuluh nadi yang mensuplai darah ke dinding jantung maka menyebabkan penyakit jantung koroner (Soeharto, 2004).

Kolesterol total sebenarnya merupakan susunan dari banyak zat,termasuk trigliserida, kolesterol HDL dan kolesterol LDL. Kategori kadarkolesterol total: Normal < 200 mg/dL, Batas tinggi 200 239

mg/dL,Tinggi <240 mg/dL (Soeharto, 2004).

Hiperlipidemia

Yang dimaksud dengan Hiperlipidemia adalah suatu keadaan yang ditandai oleh peningkatan kadar lipid/lemak darah. Berdasarkan jenisnya, hiperlipidemia dibagi menjadi 2 yaitu:

Hiperlipidemia Primer Banyak disebabkan oleh karena kelainan genetik. Biasanya kelainan ini ditemukan pada waktu pemeriksaan laboratorium secara kebetulan. Pada umumnya tidak ada keluhan, kecuali pada keadaan yang agak berat tampak adanya xantoma (penumpukan lemak di bawah jaringan kulit).

Hiperlipidermia Sekunder Pada jenis ini, peningkatan kadar lipid darah disebabkan oleh suatu penyakit tertentu, misal : diabetes mellitus, gangguan tiroid,penyakit

hepar, dan penyakit ginjal. Hiperlipidemia sekunderbersifat reversible ( berulang ) (Fredrickson, 1967).

Berdasarkan

fenotip

lipoproteinnya

hiperlipidemia

primer

dibedakan

berdasarkan 6 tipe.

Fraksi lipoprotein Tipe Sinonim utama yang meningkat I Hiperkilomkronemia Kilomikron

Lipid utama yang meningkat

Trigliserid

II A

Hiperbetalipoprotenemia

LDL

Kolesterol

II B

Hiper- & pra--LPP lipoprotenemia

LDL dan VDL

Kolesterol dan trigliserid

III

Hiper broad band LPPemia

IDL Trigliserid dan

IV

Hoperpralipoprooteinemia

VLDL

kolesterol

Hiperprabetalipoproteinem ia

VLDL dan kilomikron

Trigliserid

Trigliserid dan kilomikron

(Fredrickson, 1967)

Kolesterol merupakan substansi lemak, yang secara normal dibentuk di dalam tubuh. Kolesterol dibentuk di hati dari lemak makanan. Kolesterol memainkan banyak peran penting dalam fungsi sel tubuh(antara lain produksi hormon). Kolesterol darah dapat dibagi menjadi 2 bagian utama: kolesterol LDL (Low Density Lipoprotein) yang dikenal sebagai kolesterol jahat dan kolesterol HDL (High Density Lipoprotein)yang dikenal sebagai kolesterol baik. LDL membawa kolesterol dari hatike sel, dan HDL berperan membawa kolesterol dari sel ke hati(Satriaperwira, 2008 ).

Kadar kolesterol LDL yang tinggi akan memicu penimbunan kolesterol di sel, yang menyebabkan munculnya atherosclerosis(pengerasan dinding pembuluh darah arteri) dan penimbunan plak didinding pembuluh darah. Hal ini dihubungkan dengan penngkatan risikopenyakit akibat gangguan pembuluh darah (misalnya: penyakit jantungkoroner, stroke, gangguan pembuluh darah tepi) (Satriaperwira, 2008 ).

Kadar kolesterol darah yang tinggi dapat disebabkan oleh berbagai faktor. Faktor-faktor penyebab kadar kolesterol yang tinggi adalah

genetic,diet tinggi lemak, kelebihan berat badan, kurangnya aktivitas fisik, dan merokok. Merokok meningkatkan kadar kolesterol LDL dan menurunkan kadar kolesterol HDL. Kadar kolesterol LDL yang tinggi dapat

puladisebabkan oleh konsumsi alkohol atau obat-obatan (misalnya: steroid atau pil kontrasepsi) (Satriaperwira, 2008 ).

IV.

ALAT DAN BAHAN Alat 1. Spektrometer

2. Kuvet

3. Pipet piston

4. Sentrifuga

5. Tabung reaksi dan rak tabung reaksi

6. Spuit 3ml

Bahan 1. Serum, plasma-heparin atau EDTA 2. Alkohol 70%

Reagensia mengandung:

1. Reagen :

4-aminoantipyrin Phenol Peroksidase Kolesterol esterase Kolesterol oksidase Pipes buffer

0.30 mmol/l 6 mmol/l >0.5 U/ml > 0.15 U/ml > 0.1 U/ml 80 mmol/l ; pH 6.8

2. Standard: Kolesterol 5.17 mmol/l (200 mg/dl)

Persiapan dan stabilitas larutan:

1. Reagen: Larutan siap untuk digunakan. Reagen ini stabil sampai waktu kadaluarsa bila disimpan pada 2-8 C, tidak terkontaminasi dan terlindung dari cahaya langsung.

2. Standar: Larutan siap untuk digunakan. Larutan standar stabil sampai waktu kadaluarsa bila disimpan pada 2-8 C

V.

PROSEDUR

Ke dalam kuvet dipipetkan : Blangko Reagen (l) Aquadest Standar Sampel Reagen 10 1000 Standar (l) 10 1000 10 1000 Sampel (l)

Dicampurkan dan diinkubasikan selama 10 menit pada suhu ruangan. Kemudian baca absorbansi sampel (Asampel) terhadap BR pada panjang gelombang 500 nm. Diencerkan 0.1ml sampel dengan 0.2ml larutan NaCl 0.9% jika hasil melebihi 1000mg/dl (25.9mmol/I) Setelah itu dihitung konsentrasi kolesterol dalam sampel, dengan persamaan:

Ckolesterol

Asampel x 200 mg/dl Astan dar

Asampel x 5.17mmol/I Astan dar

Ckolesterol

Percobaan ini dilakukan secara triplo.

VI.

DATA PENGAMATAN

Kelompo k

Blanko (A)

Standar d (A)

Sampel I (A)

Sampel II (A)

Sampel III (A)

Rata-rata (A)

I II III

0,000 0,000 0,000

0,762 0,762 0,762

0,328 0,943 0,191

0,366 0,937 0,110

0,591 0,939 0,632

0,428 0,940 0,311

Perhitungan Kelompok Konsentrasi (mmol/l) Konsentrasi (mg/dl) mg/100ml (553X A sampel) Mmol/l (14.3X A sampel) I 0,428/0,762 X5.17 = 2,90 II 0,940/0,762 X 5,17 =6,38 III 0,311/0,762 X 5,17 =2,11 0,428/0,726 X 200 = 110,236 0,9401/0,762 X 200 =246,72 0,311/0,762 X200 C= 553 X 0.311 = 81,63 = 171,98 C= 14,3 X0,311 = 4,45 C= 553 X 0,940 = 519,82 C=14,3 X 0,440 = 13,442 C= 553 X 0,428 =236,68 C=14,3 X 0,428 =6,12

VII.

PEMBAHASAN

Kolesterol adalah metabolit yang mengandung lemak sterol yang ditemukan pada membran sel dan disirkulasikan dalam plasma darah. Merupakan sejenis lipid yang merupakan molekul lemak atau yang menyerupainya. Kolesterol ialah jenis khusus lipid yang disebut steroid. Steroids ialah lipid yang memiliki struktur kimia khusus..

Tubuh manusia dan hewan yang normal akan berusaha memelihara konsentrasi plasma kolesterol dengan cara mengatur sintesis dan ekskresi kolesterol. Kolesterol yang melebihi kebutuhan tubuh akan dieliminir melalui empedu, tetapi walapun begitu jika pasok kolesterol dari makanan berlebih yang akhirnya melebihi kebutuhan tubuh, maka akan berakibat kurang baik bagi tubuh dan dapat menimbulkan berbagai gangguan fisiologi seperti artherosklerosis yang manifestasinya dapat menjadi penyakit jantung koroner atau stroke.

Pada praktikum kimia klinik pertemuan ketiga adalah menentukan kadar kolesterol pada darah. Hal ini dilakukan agar mahasiswa dapat menyiapkan pasien untuk pemeriksaan kolesterol dalam darah, kemudian mahasiswa dapat menginterprestasikan hasil laboratorium yang diperoleh.

Pada manusia, 60-70% diangkut oleh LDL, 20-35% oleh HDL dan 5-12% ole VDL. Maka dari itu, praktikan ingin mengetahui seberapa banyakkah kolesterol di dalam darah manusia, yakni dengan cara pemeriksaan kolesterol pada sampel darah tertentu.

Preparasi pertama yang harus dilakukan adalah dengan cara mempersiapkan segala alat dan bahan yang diperlukan untuk praktikum ini diantaranya yaitu sampel darah. Adapun sampel darah yang akan digunakan disimpan di dalam tabung darah khusus. Dalam pelaksanaannya harus dengan hati-hati agar darah tidak terkontaminasi oleh zat lain, sehingga tidak akan mengganggu dalam hal pemeriksaan.

Serum merupakan darah yang telah dipisahkan dari sel-sel darah merah dan zat-zat koagulan serta biasanya berwarna kuning pucat. Larutan reagen merupakan campuran dari beberapa enzim yang dapat mengubah kolesterol menjadi suatu senyawa berwarna sehingga dapat dideteksi oleh spektrofotometri UV-Vis.

Pada proses pengambilan larutan, yaitu aquadest, reagen, dan sampel dilakukan dengan menggunakan mikropipet (pipet piston). Hal ini disebabkan jumlah larutan yang diambil sangat sedikit (10 L). Sebelum pipet piston digunakan, bagian atas pipet yang disebut thumb knob sebaiknya ditekan berkali-kali untuk memastikan lancarnya mikropipet. Setelah itu tip bersih dimasukkan ke dalam nozzle / ujung pipet piston sampai pas (tidak jatuh). Thumb knob ditekan sampai hambatan pertama / first stop, jangan ditekan lebih ke dalam lagi karena cairan yang terambil akan lebih besar daripada jumlah yang sebenarnya. Setelah itu, tip dimasukkan ke dalam cairan sedalam 3-4 mm karena jika kurang dari nilai tersebut dikhawatirkan cairan tidak terambil sempurna (ada gelembung udara yang terambil), sedangkan jika lebih

dari nilai tersebut dikhawatirkan terdapat kontaminan dari tip pipet. Selanjutnya pipet ditahan dalam posisi vertikal kemudian tekanan dari thumb knob dilepaskan sehingga cairan masuk ke tip. Ujung tip dipindahkan ke dalam kuvet. Untuk mengeluarkan cairannya, thumb knob ditekan sampai hambatan kedua / second stop atau ditekan semaksimal mungkin sehingga semua cairan keluar dari ujung tip. Pipet piston digunakan dalam percobaan ini karena memiliki ketelitian, sensitivitas, dan spesifisitas yang tinggi bila dibandingkan dengan pipet gelas.

Pada kuvet blanko, setelah dimasukkan aquadest dan larutan reagent, kuvet digoyang agar larutan tercampur secara sempurna. Setelah itu kuvet diinkubasikan pada suhu ruang yaitu 27 oC selama 10 menit. Proses inkubasi ini bertujuan memberikan waktu untuk terjadinya reaksi antara kedua larutan dalam campuran tersebut. Inkubasi ini juga dilakukan untuk kuvet standar dan kuvet sampel. Pengukuran blanko perlu dilakukan karena dikhawatirkan terjadi perubahan reagen pada saat inkubasi dan memberikan serapan pada panjang gelombang pengukuran.

Saat proses inkubasi, terjadi reaksi antara reagen dengan kolesterol yang terdapat pada larutan standar dan sampel. Setelah diinkubasi, kedua larutan yang tadinya berwarna bening dalam masing-masing kuvet berubah menjadi warna merah rosa. Warna merah tersebut menandakan telah

terjadinya reaksi antara enzim dengan kolesterol. Warna merah tersebut berasal dari senyawa quinoneimine, yang merupakan hasil reaksi antara reagen dan kolesterol. Reaksi yang terjadi yaitu sebagai berikut :

Perubahan warna (menjadi berwarna merah) diperlukan agar campuran larutan dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis, khususnya dengan sinar visibel. Quinoeimine akan terukur absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm dan nilai absorbansi tersebut sebanding dengan kadar kolesterol dalam darah. Setelah inkubasi selesai, masing-masing larutan blanko, standard dan sampel diukur absorbansinya dengan spektrofotometer. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 546 nm yang merupakan panjang gelombang maksimum untuk quinoeimine. Untuk larutan sampel, pengukuran dilakukan sebanyak tiga kali (triplo) agar kesalahan pada saat pengukuran dapat dihindari sehingga hasilnya lebih akurat. Ketiga hasil yang didapat dirata-ratakan dan dihitung kadar kolesterol dalam sampel.

Larutan blanko yang sudah dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian disimpan (inkubasi) selama 10 menit minimal pada suhu ruangan (15-25 oC).

Blanko yang sudah disimpan kemudian diperiksa oleh instrumen spektofotometri untuk mengetahui panjang gelombang () yang nantinya akan digunakan dalam pemeriksaan sampel. Absorbansi yang diperoleh pada saat pengukuran larutan sampel adalah 0,328 ; 0,366 ; dan 0,591. Rata-rata absorbansi larutan sampel adalah 0,28. Sedangkan absorbansi larutan standar adalah 0,762. Karena larutan blanko memberikan absorbansi yaitu 0,001 maka absorbansi masing-masing sampel dan standar dikurangi dengan nilai absorbansi blanko agar diperoleh absorbansi sampel dan standar yang

sebenarnya. Nilai dari kedua absorbansi tersebut dapat digunakan untuk menghitung kadar kolesterol dalam sampel dengan menggunakan rumus : [ ] [ ]

Konsentrasi kolesterol standar (normal) adalah dibawah 200 mg/dl. Nilai konsentrasi kolesterol dalam sampel yang diperoleh dari perhitungan sebesar 112,34 mg/dl. Nilai tersebut merupakan nilai standar buat normal

Penentuan kadar kolesterol dilakukan dalam beberapa tahap, diantaranya yakni mempersiapkan larutan baku pembanding (standar) atau biasa kita kenal sebagai larutan Blanko. Larutan blanko diambil dari reagen kit kolesterol untuk perbandingan sampel dengan larutan baku standar.

Setelah itu lalu masuk ke dalam perlakuan sampel darah yang akan digunakan dalam pemeriksaan kali ini. Sampel terbaik adalah serum. Kolesterol dalam serum stabil selama 1 minggu pada suhu kamar (18-30 oC) dan 6 bulan pada keadaan beku. Adapun nilai kolestrol yang normal pada tubuh manusia yakni < 200 ml/dl.

Seperti halnya pada larutan blanko, sampel darah dimasukkan kedalam tabung reaksi menggunakan clinipette sebanyak 10 l kemudian masukkan reagen glukosa sebanyak 1,0 l setelah itu sample di inkubasi selama 10 menit. Setelah penambahan reagen pada sampel terbentuk larutan berwarna merah muda (pink). Sampel yang sudah di inkubasi kemudian di uji menggunakan Spektrofotometer untuk mengetahui panjang gelombang () dan absorban pada sampel.

Setelah dilakukan pemeriksaan terhadap sampel, tahapan selanjutnya yakni dengan melakukan perhitungan nilai absorban standard dan nilai absorban sampel dengan konsentrasi standar. Hal ini dilakukan agar nilai kolesterol dalam sampel dapat diketahui. Perhitungan nilai konsentrasi kolesterol dapat dilakukan dengan menggunakan rumus, yakni : Csampel = x Cstandar Adapun nilai konsentrasi kolesterol dalam darah (serum) yang didapat adalah sebesar 112,34 mg/dl.

VIII.

KESIMPULAN

Daripada percobaan yang dilakukan,didapati konsentrasi kolestrol dalam sampel adalah 2,90 mmol/l dan 112,43 mg/dl manakala konsentrasi kolestrol dalam sampel dengan panjang gelombang 500 nm adalah 236,68 mg/100ml dan 6,12 mmol/l.Pasien didapati pada tahap perbatasan.Pasien untuk pemeriksaan kolestrol dalam darah telah disiapkan dan data diintepretasikan. telah

DAFTAR PUSTAKA Fridrickson.1967.Hyperlipidemia.http://medicastore.com/nutracare/isi_choles s.php?isi_choless=hiperlipid (akses tanggal 30 maret 2013

Ridwanaz. 2010. Pengertian kolesterol. http://ridwanaz.com/http:// ridwanaz.com/kesehatan/pengertian-kolesterol/akses tanggal(30 Maret 2013)

Satriaperwira. 2008. Patofisiologi Pembentukan Plaque from various sources. http://satriaperwira.wordpress.com/2008/12/26/patofisiologipembentukan-plaque/ (akses tanggal 31 maret 2012)

Soeharto, I. 2004.Serangan Jantung dan Stoke Hubungannya Dengan Lemak dan Kolesterol. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama