CROMATOGRAFA PRINCIPIOS Y APLICACIONES

ANLISIS QUMICO
Prof. Manuel Chicharro 1 Ciencia y Tecnologa de los Alimentos
Ana Isabel Bautista Alicia Benayas Yolanda Alicia Ortiz

NDICE
1. Conceptos bsicos sobre cromatografa..................................... 1.1 Introduccin................................................................. 1.2 Base cientfica.............................................................. 1.3 Terminologa en cromatografa.................................... 3 3 4 4

2. Cromatografa plana y en columna. 7 2.1 Cromatografa en papel.. 7 2.2 Cromatografa en capa fina 7 2.3 Cromatografa en columna. 11 3. Cromatografa Lquida de Alta Resolucin. HPLC 3.1 Fundamentos y principios bsicos 3.2 Instrumentacin. 3.3 Aplicaciones al anlisis de los alimentos.. 13 13 16 18

4. Cromatografa de gases 19 4.1 Fundamentos y principios bsicos. 19 4.2 Instrumentacin. 19 4.3 Aplicaciones al anlisis de los alimentos... 21 Bibliografa...22

1. CONCEPTOS BSICOS SOBRE CROMATOGRAFA

1.1 INTRODUCCIN
La cromatografa es una tcnica que se emplea para separar entre si los componentes de una sustancia. Esta tcnica fue creada por el botnico ruso Michael Tswett en 1906, el cual llam a su mtodo cromatografa, palabra griega que significa escritura a color, porque lo utilizo para separar compuestos coloreados. Tswett llev a cabo una extraccin de una mezcla de pigmentos de hojas verdes utilizando ter de petrleo, un disolvente no polar, y descubri que era capaz de separar los pigmentos al hacer pasar el extracto a travs de una columna, un tubo de vidrio rellenado con carbonato de calcio (tiza).Tswett utiliz como detector del experimento la simple observacin, ya que los compuestos que separ tenan color y era posible detectar bandas o zonas de distintas materias por su color en la columna, demostrando que la clorofila es solo uno de los muchos pigmentos que se encuentran en las hojas de las plantas. A pesar de que el mtodo cromatogrfico prometa simplificar la separacin de sustancias de mezclas complejas, no fue sino hasta finales de la dcada de los 30 y principio de los 40 cuando se empez a desarrollar la tcnica teniendo este mtodo diversas aplicaciones. En la actualidad la cromatografa se emplea principalmente para separar compuestos incoloros pero el nombre permanece para describir cualquier tcnica que se base en los mismos principios. La columna sencilla de Tswett, un tubo vertical de cristal, abierto por su parte superior, rellena de un slido comn donde el eluyente se mueve conducido por su propio peso, ha evolucionado hasta los modernos equipos que hoy conocemos (fig1).

Fig. 1. Cromatgrafo de gases con espectrmetro de masas

Fig. 2. Equipos para HPLC (C. de alta resolucin para lquidos)

1.2 BASE CIENTFICA

En la cromatografa se separan los componentes de las mezclas a medida que son transportadas por un fase fluida mvil a travs de una fase estacionaria slida o lquida, la separacin de las molculas se logra porque la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribucin entre la fase mvil y la estacionaria, y esta separacin se puede realizar en funcin de sus cargas, masas, tamaos moleculares, la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox Como resultado hay una gran variedad de tcnicas para llevar a cabo la separacin de una sustancia, que se clasifican en cuatro grandes grupos segn el mecanismo de separacin: C. de reparto: separa los solutos basndose en la solubilidad. C. de adsorcin: se basa en la afinidad de adsorcin. C. de exclusin: separa solutos segn el peso molecular. C. de intercambio inico: separa solutos segn la carga inica. Tambin se pueden clasificar segn el estado de la fase mvil en : C. de gases: la fase mvil es un gas y pueden ser dos sistemas: o C. gas-liquido o C. gas-slido C. lquida: la fase mvil es un liquido y puede ser: o C. liquido-liquido o C. liquido-slido o C. de exclusin o C. de intercambio ionico Las nicas sustancias que no pueden ser examinadas por cromatografa son las insolubles y aquellas que se descomponen con el solvente o con la fase estacionaria. Dentro de las tcnicas cromatogrficas no se incluyen los mtodos que utilizan campos elctricos para separar molculas cargadas, mtodos que se denominan electroseparaciones, electromigraciones o electroforesis. El proceso cromatogrfico, aparentemente simple, es en realidad una compleja unin de fenmenos tales como hidrodinmica, cintica, termodinmica, qumica de superficie y difusin. Hasta la fecha se han propuesto muchas teoras, que incluyen complejos matemticos para poder explicar el comportamiento de los solutos en las columnas cromatogrficas, por citar alguna de estas teorias las ms estudiadas son: ! Teora de los Platos Tericos (Martin & Synge). ! Teora Cintica (Van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg & Sjenitzer). ! Teora Desarrollada para Columnas Capilares (Golay).

1.3 TERMINOLOGA EN CROMATOGRAFA

" Absorcin: es la retencin de una especie qumica por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene sta a formar mezcla o a reaccionar qumicamente con la misma.

" Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorcin y de reparto. " Adsorcin: Es la retencin de una especie qumica en los sitios activos de la superficie de un slido, quedando limitado el fenmeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial, esta retencin superficial puede ser fsica o qumica. " C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y una fase mvil polar. " C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una fase mvil no polar. " Disolvente o revelador: Cualquier fase mvil. " Elucin: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria. " Eluyente: La fase mvil una vez que se extrae de la columna. " Fase estacionaria: Material que permanece dentro de la columna cromatogrfica durante la cromatografa y que retiene algn componente de la muestra, posee una gran rea superficial y puede ser un slido o un lquido dispuesto sobre un slido que acta como soporte. " Fase mvil: Es un fluido que puede ser lquido, gas o fluido supercrtico que se usa como portador de la mezcla y que se hace pasar a travs de la columna cromatogrfica y la fase estacionaria. " Origen: Lugar fsico donde se coloca la muestra al principio. " Revelado: Proceso de separar un soluto de la muestra por medio de cromatografa. " Soporte: El material slido inerte que en la C. de reparto sirve para sostener la fase estacionaria lquida en su sitio. " Sorbente: Cualquier fase estacionaria.

Cromatograma
Adems de observar el resultado final del proceso, se pueden realizar las medidas continuamente para obtener una informacin global del proceso pasando la muestra a travs de un detector instrumental, normalmente los transductores del detector se sitan al final de la columna. El detector registra los cambios que se producen en alguna propiedad del eluyente que pasa por l, estos cambios son reproducidos y registrados en forma de grfica, sta grfica que recoge la respuesta del detector en funcin del tiempo se denomina cromatograma. En las graficas se observa la aparicin de una serie de picos a lo largo del tiempo, generalmente la respuesta del detector es linealmente proporcional a la concentracin de analitos en la fase mvil, la forma de cada pico muestra la distribucin de concentracin del componente asociado a dicho pico. En el cromatograma el eje horizontal corresponde al volumen, o al tiempo equivalente. En la cromatografa moderna es frecuente mantener constante la velocidad de flujo (volumen/tiempo), as mediante esta relacin se puede reflejar el tiempo en el eje horizontal: velocidad de flujo x tiempo = volumen

Cromatograma obtenido de la secuenciacin de un fragmento de ADN

2. CROMATOGRAFIA PLANA Y CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

La cromatografa lquida puede llevarse a cabo por cuatro tcnicas analticas: C. En papel C. En capa fina C. en columna C. Lquida de alta resolucin HPLC

2.1 CROMATOGRAFIA EN PAPEL

Es una forma combinada de cromatografas de particin y adsorcin en la que la fase estacionaria es el agua absorbida presente en el papel, y el soporte es el papel mismo. La fase mvil es una solucin que consiste de un solvente o de una mezcla de varios lquidos, incluyendo el agua. Se deja secar sobre el papel unas gotas del extracto de la muestra y se forma una mancha. Para impedir la evaporacin, el papel se cuelga dentro de una cmara de tal forma que la mancha pueda ser irrigada con la fase mvil ya sea hacia abajo por efecto de la gravedad, hacia arriba u horizontalmente por efecto de la capilaridad. Cuando la fase mvil ha saturado el papel hasta una distancia predeterminada en la que se logre la separacin cromatogrfica, se saca el papel de la cmara y se desarrolla el cromatograma rociando agente reveladores. En el caso de sustancias coloreadas tales como los colorantes de alimentos, la separacin resulta evidente aun sin la ayuda de tales agentes. Las sustancias no polares tambin pueden separarse recubriendo el papel con un compuesto no polar y usando solventes polares como fase mvil. Es una tcnica barata pero relativamente lenta, con limitaciones en el uso de agentes reveladores, algunos de los cuales pueden atacar y destruir el papel. Las manchas tienden a ser difusas.

2.2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)

Es un procedimiento rpido y sencillo para separar mezclas de sustancias y para identificar/caracterizar o para determinar semicuantitativamente componentes individuales. La separacin se basa en que las sustancias investigadas se reparten de modo diferencial entre una fase estacionaria y otra mvil: en la TLC el eluyente (fase mvil) se desplaza por una fina capa del sorbente (fase estacionaria), transportando as los componentes individuales de la mezcla de sustancias ms o menos lejos dependiendo de su solubilidad y/o de su comportamiento frente a la adsorcin. Al contrario, que en la cromatografa en columna, el proceso separativo transcurre en un sistema abierto, la 7

placa separativa plana. El recorrido particular de cada sustancia se emplea as para su identificacin. Las separaciones se realizan generalmente por el procedimiento ascendiente, introduciendo el borde inferior de la placa cromatogrfica en el solvente, que ser succionado por accin de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie de la placa.

Aparatos y materiales. Generalidades

- Cubeta cromatogrfica (con tapa hermtica); la mayora de las veces se trata de la cubeta Normal (profundidad del espacio para el gas: 3mm) - Placas de cromatografa: preparadas por uno mismo o ya fabricadas. - Pipetas de microlitro - Recipiente de vidrio con pulverizador - Probeta o matraz Erlenmeyer con tapn (para preparar y mezclar la fase mvil) - Secador - Plantilla para TLC o regla - En caso necesario: lmpara UV para comprobar la fluorescencia o la disminucin de la misma.

Placas cromatogrficas y sorbentes

Las placas constan de un soporte liso, inerte (placas de vidrio, lminas de aluminio o de fibra) sobre las que se dispone el sorbente formando un espesor lo ms homogneo posible (por lo general 0,25 mm); dependiendo de la separacin a realizar, se tratar de silicagel, xido de aluminio, poliamida, celulosa, etc o mezclas. En tanto que en el HPLC se utilizan principalmente materiales de fase inversa, en la cromatografa en capa fina predominan los materiales para fase normal, como por ejemplo el silicagel. Hay placas de TLC que tienen la denominada zona de concentracin (=zona de carga). Se trata de una zona de unos 2 cm de anchura de barro de diatomeas o de un gel de slice de tamao de poro muy grande, de manera que durante el desarrollo de la placa de TLC en esa zona prcticamente no hay separacin cromatogrfica. La ventaja especfica es que los componentes cargados se concentran en una estrecha banda en la lnea de partida (lnea divisoria entre la zona de concentracin y sorcin). As resulta posible cargar grandes volmenes y obtener una buena separacin.

Carga de las disoluciones

Las disoluciones de la muestra y de los patrones se cargan con pipetas de microlitro (o similares) sobre la placa de TLC, de manera que el punto medio de la mancha est a 1.5 cm aproximadamente del borde inferior y de los bordes de los laterales y que haya una separacin entre 1-2 cm de una mancha a otra (Fig: A).

F 2 3 7 6
p p

5 l L

S
2cm

1 2 3 4 5 6 7
1,5 cm

1 4 l S

FIG A

FIG B

A. Placa de TLC antes de su desarrollo : carga S=lnea de partida, P=muestra (V >V ; V es el volumen p p cargado. 1-7 patrones B. Placa de TLC despus de su desarrollo: clculos. F(frente del disolvente); l recorrido del disolvente(unos L 13 cm, l S recorrido del componente l.

CARACTERSTICAS DE LOS SORBENTES ELEGIDOS PARA TLC

TAMAO

SILICAGEL

OXIDO DE ALUMINIO

ANCHURA DE PORO MEDIA -PARA CASOS ESPECIALES TAMBIN SUPERFICIE ESPECFICA

6 nm 4, 10,15 nm 500 m/g

6 nm 9, 15 nm 200 m/ g

VOLUMEN DE PORO ESPECFICO

0,75 ml / g

0,2 ml / g

TAMAO DE GRANO - PARA HPTLC

12 m aprox. 5 m aprox.

12 m aprox.

Los volmenes recomendables dependen de la concentracin de las disoluciones. Por lo general, se cargan 1-10 microgramos de sustancia por mancha. Si la concentracin de la sustancia a analizar fuera de un orden de magnitud desconocido, la muestra debera cargarse varias veces en volmenes crecientes y claramente diferentes. Los volmenes mayores se cargan en varias veces, secando entre una y otra (con aire fro o caliente, aire a presin o con nitrgeno), para evitar que las manchas se extiendan. Para realizar determinaciones cuantitativas con placas convencionales, se cargan volmenes aproximados de 0.5-1.0 microlitros por mancha. Los volmenes mayores de 5.0 microlitros deben evitarse salvo en casos excepcionales, donde se cargaran en varias veces.

Desarrollo
El eluyente, cuya composicin depende de cada problema concreto, se pone en la cubeta cromatogrfica por lo menos 30 minutos antes del principio de la separacin hasta una altura de 0.5 cm. La cubeta se cerrar con su tapa para que se sature con los vapores del disolvente y se coloca en un lugar adecuado. Para que la saturacin sea mejor, se recubre la cubeta con papel secante (se indicar en el protocolo en el caso que sea necesario). Para desarrollar la placa, su extremo inferior se introduce en el diluyente y se vuelve a cerrar la cubeta inmediatamente. Para evitar eluciones, las manchas cargadas debern estar completamente por encima del nivel de eluyente. El eluyente se ve impelido hacia arriba por capilaridad a travs del recubrimiento. El recorrido ser, dependiendo de la separacin, de 5 a 15 cm mximo, y el tiempo necesario depender del sorbente, del espesor del mismo y de la composicin del eluyente. El recorrido ptimo es por lo general de 10 cm.

Clculos
Tras el desarrollo del cromatograma, se saca la placa de la cubeta y (despus de marcar el frente) se seca cuidadosamente al aire o con un secador. La posicin de las manchas se determina: -por su color propio -por su fluorescencia -por la disminucin o amortiguacin de la fluorescencia -por reaccin qumica: la placa una vez seca se roca parcial o totalmente con un determinado reactivo, de manera que aparecern coloraciones caractersticas o una fluorescencia particular. La identificacin de cada una de las manchas se realiza de acuerdo con su color y del denominado valor rf (factor de retencin , llamado tambin factor Rf o hRf (=Rf x 100), es decir, el cociente entre el recorrido de la sustancia (ls) y el del eluyente (lL).

10

ls [cm] rf = lL[cm] Para conseguir la identificacin, los colores propios o consecuencia del revelado y los rf se comparan con los de sustancias de referencia, obtenidos en las mismas condiciones de desarrollo y tincin (si es posible en el mismo cromatograma). Como control se realizan adicionalmente los denominados cromatrogramas mixtos (la disolucin problema y la de la sustancia de referencia se cargan en una misma mancha).

Cromatografa bidimensional en capa fina

Para mejorar una separacin incompleta, se combinan dos pasos de cromatografa monodimensional de la manera siguiente: 1 paso: cargar la muestra en una esquina de la placa y desarrollarla en sentido ascendente como se describa ms arriba. 2 paso: girar 90 la placa desarrollada y seca, de manera que la mezcla ya separada parcialmente se encuentre en el borde inferior, a continuacin se desarrolla en sentido ascendente con un segundo eluyente. La investigacin y la determinacin se realizan como ya han sido descritas anteriormente.

Aplicaciones
En la mayora de los casos la TLC se realiza cuando se quieren hacer evaluaciones cualitativas rpidas (screening). Las determinaciones cuantitativas son posibles por acoplamiento del equipamiento necesario (unidades de carga, scanner); en estos casos, es mejor recurrir a las placas de HPTLC, porque son ms efectivas.

2.3 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

Fue la forma original de cromatografa lquida realizada por primera vez en 1906 por Tswett. La fase estacionaria normalmente se encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de dimetro. Se utilizan muchas clases de materiales de empaque que van desde la almina, gel de slice, tierra de diatomeas, hasta resinas sintticas y derivados polisacridos. Se usan todos los tipos de cromatografa lquida. Lo habitual es que la fase mvil se deje percolar a travs de la columna por gravedad. No se usa mucho en el anlisis de alimentos ya que es una tcnica para la separacin cromatogrfica de mezclas de sustancias. Sin embargo, hoy en da existe un sistema cromatogrfico completo y 11

automtico diseado para el anlisis bioqumico que se conoce como cromatografa lquida rpida para protenas. Estos instrumentos emplean un rango de fases en columnas de plstico de 5 o 10 cm que operan bajo presin moderada. Se revolucion el uso de la cromatografa en columna para la purificacin de soluciones de prueba o para extraer las sustancias deseadas de las soluciones, debido a la introduccin de cartuchos cortos de plstico y desechables de minicolumnas, preempacados con una variedad de fases de separacin con partculas de tamao relativamente grandes, por ejemplo, cartuchos de Bond-Elut y Sep-Pak. Las soluciones de prueba, de lavado o extraccin pasan rpidamente a travs de los cartuchos con un poco de vaco generado a travs de una bomba de agua. La mayora de los mtodos de purificacin tales como la extraccin lquido-lquido, la TLC y la cromatografa en columna de vidrio que se usan antes de la espectofotometra, la GLC, la HPLC etc, pueden ahora realizarse en forma ms eficiente usando estos cartuchos.

12

3. CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN HPLC

3.1 FUNDAMENTOS Y PRINCIPIOS BSICOS

En la cromatografa lquida los componentes de una mezcla son llevados travs de una fase estacionaria fijada dentro de una columna mediante el flujo de una fase mvil lquida. Las separaciones estn basadas en las diferencias de la velocidad de migracin entre los componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la naturaleza de los analitos y su interaccin con las fases.

Se lleva a cabo una cromatografa lquida en fase normal cuando la fase estacionaria es relativamente polar y la fase mvil es relativamente apolar. Se realiza una cromatografa en fase inversa cuando la fase estacionaria es relativamente apolar y la fase mvil es relativamente polar. Hay cuatro tipos bsicos de cromatografa en los que la fase mvil es un lquido: -Cromatografa de reparto, para especies poco polares pero no inicas de masa molecular < 104 g/mol. -Cromatografa de adsorcin o cromatografa lquido-slido, para especies no polares, ismeros estructurales y grupos de compuestos de masa molecular < 104 g/mol. -Cromatografa de intercambio inico, para especies inicas de masa molecular < 104 g/mol. -Cromatografa de exclusin por tamao o cromatografa en geles, para solutos con masa molecular >104 g/mol. La elucin de los componentes de una muestra comprende el lavado de una parte de la muestra disuelta en la fase mvil a travs de una columna de fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. La porcin de muestra se introduce por la parte superior de la columna (tiempo t0), los componentes se distribuyen por s mismos entre las dos fases segn la naturaleza qumica de stos con respecto a las fases mvil y estacionaria. Adicciones posteriores del disolvente llevan a las molculas de soluto hacia abajo en la columna, hasta que salen de ella en una tiempo determinado (tx) 13

Columna cromatogrfica:

La velocidad a la cual un soluto migra depende de la fraccin de tiempo que ha necesitado para salir de la columna, tiempo que es detectado por un detector. Esta velocidad ser pequea para solutos fuertemente retenidos por la fase estacionaria, y ser grande para solutos que tengan mayor afinidad por la fase mvil. El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la seal se transforma en una grfica en funcin del tiempo, un cromatograma, que consta de una serie de picos simtricos. Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto cualitativa (posicin en el eje) como cuantitativamente (rea bajo los picos) los componentes de la muestra. La cromatografa cuantitativa se basa en una comparacin de la altura o del rea del pico de un analito con el de uno o ms estndares. Ambos parmetros varan linealmente con la concentracin. La cromatografa cualitativa se basa en la comparacin de la posicin de los picos (tiempos determinados de retencin) con cromatogramas estndares. Ejemplo de cromatograma con un detector de Absorbancia:

14

La efectividad de la columna cromatogrfica para la separacin de solutos depende de las velocidades relativas a las cuales las especies son eluidas. La eficiencia mxima para la cromatografa lquida ocurre a muy bajas velocidades de flujo. Se puede incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye el tamao de la partcula del empaque de la columna, se reduce la viscosidad de la fase mvil o se incrementa la temperatura. En una primera etapa, la cromatografa de lquidos se llevaba a cabo en columnas de vidrio con dimetros de 1-5 cm y longitudes de 50-500 cm, cuyas partculas de la fase estacionaria no superaban las150-200 m de dimetro a fin de asegurar unos caudales razonables. Incluso as, los tiempos de separacin eran largos, podan llevar varias horas. La cromatografa lquida de alta eficacia o HPLC (High Performance Liquid Chromatografy) es el mtodo ms sofisticado y moderno de la cromatografa lquida, que utiliza partculas de fase estacionaria para el interior de la columna con dimetros muy pequeos para aumentar la eficiencia, entorno a 3-10 m. As, se ha conseguido reducir el tamao de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10 mm de dimetro en la HPLC, y el tiempo necesario para la separacin, de minutos a 1h. Fotografa de los intrumentos bsicos de laboratorio para la HPLC:

15

3.2 INSTRUMENTACIN
Para la cromatografa lquida se necesitan varios aparatos. Este es un esquema del conjunto de aparatos necesarios:

Las columnas de HPLC estas hechas de acero inoxidable, con un dimetro interno de 2-5 mm y una longitud variable de 10 a 30 cm, dependiendo del dimetro de las micropartculas que contiene la columna (fase estacionaria), que puede ser de 310m. Como cierre de las columnas se utilizan placas filtrantes de acero que no dejen escapar las micropartculas de la columna. En muchos casos se utiliza una precolumna para eliminar contaminantes y partculas de polvo. Distintos tamaos de columnas:

La mayor parte de los instrumentos comerciales modernos estn equipados con calentadores de columna, que controlan la temperatura desde la cercana al ambiente hasta 150 C. Manteniendo la temperatura constante se obtienen mejores cromatogramas. Existe una gran variedad de materiales de relleno de las columnas segn las distintas separaciones. Bsicamente, las micropartculas utilizadas estn compuestas de slice, aluminio o resina. Pueden ser de dos tipos: 16

-Partculas enteramente porosas, de forma irregular y dimetro 3-10m. -Partculas esfricas de superficie porosa, con dimetros de 30-60m y un ncleo imposible de atravesar. Son necesarias bombas de presin de varios centenares de atmsferas para conseguir velocidades de flujo razonables con micropartculas de 3-10m debido a la resistencia que ofrecen. Como consecuencia, el equipo de HPLC es ms costoso y elaborado que el de otros tipos de cromatografa. Las elevadas presiones que generan las bombas no constituyen un peligro de explosin, puesto que los lquidos no son muy compresibles. Se dispone de varios reservorios de disolvente que pueden contener cada uno ms de 500 ml. Es necesario que estos reservorios vayan acompaados de desgasificadores para eliminar los gases del disolvente, pues producen burbujas en la columna interfiriendo en los resultados. Para una buena eleccin de la fase mvil o disolvente, hay que tener en cuenta que la interaccin con la fase estacionaria (micropartculas) debe ser ptima y la separacin debe ser lo ms rpida posible. Los parmetros que determinan el tipo de disolvente a utilizar son: viscosidad, transparencia al UV, punto de ebullicin, ndice de refraccin, inercia frente a la muestra, resistencia a la corrosin, toxicidad, precio y mantenimiento. El sistema de inyeccin de muestra que ms se emplea se basa en "asas de muestreo", que son bucles o vlvulas dosificadoras que permiten una aplicacin cuantitativa y reproducible a presin elevada. Proporcionan una seleccin del tamao de la muestra que va desde 5 a 500l. La muestra se pasa primero al bucle sin presin, para luego pasar a la columna accionando el flujo del disolvente con una llave de varias vas o vlvulas de membrana. La muestra no debe contener slidos para que no se atasque la columna, si es necesario deber filtrarse por un filtro de membrana o precolumna. Lo mejor es disolver la muestra en el eluyente que se vaya a emplear en la separacin. El volumen inyectado de muestra debe ser lo ms pequeo posible, para que los resultados aparezcan ms ntidos. Para HPLC se emplean distintos detectores dependiendo de la naturaleza de la muestra. -Detectores selectivos: responden a una propiedad del soluto en disolucin. Son los detectores ultravioleta/visible (UV/Vis), detector de fluorescencia y detector electroqumico. El ms utilizado es el UV/Vis, sobre todo el espectrofotmetro, que registra sustancias que absorben la radiacin ultravioleta o visible. Los hay muy sensibles, son relativamente independientes de las oscilaciones de temperatura y se pueden utilizar en la elucin en gradiente. -Detectores universales: responden cuando una propiedad de la fase mvil es cambiada por la presencia de un soluto. Son el detector del ndice de refraccin (RI) y el detector de conductividad.

17

El ms utilizado es el detector RI, que registran todas aquellas sustancias que presenten un RI distinto al de la fase mvil pura. La seal ser tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia en el RI. Es necesario un control estricto de la temperatura y no se pueden utilizar para separaciones por elucin en gradiente.

3.3 APLICACIONES AL ANLISIS DE LOS ALIMENTOS

La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o grupos de sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente. Como condicin, es imprescindible que la muestra sea soluble en un disolvente al ser la fase mvil un lquido. Es la tcnica analtica de separacn ms ampliamente utilizada debido a sus cualidades de sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y su gran adaptabilidad a sustancias que son de gran inters para la industria, la ciencia y la sociedad. El empleo de HPLC en sus muchas variantes se ha especializado mucho. Algunas aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como aminocidos, protenas, cidos nuclicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenos, plagucidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas y una gran variedad de sustancias inorgnicas. Ejemplos de utilizacin de HPLC: -Deteccin y cuantificacin de sacarina, benzoatos, cafena y aspartame en refrescos. -Deteccin de ciclomato en jugos de fruta. -Separacin de steres de cidos grasos por fase inversa y con argentizacin de columnas (Silicato de Al con Ag). -Separacin de Triglicridos por la longitud de la cadena y el grado de insaturacin por fase inversa y detector de dispersin luminosa, para el estudio de aceites y grasas adulteradas. -Determinacin del contenido de Vit A y sus precursores ( y caroteno) en margarina y aceites de hgado por fase inversa. -Determinacin del contenido en Vit D en leche en polvo y cereales por fase normal.

18

4. CROMATOGRAFA DE GASES. GC

4.1 FUNDAMENTOS Y PRINCIPIOS BSICOS

La cromatografa en fase gaseosa es un procedimiento para la separacin de compuestos voltiles, que fluyen en una corriente gaseosa a travs de una fase estacionaria fijada a un tubo largo y fino. El gas portador (inerte, por ej., nitrgeno, helio, hidrgeno y argn) transporta una muestra representativa de la sustancia inyectada. En una separacin se parte de la base, de que cada componente ser disuelto o adsorbido por la fase estacionaria. Los distintos componentes sern retenidos por esta fase con mayor o menor fuerza y alcanzarn correspondientemente el final de la columna, donde se encuentra el detector, despus de un tiempo de flujo de gas portador ms o menos largo. La cromatografa de gases permite obtener resultados tanto cualitativos como cuantitativos. Se utilizan fundamentalmente estas alternativas de separacin: 1. A mayor disolucin, la separacin de compuestos con estructura qumica similar se consigue utilizando tiempos relativamente largos. 2. A menor disolucin se realiza la separacin rpida de mezclas de compuestos sencillos conocidos.

4.2 INSTRUMENTACIN
Actualmente ms de 30 fabricantes de instrumentos ofrecen unos 130 modelos distintos de equipos para cromatografa de gases. En las ltimas dcadas, los instrumentos que han aparecido en el mercado presentan muchos cambios y mejoras. En los aos setenta, se hicieron habituales los integradores electrnicos y los equipos de procesado de datos basados en un ordenador. Los aos ochenta introdujeron la utilizacin de los ordenadores para el control automtico de la mayora de los parmetros instrumentales, tales como la temperatura de la columna, caudales y la inyeccin de la muestra, el desarrollo de instrumentos de muy alto rendimiento a un coste moderado, y tal vez lo ms importante, el desarrollo de las columnas abiertas que son capaces de separar multitud de analitos en un tiempo relativamente corto.

Componentes bsicos
GAS PORTADOREl gas portador cumple bsicamente dos propsitos: transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir ciertas condiciones: #

19

1. Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria). 2. Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa. 3. Fcilmente disponible y puro. 4. Econmico y adecuado al detector a utilizar. # COLUMNAS DE SEPARACIN Y FASES ESTACIONARIAS

Si la fase estacionaria es una sustancia slida, esta modalidad de la GC se denomina gas-solid-chromatography. Si la fase estacionaria es un lquido no voltil (viscoso) aplicado formando una pelcula dentro de una fina columna, se denomina gas-liquid-chromatography. Dado el elevado nmero de fases lquidas que existen para temperaturas superiores a 400C, la GLC es la ms verstil y seleccionada de las GC. Permite la investigacin de compuestos gaseosos (es decir, de peso molecular relativamente bajo). La cromatografa de gas-lquido se abrevia normalmente como cromatografa de gases debido a su gran aplicacin en todos los campos de la ciencia. La GC se divide en: a) GC con columnas empaquetadas y b) GC con columnas capilares. a) El primer caso se trata de columnas convencionales con un dimetro interno(ID) superior a 1mm y longitudes de 2-3m (de vidrio, metal), rellenas de granulados slidos en los que estn embebidas las distintas fases. b) Las columnas capilares son capilares largos de vidrio o slice (ID:0.2-0.3mm, longitud: como norma 50m), existen diferentes tipos de capilares. Debido a la alta resolucin que se consigue al trabajar con columnas capilares, la GC capilar se suele denominar tambin cromatografa gaseosa de alta resolucin (HRGC). # SISTEMA DE INYECCIN MUESTRA-

La muestra debe introducirse rpidamente en la columna. Normalmente, los lquidos se introducen en la columna por medio de jeringuillas de inyeccin (jeringuillas de microlitro con un volumen total de 0.5 a 10l) a travs de una membrana de goma (septo) del inyector termostatizado y los componentes se vaporizan; la cantidad inyectada se lee directamente en la escala de la jeringuilla graduada. La cantidad de la muestra a utilizar depende del tipo de columna, de la cantidad de fase estacionaria contenida en la columna o del espesor de la pelcula en el caso de los capilares de pelcula fina, de la solubilidad de los componentes importantes en la fase estacionaria (es decir, de la polaridad de soluto y disolvente) y de la temperatura. Controlando los cambios de temperatura de la columna (horno) durante el anlisis se puede, alcanzar el intervalo de temperatura ptimo para cada componente o fraccin individual, de manera que para cada componente de la mezcla se obtengan picos claros, en el caso ideal completamente separados.

20

DETECTORES

El detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad fsica, no medible directamente, en una seal elaborable y ofrecernos informacin sobre la naturaleza y la magnitud de la propiedad fsica. En cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre el gas portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que previamente se han separado en la columna, esta accin se traduce en una seal tipo elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador grfico o integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los componentes. Un detector muy utilizado en la analtica general de los alimentos es el detector de ionizacin de llama (FID). En l se mide, registra y amplifica el flujo inico resultante de la ionizacin de las molculas en una llama de hidrgeno (gases de combustin necesarios: hidrgeno y aire comprimido). El FID es un detector de los denominados universales o inespecficos, especialmente adecuados para medidas cuantitativas. Es un detector dependiente del flujo de masa, es decir, la seal es tanto mayor, cunta ms sustancia se ioniza en la llama en la unidad de tiempo. En el anlisis de las cantidades traza se utilizan por lo general detectores que presentan una elevada sensibilidad para determinadas sustancias, son los denominados detectores especficos. Tiene especial importancia en el anlisis de residuos y de contaminantes, el detector de captura electrnica (ECD). El ECD posee la caracterstica de detectar aquellas sustancias que poseen una elevada afinidad electrnica (por ej., los halgenos, aunque tambin otros grupos funcionales de la mlecula con afinidad por los electrones). Al contrario que el FID, el ECD mide una reduccin de la seal en lugar de una amplificacin.

4.3 APLICACIONES AL ANLISIS DE ALIMENTOS

Separacin e identificacin de azcares de forma cualitativa y cuantitativa despus de una conversin a derivados voltiles termoestables. Determinacin rpida y precisa de la composicn los cidos grasos en los aceites y las grasas tras efectuar la conversin de los steres de triglicridos en steres metlicos, que son ms voltiles. As se conoce con ms detalle la composicin isomrica, geomtrica y posicional de los triglicridos en la cidos grasos. Identificacin y determinacin de steres metlicos de cidos grasos poliinsaturados individuales. Determinacin del contenido de ismeros trans en aceites, grasas y alimentos grasos. Separacin entre y tocoferol (UPLE). Separacin y determinacin de alcoholes de azcar de sus derivados del trimetilsilil ter (TMS). Determinacin del sorbitol, el manitol y el xilitol en las frutas en capilares de vidrio.

21

BIBLIOGRAFA
LIBROS
Principios de Anlisis Instrumental. 5 ed (2001). Douglas A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman. Mc Graw-Hill Interamericana. Anlisis Instrumental. (2001). K.A. Rubinson, J.F. Rubinson. Prentice Hall. Anlisis de los Alimentos. (1992). Matissek, Schnepel, Steiner. Ed. Acribia, S.A. Composicin y Anlisis de los Alimentos de Pearson. 2 ed (1996). R.S. Kirk, R. Sawyer, H. Egan. Qumica Analtica. 6 ed. (1997). Skoog, West, Holler. Mc Graw-Hill.

PGINAS WEB
www.dq.fct.unl.pt/qof/hplcts.html www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografa/hplc.html www.merck.com.pe/MPSA%5csite%5cwmsp.nsg/contents/cromatografa www.hplc.co.uk/homeframe.htm www.shu.ac.uk/virtual_campus/courses/241/hplc.htm www.dicdoc.ucv.cl/lab_sibyl www.lafaw.com www.aldbot.com/HPLC-Analysis.htm www.richardscientific.com http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/ http://biologa.med.ub.es:8080/curso/curso.html http://latina.chem.cinvestad.mx/RLQ/tutoriales/cromatografa/Gas.htm

22

ndice 22

23