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Los siderocitos son hemates que contienen grnulos de hierro no hemo; fueron descritos originalmente por Gruneberg1 en pequeas cantidades en la sangre de embriones normales de ratas, ratones y humanos, y en grandes cantidades en ratones con anemia congnita. Los grnulos estn formados por un complejo insoluble en agua de ion frrico, lpidos, protenas e hidratos de carbono. Este material siderotico (o hemosiderina) reacciona con el ferrocianuro de potasio para formar un compuesto azul: el ferriferrocianuro. Esta reaccin es la base de una reaccin positiva al azul de Prusia (Perls). El material se tine tambin con los colorantes de Romanowsky, apareciendo entonces como granulos basofilos, que reciben el nombre de cuerpos de Pappenheimer (fig. 13.1)2. En contraposicion, la ferritina, que es un compuesto soluble en agua del hierro no hemo con la proteina apoferritina, no es detectable con la reaccin de Perls. La ferritina se encuentra en todas las clulas del organismo, mientras que, en los sujetos sanos, la hemosiderina se encuentra principalmente en los macrfagos de la medula sea, en el hgado (clulas de Kupffer) y en el bazo; cuando el organismo est sobrecargado de hierro, como en la hemocromatosis o en la hemosiderosis transfusional, dicho hierro en exceso se encuentra tambien en otros tejidos. El hierro viaja en plasma unido a una globulina , la transferrina, y pasa selectivamente a la medula osea, donde el complejo hierro-transferrina se une a los receptores de la transferrina en la superficie del eritroblasto; el hierro se libera de la transferrina y penetra en la clula. La mayor parte del hierro se convierte rpidamente en hemo: parte en el citosol y parte en las mitocondrias. El residuo no hemo se encuentra en forma de ferritina. La degradacin de la ferritina la transforma parcialmente en hemosiderina, que se visualiza bajo el microscopio ptico en forma de partculas refringentes amarillo oro en las clulas fagocitarias; al tenirse con la reaccin de Perls, la hemosiderina se tie de color azul. En los sujetos sanos, los grnulos sideroticos se observan, en las preparaciones tenidas mediante la reaccin de Perls, en el citoplasma de muchos de los eritroblastos de la medula sea humana y en los reticulocitos medulares 3. Sin embargo, no se observan habitualmente en los hemates de la sangre perifrica humana. Tras la esplenectoma, se pueden encontrar en todo momento siderocitos en sangre perifrica, a menudo en grandes cantidades. Probablemente la razn se deba a que los reticulocitos, tras su salida de la medula, son secuestrados normalmente durante un tiempo en el bazo y alli completan la sintesis del hemo, utilizando, para este fin, el hierro almacenado en el interior de los grnulos sideroticos en su citoplasma. Tras la esplenectoma, esta fase de la maduracin reticulocitaria tiene que desarrollarse en la corriente sangunea, pudiendo observarse un pequeo porcentaje de siderocitos en la sangre perifrica de personas por lo dems sanas. Probablemente, el bazo sea capaz de eliminar grandes grnulos sideroticos de los hemates (como los que pueden encontrarse en la enfermedad) por un proceso de extraccion 4, y, en su ausencia, tales grnulos persisten en los hematies durante toda su vida.
de Wright) y despues se sobretenian con el metodo del ferrocianuro acido 5. De esta forma se pueden obtener hermosas fotografias, pero los pequenos granulos que contienen el hierro tenido de azul tienden a enmascararse como eritroblastos jovenes por la basofilia general del citoplasma celular. Hayhoe y Quaglino describieron un metodo que combinaba el acido peryodico de Schiff (PAS) y la tincion de hierro6. Dicho metodo puede ser de utilidad para investigar la eritropoyesis anomala en la que los eritroblastos dan una reaccion positiva al PAS. Se ha descrito un metodo rapido para demostrar los granulos sideroticos mediante la tincion con azul bromoclorofeno al 1% durante 1 min7. Los granulos con contenido ferrico se tinen de purpura oscuro.
Un estudio ha demostrado que para establecer la ausencia de hierro tingible, se deben examinar al menos siete grumos y, si es necesario, utilizar ms de una extensin con este objetivo10. No hay un mtodo citoquimico para demostrar la ferritina; los mtodos de anlisis se describen en el capitulo 7.
Preparaciones teidas
Disolver aproximadamente 0,5 g de violeta de metilo en 100 ml de NaCl, 9 g/l y filtrar. Anadir 1 volumen de sangre (en cualquier anticoagulante) a 4 volumenes de la solucin con violeta de metilo y dejar reposar la solucin durante cerca de 10 min a temperatura ambiente. A continuacin, preparar las extensiones y dejarlas secar u observar la suspensin de las celulas entre el portaobjetos y el cubreobjetos. Los cuerpos de Heinz se tien de un purpura intenso(fig. 13.5).Los cuerpos de Heinz tambien se tinen con otros colorantes basicos. El verde brillante los tine bien y el colorante no es captado por el resto de los componentes del eritrocito16. El azul Rhodanile (solucion de 5 g/l en 10 g/l de NaCl) los tine rapidamente 17 (es decir, en 2 min); en ese momento los reticulocitos solo estan tenidos debilmente. En comparacin con el violeta de metilo, los cuerpos de Heinz se tinen menos intensamente con el azul de cresil brillante o con el nuevo azul de metileno. Sin embargo, pueden ser vistos inmediatamente como cuerpos azul palido en una preparacion de reticulocitos bien tenida, si no se ha contratenido la preparacion. Si se necesitan preparaciones permanentes, fijar las extensiones tenidas vitalmente mediante la exposicion al vapor de formalina durante 5-10 min. A continuacion, contratenir las extensiones fijadas con 1 g/l de eosina o de rojo neutro, tras lavarlas minuciosamente en agua. Si se fijan las extensiones en metanol, los cuerpos de Heinz se decoloran. En la talasemia mayor, la tincin con violeta de metilo de la medula sea pondr de manifiesto las cadenas precipitadas. Aparecen como grandes inclusiones irregulares en los normoblastos tardios, generalmente nicas y en estrecho contacto con el ncleo. Si se esplenectomiza a estos pacientes, se pueden encontrar las inclusiones en los reticulocitos y en los hemates maduros.
Mtodo
Mezclar conjuntamente en un tubo pequeo, como para la tincin de reticulocitos (v. pag. 34), volmenes iguales de sangre fresca o de sangre con acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) y 10 g/l de azul de cresil brillante o 20 g/l de nuevo azul de metileno en tampon fosfato isoosmotico a pH 7,4. Mantener la preparacin a 37 C durante 1-3 h haciendo extensiones a intervalos. Dejar que se sequen las extensiones y examinarlas sin contratenirlas. La hemoglobina H precipita en forma de cuerpos multiples, casi esfricos, de diverso tamao, que se tinen de un color azul-verdoso plido (fig. 13.7) y que pueden diferenciarse claramente del material reticulofilamentoso, que se tie de oscuro, de los reticulocitos (fig. 13.8). El nmero de clulas que contienen inclusin vara de acuerdo con el tipo de talasemia . En el rasgo talasemico 0, solo el 0,01-1,0% de los hematies contiene inclusiones, pero este hallazgo proporciona una clave importante para el diagnostico. Como regla, en la enfermedad de la hemoglobina H (p. ej., la que resulta de la heterocigosidad compuesta talasemia 0/talasemia +, /), al menos el 10% de las clulas desarrollan inclusiones y, en algunos casos, el porcentaje es considerablemente mayor. Cuando solo hay unas cuantas clulas afectadas, su deteccin ser ms fcil en una preparacin enriquecida19. Llenar 2-3 tubos capilares con la sangre y centrifugarlos durante 5 min en una centrifuga de microhematocrito. Despus, marcar los tubos justo por debajo de la capa de leucocitos y tambien 1 cm ms abajo; romperlos por las marcas indicadas y transferir cuidadosamente los segmentos rotos a un tubo pequeo. Anadir 1 gota de colorante e incubar a 37 C durante 3 h antes de hacer una extension. Hay que recordar que cuando se necesita un diagnost ico preciso del tipo de rasgo talasemico (p. ej., para el diagnostico prenatal), no est indicada la preparacion de la hemoglobina H. En ese caso lo indicado es el anlisis del ADN.
Carboxihemoglobina y metahemoglobina
Las clulas que contienen carboxihemoglobina y metahemoglobina pueden ponerse de manifiesto por medios citoquimicos. Estos mtodos fueron descritos por Kleihauer20.Tienen poco valor prctico en la practica actual.
Hemoglobina fetal
El mtodo citoqumico de elucin acida, introducido por Kleihauer y cols.21, es un procedimiento sensible para identificar las clulas individuales que contienen hemoglobina F incluso cuando hay pocas. Su deteccin en la circulacin materna ha proporcionado informacin valiosa en la patognesis de la enfermedad hemoltica del recin nacido. La identificacin de las clulas que contienen hemoglobinaF se basa en el hecho de que son resistentes a la elucin acida en mayor grado que las celulas normales; asi, en la tcnica descrita a continuacin, aparecen como clulas aisladas, tenidas de oscuro en un trasfondo de clulas fantasma plidamente tenidas. Las celulas ocasionales que se tien en un grado intermedio son menos faciles de evaluar; algunas de ellas pueden ser reticulocitos porque resisten tambien a la elucion acida en alguna medida. Recomendamos el mtodo siguiente22, en el que la elucion se realiza a pH 1,5.
Reactivos
Fijador. Etanol al 80%. Solucin de elucin. Solucin A: 7,5 g/l de hematoxilina en etanol al 90%. Solucin B: FeCl3, 24 g; 20 ml de HCL, 2,5 mol/l; agua bidestilada hasta 1 l. Para su utilizacion, mezclar correctamente 5 vol. de A y 1 vol. de B. El pH es aproximadamente 1,5. La solucin puede utilizarse durante alrededor de 4 semanas; si se forma un precipitado, hay que filtrar la solucion. Contratincin. 1 g/l de eritrosina acuosa o 2,5 g/l de eosina acuosa.
Mtodo
Preparar extensiones nuevas secadas al aire. Inmediatamente despues de su secado, fijar las extensiones durante 5 min en etanol al 80% en una cubeta de Coplin. A continuacin, aclarar
las extensiones rpidamente en agua y dejarlas verticalmente sobre un papel secante durante unos 10 min para que se sequen. Despus, disponer las extensiones durante 20 s en una cubeta de Coplin con la solucin de elucin. Posteriormente, lavarlas minuciosamente con agua y, por ltimo, colocarlas para contratenirlas durante 2 min. Aclarar en agua del grifo y dejarlas secar al aire. Las celulas fetales se tinen de rojo y las celulas fantasma del adulto de rosa palido (fig. 13.9). Como controles positivo y negativo deben tenirse al lado de las extensiones problema extensiones preparadas a partir de: a) una mezcla de sangre del cordn umbilical y de sangre de adulto, y b) sangre de adulto normal. Se han propuesto diversas modificaciones al mtodo de Kleihauer. En una de ellas se incorpora nuevo azul de metileno a la solucin tampn, el tiempo de reaccion se alarga y el tampon se utiliza para lavar las extensiones 23. La ventaja de esta tecnica es que los reticulocitos se tinen de azul, mientras que las celulas que contienen hemoglobina F lo hacen de rosa. Se ha desarrollado un metodo de tincion immunofluorescente basado en la utilizacion de un anticuerpo especfico contra la hemoglobina F, que no reacciona con la hemoglobinaA24. Utilizando un procedimiento de doble marcaje, con anticuerpo marcado con rhodamina contra la globina y un anticuerpo marcado con fluoresceina contra la globina , es posible detectar la presencia de hemoglobina F y de hemoglobina A en la misma celula25.