Jurnal Natural Vol. 10, No.

2, 2010

THE EFFECT Of CIGARETTES SMOKE EXPOSURED CAUSES FERTILITY Of MALE MICE (Mus musculus)
Fitriani, Kartini Eriani, Widya Sari
Jurusan Biologi, FMIPA Unsyiah, Darussalam, Banda Aceh Email: kartini24@yahoo.com
Abstract. This research aimed to know the effect of cigarettes smoke exposured on spermatozoa quality that causes infertility of mice (Mus musculus). It was carried out from July to December 2008 at Microtechnique Laboratory of FMIPA Unsyiah. The research used the experimental method with completely randomized design was applied of this research, consisted of four treatments and 5 repitition of each treatment. The treatments were cigarette smoke exposured 0 hour (control), 2 hours, s, 4 hours and 6 hours that was given for 18 days. The parameters were a count of live liv sperm, motility sperm, abnormality sperm and intact acrosomal cap The result showed the exposured of cigarette smoke had significant influence to quality of sperm. The exposured of cigarette smoke could decrease the percentages of motility of sperm, live sperm, and intact acrocomal cap, But increase the percentage of abnormality sperm. Key word : Cigarette smoke, infertility, spermatozoa.

I.

PENDAHULUAN

Asap rokok dapat menimbulkan gangguan hormonal, spermatogenesis, merusak viabilitas spermatozoa dan menyebabkan adanya bahan toksik pada spermatozoa. Gangguan terhadap sel spermatozoa menyebabkan penurunan kualitas semen dan terjadinya kemandulan. Kemampuan Kemampua spermatozoa membuahi sel telur dipengaruhi oleh kualitas dan kuantitas spermatozoa. Spermatozoa yang kualitasnya rendah tidak dapat membuahi sel telur. Kualitas spermatozoa akan kembali baik apabila perokok aktif menghentikan kebiasaan merokok dan mengubah ah pola hidup sehat [1]. Rokok mengandung banyak bahan kimia. Setiap satu batang rokok dibakar, mengeluarkan sekitar 4.000 bahan kimia diantaranya adalah nikotin, gas karbon monoksida, nitrogen oksida, hidrogen sianida, ammonia, akrolein, benzene, dan etanol et [2]. Kandungan rokok sangat berbahaya bagi perokok maupun orang-orang orang di sekitarnya (perokok pasif). Asap rokok yang terhirup dapat menyebabkan penyakit berbahaya, yaitu kanker, penyakit jantung dan emfisema. Pada organ reproduksi akan menyebabkan gangguan gguan seperti kemandulan (pria dan wanita), impotensi, gangguan kehamilan dan perkembangan janin [2]. Merokok memberikan dampak negatif pada kesehatan reproduksi pria dan wanita. Campuran komponen toksik rokok mempengaruhi kualitas dan

kuantitas spermatozoa, zoa, pada pria meliputi disfungsi ereksi, libido, ejakulasi, dan gangguan orgasme [2]. Beberapa penelitian menyebutkan bahwa asap rokok memberikan pengaruh yang sangat besar terhadap spermatozoa meliputi mengubah bentuk spermatozoa menjadi tidak normal, merendahkan m jumlah bilangan spermatozoa, dan melambatkan spermatozoa menuju sel telur [2]. Pengaruh kandungan asap rokok berupa kadmium, nikotin, cotinin yang diberikan terhadap kultur in vitro oosit dan sel kumulus yang dikoleksi dari folikel babi menunjukkan kan ketiga senyawa tersebut mempunyai efek menghambat terjadinya ekspansi kumulus akibat penurunan sintesis progesteron oleh sel-sel sel kumulus perlakuan [3]. Paparan asap rokok pada mencit bunting 3 jam per hari selama 18 hari menyebabkan terjadinya gangguan perkembangan embrio mencit [4].

II. METODOLOGI
Bahan Bahan-bahan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 20 ekor mencit jantan (Mus musculus) berumur dua bulan an dengan berat badan 26 - 28 gram. Pelet jenis 789-S, S, rokok kretek dengan kadar nikotin 2.2 mg dan kandungan tar 38 mg per batang rokok, larutan Phosphat Buffer Saline (PBS), , formalin 1 %, alkohol 70 %, nigrosin, eosin B, dan akuades.

The effect of cigarettes smoke exposured causes fertility of male mice (mus musculus) ( Fitriani, Kartini Eriani, Widya Sari)
_____________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________

Alat-alat yang digunakan adalah botol kaca, alat bedah (pisau, gunting, pinset), bak bedah, pipet, spuid, counter, cawan petri, selang plastik, mikroskop cahaya, kaca objek, kaca penutup, kamera photo dan kandang perlakuan dengan smoking pump (Gambar 1).

diamati menggunakan mikroskop cahaya pada pembesaran 10 x 40. Pengamatan spermatozoa meliputi motilitas spermatozoa, spermatozoa yang hidup/mati, abnormalitas spermatozoa dan keutuhan tudung akrosom spermatozoa. Pengamatan motilitas spermatozoa Pengamatan motilitas spermatozoa dilakukan dengan menghitung jumlah spermatozoa motil dari 100 spermatozoa yang diamati. Pengamatan hidup atau mati spermatozoa sperma Pengamatan karakteristik hidup/mati spermatozoa dilakukan dengan cara meneteskan pewarnaan eosin B dan nigrosin di atas kaca benda yang berisi spermatozoa. Spermatozoa mati berwarna merahmerah keunguan, sedangkan spermatozoa yang hidup akan terlihat berwarna putih pada bagian kepala. Pengamatan hidup/mati spermatozoa dilakukan dengan cara menghitung jumlah spermatozoa hidup dari 100 spermatozoa yang diamati. Pengamatan abnormalitas spermatozoa Pengamatan terhadap karakteristik abnormalitas spermatozoa yang telah diwarnai dengan eosin B dan nigrosin dilakukan dengan cara menghitung jumlah spermatozoa yang abnormal dari 100 spermatozoa yang diamati. Spermatozoa yang abnormal ditandai dengan kepala ganda, ekor putus, ekor hilang dan rusaknya membran me plasma. Pengamatan spermatozoa keutuhan tudung akrosom

Gambar 1. Kandang perlakuan dan smoking Pump

Metode Penelitian Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang terdiri atas empat perlakuan dan masing-masing masing perlakuan diulang lima kali. Perlakuan terdiri atas paparan asap rokok selama 0 jam (kontrol), 2 jam, 4 jam, dan 6 jam setiap hari selama 18 hari. Data ata hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan analisis varians dan dilanjutkan dengan uji Jarak Berganda Duncan [5]. Perlakuan hewan coba Hewan uji dibagi menjadi empat perlakuan dengan lima ulangan untuk masing-masing masing perlakuan, yaitu: yaitu Perlakuan kontrol (P0) : tidak diberi paparan asap rokok (kontrol), Perlakuan 2 jam (P1) : diberi paparan asap rokok dengan lama paparan 2 jam, Perlakuan 4 jam (P2) : diberi paparan asap rokok dengan lama paparan 4 jam, Perlakuan 6 jam (P3) : diberi paparan asap rokok kok dengan lama paparan 6 jam. Pemberian paparan asap rokok dilakukan selama 18 hari. Pemberian asap rokok dilakukan dengan menggunakan smoking pump modifikasi Laboratorium Mikroteknik Jurusan Biologi FMIPA Unsyiah. Setiap selesai pemberian satu batang rokok okok diberikan jeda 10 menit sebelum dilanjutkan dengan pemberian asap rokok selanjutnya. Pemberian asap rokok dilakukan setiap hari mulai pukul 09.00 WIB sampai selesai. Mencit perlakuan selanjutnya dimatikan dengan teknik dislocasio cervicalis dan dibedah dib bangkai untuk pengambilan duktus deferens. Spermatozoa yang diperoleh dari duktus deferen selanjutnya 13

Pengamatan tudung akrosom utuh dilakukan dengan memakai larutan NaCl fisiologis yang mengandung formalin 1%. Tudung akrosom yang utuh ditandai dengan ujung kepala spermatozoa yang bewarna hitam tebal. Pengamatan dilakukan dengan cara menghitung jumlah spermatozoa yang memiliki tudung akrosom utuh dari 100 spermatozoa yang diamati.

II. HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengamatan motilitas spermatozoa Hasil penelitian menunjukkan bahwa rata-rata rata motilitas spermatozoa perlakuan P1 (2 jam) tidak berbeda nyata dengan P0 (kontrol), sedangkan perlakuan P2 (4 jam) dan P3 (6 jam) berbeda nyata dengan P0 dan P1 (P<0.05) (Tabel 1) .

The effect of cigarettes smoke exposured causes fertility of male mice (mus musculus) ( Fitriani, Kartini Eriani, Widya Sari)
_____________________________________________________________________________________________________________

Tabel 1. Rata-rata jumlah spermatozoa motil setelah pemaparan asap rokok

Perlakuan P0 (0 jam) P1 (2 jam) P2 (4 jam) P3 (6 jam) Ulangan 5 5 5 5 (X 93.2a

menembus saluran reproduksi secara normal serta tidak dapat menembus sel telur [8]. Suplementasi vitamin E dan C pada tikus yang dipapar asap rokok selama 2 bulan dapat menghambat penurunan aktifitas SOD (Superoxide Dismutase) dan asap rokok memberikan efek yang merugikan terhadap eritrosit. Radikal bebas dari asap rokok berpotensi merusak protein yang dibuktikan dengan adanya penurunan drastis terhadap aktifitas enzim SOD eritrosit pada tikus yang hanya dipapar asap rokok [9]. Reaksi rantai peroksida lipid dan senyawa radikal bebas dapat dicegah timbulnya atau diputus rantai reaksinya dengan cara menambahkan senyawa antioksidan seperti glutation, sistein, katalase, glutation, peroksidase, vitamin E dan Vitamin C di dalam medium [10]. Antioksidan didalam tubuh dibagi menjadi 3 kelompok yaitu: antioksidan primer, antioksidan sekunder dan antioksidan tersier. Antioksidan primer bekerja mencegah pembentukan senyawa radikal bebas baru dengan mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang berkurang dampak negatifnya, sebelum radikal bebas ini sempat bereaksi. Contoh jenis antioksidan primer adalah enzim SOD. Antioksidan sekunder berfungsi menangkap senyawa serta mencegah terjadinya reaksi berantai. Contoh antioksidan sekunder adalah vitamin E, vitamin C, beta karoten, asam urat, bilirubin, dan albumin. Antioksidan tersier bekerja memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang disebabkan radikal bebas, contohnya enzim yang memperbaiki DNA pada inti sel yaitu metionin sulfoksi dan reduktase [11]. Pengamatan spermatozoa hidup atau mati Perlakuan pemaparan asap rokok berpengaruh terhadap rata-rata jumlah spermatozoa hidup dibandingkan dengan kontrol (P<0.05), namun tidak berbeda antar perlakuan P1, P2 dan P3 (Tabel 2). Tabel 2. Rata-rata jumlah spermatozoa hidup setelah pemaparan asap rokok Perlakuan Ulangan ( X SD) P0 (0 jam) P1 (2 jam) P2 (4 jam) P3 (6 jam) 5 5 5 5 85a 76 75
b b

SD) 2.588

88.8a 3.5637 83.6b 4.393 79.4b 3.974

Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf 5%. Motilitas spermatozoa P1 dan P0 (kontrol) tidak menunjukkan perbedaan nyata. Sedangkan pada P2 dan P3 terhadap P0 menunjukkan penurunan nyata terhadap rata-rata jumlah motilitas spermatozoa (P<0.05). Hal ini menunjukkan bahwa lama pemaparan asap rokok dapat menyebabkan penurunan motilitas spermatozoa. Sedangkan pemaparan asap rokok selama 2 jam belum memberikan efek negatif terhadap mencit. Penurunan motilitas spermatozoa diduga disebabkan oleh senyawa radikal bebas pada asap rokok yang dapat mengganggu motilitas spermatozoa. Radikal bebas yang terkandung pada asap rokok dapat menurunkan frekuensi gerakan ekor spermatozoa karena menyebabkan berkurangnya energi pergerakan ekor spermatozoa. Radikal bebas menyebabkan produksi ATP mitokondria rendah. Mitokondria merupakan tempat proses perombakan atau katabolisme untuk menghasilkan energi bagi pergerakan ekor spermatozoa [6]. Alat gerak spermatozoa terletak pada bagian ekor spermatozoa yang disusun oleh aksonema. Aksonema terdiri dari sepasang mikrotubulus sentral dan dikelilingi 9 pasang mikrotubulus di sebelah luarnya. Mikrotubulus luar terdiri atas subfibril A dan subfibril B yang disusun oleh protein dinein. Protein dinein sangat berguna dalam motilitas spermatozoa karena mempunyai aktifitas ATP-ase yang dapat menghidrolisis ATP yang dipergunakan sebagai energi motilitas spermatozoa [7]. Penurunan motilitas spermatozoa akibat paparan asap rokok sejalan dengan peningkatan abnormalitas spermatozoa mencit perlakuan (Tabel. 3). Abnormalitas spermatozoa dapat mempengaruhi motilitas spermatozoa. Spermatozoa dengan morfologi abnormal akan menghambat pergerakan spermatozoa. Morfologi spermatozoa yang abnormal menyebabkan kelemahan pergerakan (motilitas) spermatozoa dan merupakan salah satu faktor infertilitas. Rendahnya motilitas spermatozoa yang abnormal menyebabkan spermatozoa kurang mampu melakukan penetrasi ke dalam getah serviks dan 14

5.049 7.874 4.183 5.585

68.2b

Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf 5%. Hasil pengamatan mikroskopis ditemukan spermatozoa mencit perlakuan yang hidup dan

The effect of cigarettes smoke exposured causes fertility of male mice (mus musculus) ( Fitriani, Kartini Eriani, Widya Sari)
_____________________________________________________________________________________________________________

mati. Spermatozoa yang hidup ditandai oleh kepala yang berwarna putih, sedangkan spermatozoa mati ditandai oleh kepala yang berwarna merah setelah pewarnaan dengan eosin B (Gambar 2). Rusaknya membran plasma pada spermatozoa yang mati menyebabkan pompa sodium tidak lagi berfungsi dengan baik untuk mengatur sirkulasi zat-zat dari dan ke luar sel sehingga pewarna eosin masuk ke sel dan tetap tinggal di dalam dan mewarnai spermatozoa menjadi merah terutama pada bagian kepala. Spermatozoa yang hidup memiliki membran plasma yang masih utuh sehingga pompa sodium dapat berfungsi dengan baik. Enzim Na K ATPase yang terdapat pada membran plasma akan memompa kembali ion Na yang berikatan dengan pewarna eosin ke luar dari sel.
+ +

Pengamatan abnormalitas spermatozoa Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan pemaparan asap rokok berbeda nyata dengan kontrol (P<0.05), namun saling tidak berbeda nyata antar perlakuan (P1,P2 dan P3) (Tabel 3). Peningkatan rata-rata jumlah spermatozoa yang abnormal menunjukkan adanya pengaruh pemaparan asap rokok yang mengakibatkan banyaknya spermatozoa yang abnormal. Tabel 3.Rata-rata jumlah abnormalitas spermatozoa setelah pemaparan asap rokok
Perlakuan P0 (0 jam) P1 (2 jam) P2 (4 jam) Ulangan 5 5 5 5 (

X SD)

7.8a 1.923 16.4b 4.722 20.6b 20.2b

P3 (6 jam)

2.408 2.280

Keterangan : Angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf 5%

Gambar 2. Spermatozoa dengan pewarnaan eosin B, (A) spermatozoa hidup (B) spermatozoa mati.

Semakin lama waktu pemaparan asap rokok yang diberikan pada mencit jantan maka semakin menurunkan rata-rata jumlah spermatozoa hidup. Hal ini menunjukkan bahwa terjadi peningkatan spermatozoa mati akibat paparan asap rokok. Kematian spermatozoa diduga disebabkan oleh senyawa radikal bebas yang dapat mengakibatkan kematian sel. Kematian sel disebabkan oleh kerusakan DNA yang diakibatkan pengaruh dari radikal bebas atau reactive oxygent species (ROS). Kerusakan DNA terjadi akibat tekanan oksidatif yang meningkatkan pembentukan ROS sehingga merusak fragmentasi DNA sehingga mengakibatkan apoptosis. Hal ini yang menyebabkan banyak ditemukannya spermatozoa yang mati setelah dipaparkan asap rokok [12]. Radikal bebas menyebabkan mutasi DNA dan sitotoksitas. Sitotoksitas dapat menyebabkan kematian dan penurunan jumlah sel dalam jaringan. Mekanisme sitotoksitas pada sel salah satunya dapat disebabkan oleh tekanan oksidatif [13]. Tekanan oksidatif timbul akibat dari produksi ROS yang berlebihan dan rusaknya mekanisme pertahanan antioksidan. Jika terjadi ketidakseimbangan antara pro-oksidan (toksin asap rokok) dengan anti-oksidan atau kegagalan sel untuk memperbaiki diri dari kerusakan akibat pro-oksidan, maka akan terjadi tekanan oksidatif [14].

E
D

Gambar 3. Abnormalitas spermatozoa yang dikoleksi dari duktus deferen.(A) spermatozoa normal (B) spermatozoa kepala pecah (C) spermatozoa kepala kecil (D) spermatozoa kepala pipih (E) spermatozoa yang masih memiliki droplet sitoplasma (F) spermatozoa dengan leher patah.

Hasil pengamatan mikroskopis ditemukan kelainan pada morfologi spermatozoa mencit perlakuan seperti kepala pecah, kepala pipih, ekor putus dan kepala kecil (Gambar 3). Abnormalitas pada spermatozoa dibagi menjadi abnormalitas primer dan abnormalitas sekunder. Abnormalitas primer yaitu spermatozoa yang mengalami kelainan pada saat spermatogenesis, meliputi kepala yang terlampau besar, kepala yang terlampau kecil, kepala pendek, kepala pipih memanjang, kepala rangkap dan ekor ganda. Abnormalitas sekunder yaitu spermatozoa yang mengalami kelainan setelah meninggalkan tubulus seminiferus, ditandai dengan ekor putus, kepala pecah, dan kepala tanpa ekor [15].

15

The effect of cigarettes smoke exposured causes fertility of male mice (mus musculus) ( Fitriani, Kartini Eriani, Widya Sari)
_____________________________________________________________________________________________________________

Paparan asap rokok dapat mempengaruhi proses spermatogenesis, kualitas semen dan perubahan kadar hormon testosteron. Pengaruh asap rokok dapat mempengaruhi sintesis hormon testoteron melalui dua mekanisme. Mekanisme pertama melibatkan komponen logam (kadmium dan nikel) dalam asap rokok yang dapat mengganggu aktifitas enzim adenil siklase pada membran sel leydig sehingga mengakibatkan terhambatnya sintesis hormon testosteron. Mekanisme kedua melibatkan nikotin dalam asap rokok yang dapat menstimulasi medula adrenal untuk melepaskan katekolamin. Katekolamin dapat mempengaruhi sistem saraf pusat sehingga dapat mengganggu proses spermatogenesis dan sintesis hormon testosteron melalui mekanisme umpan balik antara hipotalamus-hipofisis anterior testis. Hasil penelitian menunjukkan bahan-bahan racun dan radikal bebas menimbulkan perubahan DNA pada spermatozoa yang menyebabkan mutasi secara permanen yang dapat diwariskan pada keturunan [16]. Spermatozoa hidup dengan akrosom utuh Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemaparan asap rokok berpengaruh nyata terhadap keutuhan tudung akrososm dibandingkan dengan kontrol (P<0.05). Sedangkan pada perlakuan P1, P2 dan P3 tidak berbeda nyata (Tabel 4). Tabel 4 Rata-rata jumlah spermatozoa dengan tudung akrosom utuh Perlakuan P0 (0 jam) P1 (2 jam) P2 (4 jam) P3 (6 jam) Ulangan 5 5 5 5 (X

Gambar 4. Morfologi spermatozoa dengan keutuhan tudung akrosom. (A) spermatozoa hidup dengan tudung akrosom utuh (B) spermatozoa dengan tudung akrosom tidak utuh.

Spermatozoa yang tidak memiliki tudung akrosom utuh yang ditandai dengan kepala berwarna putih. Menurunnya rata-rata jumlah spermatozoa yang memiliki tudung akrosom utuh diduga disebabkan oleh produksi ROS yang berlebihan yang dihasilkan dari produk metabolisme yang terjadi secara alamiah dan berbahaya bagi kelangsungan sel. ROS dapat menyebabkan terjadinya peroksida lipid pada membran plasma spermatozoa yang dapat menimbulkan kegagalan fungsi spermatozoa yaitu hilangnya kemampuan untuk fertilisasi [17]. Terjadinya kerusakan pada membran spermatozoa menyebabkan gangguan pada spermatozoa itu sendiri. Membran plasma yang rusak menyebabkan meningkatnya permeabilitas membran sel pada kepala spermatozoa sehingga banyak senyawasenyawa yang tidak diinginkan dapat dengan mudah masuk ke dalam sel. Hal ini mengakibatkan terjadinya perubahan berupa pembengkakan dan perusakan bagian kepala spermatozoa sehingga menyebabkan kerusakan membran akrosom yang terletak di bagian anterior kepala spermatozoa. Membran akrosom yang telah hancur menyebabkan enzim-enzim hidrolitik yang terkandung di dalam akrosom keluar sehingga tudung akrosom yang dimiliki spermatozoa tersebut menjadi tidak utuh [18]. Hal inilah yang menurunkan jumlah spermatozoa yang memiliki tudung akrosom utuh setelah pemaparan asap rokok. KESIMPULAN Semakin lama paparan asap rokok maka semakin menurunkan kualitas spermatozoa (motilitas, hidup/mati, keutuhan tudung akrosom dan abnormalitas). Pemaparan asap rokok selama 2 jam selama 18 hari telah dapat menyebabkan penurunan nyata terhadap kualitas spermatozoa mencit.

SD)

63.2a 7.021 47.8b 5.412 47.2b 6.693

43.8b 5.630 keterangan : Angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf 5%. Paparan asap rokok menyebabkan penurunan ratarata jumlah spermatozoa dengan tudung akrosom utuh. Hasil pengamatan mikroskopis terhadap keutuhan tudung akrosom spermatozoa yang dikoleksi dari vas deferen mencit menunjukkan bahwa spermatozoa yang memiliki keutuhan tudung akrosom ditandai bintik hitam di bagian kepala spermatozoa setelah dipaparkan dengan larutan formalin 1% (Gambar 4).

16

The effect of cigarettes smoke exposured causes fertility of male mice (mus musculus) ( Fitriani, Kartini Eriani, Widya Sari)
_____________________________________________________________________________________________________________

REFERENSI 1. Anonimous. 2007. Rokok dan Kesehatan Reproduksi Pria. http://www.gessang.go.id /article_detail.php?aid=662. Diakses tanggal 5 Agustus 2008. 2. T.Y. Aditama, 1992, Rokok dan Kesehatan, UI, Jakarta, 3-5. 3. S. Virsanka, E. Nagyova, A. M. Cikova, M. Fichova, and J. Kolena, 2003, Components of Cigarette Smoke Inhibit Expansion of Oocyte Cumulus Completes from Porcine Follicles, The Journal of Physiology Reproduction, 52, 383387. 4. D.K. Sari, Sunarti dan K. Eriani, 2008, Pengaruh Asap Rokok Terhadap Fetus Mencit (Mus musculus) DYJ Prenatal. Jurnal Natural, 8 (1), 10-13. 5. K.A. Gomez dan A.A Gomez, 1995, Prosedur Statistik Untuk Penelitian, Universitas Indonesia Press, Jakarta. 6. C.S. Sikka, 2004, Role of Oxidative Stress and Antioxidant in Andrology, Journal of Andrology. 25 (1), 2699-2722, http://www.or.id./idex.Mod. Diakses tanggal 5 Agustus 2008. 7. E. Purwaningsih, 1996, Morfologi Spermatozoa: Adakah Kaitannya dengan Kehamilan, Jurnal Kedokteran YARSI, 4(1) ,54-65. 8. E. Purwaningsih, 1996, Pengaruh Puasa Ramadhan terhadap Integritas Membran pada Semen Pria Fertil, Jurnal Kedokteran YARSI, 6(1), 8-7. 9. J. Christyaningsih, 2003, Pengaruh Suplementasi Vitamin E dan C Terhadap Aktivitas Enzim Superoxide Dismutase (SOD) Dalam Eritrosit Tikus Yang Terpapar Asap Rokok Kretek, http://UnairThesis.Jiptunair-gdl-2003- Christiyaningsih.2c-667-rokok. Diakses tanggal 2 Maret 2009. 10. K. Eriani, A. Boediono, I. Djuwita, S. H. Sumarsono, A. Azhar, 2008, Development of Domestic Cat Embryo Produced by Preserved Sperms, Bioscience, 15 (4), 155-160.

11. Anonimous, 2008, Tobacco and Health, http://www. wikipedia.com/ tobacco and health, Diakses tanggal 5 Februari 2008. 12. M Moustafa, M. H. Sharma, R. K.. Thorton, J. Mascha, E. Abdel-Hafez, M . A. Thomas, A. J. Agarwal, 2004, Relation between ROS Production, Apoptosis and DNA denaturation in spermatozoa from Patient examined for infertility, Human Reproduction, 19 (1), 129138. 13. A. Agarwal, R. A. Saleh and M. A. Bedaiwy, 2003, Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction, Human Reproduction Infertility and Sexual Funtion, 7, 829-843. 14. Anonimous, 2006, Oxidative stress, http:www.sigmldrich.com/Area_ofinterest/Lif escient/Cell_Signaling?SiencientResourch/pat hwaySlideCharts/Oxidativestress.html. Diakses tanggal 10 November 2008. 15. M.R. Toelihere, 1993, Fisiologi Reproduksi pada Ternak, Angkasa Bandung, 71-141. 16. A. Nova, 2006, Perubahan Sebaran Stadia Epitel Seminiferus, Penurunan Jumlah Sel-sel Spermatogenik dan Kadar Hormon Testosteron Total Mencit (Mus musculus) Galur DDY yang Diberi Asap Rokok Kretek, http://digilibLitbangdepkes.go.id./go.php?id+j kpkbbppk-gdl-res-2004-PascaSarjana. Diakses tanggal 2 Februari 2008. 17. F.R. Ochesendorf and M. Podda, 1999, The Role of Reactive Oxygen Species in Male Fertility, Reproduction Medicine, 15(6), 393404. 18. M. Rizal, 2005, Fertilitas Spermatozoa Ejakulat dan Epididimis Domba Garut Hasil kriopreservasi Menggunakan Modifikasi Pengencer Tris dengan Berbagai Krioprotektan Tris dengan Berbagai Krioprotektan dan Antioksidan, Disertasi, IPB, Bogor.

17