ANALISIS KARBOHIDRAT

Karbohidrat atau gula menempati kedudukan inti pada metabolisme tumbuhan. Gula bukan saja merupakan senyawa organik rumit pertama yang terbentuk dalam tumbuhan sebagai hasil fotosintesis, mereka juga merupakan sumber utama energi pernafasan. Mereka adalah sarana penyimpanan energi (sebagai pati) dan pengangkut (sebagai sukrosa), serta pembangunan dasar dinding sel (selulosa). Disamping itu banyak golongan senyawa tumbuhan lain, misalnya asam nukleat dan glikosida tumbuhan, mengandung gula sebagai ciri penting strukturnya. Akhirnya, gula mempunyai sejumlah peran ekologi pada antaraksi hewan dan tumbuhan (nektar bunga terutama gula) pada perlindungan luka dan infeksi, dan pada pengawaracunan senyawa asing. Gula dapat dipilih secara memuaskan menjadi 3 golongan berdasarkan ukuran molekulnya: monosakarida sederhana (misalnya glukosa, fruktosa) dan turunannnya ; oligosakarida, yang terbentuk dengan kondensasi 2 satuan monosakarida atau lebih (misalnya sukrosa dan polisakarida). Dari segi kimia gula yang berbobot molekul rendah mempunyai sejumlah sifat yang sama. Mereka berupa senyawa polihidroksi alifatik yang aktif optik dan biasanya sangat mudah larut daklam air. Mereka seringkali sukar mengkristal, sekalipun murni, dan seringkali diisolasi sebagai turunannya (misalnya sebagai osazonn, hasil reaksi dengan fenilhidrazin). Gula nesbilabil dan mudah mengalami pengisomeran (enzimatis atau cara lain), dan atau mengalami pembukaan cincin sewaktu ekstraksi dan pembengkakan ekstrak. Karena itu, sewaktu isolasi, kita harus mencegah pemanasan dan pH sepaling (ekstrem). Gula adalah senyawa tanwarna dan bila terdapat dalam jumlah mikro, harus dideteksi dengan cara reaksi menggunakan pereaksi kromogen yang cocok. Gula mereduksi, seperti glukosa, yang secara klasik dideteksi berdasarkan pembentukan endapan merah kuning dengan larutan fehling, dapat mudah dideteksi pada kromatogram dengan menggunakan pereaksi fenol atau amina (misalnya resorsinol-H2SO4 atau anilin hidrogen ftalat). Gula tak mereduksi kurang tanggap terhadap reaksi tersebut dan biasanya dideteksi berdasarkan oksidasinya yang cepat dengan periodat atau timbal tetra asetat. Pereaksi umum untuk semua gula ialah larutan AgNO 3 basa, tetapi pereaksi ini tidak sepenuhnya khas untuk gula karena ia bereaksi juga dengan senyawa tumbuhan tertentu, seperti fenol. MONOSAKARIDA 1. Kimia dan penyebaran Gula bebas utama dalam tumbuhan adalah monosakarida, yaitu glukosa dan fruktosa (dan disakarida, yaitu sukrosa), bersama-sama dengan sesepora xilosa, ramnosa, dan galaktosa. Gula lain yang terdapat dalam jumlah sesepora ialah gula fosfat. Bagian terbesar karbohidrat terdapat dalam tumbuhan dalam bentuk terikat, sebagai oligo-atau polisakarida, atau terikat pada aglikon yang beranekaragam, yaitu sebagai glikosida. Analisis monosakarida yang paling sering dilakukan adalah yang

menyangkut identifikasi gula dalam hidrolisat glikosida tumbuhan, yaitu oligosakarida atau polisakarida. Ada 5 gula yang biasanya dijumpai sebagai komponen glikosida dan polisakarida dan kebanyakan analisis tumbuhan menyangkut pemisahan dan identifikasi mereka itu. Dua berupa heksosa, yaitu glukosa dan galaktosa dua lagi berupa pentosa, yaitu xilosa dan arabinosa, dan satu lagi berupa metil pentosa, yaitu ramnosa. Yang terdapat agak umum ialah asam uronat, yaitu asam glukuronat dan galakturonat. Heksosa ketiga yaitu manosa, juga terdapat umum dalam polisakarida. Gula pentosa, yaitu ribosa dan deoksiribosa, yang berturut-turut merupakan komponen RNA dan DNA, tetapi jenis gula ini jarang dijumpai dalam tumbuhan sebagai bentuk lainnya. Satu-satunya gula keto yang umum ialah fruktosa, tidak sering terdapat dalam glikosida tumbuhan, merupakan komponen yang biasa dalam oligosakarida (misalnya sukrosa) dan dalam polisakarida, yang dikenal sebagai fruktan. Sederetan gula yang lebih langka terdapat dalam glukosida, contohnya gula 5-karbon-bercabang apiosa, yang terdapat sebagai glikosida flavon, apiin, dalam biji peterseli, Peterselinum crispum. Harus diingat bahwa masing-masing gula dapat berada dalam lebih dari satu bentuk isomer aktif optik. Jadi, glukosa biasanya -D-isomer, ramnosa bentuknya -L, dst. Kromatografi biasanya tidak dapat membedakan enansiomer optik yang satu dari enansiomer optik lainnya. Secara teori, masing-masing gula mungkin terdapat sebagai bentuk piran (6 anggota) atau bentuk furan (5 anggota), walaupun biasanya hanya salah satu bentuk saja yang nyata. Jadi, glukosa biasanya berbentuk konfigurasi piran, sedangkan fruktosa berbentuk furan.

2. Cara yang dianjurkan a. Menyiapkan cuplikan Analisis gula bebas dalam daun atau jaringan tumbuhan lain biasanya dilakukan dengan ekstraksi jaringan segar dengan etanol 95% (metanol). Ini dilanjutkan dengan memekatkan ekstrak untuk menghilangkan alkohol dan menyaringnya melalui celite, atau memusingkan ekstrak air yang pekat tersebut untuk menghilangkan endapan. Ekstrak air jernih yang diperoleh dapat ditotolkan langsung pada kertas atau pelat. Sebelum menganalisis gula dalam hidrolisat polisakarida atau glikosida tumbiuhan, perlu dihilangkan dulu asam minetal. Dalam hal glikosida tumbuhan, aglikon yang dibebaskan perlu diekstraksi dulu edngan eter atau etil asetat. Setelah dihidrolisis dengan menggunakan H2SO4 1M asam dapat dihilangkan sebagai BaSO4 dengan menambahkan larutan BaCO3. HCL 1M yang jumlahnya sedikit dapat dihilangkan pada tekanan rendah dengan menggunakan pompa arus air, tetapi suhu harus dijaga dibawah 40C. HCL yang agak banyak dapat dihilangkan dari hidrolisat secara baik dengan

mencucinya berulang-ulang memakai larutan di-n-oktilmetilamina 10% dalam kloroform. Damar penukar ionpunn digunakan secara luas untuk menghilangkan asam pada kondisi ini.

b. Kromatografi kertas Ekstrak gula di kromatografi satu arah secara menurun pada kertas whatman no.1 dengan 4 pengembangan yang berlainan disamping larutan campuran baku yang mengandung glukosa, galaktosa, arabinosa, xilosa dan ramnosa. Campuran baku harus dilarutkan dalam isopropanol 10% masing-masing gula berkonsentrasi 0,5% bobot; kirakira 3-5 l larutan ini harus ditotolkan pada kertas. Ekstrak tumbuhan harus ditotolkan dalam beberapa konsentrasi bila kadar gula dalam ekstrak tidak diketahui. Pemisahan gula umumnya dapat dicapai dengan baik secara kromatografi selama 12-24 jam, tetapi hasil terbaik memerlukan waktu 36 jam dan membiarkan pengembangan melewati ujung kertas. Kertas yang telah dikeringkan kemudian dicelupkan kedalam pereaksi anilina hidrogen ftalat, yang dibuat dengan pelarut eter butanol, lalu dikeringkan lagi. Akhirnya kertas dipanaskan pada 105C selama 5 menit agar warna khas timbul. Kertas harus diperiksa secara rutin dengan sinar UV karena bercak gula berfluoresensi, dan ini merupakan cara deteksi yang lebih peka bila konsentrasi gula rendah hanya 2 gula umum yang sukar dibedakan pada kromatogram, yaitu glukosa dan galaktosa. Tetapi, keduanya dapat terpisah dengan baik, bila kertas dikembangkan sekurang-kurangnya 24 jam. Pengembang terbaik ialah BTPA dan fenol. Glukosa dan fruktosa dapat dipisahkan dengan mudah, selain mereka terdapat pula sukrosa (seperti dalam nektar tumbuhan,dll). Bila demikian halnya, diperlukan pengembangan khusus. Kelincahan asam glukuronat dan galakturonat dapat dibedakan dengan mudah karena selama kromatografi terjadi pelaktonan menjadi glukuronolakton, sehingga pada kromatogram akan tampak bercak kedua yang kekuatannya kira-kira sama tetapi R F nya lebih tinggi. Baru-baru ini dalam tumbuhan telah ditemuka alosa, suatu monosakarida isomer glukosa yang terikat sebagai glikosida. Dalam 3 pengembangan, alosa berdekatan dengan glukosa, tetapi terpisah jelas dalam pengembangan fenol. Keserupaan alosa dengan glukosa dalam kebanyakan pengembangan memberi petunjuk betapa pentingnya ko-kromatografi dengan menggunakan pengembang sebanyak mungkin. Dalam hal glikosida feronica, identitas alosa sebagai salah satu gula yang terikat dipastikan dengan spektroskopi RMI-13 C.

c. Memastikan identitas

Pemastian identitas dapat dilakukan pada skala mikro dengan mengukur serapan spektrum senyawa berwarna yang terbentuk sebagai hasil reaksi suatu gula dengan resorsinol H 2SO4 1M atau anilina hidrogen ftalat. Dengan pereaksi pertama, ramnosa menghasilkan 3 puncak di daerah sinar tampak, 412, 488 dan 545 nm, sedangkan glukosa mempunyai puncak pada 489 dan 555 nm dengan suatu infleksi pada 430nm, dan galaktosa mempunyai puncak pada 422 dan 495nm dengan suatu infleksi pada 550 nm.

Gluktosa dan galaktosa dapat juga diidentifikasi secara enzim pada skala mikro dengan menggunakan berturut-turut glukosa oksidase dan galaktosa oksidase. Enzim, bersama-sama dengan sesepora katalase, ditambahkan kedalam larutan gula, atau dapat disemprotkan kepada kromatogram. Dalam waktu singkat, gula dioksidasi secara khas menjadi senyawa yang tidak bereaksi lagi dengan anilina hidrogen ftalat.

d. Analisis kuantitatif Sering perlu ditentukan jumlah berbagai monosakarida yang terdapat pada ekstrak tumbuhan atau dalam hidrolisat glikosat tumbuhan. Salah satu dari cara baku yang banyak tersedia untuk keperluan itu ialah sebagai berikut : totolkan sejumlah volume larutan gula pada garis awal dengan mikropipet, buat triplo titik. Biarkan kertas mengering dan kembangkan dengan salah satu dari keempat pengembang baku gula. Untuk deteksi, kertas dicelupkan kedalam pereaksi anilina hidrogen ftalat, lalu dikeringkan dan dipanaskan selama 5 menit pada 105C. Guntinglah bercak yang berwarna dan masing-masing dielusi dengan 3 ml metanol yang mengandung SnCl2 1%. Ukur serapan pada panjang gelombang maksimum dengan spektrofotometer dan ambillah harga pukul rata dari 3 pembacaan. Disamping itu, serapan harus diukur dengan menggunakan blanko.

e. Pembanding autentik Apiosa dapat diperoleh dari biji peterseli, Peterselinum criscum, sebagai berikut : ekstrak serbuk biji dengan alkohol panas, lalu alkohol diuapkan. Hidrolisis sisa ekstrak akan menghasilkan campuran gula, salah satunya ialah apiosa. Apiosa dapat diperoleh pada skala preparatif dengan mengkromatografi campuran gula tersebut pada kertas whatman no.3 berupa garis.

3. Cara pilihan lain a. Kromatografi lapis tipis Kebanyakan pemisahan yang dicapai dengan KKt dapat dicapai dengan KLT pada selulosa mikrokristal dengan menggunakan pengembang yang sama. Silika gel, penyerap KLT yang populer, sering diubah dengan perlakuan memakai larutan dapar yang sesuai (fosfat atau borat) sebelum digunakan untuk memisahkan gula. Pengembang yang dapat memisahkan gula-umum pada silika gel biasanya ialah campuran n-butanol-asam asetat-eter-air(9 : 6 : 23 : 21). Waktu pengembangan 4 jam. Gula dapat dideteksi dengan menyemprotkan kromatogram memakai anilina hidrogen ftalat. Penyemprot lain ialah naftoresorsinol 0,2% dalam n-butanol yang mengandung asam fosfat 10%. Bila plat dipanaskan 10 menit pada 100oC, ketosa berwarna merah jambu, pentosa hijau, dan heksosa biru.

b. Kromatografi gas cair

KGC gula merupakan cara yang kurang menyenangkan dibandingkan cara KKt, tetapi KGC mempunyai kelebihan, yaitu lebih pekat. Tetapi, gula harus dipisahkan dengan KGC sebagai eter trimetilsilil, dan kita harus menguapkan larutan gula dalam air sampai kering. Pekerjaan selanjutnyapun harus dilakukan dalam keadaan bebas air. Sisa direaksikan dengan heksametildisilazan 0,2 ml dan trimetilklorosilan 0,1 ml dalam piridina kering 0,5 ml. Kelebihan pereaksi dihilangkan pada tekanan yang sangat rendah dan eter gula dilarutkan dalam heptana kering untuk disuntikkan kedalam kromatograf gas. Kromatografi dapat dilakukan pada kolom Chromosorb W tersilani yang dilapisi SE 52,3% pada suhu 108oC dan tekanan lubang masuk 15 psi. Harus diperhatikan bahwa semua gula menghasilkan 2 puncak akibat pembentukan anomer dalam kolom KGC. Pembuatan turunan gula sebelum KGC dapat disederhanakan dengan menggunakan pereaksi niaga, trisil Z yang tersedia dalam ampul 1 ml. Setelah direaksikan dengan cuplikan gula sebagian larutan dapat disuntikkan dengan langsung kedalam kolom KGC.

c. Kromatografi cair kinerja tinggi Sebagian besar KCKT merupakan cara pelengkap dalam KGC untuk memperkirakan gula. Pada saat ini KCKT belum sepeka KGC, tetapi, lepas dari itu, KCKT sangat baik untuk memisahkan campuran gula yang berkerabat dekat. Kekurangan KCKT ialah deteksinya terbatas pada pengukuran indeks bias yang kurang peka dan tidak memungkinkan pengelusian landaian melalui kolom. Tetapi, bila gula dibuat turunannya (misalnya sebagai ester benzoat) sebelum dipisahkan, dapat digunakan UV untuk mendeteksinya, tetapi dengan demikian kelebihannya dari KGC hilang. Berbagai kolom dan pengelusi telah dikembangkan untuk analisis karbohidrat secara KCKT. Cara yang populer untuk gula tanpa harus membuat turunannya ialah pemisahan pada kolom fase terikat dan elusi dengan astonitril-air. Cara KCKT untuk menentukan kadar sukrosa, glukosa, dan fruktosa dalam jaringan tumbuhan telah dikembangkan oleh Mc Bee dan Maness (1983). Jaringan tumbuhan kering diekstraksi dengan air dan dibersihkan dengan prakolom penukar ion pelindung Aminex HPX-85 H. Pemisahan dilakukan pada kolom Aminex HPX-87, dielusi pada air 85oC.

d. Elektroforesis kertas Cara ini penting untuk memisahkan gula. Cara lain seperti yang diuraikan sudah cukup untuk membedakan gula tumbuhan umum. Tetapi cara elektroforesis kertas dapat digunakan sebagai penyaring untuk membedakan gula yang mengandung penyulih asam atau basa

dari monosakarida netral. Caranya dengan melakukan elektroforesis tanpa pereaksi pengompleks (berarti dalam dapar asetat, misalnya pH 5). Dengan demikian, gula netral tidak akan bergerak bila ada garam molibda, borat, atau germanat yang membentuk senyawa kompleks bermuatan. Cara elektroforesis baku untuk gula umum ialah menggunakan dapar natrium borat 0,05 M (pH 9-10) dan tegangan 2530 V/cm selama 90 menit.

e. Gula fosfat Untuk mendeteksi gula fosfat dalam ekstrak tumbuhan diperlukan cara khusus. Mula-mula tumbuhan diekstraksi dengan asam trikloroasetat dan ekstrak kasar difraksinasi pada kolom penukar ion. Lalu, KLT dilakukan pada pelat selulosa dengan pengembang asam isobutiratNH4OH 1M-EDTA 0,1 M (100 : 60 : 1,6) atau etanol-amonium asetat (3 : 7).

4. Percobaan laborattorium a. Contoh deteksi gula/analisis nektar bunga Nektar bunga angiospermae dikenal mempunyai peranan ekologi yang penting dalam menarik serangga, burung, dan hewan lain ke bunga dengan tujuan supaya terjadi penyerbukan. Nektar bunga terdiri atas larutan gula hampir murni, gula utamanya ialah glukosa, fruktosa, dan sukrosa. Sesepora oligosakarida seperti rafinosa, maltosa, dan melibiosa mungkin juga ada. Nektar telah disigi secara luas oleh Percival (1961) ia menemukan bahwa tumbuhan dapat dikelompokkan kedalam 3 golongan berdasarkan kandungan gulanya : sukrosa menonjol (misalnya barbaris); sukrosa, glukosa, dan fruktosa, yang jumlahnya kira-kira sama (misalnya abutilon): dan fruktosa serta glukosa menonjol (misalnya sejumlah Cruciferae). Suatu percobaan praktis untuk mahasiswa meliputi pengumpulan nektar dari berbagai tumbuhan kebun, pemisahan gula secara KKt,dan penentuan jenis nektar berdasarkan perbandingan gula yang ada. Cuplikan madu yang telah diencerkan sebelumnya dapat dikromatografi bersama-sama karena madu, tentu saja, berasal dari nektar bunga sebagai hasil kerja lebah. Karena kerja infertase, konsentrasi sukrosa dalam madu rendah bila dibandingkan dengan glukosa dan fruktosa.

b. Langkah kerja 1. Kumpulkan nektar dari berbagai bunga yang terdapat setempat dengan tabung kapiler. Pada kebanyakan bunga,dengan

menghilangkan daun bunga secara hati-hati kita akan mendapatkan setetes nektar pada sepal. 2. Buatlah 3 pengenceran nektar dengan menambahkan air suling sama banyak, 2 kali jumlah nektar, dan 4 kalinya. 3. Totolkan larutan nektar pada garis awal kertas, jarak antara cuplikan yang satu dengan yang lain 2,5 cm. Totolkan juga larutan pembanding glukosa, fruktosa, dan sukrosa pada setiap ujung. 4. Kembangkan secara menurun dengan pengembangan n-butanolaseton-air (4:5:1) selama 18 jam.

5. Celupkan kertas yang sudah dikeringkan kedalam amilina hidrogen ftalat dalam n-butanol-eter; keringkan lagi dan panaskan dalam tanur pada 100oC selama 10 menit. 6. Catat RF dan konsentrasi gula dalam setiap nektar, dan tentukan termasuk kedalam golongan nektar yang manakah cuplikan bunga tersebut.

c. Telaah lebih lanjut KKt nektar dapat diulangi dan hasilnya dipastikan dengan pengembang lain, misalnya etilasetat-asam asetat-asam format-air (18 : 3 : 1 : 4) atau dengan etil asetat-piridina-air (8 : 2 : 1). KGC memungkinkan pendeteksian gula nektar dengan lebih peka. OLIGOSAKARIDA 1. Kimia dan penyebaran Kebanyakan oligosakarida tumbuhan-umummengandung mulai dari 2 (misalnya sukrosa, maltosa) sampai 5 (misalnya verbaskosa) satuan monosakarida. Walaupun hanya ada 2 satuan, satuan ini dapat digabungkan dengan ikatan eter dengan sejumlah cara yang berlainan (yaitu melalui hidroksil yang berlainan dengan ikatan atau ). Dengan demikian, salah satu masalah utama pada identifikasi oligosakarida ialah membedakan berbagai isomer. Dalam hal disakarida yang mengandung glukosa, ada 8 struktur isomer yang mungkin dan semuanya telah diketahui. Jumlah oligosakarida yang tertimbun sebagai apa adanya dalam tumbuhan nisbi sedikit. Sukrosa (2--glukosilfruktosa) adalah satu-satunya yang terdapat semesta. Yang agak umum adalah , -trehalosa (glukosil--glukosa), rafinosa (6G--trigalaktosilsukrosa), stakhiosa (6G-digalaktosilsukrosa), dan verbaskosa (6G--trigalaktosilsukrosa). Salah satu oligosakarida yang tidak umum ialah umbeliferosa (2 G-galaktosilsukrosa). Sejumlah besar oligosakarida tumbuhan yang dikenal tidak terdapat dalam keadaan bebas, melainkan terikat dengan molekul organik lain sebagai glikosida tumbuhan. Misalnya, oligosakarida berikut

sering terdapat diantara pigmen flavonoid : rutinosa (6-ramnosilglukosa), Neohesperidosa (2--ramnosilglukosa), soforosa (2-glukosilglukosa), sambubiosa (2--xilosilglukosa), dan robinobiosa (2-ramnosilgalaktosa). Glikosida tumbuhan lain yang mengandung berbagai oligosakarida ialah saponin dan alkaloid steroid. Sifat kimia oligosakarida menyerupai monosakarida dan sebagian besar cara memisahkannya sama.

2. Cara yang dianjurkan Memisahkan oligosakarida secara KKt lebih sukar daripada memisahkan monosakarida karena mereka tidak begitu lincah dalam pengembangan gula yang biasa. Untuk mengatasi kesukaran ini biasanya jangka waktu pengembangan diperpanjang (48-96 jam), dan pengembangan dibiarkan menetes dari ujung kertas. Agar kita yakin oligosakarida yang sangat berkerabat dapat terpisah (misalnya rutinosa, dan hesperidosa), mungkin kita harus melakukan elektroforesis serta digabung dengan KKt. Untuk itu, elektroforesis dalam dapar borat (pH 10) pada tegangan rendah (misalnya 15 V/cm) selama 2-4 jam. KCKT juga berguna untuk memisahkan oligosakarida. Jelas kita dapat mengidentifikasi oligosakarida yang sudah dikenal pada skala mikro dengan cara ko-kromatografi dan koelektroforesis menggunakan pembanding autentik. Identifikasi yang demikian dipastikan dengan reaksi warna dan cara lain yang ditunjukkan di bawah.

a. Memastikan identifikasi Ciri oligosakarida dapat ditentukan lebih lanjut dengan melakukan berbagai uji warna memakai pereaksi semprot yang lebih khas pada kromatogram setelah pengembangan. Misalnya trifeniltetrazolium klorida (4% dalam metanol ditambah NaOH 1M yang volumenya sama) dengan oligosakarida yang mempunyai ikatan 1 ke 4 atau 1 ke 6 (misalnya gentiobiosa, tetapi soforosa tidak) menghasilkan warna merah. Demikian juga, pereaksi orsinol HCl 1M bereaksi khas dengan oligosakarida yang mengandung satuan ketosa (misalnya sukrosa), menghasilkan warna merah. Oligosakarida dapat diuji dengan hidrolisis memakai -glukosidase dan maltase, untuk memriksa berturut-turut apakah mereka mempunyai ikatan atau . Cara lain yang dapat digunakan, ialah mengukur laju oksidasi periodat dan putaran optiknya.

3. Percobaan laboratorium a. Contoh memisahkan oligosakarida : rutinosa dan neohesperidosa

Senyawa pahit buah jeruk, yang mudah larut dalam air , berupa glikosida flavon yang terdapat pada kulir jeruk. Tidak semua glikosida flavon berasa pahit ; flavonoid utama jeruk tangerina (Citrus deliosa), yaitu hesperidin, misalnya, tidak beras. Persyaratan untuk kepahitan ialah gabungan flavanon dengan disakarida tertentu yang merupakan isomer rutinosa (6--ramnosilglukosa); ini adalah neohesperidosa (2-ramnosilglukosa). Kepahitan dapat dibalik dengan pengubahan kimia pada bagian flavanon. Dengan membuka cincinnya memakai basa, dan mereduksi iktan rangkap yang terpencil dengan natrium amalgam, terbentuklah glikosida dihidrokhalkon yang sesuai dan sekarang rasanya sangat manis. Kemanisan senyawa yang terbentuk dari naringan sama dengan sakarin dan telah diusulkan sebagai pengganti sakarin dalam makanan dari sari buah.

b. Langkah kerja 1. Larutkan secara terpisah 2-3 mg rutin dan naringan dalam 1 ml NH4OH 0,1M dan tambahkan dua tetes hidrogen peroksida ke dalam masing-masing larutan. Biarkan pada suhu kamar selama 4 jam. Selama oksidasi warna flavonoid dalam larutan basa sangat berkurang karena oksidasi inti flavanoid. 2. Kemudian, kedua larutan ini dapat ditotolkan pada garis awal dua kertas kromatografi, dalam dua atau tiga pengenceran. Kembangkan selama 48 jam (pada setiap kertas gunakan pembanding glukosa) dengan BAA dan BTPA. Setelah dikeringkan dan dicelupkan ke dalam anilina hidrogen ftalat, lalu dikeringkan dan dipanaskan, letak kedua disakarida isomer dapat dilihat dan RF diukur. 3. Harus juga dilakukan elektroforesis pada kertas Whatman no.3 dalam dapar borat (pH 10)nselama 4 jam dengan tegangan 10 V/cm. Cara ini memisahkan kedua gula dengan jelas.

c. Percobaan tambahan 1. Larutan naringin dalam air sangat pahit. Buatlah sederet larutan naringin yang konsentrasi nya makin kecil dan tentukan pada konsetrasi mana rasa pahitnya tidak terdeteksi lagi. 2. Naringin dapat diisolasi dengan sangat mudah dengan mengekstraksi kulit jeruk anggur dengan air panas. Panaskan 1 bagian kulit yang telah diiris dengan 6-8 bagian air pada 90 C selama 15 menit, lalu disaring panas melalui celite. Filtrat dipekatkan sampai volume 1/9 volume asal pada tekanan rendah dan biarkan mengkristal dalam lemari pendingin. Ini menghasilkan

oktahidrat, titik leleh 83C. Pengkristalan ulang dengan isopropanol (100 ml 8,6 g naringin) menghasilkan dihidrat, titik leleh 171C. ALKOHOL GULA dan SIKLITOL 1. Kimia dan penyebaran Gugus aldehid pada heksosa dan pentosa umum dapat direduksi dengan mudah menjadi alkohol, dengan natrium borohidrat atau pereaksi reduksi yang serupa. Tetapi reduksi pada atom karbon anomer, mengubah peluang keisomeran dan dengan demikian suatu alkohol gula dapat terbentuk dari beberapa gula mereduksi yang berlainan. Misalnya, sorbitol, dapat diperoleh dari glukosa, gulosa, dan fruktosa. Alkohol gula demikian, yang dihasilakan di laboratorium dengan cara reduksi memakai natrium borohidrat, tersebar agak luas juga dalam tumbuhan. Tak dapat diragukan lagi, gliserol merupakan alkohol gula yang paling dikenal. Dua senyawa nisbi yang sering dijumpai, yaitu sorbitol dan dulsitol. Fungsi utama alkohol gula adalah pada penyimpanan energi. Fungsi lain yang mungkin, mengendalikan osmosis dan melindungi tumbuhan dari kekeringan dan kebekuan. Segolongan alkohol tumbuhan yang sekerabat dengan alkohol gula alisiklik ialah inositol karboksoklik. Keisomeran optik merupakan ciri struktur senyawa ini misalnya, dikenal empat heksahidroksi inositol, yaitu myo-inositol. Satu siklitol terdapat semesta, yang lebih dikenal sebagai kandungan lipid dalam bentuk terikat berupa asam fitat. Siklitol yang lain ialah pinitol (eter 3-metil D-inositol), dan kuebrakhitol (eter 2-metil L-inositol). Satu turunan inositol yang sekarang menjadi perhatian dalam metabolisme karbohidrat ialah galaktimol (1-0-galaktosil-myo-inositol). Senyawa ini mula-mula diisolasi dari bit gula, tetapi kemudian ditemukan juga dalam sejumlah tumbuhan lain. Ia merupakam perantara untuk alih satuan galaktosa pada sintesis oligosakarida penyimpanan.

2. Cara yang dianjurkan alkohol gula a. Menyiapkan cuplikan Ekstraksi jaringan tumbuhan dengan etanol 80% secara refluks. Lakukan 3 kali, setiap kali digunakan pelarut segar. Uapkan alkohol pada tekanan rendah dan sisanya dilarutkan dalam air, lalu disaring untuk menghilangkan endapan. Bila perlu protein dihilangkan, dan akhirnya ekstrak diawaionkan dengan damar penukaran kation dan anion.

b. Kromatrografi kertas

Pengembang umum yang harus digunakan ialah n-propanol-etil asetatair (7 : 1 : 2). Alkohol dapat dideteksi dengan AgNO 3 basa. AgNO3 dipakai sebagai pereaksi celup. Setelah dikeringkan, kromatogram dicelupkan ke dalam larutan NaOH 0,5% dalam etanol. Bercak coklat tampak pada latar belakang putih setelah 10 menit pada suhu kamar. Pengembangan kedua yang dianjurkan untuk alkohol gula ialah campuran metil etil keton- asam asetat-larutan jenuh asam borat dalam air (9 : 1 : 1). Untuk mendeteksi bercak, pertama-tama kita harus menguraikan dulu senyawa kompleks borat yang terbentuk dari alkohol asam borat dalam pengembang. Ini dapat dilakukan dengan mencelupkan kromatogram kering ke dalam larutan asam hidrofluorida (1-4 volume asam 40%) dalam aseton pada suhu kamar, dan alkohol gula dapat dideteksi dengan disemprotkan memakai AgNO 3 amonia. Mereka tampak sabagai bercak coklat sampai hitam pada latar belakang putih.

c. Elektroforesis kertas Sebaiknya, dideteksi alkohol gula secata KKt dipastikan lagi dengan cara elektroforesis tegangan rendah yang dapat dilakukan dalam larutan timbal asetat basa (5,8%). Setelah elektroforesis, alkohol dideteksi sebagai bercak hijau-kuning pada latar belakang merah jambu setelah disemprot dengan campuran krom trioksida-KmnO 4 H2SO4 1M.

3. Cara yang dianjurkan siklitol a. Menyiapkan cuplikan Bahan yang telah dikeringkan (1g) dilumatkan dalam pelumat dengan 30ml benzena, lalu dipusingkan. Setelah itu sisa dilumatkan dengan air mendidih 50 ml selama 10 menit. Selanjutnya dikocok selama 10 ml dengan 100 mg arang, 100 mg celite, dan masing-masing 10 ml damar penukar anion dan kation, lalu dipusingkan dalam 18.000 putaran/menit. Beningnya dipekatkan pada tekanan rendah sampai 1-2 ml, dan dipindahkan ke dalam labu sempit 5ml serta dikeringkan, sirop dilarutkan dalam 100l air dengan dipanaskan pada penbakar bunsen mikro. Sebanyak 10l digunakan untuk KLT dua arah pada selulosa mikrokristal dengan pengembang aseton-air (17 : 3), dilanjutkan dengan pengembangan n-butanol-piridina-air ( 10 : 3 : 3). Bila terdapat glukosa yang sangat berlebih, ia dapat dioksidasi secara selektif dengan katalase dan glukosa oksidase menjadi asam D-glukonat yang memadat dan dapat dihilangkan dengan pemusingan.

b. Kromatografi kertas Siklitol biasanya dipisahkan dan diidentifikasi dengan cara gabungan KKt dan elektroforesis. Untuk kromatografi, selain kedua pengembang dapat digunakan pengembang n-propanol-etil asetat-air (7: 1: 2) dengan kertas Whatman no. 3 dan pengembangan semalaman. Siklitol dapat dideteksi pada kromatogram memakai pereaksi yang sama seperti pereaksi untuk alkohol gula. Yang paling banyak digunakan mungkin AgNO3 basa. Galaktinol kurang lincah dibandingkan myoinositol dalam semua pengembang.

4. Cara pilihan lain Untuk memisahkan poliol dan siklitol dapat digunakan KLT sebagai pengganti KKt. Sebaliknya siklitol dapat dikromatografi pada selulosa mikrokristal dengan memakai pengembang yang sama seperti pada KKt. Pengembangan yang cocok untuk pelat ini dapat dilakukan dengan menyemprotkan memakai larutan segar timbal tetra asetat 1% dalam etanol. Bila dipanaskan selama 2-3 menit pada 100C, siklitol tampak berupa bercak putih pada latar belakang merah manggis. Poliol dan siklitol dapat dipisahkan secara KGC. KGKC dapat juga digunakan untuk memisahkan poliol dan siklitol. Pada analisis gula bebas dan poliol dalam ekstrak kasar lumut, menemukan bahwa penggunaan dua kolom menguntungkan. Kolom yang terakhir lebih efisien untuk memisahkan poliol. Bila dijumpai campuran poliol rumit, pemisahan harus dicoba sebagai ester 4-nitrobenzoil pada kolom silika 5 m dan dielusi dengan nheksana-kloroform-asetonitril (5 : 2 : 1). Cara lain yang digunakan untuk menyinggi alkohol gula dalam tumbuhan, patut di sebutkan karena keluwesannya cara ini meliputi pengambilan CO2 oleh daun tumbuhan dan pendeteksian pemasukan foto-asimilasi ke dalam himpunan gula secara KKt dua arah, diikuti dengan radio-autografi. Dengan cara ini kita dapat mendeteksi gula dalam ekstrak daun di bawah arus yang dapat dideteksi secara KKt langsung. Hemamelitol hanya terdapat dalam jenis yang termasuk marga Primula.