Laporan Praktikum Genetika SOUTHERN BLOTTING Widya Setyaningtyas*, Haniyya, I. Sobari, K.S. Juarna, N. Restiana, Nuruliawati, A. Nurfitriana, R.

Arita Universitas Indonesia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Departemen Biologi Mei 2012

Abstrak Southern Blotting adalah metode yang digunakan untuk mendeteksi sekuen DNA spesifik pada suatu DNA sampel menggunakan probe atau komplementernya. Prinsip kerja dari Southern Blotting adalah transfer molekul DNA yang telah dipisahkan oleh gel elektroforesis ke membran nilon. Membran nilon adalah tempat hibridisasi antara sekuen DNA spesisfik dengan probe. Hibridisasi adalah pembentukan ikatan dupleks yang stabil antara dua rangkaian nukleotida yang saling komplementer melalui perpasangan basa-basa nitrogennya. Probe adalah DNA untai tunggal yang merupakan komplemen dari DNA target. Teknik hibridisasi terdiri atas 3 jenis yaitu Southern Blotting, Northern Blotting dan Western Blotting. Aplikasi dari Southern Blotting adalah mengetahui ukuran fragmen DNA, mendeteksi alel mutan penyebab penyakit tertentu serta DNA fingerprinting.

Kata kunci: hibridisasi; Southern Blotting; probe

1. Pendahuluan Tujuan pelaksanaan praktikum Southern blotting antara lain untuk memahami prinsip dan tahapan kerja dari Southern Blotting, serta mengetahui aplikasi dari Southern Blotting. Southern Blotting adalah metode pemisahan, elektroforesis, transfer ke membran

Blotting adalah transfer molekul DNA dari gel elektroforesis ke membran nilon atau penyaring nitroselulosa (Tripathi 2010: 1186). DNA diekstraksi dari jaringan (darah, tulang, dan sebagainya), kemudian dilakukan proses digesti dengan lokasi yang spesifik oleh enzim restriksi. DNA kemudian didenaturasi

secara in situ dan dipindahkan ke membran nilon (Brown & Joy Ho 2005: 85).

nitroselulosa dan hibridisasi dengan probe (Hartl & Jones 2005: 61). Prinsip dasar dari metode Southern

*) Kelompok 2A

Teknik hibridisasi terdiri dari tiga jenis, yaitu Southern Blotting, Northern Blotting, dan Western Blotting. Southern Blotting merupakan teknik yang

dan berkomplemen dengan urutan DNA tertentu (Tamarin & Leavitt 1991: 315). Aplikasi dari Southern Blotting yaitu dapat mengetahui ukuran fragmen DNA target, studi forensik seperti DNA fingerprinting dan paternity test (Klug & Cummings 1994: 427). Laboratorium forensik

digunakan untuk mendeteksi DNA. Teknik tersebut dilakukan dengan cara memisahkan molekul DNA menggunakan teknik elektroforesis kemudian molekul DNA tersebut ditransfer ke membran nitroselulosa dan dihibridisasi dengan probe DNA yang telah dilabel dengan unsur radioaktif (Martin 1996: 65). Northern Blotting menggunakan prinsip yang sama dengan Southern Blotting, yang membedakan adalah Northern Blotting digunakan untuk mendeteksi ekspresi RNA. Western blotting berfungsi untuk mendeteksi protein dengan prinsip yang sama dengan Southern Blotting dan Northern Blotting (Tomashefski dkk. 2008: 60). Salah satu contoh protein yang dapat dideteksi dengan menggunakan metode Western Blotting adalah antibodi (Schleif 1986: 291-292). Tahap-tahap kerja dalam Southern Blotting yaitu pertama elektroforesis fragmen DNA dengan gel agarosa. Kedua, denaturasi molekul DNA untai ganda menjadi molekul DNA untai tunggal. Ketiga, transfer molekul DNA ke membran nitroselulosa. Keempat, hibridisasi probe radioaktif pada fragmen DNA. Kelima, membran dibersihkan. Keenam, deteksi band DNA dengan menggunakan autoradiography (Tamarin & Leavitt 1991: 315). Probe adalah DNA untai tunggal yang dapat membentuk pasangan basa dengan urutan komplementer pada polinukleotida untai tunggal lain yang merupakan DNA target. Proses tersebut dikenal dengan sebagai penyatuan kembali (annealing) atau hibridisasi. probe harus Untuk mengidentifikasi urutan sasaran, diberi label unsur radioaktif atau

menggunakan Southern Blotting untuk menganalisis DNA fingerprints dari sampel darah atau semen yang tertinggal di tempat kejadian perkara (Bolsover dkk. 2011: 111). DNA fingerprinting adalah teknik analisis DNA yang digunakan untuk mengetahui identitas seseorang, serta membedakan individu dengan individu lain dalam satu spesies dengan cara mengidentifikasi pola khas dalam komposisi DNA mereka masing-masing (Rosen & Gothard 2010: 146). Aplikasi lain dari Southern Blotting adalah untuk diagnosis leukemia dan limfoma dengan menggunakan probe yang spesifik untuk translokasi atau penyusunan gen kembali (Provan & Gribben 2010: 60).

2. Metodologi

Alat yang digunakan pada praktikum Southern Blotting adalah membran nitroselulosa berukuran 20 x 20 cm atau 20 x 14 cm, kertas Whatman 3 MM, tissue, kertas basah, wadah, dan pemberat. Bahan yang digunakan pada praktikum Southern Blotting untuk campuran larutan A adalah 300 mL 5 M NaCl, 50 mL 10 M NaOH, dan 650 mL air, untuk campuran larutan B adalah 200 mL 10 M amonium asetat, 4 mL 10 M NaOH, dan 1796 mL air (Davis dkk.1994: 184). Cara kerja pada praktikum Southern Blotting yaitu pertama gel agarosa dicelupkan ke dalam larutan A pada suhu kamar selama 30 sampai dengan 45 menit. Larutan

nonradioaktif (Marks dkk. 1996: 239). Probe adalah DNA untai tunggal yang dilabel dengan unsur radioaktif

A dipindahkan dan diganti dengan larutan B. Gel diinkubasi selama 30 sampai dengan 45 menit. Kedua, 500 mL larutan B ditambahkan ke dalam wadah dan kertas basah diletakkan di atas pelat kaca pada wadah. Ketiga, gel diletakkan di atas pelat kaca. Keempat, membran nitroselulosa diletakkan di atas gel. Kelima, dua lembar kertas Whatman 3 MM diletakkan di atas membran nitroselulosa. Keenam, tumpukan tissue diletakkan di atas kertas Whatman 3 MM. Ketujuh, pemberat diletakkan di atas tumpukan kertas tissue dan biarkan selama semalam hingga semua molekul DNA dari gel berpindah setelah ke membran DNA nitroselulosa. berpindah ke

berfungsi untuk melihat fragmen DNA yang telah ditempeli dengan probe radioaktif (Russell 1994: 301). Sampel yang merupakan satu anggota keluarga adalah sampel M, Dad 1, dan Kid 1. Sampel tersebut dapat dikatakan sebagai satu keluarga karena sampel anak (Kid 1) mengandung band-band DNA dari sampel M dan sampel Dad 1.

4. Kesimpulan

Southern Blotting adalah teknik yang digunakan untuk mendeteksi DNA spesifik dengan menggunakan probe. Probe adalah DNA untai tunggal yang

Kedelapan,

molekul

membran nitroselulosa, semua lapisan yang ada di atas membran nitroselulosa dipindahkan dan membran nitroselulosa dihibridisasi dengan larutan yang

merupakan komplemen dari DNA target yang sudah dilabel unsur radioaktif. Prinsip kerja Southern Blotting adalah transfer molekul DNA ke membran nitroselulosa setelah dipisahkan dengan elektroforesis. Aplikasi dari Southern Blotting antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dan analisis DNA forensik yaitu DNA fingerprinting dan paternity test.

mengandung probe radioaktif. Kesembilan, membran nitroselulosa dibersihkan nitroselulosa yang telah dihibridisasi Kesepuluh, dengan kemudian membran

(washing). divisualisasi

autoradiography

(Davis dkk.1994: 184-185).

3. Pembahasan

Daftar Pustaka

Inkubasi gel agarosa pada larutan A bertujuan untuk mendenaturasi untai ganda molekul DNA menjadi untai tunggal sehingga dapat ditempeli dengan probe. Gel diinkubasi pada larutan B bertujuan untuk mengembalikan pH ke pH netral. Kertas basah, kertas Whatman 3MM, dan kertas tissue berfungsi sebagai sumbu kapilaritas tempat molekul DNA berpindah (Davis dkk.1994: 185). Proses washing pada membran nitroselulosa bertujuan untuk menghilangkan probe radioaktif yang tidak berikatan. Autoradiography Bolsover, S. R., E. A. Shephard, H. A. White & J. S. Hyams. 2011. Cell biology: a short course. 3rd ed. John Wiley & Sons, Inc., New Jersey: 432 hlm. Brown, R. D. & P. Joy Ho. 2005. Multiple myeloma: methods and protocols. Humana New Jersey: 306 hlm. Davis, L.G., W.M. Kuehl & J.F. Battey. 1994. Basic Methods in Molecular Biology. Appleton & Lange Paramount Publishing, USA: xii + 777 hlm. Press Inc.,

Hartl, D.L., E.W. Jones. 2005. Genetics: Analysis of Gene and Genomes, 6th ed. Jones and Bartlett Publishers, Inc., USA: xxv + 854 hlm. Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of Genetics. 4th ed. Macmillan Publishing Company, USA: xvi + 779 hlm. Marks, D. B., A. D. Marks & C. M. Smith. 1996. Basic medical biochemistry: a clinical approach. Terj. dari Biokimia kedokteran dasar: sebuah

Tripathi, G. 2010. Cellular and biochemical sciences. I.K. International Publishing House Pvt. Ltd., New Delhi: 1392 hlm.

pendekatan klinis oleh B.U. Pendit. EGC, Jakarta: ix + 770 hlm. Martin, R. 1996. Gel Electrophoresis: Nucleic Acids. BIOS Scientific Publishers Limited, Oxford: xii + 175 hlm. Provan, D. & J. Gribben. 2010. Molecular hematology. Blackwell Publishing Ltd., West Sussex: 428 hlm. Rosen, J. & L. Q. Gothard. 2010. Encyclopedia of physical science. Facts On File, Inc., New York: xv + 748 hlm. Russell, P. J. 1994. Fundamental of Genetics. Harper Collins College Publisher, USA: xvi + 528 hlm. Schleif, R. 1986. Genetics and Molecular Biology. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., USA: xix + 626 hlm. Tamarin, R. & R.W. Leavitt. 1991. Principles of Genetics, 3rd ed. Wm. Brown Publishers, USA: xvi + 607 hlm. Tomashefski, J. F., P. T. Cagle, C. F. Farver & A. E. Fraire. 2008. Dail and hammars pulmonary pathology: neoplastic lung disease. 3rd ed. Springer Science+Business Media, LLC., New York: 869 hlm.