UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE TECMAC DIVISIN DE BIOTECNOLOGA

ELABORO: M. EN D. JESS ALARCN BONILLA Q.B.P. BEATRIZ ORTEGA ESCAMILLA I.B.Q. MNICA ARACELI CAMACHO GONZLEZ

NDICE

PRACTICA No. 1 HIDRLISIS CIDA Y ENZIMTICA DEL ALMIDN PRACTICA No. 2 CINTICA ENZIMTICA PRACTICA No. 3 DETERMINACIN DE Vmax Y Km Y EVALUACION DEL TIPO DE INHIBICIN PRACTICA No. 4 PRODUCCIN DE AMILASAS Y CELULASAS MICROBIANAS PRACTICA No. 5 OBTENCIN DE AMILASAS VEGETALES PRACTICA No. 6 OBTENCIN DE LACTATO DESHIDROGENASA Y SUS COFACTORES A PARTIR DE TEJIDO ANIMAL PRACTICA NO. 7 INMOVILIZACIN DE UNA PROTEASA VEGETAL EN RESINAS DE INTERCAMBIO IONICO Y DE ADSORCIN

2 4 8 13 15

17

20

ENE - ABR 2013

PRCTICA No. 1 HIDRLISIS CIDA Y ENZIMTICA DEL ALMIDN

INTRODUCCIN

OBJETIVO (S) Recordar los conceptos de hidrlisis Identificar la estructura del almidn Reconocer por reacciones de identificacin, los compuestos resultantes de la hidrlisis cida y enzimtica del almidn.

MARCO TERICO. Fundamento de reacciones

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO Solucin del enzima: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) y diluyndolo hasta 10 ml con agua destilada Solucin de almidn al 2% HCl concentrado Lugol Solucin de glucosa al 2% Solucin de maltosa al 2% Reactivo de Benedict o Reactivo de Fehling Vaso de precipitados de 50 ml Vidrios de reloj Parrilla elctrica (o mechero/tripie/malla de asbesto) Bao mara a 37C Agitador de vidrio Pipetas Pasteur Pipetas de vidrio de 1 ml Pipetas de vidrio de 5 ml Pipeta de vidrio de 10 ml Termmetro

50 ml 1 frasco 1 frasco 50 ml 50 ml 1 frasco 1 pza 3 pza 1 pza 1 pza 1 pza 6 pza 6 pza 2 pza 2 pza 1 pza

METODOLOGA Hidrlisis cida 1. Agregar 20 ml de almidn al 2% en un vaso de precipitados. 2. Agregar 1 ml de HCl concentrado. 3. Agitar con una varilla de vidrio y llevar a un bao de Maria hirviendo, el vaso de precipitados debe permanecer en el bao durante cada determinacin.

4. Anotar el tiempo de inicio de la hidrlisis, 5. Cada 5 minutos hacer una reaccin con lugol en una placa de porcelana (vidrio de reloj en fondo blanco). 6. Hacer la reaccin hasta que ya no haya cambio de coloracin (la reaccin da el mismo color del lugol). Anotar el tiempo de la hidrlisis. 7. Tomar 0,5 ml de este hidrolizado y colocarlo en un tubo de ensaye rotulado como (cida) Hidrlisis Enzimtica 1. 2. 3. 4. 5. 6. En un tubo de ensayo 16x100 medir 4 ml de almidn al 2% Colocar dicho tubo en un bao mara a 37C por 5 minutos. Agregar 2 ml de la solucin de la enzima. Agitar la mezcla por golpeteo y anotar el tiempo de inicio de la hidrlisis Cada 5 minutos hacer la reaccin con lugol hasta completar 15 minutos. A los 15 minutos sin sacar el tubo de ensayo del bao mara tomar 0,5 ml del hidrolizado y colocarlo en un tubo de ensaye etiquetado como (15). 7. Continuar haciendo la reaccin con Lugol cada 5 minutos hasta los 30 minutos. 8. Completados los 30 minutos, retirar el tubo del bao mara y tomar 0,5 ml de este hidrolizado y colocarlo en un tubo de ensaye etiquetado como (30). 9. Previamente preparar tubos de ensaye con 0,5 ml de las siguientes soluciones: Sol. Almidn al 2 % ----------------------- 0,5 ml Glucosa al 2% ------------------------------ 0,5 ml Maltosa al 2% ------------------------------- 0,5 ml 10. Para conocer el grado de hidrlisis, realizar la reaccin de Benedict, adicionando a cada tubo, incluidos los hidrolizados cido y enzimtico (15y 30); 2,5 ml del Reactivo de Benedict. En caso de realizar la reaccin de Fehling adicionar a cada tubo respectivamente, 1 ml de la solucin de Fehling A y 1 ml de la solucin de Fehling B. 11. Colocar todos los tubos al mismo tiempo en un bao mara de agua hirviendo por 5 minutos, retirar los tubos y observar.

RESULTADOS Y ANLISIS 1. Registrar en el siguiente cuadro el resultado de la reaccin de hidrlisis Reactivo Almidn al 2% Glucosa al 2% Maltosa al 2% Hidrolizado cido Hidrolizado enzimtico (15) Hidrolizado enzimtico (30) Reaccin de Benedict (+/) Grado de hidrlisis

CUESTIONARIO 1. Describir los tipos de especificidad que presentan las enzimas 2. En base a la utilizacin o no de un cofactor en la forma activa de la enzima, Cmo se clasifican las enzimas? 3. Cuntos tipos de cofactores existen? 4. Cul es la funcin de las coenzimas? 5. Cul es la enzima empleada en la prctica? Escriba su nombre comn, su nombre sistemtico y su nmero de clasificacin internacional (cuatro digitos)

CONCLUSIONES Y REFERENCIAS

PRCTICA No. 2 CINTICA ENZIMTICA

INTRODUCCION. OBJETIVO (S) Evaluar el efecto del pH y la temperatura sobre la transformacin de un sustrato en una reaccin mediada por una enzima. Evaluar el efecto del a concentracin de la enzima y de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de reaccin mediada por una enzima.

MARCO TERICO

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS. 20 ml 20 ml 100 ml 20 ml 12 pza 1 pza 3 pza 2 pza 1 pza 5 pza 2 pza 1pza Solucin del enzima: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) y diluyndolo hasta 20 ml con agua destilada. Disolucin de almidn al 0,5 %. Solucin de Lugol Disoluciones tampn de pH 5.0; 6.8 y 8.0. Tubos de ensayo, placa de porcelana con excavaduras. (vidrio de reloj fondo blanco) vasos de precipitados de 50 ml Bao mara a 40 y 50 C o baos termostatado, Cronmetro. Goteros Pipetas de 2 ml Termmetro

METODOLOGA Estudio de la influencia de la [E]. 1. Tome 4 tubos de ensayo y aada a cada uno 2 ml de disolucin de almidn al 0,5 %. 2. Aada a cada tubo 0.1; 0.2; 0.3 y 0.4 ml de disolucin del enzima respectivamente, y complete hasta un volumen de 0,5 ml con agua. Aada primero el agua y luego la disolucin del enzima, pues de lo contrario la reaccin comenzar a verificarse y usted no tendr en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente despus de adicionar la solucin del enzima al ltimo tubo ponga en marcha el cronmetro y comience a medir el tiempo del experimento.

3.

En cada intervalo de 1 minuto ensaye en la placa con excavadura la reaccin de la solucin experimental con el Lugol: para ello slo tiene que extraer con el gotero pequeas cantidades de cada tubo de ensayo en reaccin a una excavadura de la placa y luego adicionar una gota del reactivo de Lugol. Observe y anote el color para cada tiempo y cada tubo ensayados. En cada toma de muestra con el gotero, enjuague el mismo en agua destilada contenida en un vaso de precipitados. 4. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no dar reaccin alguna con el reactivo de Lugol, la mezcla de las dos gotas debe quedarse del color original del Lugol. Si desea puede adicionar en una excavadura unas gotas de agua y Lugol para tenerlo como solucin de control. 5. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla: TUBO 1 2 3 4 Volumen de la enzima (ml) Tiempo total de reaccin (min) Velocidad de reaccin (1/min) 6. Con estos datos construya un grfico de [E] en el eje ordenado contra velocidad de reaccin (1/t) en el eje de abscisas.

Estudio de la influencia del pH. 1. En 3 tubos de ensayo vierta respectivamente 2 ml de las soluciones tampones de pH 5.0; 6.8 y 8.0. 2. Aada a cada tubo 2 ml de la solucin del almidn al 0,5% y 2 ml de la solucin del enzima. Incube a 40C y ensaye la reaccin con el Lugol segn se indica en el trabajo experimental del estudio de la influencia de la [E]. 3. Con los datos obtenidos extraiga las conclusiones sobre el rango de pH en el cual el enzima muestra su actividad ptima.

Estudio de la influencia de [S]. 1. Tome 4 tubos de ensayo y aada a cada uno 0.5; 1.0; 1.5 y 2.0 ml de solucin de almidn. Complete el volumen de cada tubo hasta 2,0 ml con agua destilada. 2. Adicione a cada tubo 0,5 ml de disolucin del enzima Alfa amilasa e incbelos a 40 C. 3. A intervalos de 1 minuto ensaye la presencia de almidn mediante la reaccin con Lugol de forma similar a como se describe en el trabajo experimental del estudio de la influencia de la [E]. 4. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla: 5. Con los datos de la tabla construya un grfico de velocidad de reaccin (volumen / tiempo) en el eje ordenado contra volumen de sustrato en el eje de abscisas (que representa concentracin de sustrato creciente en nuestro experimento). TUBO Volumen de sustrato (ml) Tiempo total de reaccin (min) Velocidad de reaccin (volumen/min) 1 2 3 4

Estudio de la influencia de la temperatura. 1. En 5 tubos de ensayo aada 5 ml de disolucin de almidn al 0,5% y 1 ml de solucin de enzima. 2. Ponga a hervir uno de los tubos durante 5 min y reponga el volumen de agua perdida por evaporacin. Incbelo a 40 C y ensaye de la forma estudiada la presencia de almidn en l a diferentes intervalos de tiempo. 3. Incube un segundo tubo a 40 C y un tercero a 50 C, y ensaye en ellos la reaccin con Lugol a intervalos de 1 minuto. Anote el tiempo que se demora en desaparecer la coloracin azul. 4. Un cuarto tubo incbelo en un bao de hielo y ensaye tambin la reaccin con Lugol. 5. El ltimo tubo djelo a temperatura ambiente del laboratorio y ensaye con el Lugol hasta la desaparicin de la reaccin positiva en intervalos de 1 minuto. 6. Con los datos obtenidos en el ensayo complete la siguiente tabla, y extraiga sus conclusiones: Color observado a diferentes tiempos (min) TUBOS 1 2 3 4 5 5 10 15 20 25 30

RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS 1. Describa qu caractersticas estructurales del almidn permiten su identificacin mediante las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidn. 2. Anexe la tabla y el grfico de velocidad de reaccin contra [E], tomando como concentracin del enzima el volumen de la solucin utilizado en cada tubo. Por qu se puede tomar como velocidad de reaccin el inverso del tiempo? 3. Plantee las conclusiones a que puede arribar de los resultados de ste experimento. 4. Describa lo observado al realizar el estudio de la influencia del pH en la velocidad de reaccin del enzima alfa-Amilasa. A qu conclusin llega acerca del pH ptimo de este enzima? 5. Qu efecto tendra la utilizacin del medio con pH muy cido o muy bsico en la realizacin de este ensayo? 6. Anexe la tabla y el grfico elaborados segn las indicaciones del trabajo prctico, tomando como valor de [S] el del volumen del mismo medido en cada tubo. Por qu en este caso para calcular la velocidad de la reaccin es necesario dividir el volumen de sustrato entre el tiempo? 7. Analice el grfico y plantee las conclusiones a que puede llegaren este caso. 8. Anexe la tabla resumen de los resultados del experimento del efecto de la temperatura segn las indicaciones del trabajo prctico. 9. Explique qu le sucede al enzima del tubo que se hierve antes de incubarlo a 40 C 10. Plantee las conclusiones a que pudo arribar en este ensayo. Por qu no se debe emplear el trmino de temperatura ptima?

CUESTIONARIO:

1. 2. 3. 4.

Cules son las caractersticas estructurales del almidn? Qu tipo de enzima es la alfa-Amilasa salival? Cules son los productos que origina la accin de este enzima sobre el almidn? Explique cmo influyen en la velocidad de las reacciones enzimticas una variacin en la concentracin del enzima presente, en la concentracin del sustrato, el pH y la temperatura.

CONCLUSIONES

REFERENCIAS

PRCTICA No. 3 DETERMINACION DE Vmax Y Km Y EVALUACION DEL TIPO DE INHIBICION 7

INTRODUCCIN.

OBJETIVO:

El alumno realizar los clculos necesarios para la determinacin del tipo de inhibicin, Vmax y Km de diferentes series de datos, en base a la cintica enzimtica obtenida.

MARCO TERICO. Ecuacin qumica de la reaccin catalizada de cada ejemplo. Tipo de enzima que cataliza la reaccin y va biosinttica que incluye a cada reaccin.

MATERIALES Y EQUIPO. Computadora (Excel) Listas de datos de velocidades y concentraciones de sustratos.

METODOLOGA 1. Entrar al programa Excel en la PC 2. Introducir los datos y las frmulas necesarias para llevar a cabo los clculos correspondientes. 3. Obtener las grficas necesarias. 4. Interpretar los datos obtenidos y determinar lo que se pide.

DATOS Ejercicio 1: Utilizando los siguientes datos y haciendo uso del modelo de Lineweaver-Burk y el modelo de Eadie-Hofstee, determina el valor de Vmx y la Km por cada mtodo y compara los resultados. TIEMPO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 VELOCIDAD (moles/min) 18,8 23,6 29,8 30,5 35,5 40,5 45,5 50,5 55,5 60,5 [SUSTRATO] (mM) 3 11 18 19 21 35 41 45 68 78

Ejercicio 2: La sintetasa de citrato mitocondrial del cerebro de rata es inhibida por el fenil-piruvato. La actividad de la enzima se midi a tres concentraciones diferentes de acetil-CoA en presencia de cinco concetraciones diferentes de fenil-piruvato. Las velocidades iniciales de la reaccin se

expresan en nmoles de acetil-CoA incorporados/minmg de protena mitocondrial y aparecen expuestos en la siguiente tabla: Acetil-CoA 6,2 M Fenil piruvato (mM) 0,00 0,77 1,54 3,10 6,20 9,3 M VELOCIDAD (nmoles/minmg) 276,30 250,00 233,33 200,00 157,30 12,4 M

247,04 210,00 181,03 142,37 101,20 Determine:

300,00 289,66 280,00 270,97 247,06

a) Parmetros cinticos sin inhibidor b) Tipo de inhibicin c) El valor de Ki

Ejercicio 3: Cuando se produce un infarto al miocardio, un enzima es secretado al torrente sanguneo. En el caso de una distrofia muscular una isoenzima que cataliza la misma reaccin, es secretada al torrente sanguneo y se puede diferenciar fcilmente por tener un distinto valor de Km, (Km de la isoenzima de msculo esqueltico = 2X10 5 M). Un ensayo en una muestra de sangre de un paciente que leg al hospital inconsciente dio los resultados que se indican a continuacin: VELOCIDAD INICIAL SUSTRATO (M) 5,00 x 105 7,00 x 105 1,00 x 104 1,50 x 104 2,00 x 104 3,00 x 104 ENZIMA DEL MIOCARDIO (moles/mgmin) 2,86 3,78 5,00 6,67 8,00 10,00 Determine: a) Km de la enzima el miocardio b) Km de la enzima del paciente c) Se trata de un infarto al miocardio o de una distrofia muscular? ENZIMA DEL PACIENTE (moles/ml sueromin) 43 57 75 100 120 150

Ejercicio 4: Los eritrocitos embrionarios contienen una enzima que cataliza la reaccin S P Los eritrocitos adultos tambin poseen la actividad de dicha enzima para catalizar la reaccin S P. Algunos datos cinticos se muestran en la tabla siguiente:

[S] (M) 1,68 x 105 2,50 x 105 3,33 x 105 5,00 x 105 7,00 x 105 1,00 x 104 1,50 x 104 1,67 x 104 2,00 x 104

VELOCIDAD INICIAL (moles/mgmin) Eritrocito adulto Eritrocito embrionario 1,05 5,00 1,54 6,66 1,98 8,00 2,86 10,00 3,78 11,67 5,00 13,33 6,67 15,00 7,15 15,40 8,00 16,00

Determine: a) Parmetros cinticos de la enzima en el eritrocito adulto b) Parmetros cinticos de la enzima en el eritrocito embrionario c) Qu conclusiones puede obtener referente a la identidad de los dos enzimas?

Ejercicio 5: Se obtuvieron los datos experimentales de la velocidad de una reaccin enzimtica en ausencia y en presencia de varios inhibidores (A, B, C y D), cuyos resultados se muestran en la siguiente tabla: [SUSTRATO] (mM) 0,20 0,25 0,33 0,50 1,00 2,00 2,50 3,33 4,00 5,00 CONTROL 16,67 20,00 24,98 33,33 50,00 66,67 71,40 76,92 80,00 83,33 +A (5 m) 6,25 7,69 10,00 14,29 25,00 40,00 45,45 52,63 57,14 62,50 +B (20 m) 5,56 6,67 8,33 11,11 16,67 22,22 23,81 25,64 26,67 27,77 +C (2 mM) 10,00 11,11 12,50 14,29 16,67 18,18 18,52 18,87 19,00 19,23 +D (0,1 mM) 8,89 10,81 13,78 19,05 30,77 44,44 48,78 54,00 57,14 60,60

Determine: a) La naturaleza de cada inhibidor (tipo de inhibicin) b) El valor de Ki para cada inhibidor

Ejercicio 6: La mono-amino-oxidasa mitocondrial de hgado de rata es inhibida por uno de los productos de la reaccin, el NH3. Para determinar el efecto del NH3 sobre la reaccin se realizaron dos series de experiencias: a) En una primera serie de experimentos se fij la concentracin de O 2 (0,23 mM) y se trabaj variando la concentracin de benzilamina en presencia de

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concentraciones fijas del inhibidor. Los resultados aparecen expuestos en la siguiente tabla, donde las velocidades iniciales de la reaccin se expresan en unidades arbitrarias: VELOCIDAD INICIAL BENZILAMINA (mM) 0,0 0,2 0,3 0,5 1,0 2,0 0,813 0,957 1,093 1,220 1,342 50,0 0,627 0,743 0,858 0,966 1,081 NH3 (mM) 100,0 0,531 0,637 0,741 0,844 0,926 150,0 0,444 0,528 0,627 0,725 0,787 200,0 0,387 0,462 0,543 0,627 0,687

b) En una segunda serie de experiencias, se mantuvo constante la concentracin de benzilamina (1,0 mM) y se vari la concentracin de O2 en presencia de concentraciones fijas del inhibidor. Los resultados aparecen expuestos en la siguiente tabla, en la que las velocidades iniciales de la reaccin siguen expresndose en unidades arbitrarias:

VELOCIDAD INICIAL OXGENO (mM) 0,0 0,100 0,136 0,175 0,250 0,300 1,124 1,342 1,538 1,754 1,876 Determine: a) El valor de los parmetros cinticos en ambos casos, incluida la Ki del NH3. b) Tipo de inhibicin ejercida por el NH3 sobre ambos sustratos 50,0 0,962 1,130 1,274 1,480 1,587 NH3 (mM) 75,0 0,858 1,000 1,149 1,282 1,351 100,0 0,794 0,909 1,026 1,149 1,212 150,0 0,676 0,778 0,866 0,952 1,015

RESULTADOS Y DISCUSIN

CUESTIONARIO 1. Indique la importancia del estudio de la cintica enzimtica. 2. Cules son los parmetros cinticos que caracterizan el estudio de la cintica de una enzima? 3. Qu tipo de tratamiento matemtico debe drsele a los datos obtenidos de una cintica enzimtica para obtener los parmetros cinticos?

4. Explique cmo durante el estudio de una cintica enzimtica, los parmetros cinticos se ven alterados en presencia de: a. Inhibidor competitivo b. Inhibidor NO competitivo c. Inhibidor Acompetitivo

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5. Cul es el significado del nmero de recambio (turnover number)? Cmo se mide la eficiencia cataltica? 6. Mencione 5 sustancias (frmacos) que acten como: inhibidores competitivos, no competitivos y acompetitivos.

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA

PRCTICA No. 4 PRODUCCIN DE AMILASAS Y CELULASAS POR MICROORGANISMOS DEL SUELO

INTRODUCCIN.

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OBJETIVO (S) Analizar la actividad de enzimas producidas por los microorganismos del suelo

MARCO TERICO

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS. 1 pza 1 pza 1 pza 1 frasco 1 pza 1 pza 1 pza 10 gr 1 1 1 frasco 1 pza Placa con agar celolosa rojo congo Placa con agar almidn Hisopo estril o asa bacteriolgica Solucin de benzal 100 ml esponja Mechero o 2 lmparas de alcohol Frasco con 90 mL de solucin salina estril Muestra de de suelo. balanza Incubadora a 28 C Solucin de lugol Pipeta pasteur

METODOLOGA. A. Preparacin de la suspensin: 1. Pesar 10 g de muestra y realizar una dilucin en 90 mL de solucin salina estril 2. Homogenizar la suspensin y dejar sedimentar B. Aislamiento de microorganismos amilolticos 1. Tomar la suspensin con un hispo estril y sembrar por estra masiva en la placa con agar almidn 2. Incubar la placa a 28 C durante 48 a 72 hr. 3. Inundar con lugol las cajas y contar el nmero de colonias que presenten una zona clara de hidrlisis a su alrededor . C. Aislamiento de microorganismos celulolticos 1. Tomar la suspensin con un hispo estril y sembrar por estra masiva en la placa con agar celulosa rojo congo. 2. Incubar la placa a 28 C durante 48 a 72 hr. 3. Contar el nmero de colonias que presenten una zona de hidrlisis a su alrededor. RESULTADOS Y ANLISIS Reporte en la siguiente tabla la presencia (+) o ausencia(-) de los grupos de microorganismos que se detallan. EQUIPO 1 2 3 4 5 6 AMILOLTICOS CELULOLTICOS

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7 8 Registrar la morfologa colonial de los microorganismos observados. Comparar el nmero de organismos amilolticos y celulolticos obtenidos por cada equipo, discuta sus resultados.

CUESTIONARIO 1. Escriba las reacciones enzimticas realizadas por cada uno de los grupos microbianos aislados, indicando sustratos, enzimas y productos. 2. A que grupo de enzimas pertenecen las estudiadas en esta prctica? 3. Investigue la clasificacin de las enzimas de acuerdo con la E.C. 4. Mencione tres microorganismos productores de amilasa y 3 productores de celulasas 5. Explique las aplicaciones industriales o ambientales de las amilasas y las celulasas 6. Indique los sitios de corte de las alfa amilasas, beta amilasas, amiloglucosidasas y pululanasas 7. Explique la forma de identificar las colonias productoras de amilasas por tincin con lugol,.

CONCLUSIONES

REFERENCIAS.

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PRCTICA No. 5 OBTENCIN DE AMILASAS DE SEMILLAS DE GRAMNEAS

INTRODUCCION

OBJETIVO (S) Aplicar los diferentes mtodos de extraccin para la obtencin de una enzima a partir de una fuente vegetal.

MARCO TERICO

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO 10 gr 1 pza 2 pza 1 pza 1 frasco 1 frasco 1 frasco 1 frasco 1 pza 5 pza 1 pza 1 pza 2 pza 5 pza 1 pza 1 pza 1 pza Semillas de gramneas en germinacin Mortero con pistilo Vaso de precipitados. Termostato. Solucin de Lugol Solucin de reactivo de Fehling o Tollens o Benedict Glicerina pura Solucin de almidn al 5% Mechero. Goteros Embudo / Papel filtro Termmetro Pipetas de 2 y 5 ml Tubos de ensaye Placa de porcelana con excavaduras Bao mara a 45 C Gradilla

METODOLOGA 1. Prepare 30 ml de un macerado acuoso con 10 g de semillas de gramneas germinadas teniendo en cuenta que el agua debe estar caliente (50 C). Aada 5 gotas de glicerina para extraer lo ms posible los enzimas. 2. Deje reposar de 15 - 20 minutos de 30 - 45 C y filtre el extracto.

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3. En un tubo de ensayo, introduzca 5 ml de disolucin de almidn y de 1 - 2 ml del extracto. A intervalos de 5 minutos, comprobar la degradacin del almidn por las amilasas ensayando una muestra del sistema de reaccin en una placa con excavaduras con el reactivo de Lugol. Para reconocer la presencia de azcares reductores (maltosa y glucosa), realizar la reaccin con los reactivos de Fehling, Tollens o Benedict de una muestra de 1 - 2 ml del sistema de reaccin.

RESULTADOS Y ANLISIS 1. Represente a travs de una ecuacin la accin hidroltica de las amilasas del almidn (amilosa). Nota : Utilice las estructuras qumicas. 1. Clasifique las amilasas de acuerdo con el Sistema Internacional. 2. Qu objetivo persigue realizar la reaccin con el reactivo de Lugol cada cierto intervalo de tiempo? 3. Qu objetivo persigue realizar al final del experimento la reaccin con el reactivo de Fehling? Represente la ecuacin.

CONCLUSIONES

REFERENCIAS

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PRCTICA No. 6 OBTENCIN DE LACTATO DESHIDROGENASA Y SUS COFACTORES A PARTIR DE TEJIDOS ANIMALES

INTRODUCCIN

OBJETIVO (S) Obtener una enzima oxidorreductasa a partir de fuentes animales y observar su actividad.

MARCO TERICO

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS 1 1 frasco 1 frasco 1 frasco 1 frasco 1 frasco 1 frasco 1 frasco 5g 5 pza 2 pza 1 pza 3 pza 2 pza 1 pza 1 pza 1 pza 1 pza 1 pza 1 pza 1 pza Rata de laboratorio o conejo pequeo Solucin de Cloruro de sodio al 0.9 % Solucin de Cianuro de potasio al 0.5% y al 0.01% Solucin de Lactato de sodio al 1% Solucin deAzul de metileno 0.002M Solucin de Fosfato dibsico de sodio 0.06M Cloroformo Nujol Arena lavada Tubos de ensaye de 18 x 150 mm Pipetas de 2, 5 y 10 ml Bureta de 25 ml Vasos de precipitados Mortero con pistilo Matraz erlenmeyer de 125 ml Bao mara a 37 C termostatado Centrfuga Cronometro Termmetro Gradilla Tijeras

METODOLOGIA Preparacin del sistema Deshidrogenasa LcticaNAD + a) Preparacin de la coenzima NAD+

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1. Matar una rata con ter, abrirla y obtener 4g de fragmentos de msculo de las patas traseras. 2. Cortar el msculo en fragmentos ms pequeos y ponerlos en agua a ebullicin por 5 min en un matraz Erlenmeyer de 125 ml (en proporcin de 6 ml de agua por gramo de msculo) 3. Pasar la preparacin a un mortero con un poco de arena ( 1 g) y triturar bien el msculo. 4. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como Coenzima NAD+, el precipitado se desecha en el bote de la basura. b) Preparacin de la enzima LDH 1. Colocar 4 g de msculo de las patas traseras en un mortero previamente sumergido en hielo y adicionar cloruro de sodio al 0.9% (en proporcin de 8 ml/g de msculo), agregar un poco de arena ( 1 g) y triturar perfectamente. 2. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 30 min. 3. Centrifugar a 3000 rpm por 15 min. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como Deshidrogenasa Lctica, LDH. El precipitado se desecha. c) Determinacin de actividad enzimtica. 1. Mientras se obtienen los sistemas enzimticos, preparar las 3 series siguientes en tubos de ensaye etiquetados como se indica a continuacin. NOTA: Trabajar las soluciones de CIANURO DE POTASIO con MUCHA PRECAUCION, ya que es una sustancia altamente peligrosa, no se debe de utilizar pipeta, manipular dicha sustancia con bureta y lavarse PERFECTAMENTE las manos. Tubo No. KCN al 0.5 % (ml) Lactato al 1% (ml) Azul de metileno 0.002M (ml) Agua (ml) Sobrenadante Coenzima (ml) Sobrenadante LDH (ml) Lectura inicial Lectura 15 min. Lectura 30 min. Lectura 60 min. 1 1.0 1.0 0.3 0.0 1.0 1.0 2 1.0 1.0 0.3 1.0 0.0 1.0 3 1.0 0.0 0.3 1.0 1.0 1.0 4 1.0 1.0 0.3 1.0 1.0 0.0

2. Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar a todos 1.0 ml de Nujol. Incubar en bao mara a 37C y hacer observaciones a los tiempos indicados anotando en el cuadro los grados de decoloracin con signos + y con 0 la falta de la misma. NOTA: despus de haber agregado el Nujol, NO agitar el contenido del tubo.

RESULTADOS Y ANLISIS 1. Escriba los resultados de decoloracin en la tabla anterior. 2. Interprete el objetivo de cada tubo y el global del esquema 3. Diga cuales son las funciones de cada ingrediente adicionado. 4. Mencione otros tipos de oxidorreductasas importantes. 5. Qu aplicacin industrial podra drsele a las oxidorreductasas? 6. Por qu se debe de manejar con PRECAUCION el cianuro de potasio? 7. Por qu es importante las condiciones de reaccin del experimento?

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CONCLUSIONES

REFERENCIAS

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PRCTICA No. 7 INMOVILIZACIN DE UNA PROTEASA EN RESINAS DE INTERCAMBIO INICO Y DE ADSORCIN

INTRODUCCIN

OBJETIVO Evaluar la efectividad del intercambio inico como mtodo de inmovilizacin de enzimas.

MARCO TERICO

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO Resina catinica Amberlite Papana (ablandador de carne) o Mexicana (extracto) Columna de empaquetamiento o Bureta Fibra de vidrio (pelo de ngel) Solucin cido clorhdrico 0.1 N Solucin reguladora de acetatos Agua destilada Solucin de ovo albmina al 2% (a partir de huevo) Tubos de ensaye 15 x 150 mm Gradilla Espectrofotmetro Bao mara. Pipetas de 1 y 5 ml. Varilla de vidrio

1 frasco 1 pza 1 frasco 1 frasco 1 frasco 10 pza 1 pza 1 pza 1 pza 1 pza 1 pza

METODOLOGA a) Preparacin de la columna de intercambio inico 1. 2. 3. 4. 5. Lavar con agua destilada la resina de intercambio catinico Colocar en el fondo de la columna una malla de fibra de vidrio Empaquetar la resina utilizando como acarreador agua destilada Adicionar lentamente (10 min aproximadamente), la solucin regenerante de HCl 0.1N Enjuagar el exceso de cido con agua destilada hasta obtener un pH de 4 5

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b) Preparacin de la proteasa 1. Hacer una solucin al 0.01% de mexicana o papaina (ablandador de carne) en solucin reguladora de acetatos. 2. Vaciar la solucin de la enzima lentamente (aproximadamente 10 min) 3. Enjuagar con solucin reguladora de acetatos. c) Hidrlisis de la albmina. 1. Adicionar la solucin de ovo albmina al 2% lentamente (aproximadamente 10 min.) 2. Ir colectando los eludos en tubos de ensaye 3. Leer la absorbancia de los eludos en el espectrofotmetro a 280 nm.

RESULTADOS Y ANLISIS 1. Graficar tubo eludo contra Absorbancia a 280 nm

CUESTIONARIO 2. Graficar tubo eludo contra Absorbancia a 280 nm 3. Por qu se lee a dicha longitud de onda? 4. Qu tipo de aminocidos absorben a esa longitud de onda? 5. Explique cual es la funcin de la solucin de cido clorhdrico 0.1N 6. Explique por que es importante verter siempre con lentitud 7. Explique el mecanismo de reaccin llevado a cabo por la enzima

REFERENCIAS

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