UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACIA

CARACTERIZACIN, EXTRACCIN Y ESTABILIDAD DE LOS COLORANTES NATURALES PRESENTES EN EL CLIZ DE Hibiscus sabdariffa L. (rosa de jamaica) COMO ALTERNATIVA DE CONSUMO DEL COLORANTE ARTIFICIAL ROJO No. 40

Irma Luca Arriaga Trtola Qumica Farmacutica

Guatemala, octubre 2007.

INDICE

1.

Resumen.. 1

2. Introduccin 4 3. Antecedentes... 5 4. Justificacin.... 15 5. Objetivos. 16 6. Hiptesis.. 17 7. Materiales y Mtodos. 18 8. Resultados... 24 9. Discusin de Resultados............ 33 10. Conclusiones... 37 11. Recomendaciones.... 39 12. Referencias... 40 13. Anexos.. 43

1. RESUMEN El color es un elemento muy importante, ya que ayuda a identificar un producto y juzgar su calidad, siendo su funcin el proveer caractersticas estticas o de presentacin. Actualmente en la industria alimenticia, cosmtica y farmacutica se utilizan ampliamente los colorantes de tipo artificial, sin embargo, investigaciones recientes han informado sobre los efectos txicos que estos pueden provocar; es por esto que la tendencia hacia utilizar productos de tipo natural ha ido avanzando da a da. La rosa de jamaica (Hibiscus sabdariffa) es una planta cultivada en Guatemala, en los departamentos de Baja Verapaz, Santa Rosa, Huehuetenango, entre otros. Sus clices son reconocidos por otorgar un vistoso color rojo a la infusin, debido a la presencia de derivados antocinicos, como la hibiscina y la gosipetina. Estos colorantes al ser de tipo natural, presentan riesgos nocivos mnimos o casi nulos, adems, por su origen no requieren certificaciones internacionales y importancia. La presente investigacin pretenda realizar dos acciones fundamentales: a) identificar por medio de cromatografa en capa fina los pigmentos antocinicos caractersticos de la rosa de jamaica; b) realizar un estudio de estabilidad acelerada comparando el comportamiento de la rosa de jamaica contra el colorante artificial Rojo No.40, sometidos a ciertas condiciones de temperatura (30C y 50C) y pH (4, 5 y 6), con la finalidad de analizar si los colorantes naturales en estudio eran capaces de sustituir al colorante artificial en productos farmacuticos, cosmticos o alimenticios. Utilizando la tcnica ultravioleta-visible se midi la concentracin diaria de cada una de las muestras. De los datos obtenidos se dedujo que la muestra de rosa de jamaica expuesta a 50C y pH 6 disminuy su concentracin inicial hasta un 78% al da 17 de observacin, las dems muestras mantuvieron su concentracin por arriba del 80%. Las pruebas estadsticas determinaron que existe diferencia significativa en la concentracin de rosa de jamaica versus Rojo No.40; siendo la rosa de jamaica la que tiende a tener menor concentracin y mayor variabilidad. As mismo se concluy que existe diferencia significativa entre las por lo tanto su uso puede considerarse de gran

temperaturas, siendo la temperatura de 30C en donde se obtiene mayor concentracin que a 50C. Con respecto a las variables de pH, se determin que el pH 6 es en donde la concentracin es significativamente menor comparado con los otros dos. Tambin se analizaron las combinaciones de los factores muestra-temperatura, muestra-pH, y muestratemperatura-pH, de lo cual se concluy que las combinaciones presentan diferencias significativas o interacciones, con excepcin de la combinacin temperatura-pH que no presenta interaccin. Por ltimo, el modelo estadstico indic que las condiciones ptimas de estabilidad para el colorante artificial Rojo No. 40 son a 30C a cualquier pH y para la rosa de jamaica es a 30C y pH 5. Entonces, se puede decir que los colorantes presentes en la rosa de jamaica presentan una estabilidad similar a la que tiene el colorante artificial Rojo No. 40, por lo que puede ser utilizada como alternativa de consumo tanto en la industria farmacutica, cosmtica y/o alimenticia, siendo estos seguros. Al mismo tiempo, se espera fortalecer la agricultura, ya que ste podra llegar a ser un recurso econmico de gran valor para nuestro pas y que en algn momento se extendera a niveles internacionales.

2. INTRODUCCIN Conocidos son los efectos carcinognicos y embriotxicos causados por los colorantes artificiales, sin embargo su uso sigue siendo sin duda de gran importancia en ciertos productos, ya que gracias al color se perciben sensaciones agradables a la vista, adems de ser un factor esttico. En los ltimos tiempos, las industrias cosmtica, alimenticia y farmacutica, se han preocupado por brindar al consumidor productos de alta calidad que sean seguros, es decir que posean los menores efectos secundarios y que a la vez proporcionen vitaminas, minerales y todos aquellos elementos capaces de mejorar la salud de la poblacin. Los colorantes naturales se han utilizado desde tiempos antiguos, pero es hoy en da cuando nuevamente han retomado un papel de gran importancia en dichas industrias, sto debido a la gran exigencia de la poblacin por consumir productos seguros, eficaces y de calidad. Guatemala es un pas rico en variedad de flora capaz de brindar los elementos necesarios que sustituyan a los colorantes sintticos, tal es el ejemplo de los clices de la rosa de jamaica (Hibiscus sabdariffa L. ), que contienen los pigmentos conocidos como antocianinas, responsables de proporcionar el color rojo intenso que la caracteriza, pero adems del color, cabe mencionar las propiedades tan importantes que poseen, ya que pueden se utilizados como antioxidantes, adems de prevenir y combatir enfermedades del corazn y varias formas de cncer. En la presente investigacin se realiz la caracterizacin de los pigmentos antocinicos presentes en los clices de la rosa de jamaica, para su posterior extraccin utilizando una maceracin en fro, por ltimo se analiz la estabilidad de dichos extractos a temperaturas de 30C y 50C y a pH 4, 5 y 6, utilizando para sto la tcnica espectrofotomtrica ultravioleta-visible y comparando con un estndar de referencia del colorante artificial Rojo No.40.

3. ANTECEDENTES 3.1. GENERALIDADES El color es un elemento muy importante para los humanos ya que ayuda a identificar un producto y juzgar su calidad; por estas razones no es sorprendente que por cientos de aos el color haya jugado un papel predominante en tres reas de inters comercial: alimentos, medicamentos y cosmticos (1). Histricamente las primeras pinturas encontradas fueron en Egipto en el ao 1500 a.C. En las escrituras de Plinio se menciona que el vino era coloreado artificialmente, y que haca 500 aos antes se conoca la capacidad de las especias y condimentos de colorear (1). Hasta la mitad del siglo XIX, los colorantes usados en alimentos, medicamentos y cosmticos fueron fcilmente obtenibles de materias naturales, tales como animales, vegetales y minerales (1). Sin embargo la importancia de los colorantes naturales disminuy cuando en 1856 el ingls William Henry Perkin, en su intento de sintetizar quinina, oxid sulfato de anilina con dicromato potsico y produjo el primer colorante sinttico: la mauvena, de color prpura. Posteriormente, los qumicos alemanes perfeccionaron los colorantes derivados del alquitrn de hulla y fue as como los colorantes naturales perdieron su popularidad (2). En 1987 se estim que la produccin mundial de colorantes era alrededor de 700,000 toneladas; de esta produccin, un poco ms del 50% fue destinada a la industria textil y un 2.2 % al sector de alimentos, medicamentos y cosmticos (2).

3.2.

COLORANTES SINTTICOS Y SU RELACIN CON LA INDUSTRIA ALIMENTICIA, COSMTICA Y FARMACUTICA Es indudable que en un producto destinado al consumo, sea cual fuere su naturaleza,

los caracteres organolpticos tienen una importancia capital para su aceptacin; uno de estos es el color. No basta con que un producto posea sabor y olor agradable, debe ser apetitoso por su aspecto para conseguir la plena aceptacin del consumidor (2). Gran nmero de productos alimenticios estn desprovistos originalmente de color, como sucede con muchos productos elaborados, y otros los pierden con el tiempo, como es el caso de las conservas (2). El uso de los colorantes alimenticios obedece a tres motivos fundamentales:

Tipo tcnico; subsanar prdidas o deficiencias del color natural. Tipo esttico o de presentacin; de carcter comercial, y Tipo psicolgico; en donde los caracteres organolpticos pueden producir en el pblico motivos de consumo (2).

3.2.2. Peligros de la tincin

Los abusos a que podra conducir la libre coloracin de las sustancias destinadas al consumo han sido prevenidos por las autoridades sanitarias de los distintos pases, y el uso de las materias colorantes sintticas se ha venido regulando mediante disposiciones basadas en ensayos biolgicos de toxicidad (2).

3.2.2. Regulacin de los colorantes artificiales

Con el transcurso de los aos se logr aumentar la eficiencia y garantizar la seguridad de los colorantes. Hoy en da, este tipo de aditivos que se incorporan a los alimentos estn regulados mucho ms estrictamente. La base de la legislacin moderna es la Ley Federal de Alimentos, Drogas y Cosmticos (FD&C) de 1938 que otorga a la Administracin de Alimentos y Frmacos (FDA) la autoridad legal sobre

los alimentos, sus ingredientes y define los requisitos que se deben cumplir en las etiquetas (3). Las reacciones adversas que pueden ocasionar estn desde una simple intoxicacin aguda o subaguda, hasta casos de carcinogenicidad sin ser menos importantes las alergias; por lo que en general, las disposiciones legislativas han consistido en listas en las que se especifican los colorantes utilizables y sus exigencias de pureza (3). 3.3. COLORANTES NATURALES Se les denomina as a todos aquellos compuestos que poseen coloraciones y que provienen de fuentes naturales como plantas superiores, algas, hongos y lquenes, as como de algunos organismos invertebrados (4). Son muchas las plantas superiores que producen colorantes; a pesar de su universalidad no estn lo suficientemente concentrados para permitir una rpida y econmica extraccin, y en consecuencia son relativamente escasas las que tienen gran importancia comercial como fuente de colorantes (4). Las algas deben su color a las ficobilinas, las que se clasifican en ficocianinas y ficoeritrinas, de color azulado con fluorescencia roja y de color rojizo con fluorescencia naranja brillante, respectivamente (4). Los hongos, particularmente la parte correspondiente al cuerpo fructfero, estn fuertemente pigmentados. El nmero de pigmentos diferentes probablemente excede los 1000; aunque muchos de ellos son de naturaleza comn a las plantas superiores, como por ejemplo betalanas, carotenos y quinonas, muchos de ellos no han sido encontrados en algn otro organismo biolgico (4).

Los lquenes han sido ampliamente utilizados, por poseer compuestos coloreados como las quinonas, xantonas, depsidos y desdidonas, carotenoides y xantofilas, as como fenoxazinas (4). Dentro de los organismos marinos invertebrados, los crustceos y moluscos quizs son los que proveen las ms diversas fuentes de colorantes (4). De los insectos se puede destacar la cochinilla por su contenido de cido carmnico, as como el kermes que produce cido kermsico, ambos de naturaleza antraquinnica (4). 3.4. CLASIFICACIN DE LOS COLORANTES SEGN SU ESTRUCTURA QUMICA (2)

3.4.1. Colorantes Sintticos

Colorantes nitroso Colorantes nitro Colorantes azoicos Colorantes difenilmetnicos Colorantes trifenilmetnicos Colorantes xantnicos Colorantes quinnicos Colorantes quinolenicos Colorantes indigoides

3.4.2. Colorantes Naturales

Carotenoides Flavonoides Antocianinas Betalanas Quinonas

3.5.

COLORANTE AZICOS

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Los colorantes azoicos deben su color a la presencia de un grupo azo (N=N) conjugado con anillos aromticos por ambos extremos. Como en el caso de los dems colorantes artificiales, los colorantes azicos autorizados para su utilizacin como aditivos alimentarios son todos solubles en agua, debido a la presencia de grupos sulfnicos (5). Los colorantes azoicos se han cuestionado reiteradamente, debido a que muchos colorantes de esta familia (exceptuando los autorizados por la FDA)) han demostrado ser cancergenos en experimentos con animales (5). Una diferencia fundamental es que los colorantes cancergenos son poco polares, solubles en grasas, y atraviesan con cierta facilidad la barrera intestinal, incorporndose al organismo. En cambio, los colorantes autorizados, que son muy polares y soluble en agua, no se absorben (5). Pertenecen a este grupo los colorantes (5):

Amarillo anaranjado Tartracina Azorrubina, carmoisina Amaranto Rojo cochinilla, rojo Ponceau Rojo 2G Negro brillante Marrn FK Marrn HT Litol Rubina BK Rojo Allura AC

3.5.1. Rojo No. 40 (Rojo Allura AC)

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Este colorante se utiliza desde la dcada de 1980, sobre todo en Estados Unidos, (con el cdigo FD&C Red #40), donde se introdujo para sustituir al amaranto, siendo el ms utilizado en este pas. Se ha introducido recientemente en las listas de la Unin Europea, para eliminar problemas comerciales. La ingestin diaria aceptable de este colorante es de 7 mg/kg de peso (5). 3.6. ANTOCIANINAS El nombre de antocianina deriva del griego antho que significa flor y kyanos, que significa azul. Dicho trmino fue utilizado por Marquat en 1835 para designar a los pigmentos azules de las flores. Ms tarde se descubri que no slo el color azul, sino que tambin el prpura, violeta, magenta, y que todos los tonos de rojo, rosado, escarlata, que aparecen en muchas flores, frutos y algunas hojas y races de plantas, se deben a pigmentos qumicamente similares a las antocianinas de Marquat (4,6). Las antocianinas estn distribuidas ampliamente en plantas alimenticias, existiendo en 27 familias botnicas. El uso de estos pigmentos ha sido exitosamente aplicado en el tratamiento de varios tipos de desrdenes vasculares: fragilidad capilar, insuficiencia venosa crnica perifrica y microangiopata de la retina. Tambin poseen actividad antioxidante y antiagregante plaquetaria. Estudios recientes muestran el efecto benfico sobre las clulas cancergenas y con actividad antiinflamatoria (7,8).

3.6.1. Estructura
Las antocianinas estn consideradas dentro del grupo de los flavonoides, ya que poseen el esqueleto caracterstico C6-C3-C6 y el mismo origen biosinttico, pero difieren en que absorben fuertemente en la regin visible del espectro (4). Hay seis antocianidinas comunes, es decir la aglicona de la antocianina, siendo la cianidina la ms frecuente y responsable del color magenta, los colores rojonaranja se deben a la pelargonidina, mientras que los colores violeta y azul a la

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delfinidina. Tambin son comunes tres metil-teres: peonidina, petunidina y malvidina (4). La diferencia entre cada una de las seis antocianidinas ocurre en la variacin del tipo de azcar, del nmero y de la posicin en los que estn unidas. Entre los monosacridos comunes podemos mencionar a la glucosa, galactosa, ramnosa, xilosa y arabinosa, y como disacridos a la rutinosa, sambubiosa, soforosa, gentiobiosa y latirosa (4).

3.6.2. Factores que influyen en el color y la estabilidad de las antocianinas

Las antocianinas sufren de una inestabilidad inherente, por lo que debe tenerse muchas precauciones durante su manipuleo o su procesamiento. Un conocimiento de los factores involucrados en su inestabilidad as como de los mecanismos de degradacin es sumamente vital como colorante de alimento. Los factores que influyen en la estabilidad de las antocianinas son pH, temperatura, presencia de oxgeno, as como la interaccin con otros componentes en los alimentos como el cido ascrbico, iones metlicos, azcares y copigmentos (4). Algunos estudios han mostrado que: Las antocianidinas son menos estables que las antocianinas y menos solubles en agua, por lo que asume que la glicosidacin confiere estabilidad y solubilidad al pigmento.

A mayor grado de hidroxilacin, decrece generalmente la estabilidad de la antocianina, mientras que un incremento en el grado de metoxilacin o del grado de glicosilacin, tiene el efecto opuesto. La naturaleza del azcar enlazado influye en la estabilidad. La presencia de por lo menos dos grupos acilo estabiliza a la antocianina probablemente por la presencia del sistema aromtico en el grupo acilo, encontrndose que hay diferencia tambin por el tipo de grupo presente.

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En presencia de oxgeno la mxima estabilidad trmica de las antocianidina-3glicosiladas es a pH 1.8 a 2.0, mientras que para las antocianidina-3,5diglicosiladas lo es a pH 4.0-5.0. Las antocianinas son generalmente inestables cuando se exponen a la luz ultravioleta o a la luz visible. La presencia de cido ascrbico produce decoloracin de la antocianina, probablemente por la indirecta oxidacin por el perxido de hidrgeno que se forma durante la oxidacin aerbica del cido ascrbico. Las concentraciones altas de azcar (>20%) o de jarabe para preservar las frutas o jugos, tiende a ejercer un efecto protector sobre la antocianina. La formacin de complejos con protenas, taninos y otros flavonoides como quercetina y rutina, aumentan la estabilidad y el color de las antocianinas (4).

3.7.

ROSA DE JAMAICA

3.7.1. Nombre cientfico Hibiscus sabdariffa L. (9) 3.7.2. Familia

Malvaceae (9)

3.7.3. Nombres populares

Jamaica, karkad, roselle, sorrel, viuela, abutiln, hibisco, hibiscus, pampola, pampulha, papoula, vinagreira, azadinha (9,10).

3.7.4. Historia
La primera mencin de uso medicinal y culinario fue a travs de Bontius en 1668. El hibisco fue introducido en Jamaica en el siglo XVII, siendo all muy popular como aromatizante cido, para cuyo fin empleaban los clices de las flores. En Europa se introdujo a fines del siglo XIX como bebida refrescante, aunque su color sanguinolento no lo ha popularizado

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mucho. Sus flores caractersticas y su columna de estambres y estilo que sobresalen, representan uno de los smbolos de islas tropicales como las de Hawai. Actualmente forman parte de ceremonias de devocin en la India, siendo sagrada dentro de ese contexto (10).

3.7.5. Descripcin botnica

Hierba leosa, anual, erecta, 1-2 cm de alto, corteza roja, glabra. Hojas con peciolos cortos o largos, lbulos angostos, borde aserrado; nervadura central; glndula grande cerca de la base en el envs. Flores con bracteolas unidas con el cliz, acrescentes en la fructificacin, forman una copa grande, carnosa, rojo oscura, pedculos cortos. Cliz de 2 cm de largo y en nmero de 5; 5 ptalos, 4-5 cm de largo, amarillo plidos, estambres numerosos, ovario superior con 5 carpelos cerrados, placentacin axial. Fruto en cpsula densamente estrigosa ms corta que el cliz (9,10).

3.7.6. Descripcin microscpica

Al examinar al microscopio con una solucin de hidrato de cloral SP, la jamaica pulverizada (malla 3), de color rojo, presenta tricomas fusiformes largos, frecuentemente rotos, incoloros, de pared gruesa, pelos flexuosos incoloros, a veces muy contorneados, aislados o en pares; fragmentos de parnquima de color gris con numerosas maclas de oxalato de calcio. Puede tambin observarse la presencia de maclas aisladas de oxalato de calcio y de granos de polen equinulados (12).

3.7.7. Hbitat
Nativa de la India Oriental o Angola, naturalizada como maleza en Amrica tropical, se cultiva en grandes extensiones de las partes secas del oeste de frica Central, Sudn, Mxico y la India. En Guatemala se cultiva en tierras bajas de Baja Verapaz, El Progreso, Izabal, Huehuetenango y Santa Rosa (8).

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3.7.8. Agricultura
Crece en bosque seco y monte espinoso subtropical, clima clido, terreno hmero (200-450 cc/ao), pH 4.0-5.8, suelo arenoso-arcilloso rico en materia orgnica; resiste la sequa, adaptable a lugares secos (8).

3.7.9. Accin Farmacolgica

Vitamnico, aperitivo, digestivo, colagogo, demulcente, diurtico, laxante, espasmoltico, vasoprotector, diurtico, vasodilatador perifrico, tranquilizante, antihelmntico, antibacteriano, se utiliza en catarros y resfros. (11,13-14).

3.7.10. Farmacognosia
A los flavonoides y derivados antocinicos se les atribuye actividad diurtica, colertica, disminuye la viscosidad de la sangre, reduce la presin sangunea, estimula la peristalsis intestinal, sedante y laxante. La actividad antiflogstica se atribuye al contenido de muclago. La antocianinas (delfidina, delfidina 3-sambubisido, cianidin 3-sambubisido) son los responsables del color vino tinto caracterstico de la infusin. La antocianidina conocida como hibiscina (delfinidin 3-xilosilglucsido) es un colorante de vinos y de diversas preparaciones farmacuticas, presenta adems otro colorante rojo (gosipetina), as como colorante amarillo, la gositrina (9-11).

3.7.11. Composicin Qumica

Presenta polisacridos mucilaginosos casi en un 50% constituidos por cidos urnicos en forma de sal y el resto ramnosa, arabinosa y pequeas cantidades de glucosa, xilosa y manosa. cidos orgnicos tales como cido ctrico, cido hibstico, cido mlico, cido oxlico y cido tartrico. Contiene vitamina C, pectina, fitoesteroles, derivados flavnicos (gosipetina), cido protocatnico (cido fenlico). La raz contiene principalmente cido tartrico y saponinas, mientras que las semillas contienen fitoesteroles.

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Contiene otros polifenoles como flavonoides, por ejemplo: quercetina, miricetina, hibiscetina, hibiscitrina (8,10-11).

3.7.12. Usos Etnomedicinales

Las flores y clices de hibisco en forma de infusin se emplea popularmente en uso interno como diurtico, colertico, carminativo, antiescorbtico, laxante suave y antiespasmdico. Menos frecuente como facilitador del parto, antidisentrico, en casos de disurias y como antitusivo. La races en decoccin para combatir el estreimiento y las semillas como energizante (10-11).

3.7.13. Usos alimenticios

Se utiliza mucho como corrector organolptico, ya que al incorporarla a infusiones otorga un vistoso color rojo y un agradable sabor acdulo refrescante. Gracias su calidad de aromatizante cido puede ser incorporado a vinos, jaleas y salsas. El extracto puede ser utilizado en alimentos acuosos de pH cido manteniendo su estabilidad en relacin con el color. Suele prepararse un t muy agradable al sabor y un colorante rojo para totalizar otras tisanas (10).

3.7.14. Otros usos

Los tallos proporcionan una fibra excelente muy similar al yute, conocida con el nombre de camo de hibisco, la cual resulta til para el amarre y la elaboracin de cordeles. La gosipetina es un colorante rojo, la gositrina amarillo y la hibiscina tambin rojizo, emplendose para teir vinos y en diversas preparaciones farmacuticas. El aceite de las semillas presenta baja viscosidad, lo cual es apreciado por los fabricantes de cosmticos (10).

4. JUSTIFICACIN

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Investigaciones recientes han proporcionado informacin acerca de los grandes peligros y daos a la salud que los colorantes sintticos pueden causar, sin embargo el color es una de las caractersticas principales que la industria alimenticia, cosmtica y farmacutica no puede dejar por un lado, ya que es un factor esttico por medio del cual el consumidor puede identificar y juzgar la calidad de un producto; por estas razones es que dichas industrias han utilizado como alternativa a los colorantes naturales. Se conoce que los clices de Hibiscus sabdariffa L. (rosa de jamaica), poseen los pigmentos conocidos como antocianinas, los cuales son compuestos naturales que otorgan las coloraciones rojizas. Al ser de origen natural no requieren certificaciones internacionales, tanto de la Comunidad Econmica Europea y de la Administracin de Alimentos, Medicamentos y Cosmticos de Estados Unidos (FDA) y adems, los riesgos nocivos que presentan son casi nulos, por lo que pueden ser utilizados ampliamente. Con esta investigacin se pretende crear una nueva alternativa que pueda sustituir a los colorantes sintticos, proporcionando productos de alta calidad y seguros, as como fortalecer una de las reas ms importantes para el pas como lo es la agricultura, contribuyendo as a implementar un nuevo recurso econmico.

5. OBJETIVOS

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5.1.

GENERAL Evaluar la estabilidad acelerada de los pigmentos antocinicos presentes en el cliz

de Hibiscus sabdariffa L. (rosa de jamaica) como alternativa de consumo del colorante artificial Rojo No.40. 5.2. ESPECFICOS

5.2.1. Obtener los pigmentos antocinicos presentes en la muestra de Hibiscus sabdariffa

L., por medio de la tcnica de extraccin por maceracin con solvente en fro.
5.2.2. Caracterizar los pigmentos antocinicos de Hibiscus sabdariffa L. (rosa de jamaica), mediante cromatografa en capa fina. 5.2.3. Evaluar la estabilidad acelerada de los extractos obtenidos, a diferentes temperaturas (30C y 50C) y pH (4, 5 y 6), utilizando el mtodo de espectrofotometra ultravioleta-visible, en comparacin con el colorante artificial Rojo No. 40.

6. HIPTESIS

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Los pigmentos antocinicos presentes en el cliz de Hibiscus sabdariffa L. (rosa de jamaica) poseen las caractersticas de estabilidad necesarias para ser utilizados como alternativa de consumo del colorante artificial Rojo No.40.

7. MATERIALES Y MTODOS

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7.1.

UNIVERSO Y MUESTRA 7.1.1. 7.1.2. Universo: Hibiscus sabdariffa L. (rosa de jamaica) Muestra: 1 Kg de clices de Hibiscus sabdariffa L., colectado en el municipio Jacaltenango, Huehuetenango.

7.2.

MATERIAL Y CRISTALERA

Comn de laboratorio.

7.3.

EQUIPO E INSTRUMENTOS

Espectrofotmetro Genesys de regin Ultravioleta-visible (UV-vis) Balanza semianaltica Balanza analtica Hornos calibrados Cromatofolio de slica gel 60F254

7.4.

REACTIVOS

cido clorhdrico 25 % Etanol 95% Metanol Solucin buffer pH 4 Solucin buffer pH 5 Solucin buffer pH 6 n-Butanol Cloroformo cido actico Estndar Rojo No. 40

7.5.

MTODOS

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7.5.1.

OBTENCIN Y CLASIFICACIN TAXONMICA DE LA MUESTRA (16-19)

7.5.1.1

Colecta y secado de las muestras

Observar las plantas de inters para determinar si pueden obtenerse suficientes muestras de ellas y que estn sanas. Con la ayuda de tijeras de podar o machete obtener al menos 5 ejemplares, para su determinacin taxonmica y la cantidad necesaria para llevar a cabo la parte experimental. Realizar una seleccin cuidadosa del material vegetal, desechando las partes decoloradas, manchadas, enfermas o deterioradas por insectos y hongos. Hacer el lavado con agua potable en una canasta calada de modo que el agua penetre. Lavar y escurrir para eliminar el exceso de agua, esto debe hacerse por lo menos dos veces y una lavada de desinfeccin con 10 ppm de hipoclorito de calcio. Colocar el material vegetal en bandejas con papel kraft, mover eventualmente, secar evitando que el material vegetal reciba sol directo. Para el almacenamiento el material vegetal debe contener un porcentaje de humedad no mayor al 10%. Al menos 3 muestras deben ser herborizadas y sometidas a cuarentena, para su posterior determinacin taxonmica.

7.5.2.

PROCEDIMIENTO (20)

DE

CARACTERIZACIN

DE

LOS

PIGMENTOS

ANTOCINICOS POR MEDIO DE CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (CCF)

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7.5.2.1.

Preparacin del extracto

Pulverizar 1 gramo de muestra y extraer con 6 mL de una mezcla de metanol/cido clorhdrico al 25 % (9:1), agitar por 15 minutos. Filtrar y utilizar 25 L para llevar a cabo la cromatografa.

7.5.2.2.

Soluciones de referencia

Azul de metileno: Disolver 5 mg en 10 mL de metanol; y aplicar 10 L. Amarillo naftol/Rojo Sudn: Disolver 5 mg de amarillo naftol en 5 mL de metanol y 5 mg de rojo Sudn en 5 mL de cloroformo, mezclar y aplicar 5 L en la cromatoplaca.

7.5.2.3.

Fase estacionaria

Cromatofolios de aluminio de slica gel 60F254

7.5.2.4.

Fase mvil

n-butanol - cido actico glacial agua (40:10:20)

7.5.3. PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIN DE LOS PIGMENTOS ANTOCINICOS (21)

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Descongelar aproximadamente 200 g de la muestra, de los cuales se deben pesar 100 g de clices. Macerar stos utilizando 100 mL de solvente extractor (etanol 95%, cido clorhdrico 0.1 N en proporcin 85:15). Transferir cuantitativamente 50 mL y hacer lavados del recipiente utilizando aproximadamente 50 mL de solvente extractor. Recibir el extracto en un beacker y medir; cubrir el beacker con parafilm y No.1, usando embudo Bchner. Lavar, tanto el beacker y el papel filtro repetidamente con el solvente extractor, hasta obtener aproximadamente 450 mL de extracto. Transferir a un baln aforado de 500 mL y enrazar con el disolvente extractor, esta ser la solucin A. 7.5.4. PROCEDIMIENTO PARA EVALUAR LA ESTABILIDAD DE LOS COLORANTES NATURALES (22-25) Evaluar la muestra a tres valores de pH (4, 5 y 6) y a dos temperaturas (30C y 50C), para ello utilizar hornos previamente calibrados para mantener dichas temperaturas. Estos deben permanecer conectados durante todo el proceso experimental. Analizar las muestras en el espectrofotmetro ultravioleta-visible a una longitud de onda de 540 nm. guardar durante toda la noche a 4C, posteriormente se debe filtrar utilizando papel Whatman

Realizar el siguiente procedimiento: (26-28) Aadir 20 mL de solucin buffer pH 4 a 4 tubos de 30 mL e identificar as:

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Tubo A: T1, pH1 Tubo A: T2, pH1 Tubo B: T1, pH1 Tubo B: T2, pH1 Aadir 20 mL de solucin buffer pH 5 a 4 tubos de 30 mL e identificar de la siguiente manera: Tubo A: T1, pH2 Tubo A: T2, pH2 Tubo B: T1, pH2 Tubo B: T2, pH2 Aadir 20 mL de solucin buffer pH 6 a 4 tubos de 30 mL e identificar de la siguiente manera: Tubo A: T1, pH3 Tubo A: T2, pH3 Tubo B: T1, pH3 Tubo B: T2, pH3 Siendo los tubos identificados como A, los que contengan el extracto de la muestra (Hibiscus sabdariffa L.) y los identificados como B, los que contengan la solucin estndar (Rojo No. 40); T1, ser la temperatura de 30C y la T2 la temperatura de 50C. Aadir una cantidad de extracto y estndar que brinde un valor de absorbancia entre 0.4 y 0.6 unidades. Determinar las absorbancia para cada tubo diariamente (excepto sbado y domingo) durante un mes o hasta que una de las muestras disminuya en un 80% su concentracin inicial. 7.6. DISEO DE LA INVESTIGACIN

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La caracterizacin de los pigmentos se hizo en forma descriptiva. La cromatografa en capa fina se analiz por medio de mediciones del Rf y anlisis iconogrfico. El anlisis de estabilidad acelerada se hizo utilizando un diseo factorial (2x2x3) con medidas repetidas (las medidas repetidas sern las concentraciones a travs del tiempo), en el que se evaluaron los colorantes de la rosa de jamaica y el colorante artificial Rojo No.40, dos temperaturas (30C y 50C) y tres pH (4, 5 y 6) realizndolo por duplicado. La respuesta se medi por el porcentaje de concentracin y se determin el da de corte, es decir el da en el que la concentracin de alguna de las muestras sea 80 % (21). Anlisis Estadstico: consisti en un anlisis de varianza con los porcentajes de concentracin dependiente de los resultados experimentales de los das de corte. Se hicieron comparaciones mltiples por medio de la prueba de la mnima diferencia significativa de Fisher (MDF). Se hizo un anlisis de regresin, considerando las mejores condiciones de estabilidad concentracin-tiempo de las muestras en estudio, con un intervalo de confianza del 95%.

26

8.

RESULTADOS

8.1. Identificacin taxonmica de la muestra colectada Se identific que la muestra colectada en el municipio de Jacaltenango, Huehuetenango, efectivamente corresponda al gnero y especie Hibiscus sabdariffa L. (rosa de jamaica) y se registr en la Unidad de Investigacin Herbario BIGU con nmero de identificacin 33815. 8.2. Identificacin de los pigmentos antocinicos presentes en los clices de Hibiscus

sabdariffa (rosa de jamaica) por medio de cromatografa en capa fina

Tabla No. 1 Cromatografa en capa fina del extracto de rosa de jamaica Banda A B C Estndar1 Estndar2 Color Observado Rf experimental Rosado Azul Azul-violeta Azul-celeste Rojo 0.12 0.40 0.50 0.64 0.97

Fig. 1 Cromatograma de las bandas observadas del extracto de rosa de jamaica

Frente
0.97 Rf 0.64

0.50
0.40 0.12 Inicio
1 2 3 4 5

Deteccin: Sin tratamiento qumico y en visible

1,2 y 3 = Extracto de los clices de Hibiscus sabdariffa (rosa de jamaica) 4 = Estndar azul de metileno 5 = Estndar rojo sudn/amarillo naftol

27

8.3. Estudio de estabilidad acelerada, por medio del mtodo

espectrofotomtrico UV-

Vis de los colorantes naturales de rosa de jamaica comparados con el colorante artificial Rojo No.40 bajo diferentes condiciones de temperatura y pH
T a b la No . 2 E x t ra c t o d e R o sa de J a m a i c a a 3 0 C y p H 4
D a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A bso rban c ia M1 0. 552 0. 551 0. 551 0. 551 0. 550 0. 545 0. 545 0. 543 0. 540 0. 533 0. 527 0. 523 0. 523 0. 517 0. 512 0. 506 0. 506 0. 500 Abso rban cia M2 0 .55 8 0 .55 3 0 .55 2 0 .55 0 0 .54 7 0 .54 7 0 .54 6 0 .54 6 0 .54 3 0 .52 5 0 .51 8 0 .51 6 0 .51 4 0 .50 8 0 .50 8 0 .50 5 0 .50 3 0 .49 1 M e dia 0.5 55 0.5 52 0.5 52 0.5 51 0.5 49 0.5 46 0.5 46 0.5 45 0.5 42 0.5 29 0.5 23 0.5 20 0.5 19 0.5 13 0.5 10 0.5 06 0.5 05 0.4 96 C o nc en trac i n 0.01 76 0.01 75 0.01 75 0.01 74 0.01 74 0.01 73 0.01 73 0.01 72 0.01 71 0.01 67 0.01 65 0.01 64 0.01 64 0.01 62 0.01 61 0.01 59 0.01 59 0.01 56 % de C on c entra ci n 1 00 99.4 1 99.3 1 99.1 2 98.7 4 98.2 7 98.1 7 97.9 8 97.4 1 95.0 4 93.8 0 93.2 3 93.0 4 91.9 0 91.4 3 90.5 7 90.3 8 88.6 8 M = m u estra D a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Abso rban cia M1 0 .44 3 0 .44 2 0 .44 2 0 .43 6 0 .43 5 0 .43 1 0 .43 0 0 .42 7 0 .42 5 0 .42 4 0 .42 4 0 .41 7 0 .41 4 0 .41 2 0 .40 3 0 .39 4 0 .39 3 0 .39 2

T a b la No . 3 R o jo No . 4 0 a 3 0 C y p H 4
A bs o rba nc ia M2 0.4 30 0.4 25 0.4 23 0.4 20 0.4 10 0.4 09 0.4 09 0.4 09 0.4 02 0.4 00 0.3 96 0.3 92 0.3 90 0.3 90 0.3 88 0.3 86 0.3 86 0.3 86 M e dia 0 .43 7 0 .43 4 0 .43 3 0 .42 8 0 .42 3 0 .42 0 0 .42 0 0 .41 8 0 .41 4 0 .41 2 0 .41 0 0 .40 5 0 .40 2 0 .40 1 0 .39 6 0 .39 0 0 .39 0 0 .38 9 C o nc en tra ci n 0 .01 36 0 .01 35 0 .01 35 0 .01 34 0 .01 32 0 .01 31 0 .01 31 0 .01 30 0 .01 29 0 .01 28 0 .01 27 0 .01 26 0 .01 25 0 .01 24 0 .01 23 0 .01 21 0 .01 21 0 .01 20 % de Co n ce nt rac i n 100 99 .51 99 .27 98 .16 96 .81 96 .20 96 .07 95 .70 94 .60 94 .23 93 .74 92 .38 91 .77 91 .52 90 .17 88 .82 88 .70 88 .57 M = m u estra

G rfi ca No .1 Ex trac to d e R osa de Jam a ica 3 0C y pH 4

10 5 1 05

Gr fic a No .2 Ro jo No . 40 30 C y pH 4
n i c a r t n e c n o C %
95 85 75 65 0 2 4 6 8
Das

n 95 i c a r t 85 n e c n 75 o C %
65 0 2 4 6 8
D a s

10

12

14

16

18

10

12

14

16

18

T a b la N o . 4 E x tr a c t o d e R o sa de J a m a ic a a 5 0 C y p H 4 D a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A bso rban c ia M1 0. 566 0. 565 0. 563 0. 550 0. 547 0. 546 0. 534 0. 531 0. 525 0. 507 0. 486 0. 480 0. 476 0. 475 0. 475 0. 473 0. 472 0. 470 Abso rban cia M2 0 .58 4 0 .58 4 0 .57 2 0 .56 1 0 .56 0 0 .56 0 0 .54 9 0 .54 3 0 .52 8 0 .51 3 0 .51 2 0 .50 4 0 .50 1 0 .49 7 0 .49 7 0 .49 7 0 .49 4 0 .48 8 M e dia 0.5 75 0.5 75 0.5 68 0.5 56 0.5 54 0.5 53 0.5 42 0.5 37 0.5 27 0.5 10 0.4 99 0.4 92 0.4 89 0.4 86 0.4 86 0.4 85 0.4 83 0.4 79 C o nc en trac i n 0.01 83 0.01 82 0.01 80 0.01 76 0.01 75 0.01 75 0.01 71 0.01 70 0.01 66 0.01 61 0.01 57 0.01 55 0.01 54 0.01 53 0.01 53 0.01 53 0.01 52 0.01 51 % de C on c entra ci n 1 00 99.7 2 98.4 4 96.2 5 95.8 8 95.7 9 93.6 9 92.8 7 90.9 5 87.9 3 85.9 2 84.6 4 84.0 0 83.5 5 83.5 5 83.3 6 83.0 0 82.2 7
M = m ue st ra

T a b la N o . 5 R o j o N o . 4 0 a 5 0 C y p H 4 D a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Abso rban cia M1 0 .43 1 0 .43 1 0 .43 1 0 .43 1 0 .42 3 0 .41 1 0 .41 0 0 .41 0 0 .40 8 0 .40 8 0 .40 8 0 .40 7 0 .40 7 0 .40 0 0 .39 9 0 .39 9 0 .39 8 0 .39 4 A bs o rba nc ia M2 0.4 62 0.4 62 0.4 61 0.4 61 0.4 59 0.4 52 0.4 38 0.4 32 0.4 26 0.4 20 0.4 19 0.4 18 0.4 13 0.4 06 0.4 04 0.4 04 0.4 04 0.4 01 M e dia 0 .44 7 0 .44 7 0 .44 6 0 .44 6 0 .44 1 0 .43 2 0 .42 4 0 .42 1 0 .41 7 0 .41 4 0 .41 4 0 .41 3 0 .41 0 0 .40 3 0 .40 2 0 .40 2 0 .40 1 0 .39 8 C o nc en tra ci n 0 .01 40 0 .01 40 0 .01 40 0 .01 40 0 .01 38 0 .01 35 0 .01 32 0 .01 31 0 .01 30 0 .01 29 0 .01 29 0 .01 28 0 .01 27 0 .01 25 0 .01 25 0 .01 25 0 .01 24 0 .01 23 % de Co n ce nt rac i n 100 99 .78 99 .66 99 .66 98 .46 96 .19 94 .40 93 .69 92 .73 92 .01 91 .89 91 .66 91 .06 89 .39 89 .03 89 .03 88 .91 88 .07
M = m u e str a

G r fic a N o.3 E xt ra ct o de Ro sa d e J am aica 50 C y pH 4

n i 95 c a r t n 85 e c n o 75 C %
65 0 2 4 6 8
D a s

G rf ic a N o .4 R o jo N o . 40 5 0 C y p H 4 10 5 n o 95 i c a r t 85 n e c n 75 o C % 65

10 5

10

12

14

16

18

8
D a s

10

12

14

16

18

28

Ta bla No. 6 Extracto de Rosa de Jama ica a 30C y pH 5

Da 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Absorbancia M1 0.444 0.442 0.441 0.441 0.438 0.437 0.437 0.438 0.436 0.435 0.425 0.425 0.424 0.419 0.413 0.409 0.404 0.400 Absorbancia M2 0.442 0.439 0.438 0.438 0.438 0.436 0.436 0.436 0.434 0.434 0.431 0.430 0.427 0.424 0.421 0.415 0.410 0.409 Media 0.443 0.441 0.440 0.440 0.438 0.437 0.437 0.437 0.435 0.435 0.428 0.428 0.426 0.422 0.417 0.412 0.407 0.405 Concentracin 0.0139 0.0138 0.0137 0.0137 0.0137 0.0136 0.0136 0.0137 0.0136 0.0136 0.0134 0.0133 0.0133 0.0131 0.0130 0.0128 0.0126 0.0126 % de Concentracin 100 99.05 98.81 98.81 98.45 98.09 98.09 98.21 97.73 97.61 96.04 95.92 95.44 94.48 93.40 92.20 90.99 90.39 M= muestra Da 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Absorbancia M1 0.443 0.442 0.442 0.436 0.435 0.431 0.430 0.427 0.425 0.424 0.424 0.417 0.414 0.412 0.410 0.409 0.405 0.398

Tabla No. 7 Rojo No. 40 a 30C y pH 5

Absorbancia M2 0.430 0.425 0.423 0.420 0.410 0.409 0.409 0.409 0.402 0.400 0.396 0.393 0.393 0.391 0.390 0.388 0.388 0.387 Media 0.437 0.434 0.433 0.428 0.423 0.420 0.420 0.418 0.414 0.412 0.410 0.405 0.404 0.402 0.400 0.399 0.397 0.393 Concentracin 0.0136 0.0135 0.0135 0.0134 0.0132 0.0131 0.0131 0.0130 0.0129 0.0128 0.0127 0.0126 0.0125 0.0125 0.0124 0.0124 0.0123 0.0122 % de Concentracin 100 99.51 99.27 98.16 96.81 96.20 96.07 95.70 94.60 94.23 93.74 92.51 92.14 91.65 91.28 90.91 90.42 89.43 M= mu estra

Grfica No.5 Extracto de Rosa de Jamaica 30C y pH 5

n i c a r t n e c n o C %

Grfica No.6 Rojo No.40 30C y pH 5

105 95 85 75 65 0 2 4 6 8
Das

10

12

14

16

18

105 95 85 75 65 %
n i c a r t n e c n o C

10
Das

12

14

16

18

Ta bla No. 8 Extracto de Rosa de Jama ica a 50C y pH 5

Da 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Absorbancia M1 0.420 0.417 0.400 0.397 0.397 0.396 0.396 0.381 0.378 0.378 0.369 0.365 0.364 0.360 0.355 0.357 0.351 0.350 Absorbancia M2 0.418 0.414 0.407 0.402 0.400 0.399 0.391 0.388 0.386 0.383 0.377 0.379 0.376 0.362 0.359 0.348 0.343 0.343 Media 0.419 0.416 0.404 0.400 0.399 0.398 0.394 0.385 0.382 0.381 0.373 0.372 0.370 0.361 0.357 0.353 0.347 0.347 Concentracin 0.0130 0.0129 0.0125 0.0124 0.0124 0.0123 0.0122 0.0119 0.0118 0.0118 0.0115 0.0115 0.0114 0.0111 0.0110 0.0108 0.0106 0.0106 % de Concentracin 100 99.48 96.39 95.36 95.11 94.85 93.82 91.51 90.86 90.48 88.55 88.29 87.78 85.46 84.43 83.28 81.86 81.73 M= muestra Da 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Absorbancia M1 0.425 0.420 0.419 0.416 0.413 0.412 0.411 0.408 0.406 0.406 0.399 0.397 0.397 0.394 0.393 0.393 0.392 0.390

Tabla No. 9 Rojo No. 40 a 50C y pH 5

Absorbancia M2 0.422 0.418 0.418 0.417 0.417 0.414 0.415 0.411 0.409 0.403 0.402 0.400 0.396 0.396 0.395 0.395 0.394 0.391 Media 0.424 0.419 0.419 0.417 0.415 0.413 0.413 0.410 0.408 0.405 0.401 0.399 0.397 0.395 0.394 0.394 0.393 0.391 Concentracin 0.0132 0.0131 0.0130 0.0130 0.0129 0.0129 0.0129 0.0127 0.0127 0.0126 0.0124 0.0124 0.0123 0.0123 0.0122 0.0122 0.0122 0.0121 % de Concentracin 100 98.89 98.76 98.26 97.88 97.37 97.37 96.48 95.98 95.22 94.20 93.70 93.19 92.81 92.56 92.56 92.30 91.67 M= mu estra

Grfica No.7 Extracto de Rosa de Jamaica 50C y pH 5

Grfica No.8 Rojo No.40 50C y pH 5

105
n i c a r t n e c n o C %

95 85 75 65 0 2 4 6 8 10 Das 12 14 16 18

105
n i c a r t n e c n o C %

95 85 75 65 0 2 4 6 8
Das

10

12

14

16

18

29

Ta bla No. 10 Extr acto de Rosa de Jama ica a 30 C y pH 6

D a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Absorban cia M1 0. 468 0. 461 0. 453 0. 442 0. 432 0. 427 0. 412 0. 410 0. 407 0. 407 0. 405 0. 399 0. 397 0. 396 0. 392 0. 388 0. 382 0. 381 Absorban cia M2 0.45 4 0.44 9 0.44 0 0.43 6 0.43 0 0.42 2 0.417 0.415 0.412 0.405 0.401 0.401 0.39 7 0.38 9 0.38 5 0.38 3 0.37 7 0.37 7 Me dia 0.4 61 0.4 55 0.4 47 0.4 39 0.4 31 0.4 25 0.4 15 0.4 13 0.4 10 0.4 06 0.4 03 0.4 00 0.3 97 0.3 93 0.3 89 0.3 86 0.3 80 0.3 79 Concen tracin 0.0145 0.0143 0.0140 0.0137 0.0135 0.0132 0.0129 0.0128 0.0127 0.0126 0.0125 0.0124 0.0123 0.0122 0.0120 0.0119 0.0117 0.0117 % de C on centracin 100 98.2 9 96.3 3 94.6 1 92.7 6 91.2 6 88.9 6 88.5 0 87.8 0 87.00 86.3 0 85.6 1 84.9 2 83.8 8 82.9 6 82.2 7 80.8 9 80.7 7 M = m uestra Da 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Absorban cia M1 0.47 7 0.47 5 0.47 4 0.47 4 0.47 3 0.47 1 0.46 8 0.46 5 0.45 9 0.45 7 0.45 5 0.44 9 0.44 5 0.44 1 0.43 6 0.43 6 0.43 2 0.42 9

T abla No. 11 Rojo No. 40 a 30 C y pH 6

Absorbancia M2 0.4 73 0.4 73 0.4 72 0.4 71 0.4 67 0.4 65 0.4 64 0.4 57 0.4 51 0.4 49 0.4 46 0.4 42 0.4 37 0.4 34 0.4 33 0.4 31 0.4 27 0.4 26 Me dia 0.47 5 0.47 4 0.47 3 0.47 3 0.47 0 0.46 8 0.46 6 0.46 1 0.45 5 0.45 3 0.45 1 0.44 6 0.44 1 0.43 8 0.43 5 0.43 4 0.43 0 0.42 8 C oncen tracin 0.0149 0.0149 0.0149 0.0148 0.0148 0.0147 0.0146 0.0145 0.0143 0.0142 0.0141 0.0139 0.0138 0.0137 0.0136 0.0135 0.0134 0.0133 % de Con ce ntracin 100 99 .92 99 .70 99 .58 99 .02 98 .57 98 .12 97 .00 95 .66 95 .21 94 .65 93 .52 92 .51 91.73 91.06 90.83 89 .93 89 .49 M = mu estra

Grfica No.9 Extracto de Rosa de Jamaica 30C y pH 6

n i c a r t n e c n o C %

105 95 85 75 65 0 2 4 6 8
Das

n i c a r t n e c n o C %

105 95 85 75 65 0 2 4

Grfica No.10 Rojo No.40 30C y pH 6

10

12

14

16

18

8
D as

10

12

14

16

18

Ta bla No. 12 Extr acto de Rosa de Jama ica a 30 C y pH 6

D a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Absorban cia M1 0. 412 0. 408 0. 398 0. 398 0. 397 0. 396 0. 395 0. 395 0. 391 0. 390 0. 387 0. 386 0. 385 0. 383 0. 381 0. 378 0. 377 0. 363 Absorban cia M2 0.417 0.402 0.401 0.400 0.39 8 0.39 5 0.39 5 0.39 6 0.39 3 0.39 2 0.39 2 0.38 8 0.38 7 0.38 6 0.38 3 0.38 2 0.38 2 0.37 6 Me dia 0.4 15 0.4 05 0.4 00 0.3 99 0.3 98 0.3 96 0.3 95 0.3 96 0.3 92 0.3 91 0.3 90 0.3 87 0.3 86 0.3 85 0.3 82 0.3 80 0.3 80 0.3 70 Concen tracin 0.0129 0.0126 0.0124 0.0124 0.0123 0.0123 0.0122 0.0123 0.0121 0.0121 0.0121 0.0120 0.0119 0.0119 0.0118 0.0117 0.0117 0.0114 % de C on centracin 100 97.5 3 85.5 0 85.3 8 85.04 84.5 8 84.4 6 84.5 8 83.7 7 83.5 4 83.19 82.6 2 82.3 9 82.04 81.4 6 81.00 80.8 9 78.5 8 M = m uestra Da 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Absorban cia M1 0.49 7 0.49 6 0.49 4 0.49 3 0.47 9 0.47 3 0.47 1 0.46 2 0.46 0 0.45 9 0.45 6 0.45 0 0.44 5 0.44 2 0.44 0 0.43 6 0.43 5 0.43 4

Ta bla No. 13 Rojo No. 40 a 30 C y pH 6

Absorbancia M2 0.5 03 0.5 03 0.5 01 0.5 00 0.4 94 0.4 90 0.4 86 0.4 84 0.4 82 0.4 73 0.4 71 0.4 68 0.4 67 0.4 66 0.4 59 0.4 57 0.4 57 0.4 52 Me dia 0.500 0.500 0.49 8 0.49 7 0.48 7 0.48 2 0.47 9 0.47 3 0.47 1 0.46 6 0.46 4 0.45 9 0.45 6 0.45 4 0.45 0 0.44 7 0.44 6 0.44 3 C oncen tracin 0.0158 0.0157 0.0157 0.0156 0.0153 0.0151 0.0150 0.0149 0.0148 0.0146 0.0145 0.0144 0.0143 0.0142 0.0141 0.0140 0.0140 0.0139 % de Con ce ntracin 100 99 .62 99 .20 98 .99 96 .87 95 .81 95 .18 94 .02 93 .59 92 .53 92 .01 91.05 90.42 90.00 89 .04 88 .41 88 .30 87 .67 M = mu estra

Grfica No.11 Extracto de Rosa de Jamaica 50C y pH 6

Grfica No.12 Rojo No.40 50C y pH 6

n i c a r t n e c n o C %

n i c a r t n e c n o C %

105 95 85 75 65 0 2 4 6 8
Das

105 95 85 75 65 0 2 4 6 8
Das

10

12

14

16

18

10

12

14

16

18

El clculo de la concentracin de las muestras se encuentra en el apartado de Anexos (Grfica A)

30

8.4.

Anlisis Estadstico Tabla No.14 Anlisis de Varianza Source Partial SS df MS F Prob> F 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.7175 0.0001

Model 6790.66595 29 234.160895 80.88 Muestra 761.464307 1 761.464307 263.01 Temperatura 425.334002 1 425.332002 146.91 pH 575.915613 2 287.957806 99.46 Tiempo 4187.61659 18 232.645366 80.36 Muestra*Temperatura 281.785338 1 281.785338 97.33 Muestra*pH 497.900309 2 248.950155 85.99 Temperatura*pH 1.92546603 2 962.733015 0.33 Muestra*Temp*pH 58.7243264 2 29.3621632 10.14 Residual 573.237567 198 2.89513923 Total 7363.90352 227 32.4401036

Observaciones=228 R-cuadrado = 0.9222 MSE = 1.70151 Adj R-cuadrado =0.9108

Tabla No.15 Promedio de las concentraciones extracto-colorante en la combinacin muestra-temperatura Muestra 30C 50C Rosa de jamaica 92.98 88.02 Rojo No.40 94.41 93.90
Grfica No.13 C ombinacin Muestra-Temperatura 100 n o i c 90 a r t n e 80 c n o C %

30C
R. Jamaica

50C
Rojo 40

31

Tabla No.16 Promedio de las concentraciones extracto-colorante en la combinacin muestra-pH

Muestra Rosa de jamaica Rojo No.40 pH 4 92.30 93.62
Grfica No.14 Combinacin Muestra-pH

pH 5 92.97 94.78

pH 6 86.23 94.05

n 100 o i c a r 90 t n e c 80 n o C %

pH 4

pH 5
R. Jamaica

pH 6
Rojo 40

Tabla No.17 Promedio de las concentraciones extracto-colorante en la combinacin muestratemperatura-pH 30C pH 4 30C pH 5 50C pH 4 50C pH 5 50C pH 6 Muestra Rosa de jamaica Rojo No.40 94.92 93.92 95.92 94.32 89.67 93.33 90.02 95.25 84.36 93.12

Grfica No.15 Combinacin Muestra-Temperatura-pH

n i 90 c a r t n 80 e c n o 70 C %

100

30C pH 4

30C pH 5

30C pH 6 R . Jamaica

50C pH 4

50C pH 5 Rojo 40

50C pH 6

32

8.5. Anlisis de regresin lineal

Grfica No.16 Rosa de Jamaica a 30C y pH 4

110 100 90 80 70 60 50 0 5 10
Das

%Concentracin

15

20

Ecuacin: y=100.956173 0.55998742x Coeficiente de determinacin (R2): 0.89499933 La regresin lineal es significativa (p<0.0001) Da en el que se espera que la concentracin decaiga al 80% 37.4 das Intervalo de confianza al 95% 30.27 a 47.61 das

Grfica No.17 Rojo No.40 a 30C y pH 4

%Concentracin

110 90 70 50 0 5 10
D s

15

Ecuacin: y=100.170367 0.69471573x Coeficiente de determinacin (R2): 0.98934529 La regresin lineal es significativa (p<0.0001) Da en el que se espera que la concentracin decaiga al 80% 29.03 das Intervalo de confianza al 95% 27.04 a 31.25 das

33

Grfica No.18 Rojo No.40 a 30 y pH 5

%Concentracin

110 90 70 50 0 5 10
Das

15

20

Ecuacin: y=99.7834991 0.60716377x Coeficiente de determinacin (R2): 0.98824115 La regresin lineal es significativa (p<0.0001) Da en el que se espera que la concentracin decaiga al 80% 32.6 das Intervalo de confianza al 95% 30.30 a 35.13 das

Grfica No.19 Rojo No.40 a 30 y pH 6

%Concentracion

150

50 0 5 10 15

Ecuacin: y=101.335188 0.70533473x Coeficiente de determinacin (R2): 0.98070443 La regresin lineal es significativa (p<0.0001) Da en el que se espera que la concentracin decaiga al 80% 30.25 das Intervalo de confianza al 95% 27.52 a 33.4 das

34

Tabla No. 17 Promedio conjunto de las concentraciones del extracto-colorante en condiciones ptimas Das 0 5 10 15 18 25 35 37 40
jamaica No.40

RJ-30C-pH 5 R40-30C-pH 4 R40-30C-pH 5 100.96 98.16 95.36 92.56 90.88 86.96 81.36 80.24 78.56 100.17 96.70 93.22 89.75 87.67 82.80 75.86 74.47 72.38 99.78 96.75 93.71 90.68 88.85 84.60 78.53 77.32 75.50

R40-30C-pH 6 101.34 97.81 94.28 90.76 88.64 83.70 76.65 75.24 73.12
RJ = rosa de

R40= colorante artificial Rojo La concentracin de cada una de las muestras se calcul utilizando la ecuacin respectiva (grficas 16-19)

Grfica No.20 Regresin lineal conjunta del comportamiento de los cuatro sistemas con mayor estabilidad 105 100 95 90 85 80 0 10 20
Das

%Concentracion

30

40

50

RJ-30-5

R40-30-4

R40-30-5

R40-30-6

35

9.

DISCUSIN DE RESULTADOS

La extraccin de los pigmentos que proporcionan las coloraciones rojizas a los clices de la rosa de jamaica (Hibiscus sabdariffa) se realiz por medio de la tcnica de maceracin en fro. Despus de obtenido el extracto se procedi a la caracterizacin de los pigmentos utilizando la cromatografa en capa fina (CCF). Segn Wagner, et. al., en el cromatograma deben observarse dos bandas principales de color azul-violeta en la regin de la banda del estndar azul de metileno y a un Rf entre 0.25-0.5. Comparando con los resultados experimentales, se confirma la presencia del pigmento de inters: delfinidin-3-xilosilglucsido (hibiscina) en la muestra analizada, de coloracin azul-violeta y que se ubica a un Rf de 0.5 la que representa dicho pigmento, el cual es el responsable de las coloraciones rojizas que caracterizan a la rosa de jamaica. (Tabla 1 y Figura 1). Adems se identific otro pigmento: la gosipetina de coloracin de rosada a rojo, que no tiene relevancia alguna en la investigacin pero se mencionan ya que con ste se confirma la caracterizacin del extracto de la rosa de jamaica. Cabe mencionar que el estndar amarillo naftol no se logr separar, por lo que no aparece en el cromatograma (Figura 1), sin embargo esto no interfiere con los resultados ni en el anlisis de los mismos, debido a que este se utiliza para comparar los colorantes amarillos presentes en la rosa de jamaica, los cuales no tienen relevancia en este estudio. El estudio de estabilidad, en resumen, consisti en comparar la concentracin (del extracto de rosa de jamaica) expresada en porcentaje, contra el colorante artificial Rojo No.40, ambos sometidos a diferentes condiciones de temperatura y pH. Con esto se pretenda medir, por espectrofotometra ultravioleta-visible, la concentracin de las muestras y determinar el da en el cual una de ellas disminua su concentracin por debajo del 80% (da de corte) y al mismo tiempo observar cmo las variables de temperatura y pH afectaban el comportamiento tanto de la rosa de jamaica como del Rojo No. 40, con la finalidad de determinar su estabilidad a corto plazo, es importante mencionar que los anlisis se realizaron por duplicado con un intervalo de confianza al 95%.

36

El anlisis se dividi en varias secciones para una mejor comprensin de los resultados: a) Anlisis General de la Estabilidad. Las muestras estudiadas de rosa de jamaica a 30C y pH 4, 5 y 6; rosa de jamaica a 50C y pH 4 y 5; Rojo No. 40 a 30C y pH 4, 5 y 6; Rojo No. 40 a 50C y pH 4, 5 y 6, mantuvieron la concentracin por arriba del 80% de la concentracin inicial, siendo la muestra de rosa de jamaica a 50C y pH 6 la que disminuy su concentracin hasta un 78.58% al da 17 de observacin, da en el cual la tcnica indicaba finalizar la experimentacin. En todos los dems casos se mantiene dentro del rango de concentracin esperado, tanto de las muestras de rosa de jamaica como Rojo No. 40 expuestos a las mejores condiciones establecidas de temperatura y pH. b) Anlisis de Varianza. Los resultados obtenidos fueron analizados mediante el modelo estadstico ANOVA, por medio del cual se determin la mejor combinacin entre el colorante Rojo No. 40, temperatura y pH; as como entre la rosa de jamaica, temperatura y pH a las cuales presentaban mejor estabilidad. A su vez estos datos fueron tomados para realizar la regresin lineal y con esto determinar si exista diferencia significativa entre las muestras estudiadas. De lo anterior se determin entonces, que existe diferencia significativa entre los porcentajes de concentracin entre rosa de jamaica y Rojo No. 40 (p <0.00001). La rosa de jamaica es la que tiende a tener menor porcentaje de concentracin y mayor variabilidad. (Tabla 2-13)(Grficas 1-12). Tambin se estableci que existe diferencia significativa entre las concentraciones de las muestras sometidas a las distintas temperaturas (p<0.00001), siendo la variable temperatura de 30C en donde se obtiene mayor concentracin que a 50C. De las variables de pH, por medio del anlisis de varianza, se determin que existe diferencia significativa entre las concentraciones tanto de rosa de jamaica como del colorante artificial, sometidos a los tres niveles de pH medidos (p<0.00001). Con la prueba de la mnima diferencia de Fisher (MDF), se tiene que entre todos los valores de pH hay diferencia

37

significativa, pero esto puede deberse a la gran cantidad de datos, lo que hace que aunque los promedios sean muy cercanos, la prueba indica diferencia. El valor de pH que marca una diferencia significativa, comparado con los otros dos, es el pH 6, en el cual la concentracin es significativamente menor a las obtenidas con pH 4 y 5 (p<0.00001). (Grficas 16-18) Segn los porcentajes de concentracin se puede decir que el mejor pH, por su estabilidad o concentracin, es el pH 5. Adems de lo anterior, se observa que las combinaciones de los factores muestra- temperatura, muestra-pH, y muestra-temperaturapH, presentan diferencias significativas o interacciones (p<0.0001), con excepcin de la combinacin temperatura-pH que no presenta interaccin (p=0.7175). Analizando las combinaciones de los factores, ya mencionadas, se estableci que: a 50C la rosa de jamaica presenta menor estabilidad ya que los porcentajes de concentracin decaen significativamente (Grfica 13). De la combinacin colorante-pH, se observ que a pH 4 y 5 el comportamiento de ambos colorantes (rosa de jamaica y Rojo No. 40) es similar, pero a pH 6, la rosa de jamaica disminuye la concentracin significativamente (Grfica 14). Acerca de la combinacin colorante-temperatura-pH, se observ que a 30C el colorante artificial Rojo No. 40 no presenta muchos cambios en la estabilidad de la concentracin, pero la rosa de jamaica tiene mejor estabilidad a pH 5 y disminuye a pH 6. As mismo, a 50C la rosa de jamaica pierde estabilidad y sobre todo, a pH 6 en donde presenta la mxima diferencia, mientras que el colorante Rojo No. 40 no presenta diferencia significativa al cambiar las variables de pH y temperatura (Grfica 15). En conclusin, puede decirse que el mejor colorante es Rojo No. 40 a 30C a cualquier pH (4, 5 y 6) y que las condiciones ptimas para rosa de jamaica son tambin a 30C pero especficamente a pH 5. c) Mediciones Repetidas. Considerando que se midieron alcuotas de los colorantes bajos las diferentes condiciones de temperatura y pH a travs del tiempo, el anlisis se denomina medidas repetidas. Se incluye en el diseo y en anlisis como tal, para aislar la variacin debida a los

38

cambios entre das (variable tiempo) y as poder estimar mejor las variaciones debidas a los factores (temperatura y pH). El anlisis indica que existe diferencia significativa entre das (p<0.00001). Si bien es cierto que no interesa establecer qu das son diferentes, ya que, lo que interesa es conocer el da en el que al menos una de las muestras disminuya el 80% de concentracin inicial (da de corte), se puede observar el comportamiento de las respuestas a travs del tiempo, en donde se puede observar que el decaimiento es lineal y por lo tanto proporciona la base para el anlisis de regresin (Anexos). d) Anlisis de Regresin. Considerando las mejores condiciones de estabilidad derivadas del anlisis anterior, se presenta que, de conformidad con los das en que se espera tener 80% de concentracin, la rosa de jamaica es mejor, ya que ofrece mayor estabilidad, sin embargo, lo que ocurre es que la concentracin, en este caso, presenta mayor variacin, lo cual se refleja en el intervalo de confianza que es muy amplio (Grfica 16). Por otro lado, al observar el comportamiento del colorante Rojo No.40, se puede determinar que la mayor estabilidad se obtiene a pH 5 y 30C, con un intervalo de confianza de al 95% que indica que la concentracin disminuir entre los das 30.30 a 35.13, (Grfica 17, 18 y 19) por lo que podra considerarse este pH como el recomendado para este colorante al igual que en el caso de la rosa de jamaica. Si se colocan las cuatro lneas de regresin lineal (condiciones ptimas de rosa de jamaica y Rojo No. 40), en un solo grfico, se pueden observar las similitudes y diferencias entre el comportamiento de los cuatro sistemas (Grfica 17). En conclusin, una vez establecidas las mejores condiciones de temperatura y pH, la rosa de jamaica presenta una estabilidad similar a la que tiene el colorante artificial Rojo No. 40, por lo que puede ser utilizada como alternativa de consumo de este, por lo que se confirma la hiptesis que se estableci inicialmente.

39

10.

CONCLUSIONES

1. El pigmento principal, identificado por cromatografa en capa fina, se caracteriz por presentar una coloracin azul-violeta a un Rf entre 0.25 y 0.5, ste es el responsable de las coloraciones rojizas caractersticas de los clices de la rosa de jamaica y comnmente se conoce como hibiscina. 2. Las muestras estudiadas de rosa de jamaica a 30C y pH 4, 5 y 6; rosa de jamaica a 50C y pH 4 y 5; Rojo No. 40 a 30C y pH 4, 5 y 6; Rojo No. 40 a 50C y pH 4, 5 y 6, mantuvieron la concentracin por arriba del 80% de la concentracin inicial, siendo la muestra de rosa de jamaica a 50C y pH 6 la que disminuy su concentracin hasta un 78.58% al da 17 de observacin. 3. Existe diferencia significativa entre la concentracin del extracto de rosa de jamaica y Rojo No. 40 (p <0.00001), siendo la rosa de jamaica la que tiende a tener menor concentracin y mayor variabilidad. 4. Hay una diferencia significativa entre la concentracin de las muestras sometidas a las diferentes temperaturas (p<0.00001), siendo la variable temperatura de 30C en donde se obtiene mayor concentracin que a 50C. 5. Existe diferencia significativa entre la concentracin de las muestras en estudio, bajo las condiciones de pH (p<0.00001), siendo el valor de pH 6 el que marca una diferencia significativa, comparado con los otros dos, en el cual la concentracin es significativamente menor a las obtenidas con pH 4 y 5 (p<0.00001). 6. Segn la interaccin entre pH y la concentracin de las muestras el mejor pH, es el 5, tanto en la rosa de jamaica como en el colorante Rojo No.40.

40

7. Las combinaciones de los factores muestra-temperatura, muestra-pH, y muestratemperatura-pH, presentan diferencias significativas o interacciones (p<0.0001), con excepcin de la combinacin temperatura-pH que no presenta interaccin (p=0.7175). 8. El anlisis estadstico por medio del modelo ANOVA, determin que las condiciones ptimas de estabilidad para el colorante artificial Rojo No. 40 son a 30C a cualquier pH y para la rosa de jamaica son a 30C y pH 5. 9. Los colorantes presentes en la rosa de jamaica presentan una estabilidad similar a la que tiene el colorante artificial Rojo No. 40, por lo que puede ser utilizada como alternativa de consumo en sustitucin de ste, por lo que se confirma la hiptesis establecida.

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10. RECOMENDACIONES 1. Ampliar el estudio de estabilidad por medio de un anlisis a largo plazo, para determinar si existen cambios en la concentracin para los factores que no fueron afectados por las variables de pH y temperatura. 2. Estudiar la estabilidad de los colorantes de la rosa de jamaica ya implementados como excipientes en preparados farmacuticos o alimenticios y observar su comportamiento. 3. Analizar otros pigmentos presentes en la rosa de jamaica y establecer si estos pueden al mismo tiempo ser sustitutos de algn colorante artificial que contenga caractersticas similares en cuanto al color. 4. Estudiar la estabilidad de los colorantes de la rosa de jamaica comparados con otros colorantes artificiales como por ejemplo Rojo No.2, para observar si los pigmentos de la rosa de jamaica pueden tambin, ser sustitutos de estos. 5. Determinar las dosis txicas de los colorantes de la rosa de jamaica para establecer las cantidades mnimas y mximas que pueden ser consumidas si causar dao. 6. Debido al sabor fuertemente cido de la rosa de jamaica que puede afectar algunos principios activos o componentes de preparados farmacuticos, cosmticos o alimentos, es recomendable realizar estudios del comportamiento del mismo.

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12. ANEXOS

Tabla A Propiedades de las antocianidinas comunes

Antocianidina Pelargonidina Cianidina Peonidina Delfinidina Petunidina Malvidina Forestal 68 49 63 32 46 60 30 13 20 27 Frmico 33 Rf(x100) BAW 80 68 71 42 52 58 Color Visible Rojo Magenta Magenta Prpura Prpura Prpura mx, nm en
MeOH-HCl

530 535 532 546 543 542

Tabla B Propiedades de las antocianinas comunes

Antocianina Pelargonidin3-glucsido 3,5-diglucsido 5-glucsido Cianidin3-glucsido 3,5-glucsido 3-galactsido Malvidin3-glucsido 3-galactsido 3,5-diglucsido BAW 44 31 51 38 28 37 38 36 31 BuHCl 38 14 49 25 06 24 15 15 03 Rf(x100) HOAcHCl 35 45 57 42 40 26 29 29 61 1%HCl 14 23 18 07 16 07 06 06 34 mx, nm en
MeOH-HCl

506 504 513 523 522

534

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Tabla C Algunos ejemplos de antocianinas y su ocurrencia natural Nombre cientfico/Nombre comn/Ocurrencia

Allium cepa/cebolla/bulbos Cyphomandra betaceae/berenjena/cscara Citrus sinensis/naranja/cscara Ipomea batatas/camote/races Malus pumila/manzana/cscara Olea europea/aceituna/frutos Passiflora edulis/maracuy/frutos Prunus avium/cereza/frutos Sambucus nigra/saco/frutos Zea mays/maz morada/mazorca

Antocianidinas o Antocianinas presentes

Cy 3-glucsido, 3-laminaribiosido Cy, Pn, Dp 3- glucsido Cy y Dp 3-glucsido Cy y Pn 3-(dicafeil soforsido)-5-glucsido Cy 3-glucsido, 3-xilsido, 3-galactsido, 3- y 7-arabinsidos; libres y acilados Cy 3-glucsido Cy 3-glucsido Cy, Pn 3-glucsidos y 3-rutinsidos Cy 3(2-1-xilosilglucsido), sambucianina Cy, Pg y Pn 3-glucsidos, Cy 3-galactsido, libres y acilados

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Muestra de rosa de jamaica colectada en Jacaltenango, Huehuetenango e Identificada en la

Unidad de Investigacin Herbario

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Grfica A Curva de Calibracin utilizando estndar de Rojo No.40

Ecuacin utilizada para encontrar la concentracin de las muestras

y = a+bx
En donde: y = absorbancia x = concentracin a = 0.0287 b= 29.91

Por ejemplo: En el da 12 se midi las absorbancia de la rosa de jamaica (50C y pH 4) la cual fue de 0.488, la concentracin se calcula as:

0.488 = 0.0284 + 29.91x 0.488-0.0284 = x 29.91 0.0154 = x

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Grfica B Comportamiento de las respuestas a travs del tiempo por medio de la cual se determin (por sus caractersticas) que el decaimiento es lineal y por lo tanto da base para el anlisis de regresin
Concentracin 100

90

80

70 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Figura 1 Antocianidinas presentes en la naturaleza

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Figura 2 Estructura qumica del pigmento rojizo caracterstico de la rosa de jamaica

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