CITOSCHELETUL

Filamentele de actin (microfilamentele) Microtubulii Filamentele intermediare

Citoscheletul este un sistem complex de filamente de natur proteic, localizat n citoplasm, ce particip la: - organizarea n spaiu a componentelor celulare - realizarea funciilor mecanice ale celulei
1931 - Paul Wintrebert (zoolog i embriolog francez) a introdus conceptul i termenul de citoschelet
(cytosquelette, lb. francez)

Filamente de actin (rou) Microtubuli (verde)

Dispoziia intracelular a filamentelor de actin i a microtubulilor (celul n cultur)

Clasificarea filamentelor citoscheletului

Tipul de filamente
Microfilamente (filamente de actin) Filamente intermediare

Diametrul (nm)
7

Structura filamentului
Elicoidal, din monomeri de actin

Polaritatea filamentului
Polaritate structural, cu extremiti neechivalente Lipsit de polaritate structural, cu extremiti echivalente

Subunitile proteice
Actin

10

Elicoidal, format prin contacte multiple (contacte laterale i la capete ale dimerilor i tetramerilor)

Vimentin Desmin Proteina acid fibrilar glial Keratine Proteine ale neurofilamentelor (NF) Lamine A, B i C Tubuline (tip i )

Microtubuli

23

Elicoidal tubular, format din subuniti de - i -tubulin dispuse alternativ

Polaritate structural, cu extremiti neechivalente

Proteinele accesorii
De filamentele citoscheletului se pot asocia un numr mare de proteine accesorii care permit filamentelor s realizeze funcii distincte n diferite regiuni ale unei celule i n diferite etape ale ciclului celular. Proteinele accesorii se fixeaz de elementele citoscheletului i ndeplinesc diverse roluri: (i) Regleaz echilibrul dintre subunitile libere i cele asamblate n filamente (ii) Modific cinetica proceselor de asamblaredezasamblare (iii) Mediaz fixarea filamentelor ntre ele sau de alte structuri celulare (iv) Induc siturile de asamblare a unor noi filamente

Filamentele de actin
Actina este o protein prezent n toate celulele eucariote Actina este una dintre proteinele cele mai bine conservate pe parcursul evoluiei n celulele mamiferelor exist ase izoforme de actin codificate de gene distincte, grupate n trei clase (, i ). Izoformele de actin prezint diferene ale secvenei de aminoacizi cu preponderen la extremitatea amino-terminal. Izoformele actinei din celulele organismului uman sunt: izoforma -scheletal, izoforma -cardiac, izoforma vascular, izoforma -enteric din musculatura neted a viscerelor, izoformele -citoplasmatic i -citoplasmatic din celulele nemusculare. n celule actina poate exista fie n form monomeric, numit actin-G (actin globular), fie n form polimerizat, numit actin-F (actin asamblat n filamente).

Actina n form monomeric (actina-G)

Actina monomeric este o protein globular de 42 kDa (375-377 aa) Conformaia actinei este asemntoare unei scoici cu dou valve

Actina-G fixeaz o molecul de ATP i un cation divalent (Ca2+ sau Mg2+) n spaiul interior delimitat de cele dou domenii structurale.

Filamentele de actin polimeri de actin F

n imaginile de microscopie electronic filamentele de actin apar sub forma unor fibre cu diametrul de circa 7 nm, n care subunitile de actin au o dispoziie helicoidal, ce se repet periodic la fiecare 37 nm. Cele dou extremiti ale filementelor de actin nu sunt echivalente: captul plus (cu cretere rapid) i captul minus (cu cretere lent)

Structura monomerului de actin (actina G) i a actinei F

Structura actinei n form monomeric. Molecula prezint 4 subdomenii, iar n cavitatea central se fixeaz ATP sau ADP i un cation divalent Ca2+ sau Mg2+. Diferitele pri ale catenei polipetidice sunt reprezentate cu culori diferite.

Structura actinei-F prezentnd poziia relativ a 3 monomeri.

Dispoziia filamentelor de actin n celulele animale

filamentele de actin sunt dispuse sub membrana plasmatic.
Fibroblaste de embrion de oarece Celule endoteliale umane

Filamentele de actin pot forma numeroase tipuri de prelungiri ale suprafeei celulare: lamellipodia, filopodia, microspiculi (precursori ai filopodia), stereocili, microvili.

Lamellipodium

Actina organizat sub form de filamente (polimerizarea actinei)

Prin polimerizarea actinei se formeaz att structuri labile, tranzitorii, ct i structuri stabile cu caracter permanent. Structuri stabile formate din filamente de actin sunt microvilii din celulele epiteliale intestinale, stereocilii din celulele urechii interne i aparatul contractil din celulele musculare. Structurile labile de actin, dinamice, sunt reprezentate de lamelipodia i filopodia, implicate n locomoia celular i n chemotaxie. i inelul contractil este o structur temporar cu rol n citokinez.

Asamblarea actinei-G sub form de polimeri de actin-F

Mecanismul de asamblare sub form de

filamente al subunitilor de actin-G

Polimerizarea actinei este nsoit de hidroliza ATP i de modificri conformaionale ale moleculelor de actin.

Treadmilling
Filamentele de actin prezint in vitro un comportament dinamic cunoscut sub numele de band rulant (engl. treadmilling), ce are loc atunci cnd moleculele de actin sunt adugate continuu la extremitatea plus a filamentului i sunt eliberate cu aceeai vitez la extremitatea minus, astfel nct lungimea filamentului rmne nemodificat.

Aciunea toxinelor asupra organizrii filamentelor de actin: - Latrunculina (extras din spongierul marin Latrunculia magnifica), - Faloidina (izolat din ciuperca otrvitoare Amanita phalloides), - Citocalazinele (izolate din fungi).

Latrunculia magnifica

latrunculina

faloidina

Latrunculina se fixeaz de monomerii de actin i blocheaz asamblarea lor n filamente (efectul net este depolimerizarea filamentelor de actin). Faloidina se fixeaz de filamentele de actin i nu permite depolimerizarea (efectul const n amplificarea polimerizrii actinei). Citocalazinele se fixeaz de extremitatea plus a microfilamentelor blocnd polimerizarea.

Proteinele ce controleaz polimerizarea actinei: - Complexul ARP

(actin-related proteins) Arp2, Arp3, i 5 proteine accesorii NPF (nucleation promoting factor)

Forminele - controleaz formarea mnunchiurilor

paralele de filamente de actin.

Profilina - protein ce se leag de actina monomeric i particip la controlul polimerizrii actinei ca rspuns la semnale din mediul extracelular
Profilina se fixeaz de monomerii de actin blocnd acea regiune a moleculei de actin ce se asociaz n mod normal cu extremitatea minus a filamentelor, dar lsnd expus regiunea monomerului ce interacioneaz cu extremitatea plus a filamentelor. Astfel, complexul actin-profilin se poate aduga rapid la extremitatea plus a filamentului.

Timozina inhib polimerizarea actinei (efect invers fa de profilin) Cofilina (denumire alternativ ADF, actin depolymerizing factor) se fixeaz strns de-a lungul filamentului de actin, fornd rsucirea strns a acestuia. Aceast rsucire suplimentar genereaz un stres mecanic ce labilizeaz contactele dintre subunitile de actin, favoriznd disocierea filamentului.

Structura cofilinei

Filament de actin decorat cu cofilin

Concluzie
Celulele dispun de diverse mecanisme prin care pot stoca actina monomeric i prin care pot utiliza acest stoc n caz de necesitate.

Filamentele de actin din fasciculele paralele, fasciculele contractile i reelele similare gelurilor identificate n filopodia, fibrele de stres i corticala celular.

Organizarea structural a proteinelor de legare ncruciat a filamentelor de actin sub form de fascicule sau reele
- Proteine ce particip la formarea fasciculelor de actin: fimbrina, -actinina i vilina. - Aranjamentul filamentelor de actin sub form de reea este determinat de filamin.

-Actinina leag transversal filamentele de actin determinnd o spaiere lejer, caracteristic fasciculelor contractile. Fimbrina leag transversal filamentele de actin ntr-un aranjament compact, caracteristic fasciculelor paralele.

14 nm
30 nm

Filamina organizeaz filamentele de actin sub form de reea lax cu consisten de gel vscos. Dimerul de filamin are forma literei V i se caracterizeaz printr-o mare flexibilitate.

Spectrina
Spectrina este o protein flexibil alctuit din 4 lanuri polipeptidice (2 lanuri de -spectrin i 2 lanuri de -spectrin). n eritrocite spectrina se asociaz cu filamente scurte de actin, rezultnd o reea bidimensional de spectrin-actin ce se ataeaz de membrana plasmatic, pe faa citoplasmatic i care este responsabil pentru forma de disc biconcav a eritocitelor.

Sferocitoza ereditar
Defectele moleculare ale spectrinei constituie cauza sferocitozei (boal ereditar caracterizat prin prezena unor eritrocite cu form sferic; sferocitele sunt mai puin deformabile dect eritrocitele normale, biconcave, i sunt vulnerabile la sechestrarea splenic i susceptibile de a fi distruse de ctre macrofage). Manifestrile clinice sunt: anemia, splenomegalia i icterul.

Sferocite

Gelsolina protein de fragmentare a filamentelor de actin ca rspuns la creterea concentraiei ionilor de Ca2+ n citosol. Gelsolina cliveaz filamentele de actin i se leag la extremitatea plus a fragmentelor rezultate, formnd o bonet. Gelsolina mediaz lichefierea cortexului celular pentru a permite fuziunea membranelor.
Gelsolina legat de actin

Domeniile structurale ale gelsolinei

Interaciunea actinei cu miozina

Proprietile contractile ale anumitor filamente de actin sunt determinate de prezena miozinei (protein cu funcie motorie). La EK au fost identificate 18 tipuri de miozine aparinnd aceleiai superfamilii de proteine. Toate miozinele sunt proteine motorii ce au capacitatea de a transforma energia chimic n lucru mecanic, deplasndu-se de-a lungul filamentelor de actin de la extremitatea minus spre extremitatea plus (cu excepia miozinei VI care se deplaseaz n sens invers).

Miozina II (miozina convenional)

Miozina II este un hexamer: 2 lanuri polipeptidice grele (200 kDa) 4 lanuri polipeptidice uoare (2 l. de 18 kDa i 2 l. de 20 kDa)

Domeniul motor capul

Domeniul flexibil cu situri de legare a lanurilor uoare eseniale (ELC) i reglatoare (RLC) gtul

Domeniul cu structur -helicoidal extins coada

Rolul miozinei II n contracia muscular i organizarea structural a sarcomerului

Miozina II din celulele nemusculare

Fibrele de stres
Contacte focale

Celule endoteliale arteriale Fibroblast

Inelul contractil
se formeaz n timpul citokinezei.

Evidenierea inelului contractil n timpul citokinezei cu ajutorul anticorpilor marcai fluorescent (anti-actin i anti-miozin II).

Centurile de adeziune
aparin complexelor joncionale de ancorare intercelular. n celulele epiteliale polarizate se formeaz n apropierea suprafeei apicale. Contracia lor poate determina plierea stratului celular, fenomen important n morfogeneza tisular.

Tipuri de miozine: miozina II i miozinele neconvenionale

Toate miozinele prezint un domeniu motor. Diferitele tipuri de miozine se deosebesc prin dimensiunea domeniilor cu structur -helicoidal ce formeaz cozile prin intermediul crora interacioneaz specific cu alte molecule i componente celulare.

Miozina II i miozinele neconvenionale

Miozina I are un singur lan greu cu un singur domeniu globular cu funcie motorie.

Miozina V are dou lanuri grele, similar miozinei II, dar cu un domeniu reglator (gtul) de dimensiuni mari, ce prezint 6 situri de legare pentru lanurile uoare.

Roluri ale miozinelor n celulele vertebratelor

Miozinele I, V i VI se leag de membrane i de complexe macromoleculare prin intermediul domeniilor helicoidale (cozilor). Miozinele I i V se leag de veziculele desprinse din aparatul Golgi. Miozina VI mediaz transportul veziculelor de endocitoz.

Microvilii
+
Microvili ai celulelor epiteliale intestinale

MICROTUBULII

Organizarea structural a microtubulilor

Microtubulii sunt componente ale citoscheletului implicate n diverse procese celulare dinamice: migrarea celular, micarea cililor i flagelilor, segregarea cromozomilor n timpul mitozei, transportul intracelular al veziculelor i organitelor, secreie, endocitoz, stabilirea formei i polaritii celulelor. Microtubulii sunt structuri proteice tubulare alctuite din molecule de tubulin. Tubulina este un heterodimer compus din dou subuniti globulare neidentice, nrudite (-tubulin i -tubulin) Microtubulii sunt structuri cilindrice cu diametrul exterior de 24 nm i diametrul interior de 14 nm. Asamblarea microtubulilor se realizeaz prin alinierea cap la coad a dimerilor sub form de protofilamente. Prin asocierea lateral a 13 protofilamente paralele se formeaz un microtubul. Microtubulii prezint polaritate structural dublat de o polaritate funcional, ca rezultat al dispunerii alternative a subunitilor: MT au o extremitate (+) cu cretere rapid i o extremitate (-) cu cretere lent.

Organizarea structural i polaritatea microtubulilor

Comportamentul dinamic al microtubulilor

n funcie de stabilitatea lor, microtubulii sunt de dou tipuri: MT axonemali (sunt relativ stabili i fac parte din structura axonemei cililor i flagelilor) i MT citoplasmatici (sunt structuri labile, ca de exemplu fusul de diviziune mitotic). Cinetica asamblrii microtubulilor este descris grafic de o curb cu aspect sigmoidal i urmeaz aceleai etape ca i polimerizarea microfilamentelor: faza de lag, faza de elongare i faza staionar. Microtubulii se extind din regiunea perinuclear numit centrozom, reprezentnd centrul major de organizarea a microtubulilor n celulele animale. n celulele cu cili i flageli rolul de centru de organizare a microtubulilor este ndeplinit de corpusculul bazal al axonemei. Microtubulii prezint instabilitate dinamic, suferind modificri rapide prin asamblare i dezasamblare.

Fusul de diviziune mitotic (evideniat

prin imunofluorescen i contrast de faz)

Substane antimitotice intervin n transferul subunitilor de tubulin dintre microtubului i stocul de tubulin liber.

colchicina

Colchicum autumnale

Colchicina i colcemidul se leag de tubulin i mpiedic asamblarea sub form de microtubuli. Expunerea la colchicin sau colcemid determin distrugerea rapid a fusului de diviziune. Distrugerea fusului de diviziune omoar preferenial celulele anormale, tumorale. Vinblastina i vincristina, substane antimitotice cu efect similar colchicinei i colcemidului sunt utilizate n chimioterapia unor forme de cancer.

Efectul medicamentului TAXOL asupra organizrii microtubulilor se leag strns de

microtubuli, stabilizndu-i i mpiedicnd depolimerizarea lor. Taxolul oprete diviziunea celular (agent chimioterapeutic).

Taxus brevifolia

Centrii de organizare ai microtubulilor

n celule, captul (+) al microtubulilor (cu cretere rapid), se extinde din anumite structuri ce funcioneaz ca situri de nucleaie, numite i centrii de organizare ai microtubulilor (MTOC microtubule organizing center), reprezentate de: centrozomi polii fusului de diviziune corpusculii bazali ai cililor

Fusul de diviziune mitotic n celula animal: MT astrali, polari i kinetocorici.

Cei doi centrozomi (polii fusului de diviziune) organizeaz microtubulii astrali, polari i kinetocorici.

Instabilitatea dinamic a microtubulilor

necesit un aport de energie furnizat de hidroliza GTP care modific echilibrul polimerizare/depolimerizare.

Rolul GTP n procesul de polimerizare/depolimerizare al microtubulilor. Hidroliza GTP favorizeaz depolimerizarea, slbind legturile dintre subunitile de tubulin asamblate n microtubuli.

Modificrile post-translaionale ale tubulinei

Modificrile post-translaionale constituie semnale chimice pe suprafaa microtubulilor ce favorizeaz interaciunea lor cu alte componente citoplasmatice.
Principalele tipuri de modificri post-translaionale ale tubulinei sunt acetilare i detirozinarea. Acetilarea i detirozinarea sunt reacii enzimatice lente ce au loc numai la nivelul microtubulilor (nu i la nivelul tubulinei libere). Cu ct microtubulii rmn n stare polimerizat o perioad mai ndelungat, cu att va fi mai mare gradul de acetilare i detirozinare. Dup dezasamblarea microtubulilor reaciile se desfoar n sens invers.

Proteine asociate de microtubuli (MAP, microtubule associated proteins)

Proteine cu funcii dinamice asociate de microtubuli (ATPaze dependente de microtubuli): KINEZINA i proteinele nrudite cu kinezina (KRP, kinesin related proteins) Dineinele:
Dineinele citoplasmatice Dineinele axonemale

KINEZINA-1 (kinezina convenional)

n neuroni mediaz transportul anterograd (dinspre corpul celular spre terminaia axonului). Prin transport anterograd sunt dirijate spre jonciunile sinaptice veziculele cu neurotransmitori.

Deplasarea kinezinei de-a lungul microtubulilor

Dineina citoplasmatic - este o MAP dinamic

ce realizeaz transportul componentelor celulare spre captul minus al microtubulilor, n sens invers fa de kinezin.
Dineina citoplasmatic este implicat i n mitoz, participnd la asamblarea i orientarea fusului de diviziune, precum i la capturarea i micarea cromozomilor.

Dineina citoplasmatic este un complex proteic alctuit din 2 lanuri grele i numeroase lanuri intermediare i lanuri uoare.

Organizarea structural a proteinelor cu funcii motorii care se deplaseaz de-a lungul microfilamentelor (miozina) sau al microtubulilor (kinezina i dineina)

Organizarea microtubulilor n fibroblaste i neuroni

Axonema cililor i flagelilor: aranjamentul 9+2

Corpusculul bazal al axonemei cililor i flagelilor

Sindromul Kartagener (diskinezie ciliar major)

Manifestri clinice: deficien respiratorie, pierderea auzului, infertilitate masculin, dextrocardie. "situs viscerum inversus"
Organele interne au o poziie invers (n oglind fa de poziia normal). Diagnosticul se bazeaz pe examenul radiologic i examinarea ultrastructurii cililor din celulele epiteliale nazale sau ale traheei.

Ultrastructura axonemei din flagelul spermatozoizilor

Diagnosticarea diskineziilor ciliare

Poziionarea normal a inimii

Poziionarea n oglind (situs inversus) a inimii, ficatului, splinei i stomacului: (imagini de tomografie computerizat) Dextrocardie (radiografie toracic cu raze X)

FILAMENTELE INTERMEDIARE
Filamente de keratin

Principalele tipuri de filamente intermediare

Clasificarea filamentelor intermediare n funcie de caracteristicile structurale (secvena de aminoacizi) i distribuia specific de tipul de esut

Lynne Chang & Robert D. Goldman Nature Reviews Molecular Cell Biology 5, 601-613 (August 2004)

Structura i asamblarea filamentelor intermediare

Asamblarea filamentelor intermediare

2 nm

4 nm

10 nm

Tipuri de filamente intermediare:

Filamente de keratin din celule epiteliale (imagine stnga) Neurofilamente din axonul neuronului (A) Filamente gliale din celule gliale (B) Seciune transversal prin axon relavnd aranjamentul regulat al neurofilamentelor (C)

Epidermoliza buloas
Reeaua de filamente intermediare a keratinocitelor bazale este dezorganizat, celulele fiind extrem de sensibile la stresul mecanic. Epiderma persoanelor bolnave este extrem de friabil, observndu-se dezlipirea keratinocitelor bazale i apariia de vezicule la locurile de stres tegumentar.

Copil butterfly n vrst de 5 ani