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Revista Mdica del Hospital Nacional de Nios Dr. Carlos Senz Herrera
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Rev. md. Hosp. Nac. Nios (Costa Rica) v.34 supl. San Jos 1999
Pruebas de sensibilidad antimicrobiana Mtodologa de laboratorio

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Dr. Marco Luis Herrera*

Consideraciones Generales La prueba de sensibilidad antimicrobiana es una de las tantas armas con las que contamos en el laboratorio para ayudar a los profesionales en medicina controlar los procesos infecciosos que se desarrolla en los pacientes(4).

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Pero para poder desarrollar todo el potencial con que se cuenta hay que cumplir con un requisito fundamental: es necesario lograr el aislamiento del agente productor del cuadro clnico mediante los cultivos correspondientes. Hay un axioma que no pierde actualidad y sobre el que es indispensable insistir: Primero cultivar y luego medicar. Antes de medicar (antibiticos) a un paciente, asegrese de que ya se hayan recolectado las muestras para realizar los cultivos que requiere un buen diagnstico. Esto asegurar hasta un mximo las posibilidades de aislar el agente etiolgico. Contando ya con dicho agente el laboratorio puede hacer uso de las diferentes tcnicas que se han desarrollado para guiar de la mejor manera posible al mdico, en la escogencia del antibitico a emplear en el control del proceso infeccioso. Como un comentario adicional, hay que recordar que muchas veces, lo que se observa in vitro no correspondiente a lo observado in vivo, razn por la cual, los seores clnicos deben poner especial atencin en el seguimiento clnico de su paciente. La no concordancia entre los hallazgos en el laboratorio y la respuesta del paciente a la terapia antimicrobiana, tiene diferentes explicaciones, algunas de las cuales tienen relacin con el comportamiento de los microorganismos y otras con el comportamiento individual de cada paciente. Un ejemplo para el primer caso es la produccin en el paciente de enzimas inducidas durante el curso de una terapia antimicrobiana, enzimas que tienen la propiedad de inactivar el antibitico slo en el paciente(9). Por otra parte, siempre es conveniente revisar si realmente el paciente est ingiriendo el antibitico como corresponde, si est siendo administrado en el plazo y en la concentracin adecuada para ese paciente, sin olvidar la idiosincracia del mismo. La razn fundamental de una prueba de sensibilidad es la de realizar una prediccin a travs de una prueba in vitro, observar la respuesta del paciente a un determinado antibitico, la evolucin de la infeccin y detectar una resistencia relevante del organismo que est causando este proceso infeccioso(4). Hay an muchos agentes microbianos para los cuales la escogencia de una terapia antimicrobiana contina siendo emprica, porque estos agentes no han desarrollado resistencia contra los antibiticos(1). Por esta razn, la prueba de sensibilidad adquiere una mayor importancia para algunas especies bacterianas que no tienen una sensibilidad predecible. Ejemplos claros de este ltimo tipo de microorganismos son: Staphylococcus sp., Enterococcus sp., Pseudomonas sp. y los miembros de la familia Enterobacteriaceae(4). Otros organismos donde la prueba de sensibilidad, sobre todo en los ltimos aos, ha adquirido una gran importancia son: Streptococus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae y Mycobacterium tuberculosis(4). Para efectuar las pruebas de sensibilidad, se cuenta con los siguientes mtodos(4). A. B. C. D. Difusin en agar (Tcnica de Bauer & Kirby) Dilucin en agar Macrodilucin en caldo Microdilucin en caldo

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E. F. G.

Epsilon test (E test) Mtodos aumatizados Pruebas especiales.

Sin que importe el mtodo a emplear, hay tres facetas o pasos que se deben considerar: el medio de cultivo a emplear, el antibitico a utilizar y la cepa bacteriana a probar. Cualquiera que sea el mtodo hay que controlar cada una de estas tres variables y cada una de ellas es importante a su manera. Vamos a discutir en primer lugar lo concerniente al medio de cultivo. Segn el mtodo a emplear y segn el agente a estudiar, hay varios medios de cultivo que se pueden utilizar. El ms conocido es el Meller-Hinton ya sea en agar o en caldo, el cual se emplea en los mtodos de difusin y de dilucin enagar; adems, el reforzado con sangre de carnero al 5%, para la deteccin de la sensibilidad del Streptococus pneumoniae (1). Otro medio de cultivo usado en especial para la prueba de sensibilidad del Haemophilus influenzae es el HTM (Haemophilus Test Media). Para la Neisseria gonorrhoeae, puede utilizarse el medio de cultivo conocido como agar chocolate con una base de GC y enriquecido con Isovitalex al 2%(1). Todos estos medios de cultivo deben ser preparados de la mejor manera posible, ajustando el pH, y asegurndose de que la concentracin del agar sea la correcta. En especial, para la tcnica de la difusin en agar, estos parmetros deben ser an ms claramente controlados. Un agar muy suave, puede producir falsa sensibilidad y a su vez, un agar muy duro, puede producir una falsa resistencia, al incidir en un cambio en la velocidad y distancia de la difunsin del antibitico(16). Tambin cambios en el pH, pueden producir falsa resistencia o falsa sensibilidad al incidir en la polaridad de los antibiticos. A la hora de preparar el medio de cultivo, este pH debe ser correctamente regulado. Otro punto de gran importancia es la profundidad del agar, la cual debe ser exactamente de 4 mm. Un agar delgado, permite una mejor difusin de los antibiticos produciendo una falsa sensibilidad, pero tambin un agar con ms de 4 mm de profundidad puede producir una disminucin en la migracin (difusin) del antibitico con la consiguiente falsa resistencia. Adems, los medios de cultivo deben ser lo ms frescos posible, con no ms de 7 das de preparados y siempre deben ser guardados en bolsas plsticas selladas y a 4C(16). Cada vez que se va a preparar el medio de cultivo, hay que asegurarse que el polvo est en buenas condiciones, sin cambios de color y de consistencia y por supuesto, que sea polvo (no hidratado). En cuanto al antibitico, las consideraciones son las siguientes: Podemos tener cuatro tipos de posibilidades, discos de papel impreganados con una concentracin conocida del antibitico, pastillas con una concentracin conocida del antibitico, preparaciones farmacuticas del antibitico o tiras de plstico con una matriz propia y una gradiente decreciente del antibitico determinado. Lo importante es que estas diferentes presentaciones del antibitico estn en la mejor condicin posible, que se respete la cadena de fro, que no se humedezcan, y que realmente contengan la concentracin del antibitico que dice tener(16). En cuanto a la cepa bacteriana, es indispensable que sea fresca (un periodo de incubacin no mayor de 24 horas) y que haya sido crecida en un medio de cultivo no inhibitorio(16). Siempre se debe ajustar la concentracin del inculo de la cepa a probar. Esto significa que debemos estandarizar dicho inculo(16). Esta estandarizacin puede realizarse utilizando el estndar de McFarlane o utilizando un nefelmetro. En ambos caos, la estandarizacin se hace hasta el estndar 0,5 de McFarlane(16). Es conveniente, cada cierto tiempo, revisar el inculo, haciendo un plateo y un conteo colonial con la finalidad de asegurarse de que se est preparando correctamente(16). Para la preparacin del inculo lo ms recomendable es usar aguar destilada estril; tambin puede usarse solucin salina al 0,4% o un caldo nutritivo(1, 16). A-Disfusin en agar (Tcnica de Bauer & Kirby) La tcnica de difusin en agar(16), es cualitativa y sus resultados se pueden interpretar nicamente como sensible, intermedio o resistente, y est diseada especficamente para bacterias de crecimiento rpido domo los Staphylococcus sp. O los integrantes de la familia Enterobacteriaceae. Esta tcnica, el inculo bacteriano llevado a una concentracin igual a la del estndar 0,5 de McFarlane, se aplica sobre la superficie de una placa seca de agar Meller-Hinton que tenga un pH entre 7, 2 y 7,4 medido a temperatura ambiente y una vez solidificado el medio de cultivo. La cepa se debe rayar sobre la superficie del medio de solidificado el medio de cultivo. La cepa se debe rayar sobre la superficie del medio de forma tal que se logre un crecimiento confluente(16). Una vez realizado esto, en un plazo no mayor de 15 minutos, se procede a colocar los discos o las pastillas con el antibitico. Si se emplean placas de petri de 100 mm de dimetro, el nmero mximo de discos a colocar es de 5(1,16). Luego, la placa se incuba a 35C en aire ambiente y por un periodo no mayor a las 18 horas excepto para los aislamientos de Staphylococus sp y Enterococcus sp, para los cuales se recomienda una incubacin de 24 horas, principalmente para lograr una mejor deteccin de la resistencia a la oxacilina y a la vancomicina(16). Cada plato es observado en una luz indirecta y cada halo de inhibicin es medido utilizando un caliper o en su defecto una regla graduada en la forma adecuada. En el caso de que no se presente un halo, no se debe reportar Omm, se debe reportar 6 mm, ya que ese es el dimetro del disco.

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Los dimetros alrededor de cada disco son medidos y su interpretacin se basa en guas publicadas cada cierto tiempo, por la NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) y el organismo es reportado como sensible, intermedio o resistente al antibitico testado(1, 4, 7, 16). Cada antibitico tiene su halo de inhibicin especfico y ste depende del tamao de la molcula del antibitico y su polaridad; de esta manera, un antibitico con un peso molecular bajo como la penicilina, tendr mucha capacidad para migrar, por lo tanto su halo, en el caso de una cepa sensible tendr un dimetro muy amplio. En el caso de la vancomicina, que tiene una molcula muy grande y muy hidrofbica, su halo de inhibicin ser muy pequeo. De esta manera, no se puede afirmar, que para una cepa determinada, sta es ms sensible a la penicilina que a la vancomicina, slo porque el primero tenga un halo de inhibicin mucho mayor(16). La tcnica de difucin en agar, presenta varias ventajas como: a. b. c. d. e. es fcil de efectuar y de gran reproducibilidad bajo precio no requiere equipo especial sus resultados son fcilmente interpretados por los clnicos es muy flexible a la hora de escoger los antibiticos a probar(16).

Dentro de sus desventajas est el hecho de que brinda slo informacin cualitativa. Otra desvetaja y la ms importante, es que esta tcnica debe ser modificada para poderla emplear en organismos fastidiosos o de crecimiento lento(1, 16). Organismos con Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoecae, Streptococcus pneumoniae y Moraxella catarrhalis, necesitan de una tcnica de difusin modifica, modificacin que se hace principalmente en el periodo de incubacin, en el medio de cultivo a emplear, en la atmsfera de incubacin y en la preparacin del inculo(1). Para Haemophilus influenzae, lo recomendado es poner a crecer al organismo en un agar chocolate suplementado, preparar el inculo en un caldo de Meller-Hinton o solucin salina estril al 0,9%, realizar la prueba de sensibilidad sobre el agar HTM e incubarlo a 35C por 16 a 18 horas en una atmsfera de 5 a 7% de CO2(1). Para Neisseria gonorrhoecae se debe utilizar agar base GC suplementado(4) y para Streptococcus pneumoniae agar sangre al 5% y que tenga Meller-Hinton como base. Para ambos, la incubacin debe ser un poco ms prolongada que para H. Influenzae (20 a 24 horas), manteniendo el resto de condiciones igual (35C y 5 a 7% de CO2)(1). Para estos agentes fastidiosos, existen guas propias de la NCCLS que se emplean para conocer si las cepas se reportan como sensible, intermedio o resistente(7). En especial, para el caso del Streptococcus pneumoniae, lo recomendado es el empleo de un disco de oxacilina de 1 ug de potencia. Una vez incubado por 24 horas, si el halo encontrado es menor de 20 mm, la cepa se considera resistente y debe ser confirmado realizando una prueba ms especfica que nos informe hasta dnde llega esa concentracin(1,16). Para esto se hace una CMI, ya sea por microtitulacin o por la tcnica del E test(1, 8). Por el contrario, si el halo de inhibicin es mayor de 20 mm, se considera que la cepa es sensible a la penicilina, con una concentracin mnima inhibidoria menor de 0,006 ug/ml(1). B-Mtodo de Dilucin en agar Siendo la tcnica de difusin en agar nicamente cualitativa, y teniendo en mente que en muchas oportunidades clnicas se hace necesario conocer con exactitud qu concentracin de antibitico es la necesaria para lograr controlar un proceso infeccioso dado, es evidente la necesidad de contar con metodologa que solvente ese problema. Se han desarrollado varios mtodos en este campo como son las tcnicas de la dilucin en agar, la microtitulacin y el E test (16). En stas lo que se pretende es hacer un gradiente decreciente de la concentracin de un antibitico dado y probarlo contra un inculo bacteriano estandarizado. Al igual que la tcnica de difusin, en las de dilucin, hay que controlar el medio de cultivo, el inculo bacteriano y el antibitico. De este tipo de tcnicas podemos mencionar tres: la dilucin es agar, la dilucin en tubo y la microtitulacin. La dilucin en tubo sigue siendo el estndar dorado de las pruebas de sensibilidad, o sea, es la tcnica de referencia, aun cuando, ante todo presenta el problema de la contaminacin y la dificultad para detectarla.(16) En la tcnica de la dilucin en agar, se preparan tubos con la concentracin definida de antibitico y se le agrega a cada tubo una cantidad conocida del agar Meller-Hinton, este tubo se homogeniza y se chorrea en una placa de Petri vaca con lo que se logra una placa de agar Meller-Hinton con el antibitico diluido a una concentracin determinada(16). Generalmente se inicia a una concentracin de 128 ug/ml y se hacen diluciones dobles hasta obtener el gradiente decreciente en la concentracin de antibitico (64; 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,06 ug de droga activa)(16). La escogencia de la concentracin en la que se inicia el gradiente, depende del antibitico y del tipo de cepa a probar. Para inocular el medio de cultivo, se emplea un inoculador conocido como el inoculador de Steer. Este es una placa de metal de 32 pozos y una lmina de metal con 32 proyecciones que toman, cada una, 20 ul del inculo estandarizado del agente y que se coloca sobre la superficie del agar con antibiticos. Adicional a esto, se inocula una placa de Meller-Hinton sin antibitico, que sirve como control positivo de crecimiento. La placa se incuba a 35C por 18 a 24 horas y se revisa el crecimiento, siempre contra el control positivo. Si la cepa logra crecer en la superficie del medio de cultivo, se reporta como resistente a esa concentracin del antibitico. Si, por el contrario, no crece, se reporta como sensible a esa concentracin de antibitico.

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Con esta tcnica, se puede obtener la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI), la que se define como la mnima concentracin de antibitico que inhibe el crecimiento de una cepa bacteriana determinada(16). Preparar toda una gradiente de medios de cultivo con una concentracin decreciente de antibitico, hace que esta tcnica sea muy engorrosa por lo que en realidad se utilizan slo dos diluciones, una arriba del punto de quiebra del antibitico y otra debajo de este valor. El punto de quiebra es un valor matemtico, que expresa un punto o concentracin arriba del cual la cepa se debe interpretar como resistente al antibitico(16). Basndose en este criterio, al escogerse dos concentraciones, una abajo y otra arriba del punto de quiebra, si la cepa crece en las dos concentraciones es resistente, si crece slo en la concentracin bajo el punto de quiebra, la cepa es intermedia y sensible si no crece en ninguna. A un utilizando slo dos concentraciones, esta tcnica exige mucho trabajo tcnico y es lenta para la resultados; por eso se ha empleado otra tcnica derivada de sta: la microtitulacin(16). C-Macrotitulacin en tubo Esta tcnica se deriva de la anterior, pero no se utiliza por la cantidad de material que emplea, y porque presenta el grave problema de la dificultad para detectar contaminaciones del medio de cultivo, lo que podra producir una falsa resistencia. Sin embargo, la tcnica que se usa es la misma de la microdilucin y la interpretacin es la misma tambin(16). D-Microtitulacin Aqu empleamos unas placas plsticas, estriles, con tapa, de 96 pozos y un fondo en U(16). Cada placa permite realizar una CMI de un antibitico a ocho cepas diferentes, o una CMI de una cepa contra ocho diferentes antibiticos. El medio de cultivo empleado es Meller-Hinton en caldo o el medio caldo HTM, si la cepa a estudiar es un Haemophilus sp. (16). La cepa se prepara en las mismas condiciones de turbidez, pureza y crecimiento de todas las pruebas de sensibilidad. Para preparar las diferentes diluciones del antibitico se parte de una solucin madre que se debe diluir en las condiciones adecuadas para cada antibitico. Esta solucin madre es diferente para cada antibitico y su escogencia depende del tipo de antibitico y la cepa a probar. Con esa tcnica se pueden determinar dos diferentes valores: la CMI y la CMB(16). La CMI ya la hemos definido como la mnima concentracin de antibitico que inhibe el crecimiento posible de un inculo bacteriano estandarizado. La CMB es la mnima concentracin de un antibitico que mata el 99,9% de las bacterias de un inculo inicial. Esto nos indica lo necesario que es conocer con toda exactitud el nmero de ucf/ml del inculo estandarizado. El primer paso para proceder al montaje de una CMI/CMB utilizando la tcnica de la microtitulacin es colocar 50 ul del medio de cultivo en cada uno de los pozos de la placa a emplear(16). Luego se colocan 50 ul de la solucin madre del antibitico, teniendo en cuenta que estamos haciendo una dilucin 1: 2, por o que si la solucin madre tiene 512 ug/ml, en el primer pozo tendramos una concentracin real de 256 ug/ml, luego procedemos a realizar diluciones dobles hasta los pozos 10, dejando el 11 como control de crecimiento negativo y al pozo 12 de control positivo de crecimiento. El control positivo tiene medio de cultivo ms el inculo bacteriano y el control negativo tiene medio de cultivo y antibitico, para un volumen final de 100 ul en ambos pozos(16). En los pozos de 1 a 10 (con excepcin de pozos 11 y 12), colocamos 50 ul de la solucin madre (en este ejemplo de 512 ug/ml) en el primer pozo y realizamos diluciones dobles hasta el pozo 10 del cual eliminamos 50 ul, siempre para un volumen hasta el momento de 50 ul en cada pozo(16). Por ltimo se colocan 50 ul del inculo bacteriano estandarizado. Resumiendo, en el primer pozo hemos puesto 50 ul de medio de cultivo, 50 ul de la solucin madre de 512 ul, hemos sacado 50 ul y hemos colocado 50 ul del inculo bacteriano. En este primer pozo la concentracin del antibitico, si iniciamos con la solucin madre de 512 ul, sera de 128 ug, por consiguiente, el pozo 2 tendr una concentracin de 64 ug, el siguiente de 32, el siguiente de 16 y as hasta el pozo 10 que tendra una concentracin final de 0,125 ug/ml. La placa se incuba a 35C por 18 a 24 horas, cubierta, ya sea con la tapa de la placa o con un plstico adhesivo permeable al oxgeno. Una vez lista la placa, se hace una serie de diluciones del inculo, se realiza el plateo final en un medio de cultivo apropiado a la cepa y se incuba en las condiciones apropiadas hasta el otro da. Luego de este periodo de incubacin, se cuentan las ufc, se multiplican por la dilucin y se obtiene la concentracin (ufc/ml) del inculo empleado(16). La interpretacin es relativamente sencilla, la CMI se determina viendo en cul pozo no hay crecimiento, usando como referencia el control positivo en el cual s hay crecimiento. La CMI ser la concentracin del ltimo pozo en el cual no hay crecimiento. Para obtener la CMB, de aquellos tubos en los que no se observe crecimiento, se extraen 10 ul y se inoculan en el medio de cultivo, se incuba y luego se cuentan las colonias que crecen y esto se refiere al conteo bacteriano del inculo inicial. Generalmente la CMB es una o dos diluciones ms alta que la CMI(16). Por supuesto, esta tcnica consume una gran cantidad de tiempo y trabajo, por lo que recientemente una casa comercial sueca, desarroll una variacin sustancial de esta tcnica y la llama E test o Epsilon test(7, 16). E-E test interpretacin de los

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Este mtodo emplea una tira con una matriz plstica que tiene una concentracin decreciente de un antibitico determinado. El medio que se usa es agar sangre con sangre de caballo al 5% y con una base de Meller-Hinton o puede utilizarse agar HTM o agar chocolate suplementado. Aqu, se determina solamente la CMI y sta se encuentra en la interfase de la elipse(7, 16). La lectura debe ser muy cuidadosa y puede hacerse con la ayuda de una lupa. Se recomienda que, si la interfase cae entre dos puntos, se escoja la concentracin ms alta y tambin es muy importante la observacin de pequeas colonias presentes en las zonas de bajo crecimiento, lo que puede indicar resistencia o bajos niveles de sta. En E test ha venido a resolver una serie de problemas y a hacer ms rpida y fcil la determinacin de la CMI. Actualmente, se pueden adquirir tiras de E test para pruebas de sensibilidad de las bacterias tradicionales y de las especiales como organismos anaerobios, Campylobacter sp., Helicobacter pylory y Micobacterium tuberculosis. Hay tambin, E test para sensibilidad de los organismos levaduriformes(7). Nos faltan dos temas importantes, el primero de ellos es la discusin de los mtodos automatizados y por ltimo aquellos mtodos llamados espaciales. F-Mtodos automatizados En cuanto a los mtodos automatizados(3), revisaremos solamente el nico sistema con el cual se ha acumulado una amplia experiencia en el Hospital Nacional de Nios. Se trata del Sistema Automatizado Vitek de la casa comercial BioMerieux(13). Este utiliza tarjetas de plstico transparente para la prueba de sensibilidad. Se trata de tarjetas de 30 pozos que llenan con el inculo bacteriano estandarizado, mediante una bomba de vaco y luego las tarjetas son selladas hermticamente, se introducen a un incubador a 35C y cada 10 minutos el sistema hace una lectura y se mide la concentracin del inculo bacteriano. Cada tarjeta tiene un pozo control positivo de crecimiento y es este pozo donde se construye una curva normal de crecimiento bacteriano(13). Cada uno de los pozos de antibiticos es referido al control positivo de crecimiento y la curva obtenida en cada uno a su vez, se controla la curva normal obtenida en el pozo de control positivo. As pues, una cepa resistente, tendra una curva exacta o muy parecida a la normal, una cepa intermedia presentara una curva mucho menos amplia y con un menor recuento bacteriano que el control; una cepa sensible, no tendra una curva, tendra una lnea recta(13). Es importante mencionar que una prueba de sensibilidad realizada en un sistema automatizado, proporciona un dato que se aproxima a una CMI ya que estos sistemas trabajan con 2 4 diferentes concentraciones del antibitico, por lo que se insiste en el hecho de que este dato es semicuantitativo. Aun as, este sistema ha venido a solventar una serie de problemas tcnicos y en especial la reduccin importante en el tiempo de incubacin de la prueba. En la mayora de los casos, la sensibilidad se reporta en tiempos tan bajos como 4 a 5 horas, tiempo que antes tomaba de 18 a 24 horas(3, 13). Este sistema no puede emplearse para las pruebas de sensibilidad de las cepas fastidiosas; sin embargo, es esperable que en pocos aos se pueda desarrollar un medio de cultivo que soporte el crecimiento de este tipo de cepas. El sistema Vitek est hecho para las pruebas de sensibilidad de los organismos de crecimiento rpido y es aqu donde se ha sentido su impacto. La casa comercial, ya tiene a disposicin tarjetas para la prueba de sensibilidad de organismos anaerbicos, pero no tenemos experiencia en este campo(13). G-Pruebas especiales Son tcnicas que se utilizan con fines especiales y que se emplean en estudios de resistencia bacteriana en condiciones muy claramente definidas(9). Los mtodos a discutir son los siguientes: deteccin de la resistencia contra aminoglucsidos en los Enterococcus, deteccin de la resistencia de Enterococcus contra la vancomicina, deteccin de la resistencia a la oxacilina en Staphylococcus, deteccin de la B-lactamasa y determinacin de la actividad bactericida(9). Para el tratamiento de infecciones serias por Enterococcus, comnmente se utiliza una combinacin sinrgica entre la vancominina y un aminoglucsido que puede ser gentamicina o streptomicina. En estos casos, se puede hacer una prueba para detectar la resistencia del Enterococcus a estos aminoglucsidos. Para ello hay tres mtodos: el de difusin, el de dilucin y la microtitulacin(9). El ms sencillo el de dilucin donde se emplean placas de Petri con Meller-Hinton suplementado con gentamicina (500 ug) o streptomicina (200 ug). Si hay crecimiento en estas placas, hay resistencia a esos antibiticos(9). El sistema Vitek trae una tarjeta (TA) que tiene estos antibiticos, por lo que puede ser utilizada en casos de sinergismo entre la gentamicina y la streptomicina para el tratamiento de infecciones invasoras por Enterococcus(13). En cuanto a la resistencia de los Enterococcus contra la vancomicina, hemos empleado un agar sangre con base de MellerHinton y 6 ug/ml de medio de vancomicina. Este mtodo lo hemos usado para la deteccin de este tipo de agentes a partir de las heces de nios costarricenses y manos del personal de salud, con resultados excelentes (en prensa). La NCCLS, recomienda, para la deteccin de la resistencia de los Staphylococcus a la oxacilina, el uso de un Melle-Hinton suplementado con cloruro de sodio al 4% y 6 ug de oxacilina por ml de medio cultivo(7, 9).

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En el campo de la resistencia bacteriana mediada por enzimas, podemos mencionar varios tipos como por ejemplo las B-lactamasas, las B-lactamasas de efecto expandido o inducibles y algunas otras como son la cloranfenicol acetil tranferasa (CAT) o aminoglucsido acetil tranferasa (AAT)(6,9). El mtodo ms sencillo para la deteccin de la B-lactamasa es el uso de la cefalosporina cromognica o Cefinasa de la casa BBL, en la cual tenemos un disco impregnado con la cefalosporina y slo se coloca una asada del organismo a testar y pocos minutos despus se observa el cambio de color. Si la cepa produce una B-lactamasa, hay un cambio de color del disco y ste pasa de amarillo a rojo(9). En los ltimos aos, se han detectado muchos tipos de B-lactamasas inducidas, con gran importancia clnica, ya que no son detectadas en el laboratorio por los mtodos rutinarios. Puede haber un reporte de sensibilidad, pero no funciona el antibitico en el paciente, ya que al poner la cepa en contacto con el antibitico in vivo, se presenta la induccin y no hay actividad del antibitico. Para poner en evidencia este tipo de cepas hemos usado una tcnica muy sencilla. En un plato de agar Meller-Hinton, se raya un inculo bacteriano estandarizado y se colocan tres discos: aztreonam, cefotaxime o ceftazidime y amoxicilina/ac. clavulnico, separados equidistantemente por 30 mm. Una vez incubada la placa por 24 horas, si la cepa produce enzimas inducidas, veremos un gran halo de inhibicin.(9) Para la deteccin de la resistencia al cloranfenicol mediada por una CAT, producida por Haemophilus influenzae, se ha desarrollado una tcnica muy ingeniosa, donde se usan discos sin antibitico impregnados con la cepa a probar, discos de cloranfenicol y un agar Meller-Hinton(6). La idea es rayar una cepa de Escherichia coli con sensibilidad comprobada al cloranfenicol sobre el agar y luego colocar discos de cloranfenicol y sobre ellos discos sin antibiticos impregnados con la cepa a probar. Si la cepa produce CAT, inactivar al coranfenicol y la Escherichia coli no presentar un halo de inhibicin; por el contrario, si la cepa no produce esta enzima, no habr inhibicin y por ende, la Escherichia coli presentar un halo de inhibicin, poniendo en evidencia la produccin de la CAT. Control de Calidad Una revisin sobre el tema de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana no puede estar concluido sin mencionar lo concerniente al control de la calidad(1, 3, 4, 7, 9, 16). Este es un tema de gran importancia. Dicho control se realiza utilizando cepas control de la American Type Cultive Colection (ATCC) o de alguna otra institucin internacional que se dedique a la produccin y mantenimiento de cepas bacterianas. Las cepas de la ATCC, presentan patrones de sensibilidad conocidos, por lo que al montar una prueba de sensibilidad, sta debe encontrarse dentro de los lmites mximos o mnimos impuestos por las regulaciones internacionales. El control de calidad debe ser efectuado al menos una vez por semana, cada vez que se cambia el lote del medio del cultivo o se prepara medio fresco y cada vez que se cambia un antibitico o se inicie el uso de uno nuevo. Quedan sin tratar algunas otras tcnicas, como son los mtodos genticos para la deteccin de resistencia y las diferentes tcnicas empleadas en el estudio de resistencia a los antivirales, los antimicticos, antiparasitarios y la resistencia en organismos anaerbicos(2, 5, 10, 11,14, 15), as como la deteccin de agentes antimicrobianos en fluidos biolgicos(12). En todos estos campos se ha avanzado mucho en los ltimos aos, por lo que estos temas sern objeto de una publicacin posterior. Bibliografa 1. Doern G.: Susceptibility tests of fastidious bacteria. In: Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology. Washington D. C., 1995. [ Links ] 2. Espinel I. & Pfaller M.:Antifungal Agents and Susceptibility Testing. In. : Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P. Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology. Washington D. C., 1995. [ Links ] 3. Ferraro M. & Jorgensen J.: Instrument-Based Antibacterial Susceptibility Testing. In: Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M. et al.: American Society of Microbiology. Washington D.C., 1995. [ Links ] 4. Jorgensen J. & Sahm D. Antimicrobial Susceptibility Testing: General Considerations. In: Manual of Clinical Microbiology. Sixth edition. Eds: Murray P., Baron E., Pfaller M et al.: American Society of Microbiology. Washington D.C., 1995. [ Links ] 5. Inderlied C. & Salfinger M.: Antimicrobial Agents and Susceptibility Tests: Mycobacteria. 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Hospital Nacional de Nios Dr. Carlos Senz Herrera

Apdo. 1654-1000, San Jos, Costa Rica.

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