Apostila Pratica Nutricao

Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia
Apostila de Aulas Prticas

Bacteriologia
Nutrio
Raquel de Souza SantAnna (Monitora da Disciplina de Bacteriologia em 2007)
Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira (Professor Adjunto de Bacteriologia) 2007
Apresentao O aprendizado terico e prtico de microbiologia, incluindo a bacteriologia, muito importante para o profissional da rea de nutrio. As reas de atuao em controle microbiolgico de alimentos, treinamento de manipuladores, tecnologia na produo de alimentos, entre outras, exigem um profundo conhecimento desta disciplina. A apostila o material de apoio s aulas prticas disponibilizado aos alunos. Esta contm explicaes tericas e prticas dos procedimentos a serem realizados em cada aula de forma clara e didtica. A disciplina j possua uma apostila de aulas prticas desde 2001, mas necessria constante renovao para que os assuntos sejam abordados de maneira atualizada e direta para despertar o interesse dos alunos. Cada assunto apresenta uma introduo contendo a teoria do tema abordado, assim como a sua aplicao e importncia no exerccio da profisso, objetivando o melhor entendimento do tema, dos materiais a serem utilizados, da execuo e dos resultados obtidos. No final de cada assunto o aluno poder tirar as suas concluses da prtica executada e encontrar algumas questes de fixao. A apostila apresenta, tambm, figuras ilustrando a atividade a ser realizada, facilitando a compreenso do aluno. Finalmente procurou-se acentuar a importncia e aplicao de cada prtica no contexto das atividades de um nutricionista de modo a estimular o aprendizado. Esperamos que voc, aluno, aproveite ao mximo este recurso didtico! Lembre-se, qualquer dvida, no hesite em perguntar ao seu professor ou aos monitores! Os autores.
ndice
Como trabalhar no laboratrio de microbiologia ................................................................. 1 Assunto 1: Meios de cultura e Tcnicas de Semeadura ..................................................... 5 Assunto 2: Bactrias no Ambiente .................................................................................... 15 Assunto 3: Controle Microbiano ........................................................................................ 18 Assunto 4: Colorao de Gram ......................................................................................... 27 Assunto 5: Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos TSA (Antibiograma) ................... 34 Assunto 6: Cocos Gram positivos ..................................................................................... 41 Assunto 7: Colorao de Zihel-Neelsen (Visualizao de Bactrias Espiraladas)............ 52 Assunto 8: Bacilos Gram-negativos .................................................................................. 59 Assunto 9: Contagem em Placa e Tcnica do Nmero Mais Provvel (NMP).................. 69 Bibliografia ........................................................................................................................ 80
Como trabalhar no laboratrio de microbiologia

importante que falemos brevemente obre como devemos nos portar dentro de um laboratrio de microbiologia em geral, no importando se o microorganismo estudado ser uma bactria, um fungo ou um vrus.
Cuidados fundamentais
Alguns experimentos que ns realizaremos podem ser perigosos se voc manipular os materiais impropriamente ou executar os procedimentos incorretamente. So necessrias algumas medidas de segurana quando se trabalha com microorganismos e substncias qumicas, alm de vidros, banhos-maria ferventes, instrumentos cortantes e outros materiais. Se voc tiver qualquer problema com materiais ou procedimentos, no hesite em chamar o professor ou o monitor para te auxiliar.
Procedimentos de Precauo e Segurana

O laboratrio de microbiologia um lugar onde culturas de microorganismos so manipuladas e examinadas. Este tipo de atividade deve ser realizado em conjunto com boas tcnicas asspticas, num local de trabalho limpo e organizado. Tambm como tcnicas asspticas, todos os materiais que sero utilizados sero esterilizados para eliminar todos os microorganismos presentes ali, e deve-se tomar muito cuidado para no haver recontaminao deste material com microorganismos do ambiente. Geralmente, os microorganismos estudados no so patognicos, mas ainda assim, devemos manipular qualquer cultura ou qualquer organismo como se fosse potencialmente patognico, lembrando que muitos microorganismos que geralmente no so patognicos podem causar doenas oportunistas. Cada estudante deve aprender e praticar as prticas asspticas no laboratrio. Isto importante para prevenir a contaminao de suas mos, cabelos e roupas com material contaminado, alm de evitar a contaminao do seu trabalho e proteger seus colegas que estaro trabalhando na bancada ao lado. A importncia da assepsia e desinfeco apropriadas est descrita na apostila e ser observada em uma das aulas prticas. Em geral, todos os procedimentos de segurana e precaues tomados no laboratrio de microbiologia se resumem em: 1 restringir os microorganismos presentes em culturas e amostras aos recipientes (vidros ou sacos de coleta, placas ou tubos) quando da sua coleta, crescimento (incubao) ou sua anlise; 2 prevenir a contaminao com microorganismos ambientais (normalmente presentes nas mos, cabelos, roupas, superfcies e no ar) das amostras e culturas analisadas, o que pode interferir nos resultados obtidos. Mos e superficies devem ser higienizados e tratadas com anti-spticos e desinfetantes corretos, jalecos devem ser utilizados, cabelos compridos devem ser presos para trs, e as reas de trabalho devem estar livres de objetos desnecessrios. Lembre-se que na hora de transferir os microorganismos ou culturas no devemos utilizar a boca (por exemplo, para pipetar). 1
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia A conduta pessoal no laboratrio de microbiologia deve ser sempre observada. O monitor ou professor deve ser sempre consultado caso haja algum problema.
Conduta geral no laboratrio

1 Sempre identifique e confira o seu material antes de iniciar os trabalhos no laboratrio. 2 Antes de entrar no laboratrio, retire casacos, jaquetas, etc. Estes itens devem ser deixados em uma prateleira com sua bolsa ou mochila, papis e outros itens que no sero utilizados na aula prtica. 3 Para entrar no laboratrio, todos os estudantes devem estar usando seu jaleco, de preferncia limpo e branco. 4 No incio e no final de cada aula prtica, os alunos devem limpar e desinfetar a sua bancada com uma soluo desinfetante prpria. Este espao deve ser mantido limpo e arrumado durante o decorrer de toda a aula prtica. 5 Antes de comear devemos lembrar: - prenda seu cabelo comprido para trs, longe da chama do Bico de Bunsen; - no use jias e acessrios durante a aula prtica; - mantenha seus dedos, lpis, caneta e qualquer objetos longe da sua boca; - no fume, coma ou beba nada no laboratrio; - no fique andando pelo laboratrio, pois atividades desnecessrias podem causar acidentes, distrair os outros alunos e promover contaminao. 6 Lembre-se de trazer uma caneta que escreva em vidro (caneta para retro, cd, marcador, etc.) 7 Anote todos os detalhes da aula prtica e faa os exerccios de fixao de cada assunto. 8 Se voc est em dvida quanto ao procedimento, confira na apostila. Se a dvida persistir, chame o professor ou monitor. Evite tirar dvidas com os colegas de outros grupos. 9 Se respingar cultura em suas mucosas (boca, olhos) ou qualquer tipo de acidente ocorrer, chame o professor ou monitor imediatamente. Limpe o local com papel toalha e ponha desinfetante sobre o local (superfcies inanimadas) por 15 minutos, retirando com papel toalha. 10 Avise ao professor ou monitor sobre qualquer acidente (corte, queimadura) que ocorra. 11 Nunca retire culturas ou equipamentos do laboratrio em quaisquer circunstncias. 12 antes de sair do laboratrio, cuidadosamente lave e faa a anti-sepsia em suas mos. Lembre-se de lavar seu jaleco para a prxima aula prtica.
Como trabalhar com o microscpio

Em primeiro lugar essencial que voc conhea as partes pticas e mecnicas dos microscpios:
- Mantenha o microscpio livre de poeira, vapores cidos e do contato com reagentes. Para mant-lo seco, cubra com capa de flanela, pois evita o p e a multiplicao de fungos (Obs: as capas devem ser lavadas periodicamente). - No manusear o equipamento com as mos sujas ou molhadas. - Jamais comer ou beber prximo ao equipamento. - Na remoo do equipamento, segure-o firmemente com uma das mos no brao e outra na base, ou com as duas no brao, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de trabalho de superfcie plana, evitando qualquer movimentao brusca. Nunca desloque o aparelho com a lmpada acesa ou logo aps ter sido apagada. - Muita ateno necessria quando se observa a preparao em meio lquido, pois h sempre o risco de molhar a lente frontal da objetiva; portanto o conselho retirar o excesso de lquido com papel de filtro, antes de colocar a lmina sobre a platina; em de acidente, enxugar imediatamente com papel absorvente macio.
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - Na observao de uma preparao, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para focalizar com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma: Escolha uma estrutura na preparao, mova a lmina at que o objeto fique exatamente no centro do campo, em seguida mude para a objetiva de maior aumento, olhando por fora para evitar o choque com a lamnula. Olhar pela ocular e abaixar o tubo ou elevar a platina com o macromtrico muito lentamente; assim que a imagem aparecer, mesmo confusa, parar e completar a focalizao com o micromtrico. O uso da objetiva de imerso mais delicado, pois a distncia focal entre a face da objetiva e a parte superior da lamnula, diminui quando a ampliao aumentada. Em primeiro lugar, assegure-se da existncia de algo no campo, posicionando a objetiva de menor aumento. Certifique-se que a iluminao e o objeto esto bem centrados, suspenda o tubo e coloque uma gota de leo no centro da operao; o leo deve ter o mesmo ndice de refrao da objetiva; Abaixe o tubo at colocar a lente frontal em contato com a gota de leo ainda convexa, at a mudana de forma da mesma; suspenda levemente o tubo, mas sem perda de contato com a gota, coloque os olhos nas oculares e abaixe o tubo muito lentamente; assim que a imagem aparecer, complete a focalizao com o micromtrico.
Assunto 1: Meios de cultura e Tcnicas de Semeadura

Introduo
O estudo de bactrias exige o prvio isolamento e identificao, para tanto, so utilizados diversos meios de cultura diferentes. Meio de cultura uma mistura de nutrientes que possibilitam o crescimento in vitro de microorganismos. A maioria das bactrias cresce em meios de cultura. As excees so as ricketsias, clamdias, Mycobacterium leprae e Treponema, que so parasitos intracelulares obrigatrios. Neste caso, estes microorganismos podem ser cultivados em culturas de clulas e ovos embrionados. Inoculao a contaminao proposital de um meio de cultura, ou seja, a transferncia de um determinado nmero de microorganismos para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a sua identificao. A inoculao das bactrias em diferentes meios envolve vrias tcnicas de semeadura. Toda a manipulao realizada em laboratrio (com meios, cultura e material utilizado) requer certos cuidados para evitar a contaminao. Esses procedimentos so denominados tcnicas asspticas.
Fundamentao terica
Meios de Cultura
Os diversos meios de cultura existentes podem ser classificados de diversas formas: So aqueles encontrados na natureza, de origem vegetal (p.ex.: pedao de batata, de abbora) ou animal (p.ex.: gema de ovo, pedao de carne) So aqueles fabricados em laboratrio, constitudo de substncias qumicas, podendo ser definidos ou indefinidos (complexos) Quanto composio Definidos Artificiais Indefinidos Possui composio definida, ou seja, se conhece qualitativa e quantitativa sua composio. A sua composio real no conhecida, apenas feita uma estimativa qualitativa. Por exemplo: meios suplementados com sangue, gema de ovo, alimentos...
Naturais
Quanto
ao
estado Lquido
So desprovidos de Agar caldo
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia fsico Semi-slido Slido Simples Apresentam em sua composio at 1% de Agar. Apresentam em sua composio de 1,5 a 2,5% de Agar. S possui os nutrientes bsicos para o crescimento das bactrias em geral. Alm dos nutrientes bsicos possui elementos nutritivos a mais, como fatores promotores de crescimento (sangue...), mas no especfico. suplementado com nutrientes especficos para o microorganismo que se deseja pesquisar. Alm disso, possui nutrientes agentes inibidores de determinados microorganismos, mas no permite o isolamento da bactria, pois um meio lquido. Por exemplo: aminocidos (lisina Salmonella) Possui agentes inibidores de determinados microorganismos. Permite a identificao e isolamento da bactria, pois um meio slido (permite a visualizao de UFCs). Por exemplo: Agar EMB inibe Gram+ Permite a diferenciao de diferentes microorganismos. Por exemplo: a diferenciao de bactrias fermentadoras e no fermentadoras da lactose no Agar EMB. Possuem agentes que indicam determinadas reaes no meio, para a determinao do metabolismo das bactrias. Por exemplo: ferro no meio pode indicar a produo de H2S pelo enegrecimento do meio. (sulfeto ferroso) *** geralmente o agente um indicador de pH Meios onde so estocadas culturas puras para posterior utilizao. Geralmente so meios semislidos.
Enriquecido
De enriquecimento
Quanto finalidade e Seletivo caractersticas
Diferencial
Indicadores
De estoque
Tcnicas de Semeadura
As tcnicas de semeadura so o mtodo pelo qual se transfere inculos bacterianos de um meio de cultura ou material a ser analisado (secrees, alimentos) para um outro meio de cultura. Para garantir que apenas o microorganismo desejado seja semeado, so utilizadas as tcnicas asspticas: procedimentos que devem ser adotados visando a no contaminao de materiais, meios e culturas. As tcnicas de assepsia incluem: fazer a desinfeco da rea de trabalho e anti-sepsia das mos ANTES e DEPOIS de qualquer trabalho. (1) 6
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia trabalhar SEMPRE na rea de segurana: uma rea de aproximadamente 10 cm ao redor da chama do bico de Bunsen. (2) esterilizar adequadamente todo material (p.ex.: alas e agulhas bacteriolgicas) ANTES e DEPOIS de seu uso sempre aquecer da base para a ponta, evitando a formao de aerossis. (3) flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculaes, evitando a contaminao da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o microorganismo desejado ser inoculado. (4)
De acordo com as caractersticas fsicas dos meios de origem e destino, alm da finalidade da inoculao, podem-se utilizar diferentes tcnicas de inoculao. A transferncia de inculo de um meio para outro tambm denominada genericamente como repique. A seguir, veremos quais so as tcnicas de inoculao:
Semeadura em meios slidos Estria sinuosa: semear com ala ou agulha bacteriolgica, em zig-zag, partindo da base para a extremidade do bizel (superfcie inclinada do meio). Objetivo: obteno de intensa massa de microorganismos Estria Reta: semear com agulha bacteriolgica, fazendo uma linha reta, com cuidado de no ferir o Agar, partindo da base para a extremidade do bizel (superfcie inclinada do meio). 7
Meio inclinado em tubos
ou
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Objetivo: obteno microorganismos. de pequena massa de
Picada Central: semear com agulha bacteriolgica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inculo deve penetrar at 2/3 do tubo ou at o fundo deste. Objetivo: utilizado para verificar fermentao e motilidade em algumas tcnicas. Meio em camada alta Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriolgica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inculo deve penetrar at 2/3 do tubo ou at o fundo deste. Objetivo: utilizado para verificar fermentao e motilidade em algumas tcnicas. Meio em placa de Petri Pour-plate ou disseminao (mtodo em profundidade): Transferir 1 ml da cultura para placa de Petri vazia, colocar 10 20 ml do meio fundido (e resfriado a cerca de 45 50C) sobre a cultura e homogeneizar suavemente com movimentos circulares. Objetivo: contagem bacteriana. utilizado tambm para anlise de microorganismos anaerbios, adicionando uma outra camada de meio fundido aps o endurecimento da primeira camada. Estria simples: transferir uma alada da cultura para meio slido em placa e estriar com a ala bacteriolgica sobre o meio. A estria pode ser realizada em movimento de zigzag (estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre o meio (estria reta). Objetivo: Essa tcnica muito utilizada para visualizao de determinadas propriedades metablicas, como a produo de enzimas hidrolticas (hidrlise de substncias do meio gema de ovo, sangue...), e produo de pigmentos. Esgotamento em estrias ou estrias mltiplas: transferir uma alada da cultura para meio slido em placa e estriar com a ala bacteriolgica sobre o meio. A placa dividida em 4 quadrantes e a inoculao pode ser feita de 2 tipos: em 3 estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag. Quando atingir a metade, 8
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia girar a placa 90 e estriar at a metade (1/4 da placa), girar mais 90 e estriar o meio restante. em 4 estrias: estriar at 2/3 da metade da placa, girar 90, estriar 2/3 do prximo quadrante (1/4 da placa), girar 90, estriar mais 2/3 do prximo quadrante (1/4 da placa), girar 90 e estriar o restante do meio. Objetivo: obteno de colnias isoladas. importante no cruzar as estrias (no tocar a ala na estria anterior), para reduzir o inculo a cada estria e obter as colnias isoladas. Pode-se, alternativamente, flambar a ala entre as estrias e tocar a ponta da estria anterior, arrastando um pequeno inculo para a prxima estria. Spread-plate ou distenso: Transferir 0,1 ml da cultura para o meio slido na placa e espalhar uniformemente com a prpria ponta da pipeta, ou ala bacteriolgica / swab / ala Drigalsky. Objetivo: obteno de crescimento confluente, ou para contagem bacteriana. Esta tcnica muito utilizada na realizao de antibiogramas.
ou
Semeadura em meios semi-slidos Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriolgica, no centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inculo deve penetrar at 2/3 do tubo ou at o fundo deste. Objetivo: utilizado para verificar fermentao e motilidade em algumas tcnicas. Alm disso, o meio tambm utilizado para estocar culturas puras.
Semeadura em meios lquidos Difuso: uma alada da colnia (Agar em placa) ou da cultura (de outro meio ou lquido) introduzida no meio lquido, com agitao da ala, para maior difuso dos microorganismos (da ala para o meio e homogeneizao no meio). Pode-se inclinar o tubo a 30 e esfregar o inculo na parede do mesmo, quando o tubo retornar posio original o inculo se difundir no meio. Objetivo: um repique genrico para crescimento bacteriano em meio lquido.
Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de: executar e determinar a finalidade das principais tcnicas de semeadura de bactrias em diferentes meios (lquidos, semi-slidos e slidos), tanto em tubos quanto em placas; caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada um; identificar e executar as tcnicas de assepsia em laboratrio.
Material
Para a atividade prtica sero utilizados: - Placa de Petri com Agar - Tubo com Agar inclinado - Placa de Petri estril - Tubo com Agar semi-slido - Tubo com Agar em camada alta - Cultura bacteriana em caldo e em Agar - Amostra de gua em tubo (para a tcnica do pour plate) - Pipetas estreis - Ala e agulha bacteriolgicas
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Execuo da prtica
A partir de cultura em placa:
- a partir de um crescimento isolado obtido em placa, pegar uma colnia com auxlio de uma ala bacteriolgica e transferir para o tubo com caldo, atravs do processo de difuso.
A partir de cultura em caldo:
- a partir de um crescimento obtido em caldo, realizar as seguintes inoculaes: 1. Com auxlio de uma ala bacteriolgica, transferir o inculo para o tubo com caldo, atravs da tcnica de difuso. 2. Com auxlio de uma ala ou agulha bacteriolgica, transferir o inculo para o tubo com Agar inclinado, atravs da tcnica de estria (sinuosa ou reta). 3. Com auxlio de uma ala bacteriolgica, transferir o inculo para a placa com Agar, atravs da tcnica de esgotamento em estrias (3 ou 4 estrias). 4. Com auxlio de uma agulha bacteriolgica, transferir o inculo para o tubo com Agar semislido, atravs da tcnica de picada central.
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A partir da amostra de gua:
- com o auxlio de uma pipeta estril, transferir 1 ml da amostra de gua para uma placa estril e adicionar o meio fundido, realizando a tcnica do pour plate.
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Aps a execuo de todas as inoculaes, incubar os meios a 37C por 24 horas. Observar e interpretar o crescimento nos meios, destacando aquele empregado no isolamento de colnias (esgotamento em estrias).
Exerccios de fixao
1. Qual a diferena entre os meios de enriquecimento e seletivo? 2. Qual a finalidade da tcnica do spread plate ou tcnica do espalhamento? 3. Por que no devemos cruzar as estrias na tcnica do esgotamento em estrias? 4. Por que devem ser realizadas as tcnicas asspticas? 5. Por que utilizamos diferentes meios durante a anlise de um determinado material (p.ex.: alimento)? 6. Para uma cultura que esteja guardada h muito tempo (sob refrigerao), qual o tipo de meio devemos utilizar para retornar a utiliz-la numa atividade prtica? 7. Para determinar a presena de um microorganismo especfico num material que esteja muito contaminado, quais os tipos de meios que devemos utilizar?
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Observaes
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Assunto 2: Bactrias no Ambiente

Introduo
A presena de bactrias pode ser verificada em quase todos os ambientes. A exposio de alimentos, sua manipulao e conservao incorretas, so fatores que levam sua contaminao por microorganismos. Os microorganismos podem ter relao com o alimento de trs formas: adicionados intencionalmente: so aqueles que provocam alteraes desejveis nos alimentos, como os lactobacilos, que fermentam o leite, transformando-o em iogurte, queijo (etc). deterioradores: durante o seu desenvolvimento, estes microorganismos causam mudanas desagradveis nos alimentos, tornando-os imprprios para o consumo, como os coliformes, que deterioram alimentos como queijos frescais, leite (etc). patognicos: podem colonizar o alimento e representam um risco sade de quem ingerir este alimento (com o microorganismo ou com toxinas formadas por este), como Salmonella sp., Staphylococcus aureus e outros.
Fundamentao terica
As bactrias esto presentes em todos os ambientes. Muitas vezes, sua presena no prejudicial, como os microorganismos que colonizam a nossa pele e o nosso trato gastrintestinal. Algumas vezes esta presena at benfica, como a utilizao de microorganismos na indstria de alimentos na produo de alimentos fermentados, como diversas bebidas. Quem nunca ouviu falar em alimentos pr e pr biticos? So alimentos que contm em sua composio microorganismos vivos que, quando no nosso organismo, causam reaes benficas (como auxiliar a regulao do trnsito gastrintestinal), ou estimulam os microorganismos da nossa microbiota normal a exercer seu papel benfico no nosso organismo (como a produo de vitamina K pelas bactrias do nosso trato gastrintestinal). Mas, nem sempre a relao alimento x microorganismos x homem benfica. Diversos microorganismos tm a capacidade de nos causar doenas, at mesmo os microorganismos da nossa microbiota normal (em casos de reduo da atividade imunolgica, causando doenas oportunistas), e muitos casos podem ser veiculados por alimentos. importante ressaltar que os alimentos por si s no so fontes de contaminao, mas podem veicular esta contaminao adquirida, podendo causar doenas. As principais fontes de contaminao so o solo e a gua, as plantas, os utenslios utilizados na preparao do alimento (contaminao cruzada), o trato gastrintestinal do homem e de animais, os prprios manipuladores de alimentos, a rao animal, a pele dos animais, e at o ar. A indstria de alimentos vem crescendo e a preocupao com a obteno de alimentos com qualidade tanto do ponto de vista tecnolgico (o alimento deve ser nutritivo, competitivo, aceitvel no mercado, etc.) quanto microbiolgico (segurana alimentar) est cada vez mais desenvolvida. O nutricionista tem papel fundamental nesse controle, pois a manipulao, preparo e conservao inadequados esto freqentemente associados a doenas (intoxicaes ou infeces) microbianas. O manipulador de alimentos deve ter treinamento constante para que no contamine o alimento com tcnicas e hbitos anti-higinicos. 15
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia dever do nutricionista conhecer os riscos associados precariedade no cuidado com os alimentos para melhor orientao e superviso das atividades de qualquer UAN (Unidade de Alimentao e Nutrio), restaurante ou indstria, evitando a disseminao de doenas atravs dos alimentos.
Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de: constatar a presena de bactrias no ambiente; compreender a importncia dos critrios bsicos de higiene na produo e manipulao de alimentos, visando evitar a contaminao dos mesmos por bactrias ambientais ou por portadores de microorganismos patognicos; diferenciar fontes de contaminao e veculos de contaminao; comentar sobre o papel de bactrias ambientais como eventuais deterioradoras de alimentos.
Material
- 2 Placas de Petri com Agar - swab estril
Execuo da prtica
Bactrias no ambiente:
- 1 placa com Agar deve ser exposta ao ambiente, fora da rea de segurana. Cada grupo deixar a placa em exposio por um tempo diferente (5 / 10 / 15 / 20 minutos)
- aps o tempo de exposio, a placa deve ser tampada novamente.
Bactrias nas superfcies:
- 1 placa com Agar deve ser dividida em 4 quadrantes - em cada quadrante deve ser inoculado um material diferente, para a verificao de bactrias em diversas superfcies, de acordo com o diagrama representado a seguir:
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Aps a execuo de todas as inoculaes, incubar os meios a 37C por 24 horas. Observar e interpretar o crescimento nos meios.
Exerccios de fixao
1. Qual o papel do nutricionista na qualidade microbiolgica dos alimentos? 2. Por que necessrio tomar medidas de controle no ambiente em que se preparam e/ou manipulam alimentos? 3. O que contaminao cruzada? 4. Os alimentos podem ser considerados fonte de contaminao? 5. Quais so as principais fontes de contaminao dos alimentos?
Observaes
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Assunto 3: Controle Microbiano

Introduo
Como j vimos, as bactrias esto em quase todos os ambientes e superfcies, e no desejvel que muitos materiais se contaminem com elas, como os alimentos, os utenslios utilizados na sua preparao, medicamentos, e outros. Para tanto, podemos aplicar diversos mtodos de controle microbiano. O crescimento microbiano fortemente influenciado por fatores ambientais (fatores extrnsecos), quais sejam: temperatura ambiental, umidade relativa do ambiente, composio gasosa do ambiente. O controle microbiano compreende uma srie de procedimentos com a finalidade de reduzir a quantidade, eliminar, diminuir / impedir a multiplicao de microorganismos existente em ambientes, utenslios, e superfcies vivas ou inanimadas. A conservao de alimentos envolve sempre o uso de uma ou mais tcnicas empregadas no controle microbiano.
Fundamentao terica
Antes de conhecer os processos utilizados para controle microbiano e compreender seu modo de ao, importante que alguns conceitos muito utilizados sejam definidos: Desinfeco: reduo do nmero de microorganismos em uma matria inanimada (ambientes, superfcies, objetos, alimentos) Sanitizao: igual a desinfeco (termo utilizado na indstria de alimentos) Esterilizao: destruio total de microorganismos em um material Anti-sepsia: reduo do nmero de microorganismos em matria viva (pele) Assepsia: conjunto de tcnicas e/ou medidas asspticas, que visam a no contaminao de algo (por exemplo, de alimentos durante o preparo) Definidos estes conceitos, podemos comentar sobre os principais meios de controle microbiano, que pode ser feito atravs de agentes qumicos ou fsicos.
Controle Microbiano por Agentes Fsicos

Calor Pode ser utilizado em duas formas: calor seco e calor mido.
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia o mtodo mais empregado para destruio de microorganismos devido ao seu baixo custo de aplicao, fcil aplicao, eficcia e praticidade. Calor seco Modo de ao: Flambagem Oxidao de - Definio: contato direto do material a ser tratado com o fogo. componentes esterilizante celulares - Aplicao: materiais metlicos (p.ex.: ala bacteriolgica) Forno ou estufa - Definio: o material submetido a uma temperatura de 170 180C por 1 2 horas. esterilizante - Aplicao: vidrarias e metais (material cirrgico) Incinerao - Definio: queima total do material. esterilizante. - Aplicao: materiais descartveis (principalmente materiais hospitalares) Calor mido Modo de ao: Pasteurizao Desnaturao de - Definio: aplicao de calor inferior a 100C. desinfetante (no componentes elimina formas esporuladas). Pode ser classificada em: celulares lenta: 63C / 30 minutos rpida: 72C / 15segundos - Aplicao: diversos alimentos so pasteurizados, como sucos, leite, etc. Fervura - Definio: aplicao de calor a 100C por 15 minutos. desinfetante (no elimina formas esporuladas). - Aplicao: alimentos em geral, p.ex.: leite Autoclavao - Definio: aplicao de calor a 121C a uma presso de 1 atm, por 15 30 minutos. - Aplicao: materiais, meios, utenslios. Diversos alimentos so tratados por este processo, p.ex.: alimentos enlatados (apertizao). Esterilizao - Definio: aplicao de calor maior que 100C. Alimentos denominados UAT (UHT) so submetidos a uma temperatura de 140 150C por 2 4 segundos e rapidamente resfriados e acondicionados em recipientes estreis. - Aplicao: diversos alimentos, como o leite UAT O calor mido mais eficaz que o calor seco, pois a gua melhor condutora de calor quando comparada com o ar.
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Radiaes Luz Ultravioleta - possui atividade mxima num comprimento de onda de 260 nm - desinfetante - geralmente utilizado em ambientes - no penetrante desinfeco apenas superficial - a lmpada tem vida til de 200 horas (aproximadamente) - age no DNA microbiano, gerando mutaes letais Radiao Gama - esterilizante - mais energtico que UV, atua num comprimento de onda menor - age ionizando componentes celulares, levando morte - muito utilizado em produtos hospitalares descartveis - seu uso nas indstrias de alimentos est crescendo - possui baixo poder de penetrao desinfeco apenas superficial
No ionizantes
Ionizantes
Clarificante Esterilizante
Filtrao - retm as impurezas grosseiras - desinfetante - possui poros iguais ou menores que 1 mm, podendo reter, inclusive, alguns vrus.
Outros Adio de NaCl - tambm conhecida como salga - reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo microbiano. Tambm pode causar lise osmtica da clula bacteriana. - muito utilizada em produtos crneos (carne seca, pescado) Adio de outros slidos (acares) - utilizado na fabricao de compotas e alimentos em calda - reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo microbiano - muito empregado para conservao de frutas e hortalias
Presso osmtica
Dessecao
- retirada umidade do alimento em maior ou menor grau - reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo microbiano - aplicao de dessecao em vcuo (presso negativa) - reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo microbiano - seu emprego na indstria de alimentos crescente Refrigerao 20
Liofilizao
Baixas temperaturas
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - temperatura entre 0 e 10C - reduz a atividade metablica de alguns microorganismos (mesfilos e termfilos) Congelamento - temperaturas inferiores a 0C - impede a atividade metablica da maioria dos microorganismos - em alguns casos, causa a morte dos microorganismos
Controle Microbiano por Agentes Qumicos
lcool Etlico um dos mtodos qumicos mais empregados para controle microbiano, por seu baixo custo, relativa eficcia e fcil aplicao. Pode ser usado como desinfetante ou anti-sptico. Possui maior atividade germicida quando hidratado (60 70%), pois nessa condio possui maior poder penetrante. O lcool absoluto possui poder bacteriosttico, enquanto o lcool hidratado a 70% possui poder bactericida. So apontados diversos mecanismos de ao para o etanol: - ao detergente: solvente de lipdeos - ao desidratante: retira gua das clulas - ao desnaturante: agindo sobre protenas celulares Fenis e Derivados O fenol um desinfetante fraco, porm utilizado como um desinfetante de referncia para ser comparado com outros produtos. Um coeficiente maior que 1 indica que o produto mais ativo que o fenol. Atua como desnaturantes de componentes proticos Dentre os cresis, o mais importante a creolina, uma mistura de cresis muito utilizada para pisos e sanitrios. O hexaclorofeno muito utilizado na antissepsia cirrgica. Halognios Os principais halognios utilizados no controle microbiano so o Cloro e o Iodo. Cloro: usado como desinfetante de guas, alimentos e pisos. Seu mecanismo de ao dado pela reao: Cl2 + H2O HCl + HClO O cido hipocloroso instvel, se decompondo espontaneamente em HCl + 1/2 O2, que eliminar os microorganismos atravs de oxidao de componentes celulares. Iodo: reage de forma irreversvel com aminocidos aromticos de protenas celulares (fenilalanina e tirosina), desnaturando-as. Devido grande possibilidade de alergias, seu uso 21
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia como anti-sptico na prtica cirrgica vem diminuindo, sendo substitudo por clorexidine e similares. Detergentes catinicos Alteram a permeabilidade da membrana. mais ativo contra Gram negativos. Exemplo: compostos quaternrios de amnio cloreto de benzalcnio. Sais de Metais Pesados Os metais pesados agem na inativao de enzimas, por sua alta afinidade por apoprotenas. Os principais metais pesados utilizados no controle microbiano so: Mercrio (Hg): j foi muito utilizado como anti-sptico, mas seu uso est decaindo devido ao risco de intoxicao por absoro cutnea. Sulfato de Cobre (CuSO4): utilizado como desinfetante para guas de recreao Nitrato de Prata (AgNO3): um anti-sptico altamente eficiente contra gonococos, que causam oftalmia em recm-nascidos e gonorria em adultos com vida sexual ativa. cidos Tanto os cidos orgnicos quanto os inorgnicos so muito utilizados na conservao de alimentos. So mais utilizados os cidos fracos, e na forma de sal, pois assim apresentam maior solubilidade. A atividade antimicrobiolgica dos cidos fracos atribuda a sua forma no dissociada (HA), pois esta penetra atravs da membrana tornando-se ionizada aps alcanar o interior da clula. A concentrao intracelular destes cidos orgnicos altera o funcionamento normal do gradiente envolvido no sistema de transporte da membrana celular. A concentrao da forma no dissociada do conservante qumico no alimento determinada pelo pKa (pH n qual 50% da molcula est na forma dissociada) do cido e do pH do meio, como mostra a frmula a seguir:
Portanto, a concentrao da forma no dissociada aumenta com a elevao da acidez do alimento, ou seja, o pH do alimento deve ser menor que o pKa, de forma a garantir alta concentrao da forma no dissociada. Os valores de pKa da maioria dos cidos encontra-se na faixa de pH entre 3,0 e 5,0. O pKa usado na medio de sua eficincia no alimento em determinado pH. Exemplos de cidos orgnicos utilizados na indstria de alimentos: cido tartrico (tartarato de sdio, tartarato potssio), cido ctrico (citrato de sdio, citrato de potssio), cido propinico (propionato de clcio).
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia lcalis Os principais lcalis utilizados so o NaOH, o KOH e o Ca(OH)2. O NaOH, principalmente, est presente nos sabes, conferindo-lhes relativa ao anti-sptica. Corantes bsicos So mais eficiente contra Gram-positivos. Exemplo: Cristal Violeta, Azul de Metileno. Redutores Reduzem compostos celulares, levando as clulas morte. Aldedos e derivados: formaldedo e formalina so utilizados para desinfetar paredes e pisos, mas causam irritaes cutneas. Oxidantes Oxidam componentes celulares levando morte das clulas. So muito utilizados como desinfetantes. Exemplo: Oznio, gua oxigenada, permanganato de potssio, perxido de zinco. xido de etileno (gs): um agente alquilante, age inativando protenas e cidos nuclicos. temperatura de 52C o xido de etileno passa do estado lquido para o gasoso. Seus vapores so utilizados para esterilizao de materiais de borracha ou plstico. Antimicrobianos Possuem ao seletiva contra microorganismos, ao contrrio dos anteriores. So um mtodo biolgico de controle microbiano. Sero abordados num prximo assunto.
Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de: conceituar e diferenciar os termos utilizados no controle microbiolgico; descrever os agentes fsicos e qumicos utilizados no controle microbiano; entender o funcionamento de autoclaves e fornos de esterilizao, diferenciando calor mido de calor seco compreender as diferenas encontradas na ao dos diferentes mtodos de anti-sepsia utilizados.
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Material
- Culturas bacterianas - 2 Placas de Petri com Agar - Solues anti-spticas - Gaze estril - Trip e tela de amianto - Recipiente com gua em ebulio
Execuo da prtica
Agentes Qumicos
- dividir uma placa de Petri com Agar em 4 quadrantes - semear os 4 quadrantes da seguinte forma: - 1 quadrante: um aluno encosta o dedo suavemente no Agar - 2 quadrante: outro aluno lava o dedo com gua e sabo por 1 minuto, seca com gaze estril e faz a impresso do dedo - 3 quadrante: outro aluno faz a anti-sepsia de seu dedo com gaze embebida em lcool etlico a 70%, seca com gaze estril e faz a impresso do dedo - 4 quadrante: um outro aluno faz a anti-sepsia de seu dedo com gaze embebida em lcool iodado, seca com gaze estril e faz a impresso do dedo
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Agentes Fsicos - calor
- dividir uma placa de Petri em 8 partes e semear as culturas bacterianas no espao respectivo ao tempo 0 - para os prximos espaos, colocar as culturas em banho-maria fervente at atingir o tempo especificado: - 5 minutos reinocular - 10 minutos reinocular - 20 minutos reinocular
- Aps a execuo de todas as inoculaes, incubar os meios a 37C por 24 horas. - Observar e interpretar o crescimento nos meios.
Exerccios de fixao
1. Qual a diferena entre anti-sepsia e assepsia? 2. Qual o modo de ao do calor seco? E do calor mido? Qual o mais eficaz? 3. Qual o tipo de calor mais utilizado para a indstria de alimentos? Por qu? 4. Por que o lcool etlico utilizado como desinfetante e anti-sptico deve ser hidratado? 5. Qual o mecanismo de ao dos cidos utilizados na conservao de alimentos? 6. Por que a autoclave, embora funcione numa temperatura muito mais baixa que os fornos ou estufas de esterilizao, tambm possuem ao esterilizante?
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Observaes
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Assunto 4: Colorao de Gram

Introduo
Coloraes simples tornam possvel a visualizao das bactrias ao microscpio, mas isso no faz distino entre organismos de morfologia similar. Para tanto, necessrio realizar uma colorao diferencial. Existem diversos mtodos de colorao utilizados para a anlise de bactrias. Entre estes, o mais utilizado a colorao desenvolvida por Christian Gram em 1884. Usando duas seqncias de colorao, com diferentes corantes, este mtodo permite a diviso das bactrias em 2 grandes grupos. O primeiro grupo, que retm a cor do primeiro corante (o cristal violeta), denominado Gram positivo. O segundo grupo perde a cor do primeiro corante e retm a cor do segundo corante utilizado (fucsina) e denominado Gram negativo. Uma soluo de iodo (lugol) utilizada como mordente (um composto qumico que fixa um corante ou outra substncia ao se combinar com o mesmo e formar um composto insolvel) para a primeira etapa da colorao. H tambm um agente descorante entre a utilizao de um e outro corantes. Pode-se utilizar diferentes descorantes, de acordo com a velocidade de descolorao desejada. O lcool etlico a 95% um agente descorante mais devagar, enquanto a acetona agiliza essa etapa. Geralmente utiliza-se uma mistura de lcool etlico e acetona (95:5), obtendo uma velocidade de descolorao intermediria. A maioria dos cocos Gram positiva com exceo dos gneros Neisseria e Veillonella que so os nicos Gram negativos. Assim tambm acontece com os bacilos, sendo a maioria Gram negativos. Entre os bacilos Gram positivos incluem-se aqueles pertencentes aos gneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium. Os vbrios so Gram-negativos. A investigao das caractersticas morfolgicas e de colorao (morfo-tintoriais) das bactrias etapa inicial de grande importncia no isolamento e identificao de bactrias de material clnico bem como de alimentos. No entanto, a identificao completa de uma bactria sempre necessitar de dados fisiolgicos ou genticos da mesma.
Fundamentao terica
A colorao de Gram baseia-se na diferena das paredes celulares das diversas bactrias e como estas sero coradas de forma distinta. As bactrias denominadas Gram negativas possuem uma fina camada de glicoprotena recoberta por uma espessa camada formada principalmente por lipoprotenas e substncias lipdicas. J as consideradas Gram positivas possuem uma nica e espessa camada de glicoprotena. Antes de iniciar a colorao, necessrio fazer um esfregao, ou seja, pegar uma colnia previamente isolada ou uma alada de uma cultura pura e transferir para uma lmina limpa. Se for utilizada uma colnia, deve-se adicionar uma gota/alada de soluo salina a 0,9%, homogeneizando-a. importante que o esfregao seja bem preparado, para que, ao final da colorao, seja possvel a visualizao das bactrias. Tambm importante no esquecer de fixar 27
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia o esfregao na chama do Bico de Bunsen, evitando que a massa de clulas a ser analisada se perca durante as etapas da colorao. Na primeira etapa da colorao, o corante violeta adicionado sobre o esfregao. O corante, ento, penetra na parede da bactria, independente se esta Gram positiva ou Gram negativa. Ao adicionar o lugol, este se combina com o corante Cristal Violeta, formando um grande complexo, o Cristal Violeta-Iodo (CV-I), fixando o corante na parede a bactria. O lcool tem papel fundamental neste mtodo. Ao ser adicionado sobre o esfregao corado com o Cristal violeta vai diferenciar as bactrias: as Gram positivas, com sua parede rica em complexas cadeias de peptidoglicano sero desidratadas, e os poros na parede sero reduzidos, impedindo a sada do complexo CV-I e tornando a parede permanentemente corada de roxo (a cor do complexo CV-I). as bactrias Gram negativas possuem uma fina camada de peptidoglicano, mas acima desta camada encontra-se uma outra, de carter lipdico (rica em LPS, lipoprotenas e outros componentes). Essa camada lipdica, em contato com o lcool, dissolve-se, deixando a camada de peptidoglicano desprotegida e permitindo a sada do complexo CV-I, tornando a clula descorada neste momento. importante lembrar de lavar a lmina aps a etapa de descolorao, pois se restar algum resduo de lcool, a prxima etapa no ser realizada adequadamente, e os resultados podero ser alterados. O esfregao ento tratado com fucsina, que no ter efeito algum sobre as clulas Gram positivas, que esto com os poros de sua parede reduzidos; mas penetrar na parede das clulas Gram negativas, corando-as de vermelho. Esta colorao utilizada para a maioria das bactrias, mas h algumas que no se coram por este mtodo, como as micobactrias, as bactrias espiraladas e as bactrias que no possuem parede celular. Para estes, h outros mtodos de colorao, como o mtodo de ZihelNeelsen, o de Fontana-Tribondeau e o mtodo de visualizao em campo escuro. Alguns fatores podem influenciar nos resultados obtidos na colorao: Os corantes empregados na tcnica, se no filtrados, podem deixar resduos (cristais) na lmina. Um descoramento excessivo ou insuficiente pode levar a uma incorreta diferenciao da bactria pelo lcool. A idade da cultura bacteriana tem importncia fundamental na colorao de Gram. Em culturas envelhecidas, clulas Gram-positivas freqentemente se tornam Gram-negativas. Enzimas lticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos membrana e parede da clula, como por exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes. Conseqentemente, o complexo iodo-cristal violeta poder ser retirado da clula.
Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia executar a tcnica da colorao de Gram; utilizar a objetiva de imerso; relacionar a composio qumica da parede celular das bactrias com os corantes de Gram; compreender a importncia de realizar a colorao de Gram a partir de um material submetido a exame microbiolgico; descrever as formas, arranjos e colorao das bactrias.
Material
- Lminas - Culturas bacterianas em meio lquido e slido - Alas e agulhas - Bateria da colorao de Gram (corantes cristal de violeta e fucsina, lugol, lcool, gua) - Papel de filtro - leo de cedro (leo de imerso) - Microscpio - Bico de Bunsen
Execuo da prtica
Etapas
Preparo e fixao do esfregao

Observaes
Transferir uma alada da cultura ou uma colnia Ao fazer o esfregao a partir de diferentes da placa para uma lmina de microscpio limpa. culturas deve-se observar alguns detalhes: de placa: deve-se coletar apenas 1 colnia, espalhando-a pela lmina isso evitar a observao de colnias diferentes na lmina e que seja coletado um inculo muito carregado, o que dificultar a visualizao das clulas coradas. de caldo: deve-se coletar apenas uma alada e espalh-la na lmina isso evita que seja coletado um inculo muito carregado. Com o auxlio da ala, espalhar a cultura. Para o inculo coletado de caldo no Se tiver sido colhida colnia da placa, adicionar necessrio adicionar soluo salina. Mas para colnia coletada de placa necessrio fazer a salina estril para facilitar o espalhamento. diluio na lmina, evitando que o esfregao 29
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia fique muito concentrado o que dificulta a visualizao das clulas coradas ao microscpio.
Passar a lmina com o esfregao sobre a chama importante fixar o esfregao para que este no do Bico de Bunsen, at que este esteja se perca durante as etapas de lavagem entre a completamente seco. utilizao de um e outro corantes
Colorao do esfregao
O que est acontecendo na parede da bactria?
Etapas da Colorao
Cobrir o esfregao com soluo de Cristal O Cristal Violeta penetra a parede de ambos os Violeta por cerca de 1 minuto. tipos de clulas (Gram + e Gram -)
A seguir, lavar em gua corrente com o A lavagem com gua importante aps cada pissete. etapa para que uma substncia utilizada no interfira na ao da prxima. Nesse caso, a lavagem serve para retirar o excesso de corante.
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Cobrir o esfregao com soluo de Lugol fraco O Lugol uma soluo de Iodo e funciona como por cerca de 1 minuto. mordente neta etapa da colorao, ou seja, ele fixa o corante Cristal Violeta na parede da clula, pois forma um complexo grande: o CV-I
Novamente lavar com gua, e ento lavar com O lcool absoluto, ou soluo de lcool-acetona, lcool absoluto at que no saia mais corante funciona como diferenciador da colorao: da lmina (10 15 segundos). nas Gram +, o lcool desidrata a matriz glicoproteica (peptidoglicano), reduzindo os poros da parede e impedindo a sada do complexo CV-I, corando a clula de roxo:
nas Gram -, o lcool dissolve a membrana externa, de carter lipdico (lipoprotenas, fosfolipdeos, LPS), fazendo com que o complexo CV-I saia da parede, deixando a clula descorada e com os poros da matriz glicoproteica abertos:
Lavar com gua corrente em abundncia, importante prestar com bastante ateno nesta 31
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia para que no reste lcool sobre a lmina. etapa, pois se restar algum lcool na lmina a colorao no prosseguir, j que o prximo corante no se fixar na lmina.
Cobrir o esfregao com fucsina por cerca de A fucsina age de diferentes formas nas 30 segundos. diferentes clulas: nas Gram +, os poros esto reduzidos, impedindo que a fucsina penetre na parede celular, no alterando a cor roxa:
nas Gram -, os poros da camada de peptidoglicano esto abertos, permitindo que a fucsina penetre na clula, corando-as de vermelho:
Lavar com gua e secar suavemente com Aps secar suavemente a lmina, observar ao papel. microscpio na objetiva de imerso (100x), com leo de cedro/mineral e identificar a clula corada.
Para decorar!!! Vi Lulu Ali A Fumar (Cristal Violeta) (Lugol) (lcool) (gua) (Fucsina)
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Exerccios de fixao
1. Em que se baseia o mtodo da colorao de Gram? 2. Por que o lcool considerado como agente diferenciador da colorao de Gram? 3. Qual o papel do mordente (lugol)?
Observaes
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Assunto 5: Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos TSA (Antibiograma)

Introduo
O sucesso na teraputica antimicrobiana de uma infeco bacteriana depende da sensibilidade do agente droga utilizada. Algumas bactrias apresentam um perfil de sensibilidade previsvel e constante, no entanto muitas outras so altamente suscetveis ao desenvolvimento ou aquisio de resistncia a diversos antimicrobianos. Atualmente, o uso adequado e criterioso de antimicrobianos muito importante para preveno da seleo de amostras bacterianas multirresistentes. O teste de sensibilidade a antimicrobianos ou antibiograma permite o esclarecimento objetivo do perfil de sensibilidade do patgeno e a utilizao de drogas eficazes no tratamento. O antibiograma ou TSA indicado para qualquer microrganismo relacionado ao processo infeccioso, mas principalmente queles cuja sensibilidade a drogas normalmente empregadas na terapia no seja previsvel como por exemplos: S. aureus, bacilos gram-negativos no fermentadores (Pseudomonas), bacilos Gram negativos fermentadores (enterobactrias) etc. A seleo dos antimicrobianos para a realizao dos antibiogramas de rotina deve seguir alguns princpios. Uma das estratgias adotadas o reconhecimento que alguns agentes antimicrobianos podem ser agrupados em classes, baseando-se no seu espectro de atividade. Assim, um s representante de classe necessita ser testado, a no ser quando dentro de uma mesma classe de antimicrobianos no exista a possibilidade de equivalncia.
Fundamentao terica
Uma bactria considerada sensvel a um antimicrobiano quando o seu crescimento inibido, in vitro, por uma concentrao trs, ou mais vezes, inferior quela que o antimicrobiano atinge no sangue, caso contrrio ela considerada resistente. O meio termo (bactrias moderadamente resistentes) dado por aquela cujo crescimento inibido por concentraes intermedirias. Na interpretao dos resultados, consideramos as bactrias intermediariamente resistentes como resistentes. A concentrao inibitria do antimicrobiano pode ser determinada direta ou indiretamente. A determinao direta feita pelos chamados mtodos da diluio, e, a indireta, pelo mtodo de difuso em placa com discos impregnados com as drogas. - Mtodo de Diluio (MIC): No mtodo de diluio, concentraes variadas do antibitico, obtidas pela diluio em Caldo ou Agar, so inoculadas com o microrganismo. A concentrao mais baixa do antibitico que evita o crescimento aps a incubao de 12 a 24 horas a concentrao inibitria mnima, a medida da sensibilidade. - Mtodo da Difuso do Disco: Nos testes pelo mtodo de difuso, discos de papel impregnados com o antibitico so colocados uniformemente na superfcie do Agar semeado com o microrganismo. Forma-se, ento, um gradiente de concentrao pela difuso do antibitico a partir do disco para o Agar com conseqente inibio do crescimento do microorganismo sensvel ao determinado (os) antibitico (os). Devido sua simplicidade e por poderem ser realizados rapidamente, os mtodos de difuso com disco (de Bawer e Kirby) tm preferncia sobre os de diluio para os testes de rotina, mas indispensvel que sejam, rigorosamente padronizados, pois a presena de algumas 34
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia substncias nos meios podem influenciar o tamanho do halo de inibio. Para minimizar os riscos de resultados errneos, utilizamos o Agar Mueller-Hinton como meio de crescimento, pois este um meio padronizado e sem componentes que possam interferir nos resultados. Deve-se ressaltar que o teste de sensibilidade deve ser realizado com uma cultura pura, devendo-se fazer uma colorao de Gram antes de qualquer TSA para a confirmao da pureza da cultura. A base para o julgamento de sensibilidade o tamanho real do halo de inibio (zona sem crescimento em volta dos discos de antibitico). O tamanho do halo sozinho no uma medida quantitativa da atividade do antibitico, assim, errneo pensar que quanto maior o halo, mais potente seja o antibitico. Por essa razo, comparaes diretas dos dimetros dos halos produzidos por antibiticos no relacionados so falsos e no devem ser realizados. Deve-se interpretar a sensibilidade de acordo com os dados obtidos (dimetro do halo) em comparao aos dados da tabela de interpretao do antibiograma, com antibacterianos de uso corrente na teraputica clnica. Os antimicrobianos podem ser classificados de acordo com sua ao na clula bacteriana: Stio de ao Mecanismo de ao Classes de antimicrobianos
Antimicrobianos - agem na etapa da sntese da parede que - b-lactmicos (penicilina, que atuam a nvel ocorre externamente membrana plasmtica monobactmicos) da parede celular - impedem a unio de cadeias peptdicas - aumentam atividade das autolisinas - se ligam face externa da membrana Antimicrobianos que atuam a nvel da membrana citoplasmtica - possuem NH3+ (fica na superfcie da - Polimixinas (no reagem membrana, formando poros) e Ag+ (se insere com fosfatdeos de colina na membrana) na sua molcula das clulas animais) - desorganizam a membrana plasmtica - provocam a sada de componentes celulares Aminoglicosdeos (estrptomicina, gentamicina) - Tetraciclinas (tetraciclina, doxiciclina) - Cloranfenicol - Macroldeos (eritromicina Estreptograminas (lincomicina, clindamicina) - Metronidazol - Derivados quinolnicos (cido naxadlico, ciprofloxacino) - Macroldeos (rifampicinas)
Antimicrobianos - aminoglicosdeos e tetraciclinas: se ligam que atuam a nvel subunidade 30s do ribossomo, tornando-o dos ribossomos no funcional, impedindo a incorporao de aminocidos - cloranfenicol, lincomicina e clindamicina: se ligam subunidade 50s do ribossomo, impedindo a unio de novos aminocidos - eritromicina: se liga subunidade 50s do ribossomo e impede a translocao Antimicrobianos - metronidazol: reduzido, se tornando txico que atuam a nvel e quebrando a molcula de DNA do DNA - rifampicina: combinam-se com RNApolimerases, bloqueando a transcrio do DNA - derivados quinolnicos: inibem a ao das girases Antimicrobianos que atuam a nvel do metabolismo intermedirio
- sulfonamidas: bloqueiam a sntese de cido - Sulfonamidas flico (competem com o PABA) - Trimetoprina - trimetoprina: interfere na sntese de purinas, metionina, serina e timina 35
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Na escolha do antimicrobiano a ser utilizado, devem ser avaliados os seguintes critrios: toxicidade seletiva, bactericida, amplo espectro, no deve ser alergnico, no deve provocar efeitos colaterais e no devem ter microorganismos resistentes. necessrio que se observe o tempo mnimo para uso do agente antimicrobiano, para evitar a seleo de microrganismos resistentes. Graas ao uso descuidado de agentes antimicrobianos, a taxa de casos de microrganismos multirresistentes vem aumentando nos ltimos anos. Um exemplo o tratamento da tuberculose, que consiste na administrao de uma combinao de antibiticos (2 a 3) por um longo perodo (6 meses). O abandono precoce do tratamento acaba por selecionar cepas MDR (multi drug resistent). Durante a execuo da prtica utilizaremos a Escala Mac Farland, que consiste num mtodo de quantificao de microorganismos atravs de turbidez. A escala preparada com cido sulfrico e cloreto de brio em diversas concentraes, que reagem formando cloreto de brio obtendo diversos graus de turbidez. A concentrao aproximada de microorganismos dada conforme a leitura de absorbncia realizada, de acordo com a tabela a seguir. Geralmente utilizamos uma concentrao de microrganismos equivalentes ao padro 0,5 da escala MacFarland, ou seja, 1,5x108/ml. Padro da 1 escala MacFarland Concentrao 300 aproximada de microrganismos (x106/ml) 2 3 4 5 6 7 8 9 10
600
900
1.200
1.500
1.800
2.100
2.400
2.700
3.000
O Nutricionista deve conhecer bem a funcionalidade dos antibiogramas e dos antibiticos que so utilizados para o tratamento de infeces a partir do conhecimento sensibilidade das bactrias aos mesmos, para ento acompanhar a dieta do indivduo, fazendo as devidas modificaes necessrias devido as inmeras interaes frmaco-nutrientes e a biodisponibilidade dos frmacos, sem esquecer as possveis deficincias de vitaminas e minerais que podem vir a acontecer devido as introduo de alguns antibiticos.
Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de: conceituar antibiograma (TSA) e identificar os grupos ou quadros clnicos nos quais o antibiograma indicado; diferenciar os mtodos de diluio (CIM ou MIC) do mtodo de difuso e descrever as etapas para a realizao deste ltimo; compreender a influncia de alguns fatores no dimetro do halo e inibio; ler e interpretar resultados possveis de um antibiograma; citar alguns grupos microbianos aonde o TSA deve ser feito atravs de outras tcnicas. 36
Material
- Cultura bacteriana - Tubo com soluo salina estril - Swab estril - Tubo no 0,5 da escala de Mac Farland - Pipeta estril - Placa de Agar Mueller-Hinton - 4 discos de antibiticos diferentes - Pina - Rgua graduada
Execuo da prtica
- ajustar a densidade do inculo acrescentando a cultura soluo salina at esta se igualar turvao do tubo 0,5 da escala de Mac Farland (lembrando que o ajuste feito por turbidez, e no pela cor que o caldo se apresenta).
- embeber o swab na suspenso bacteriana padronizada e inocular na placa de Mueller-Hinton de modo a obter um crescimento confluente (estriar em pelo menos 3 direes)
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - aguardar um tempo para que o Agar absorva o inculo (mais ou menos 10 minutos) e, com o auxlio de uma pina estril, colocar os discos de antibiticos sobre o Agar, pressionando levemente cada disco para que este fique aderido ao meio. Deixar entre eles e deles borda da placa um espao no inferior a 15 mm.
Incubar 18-24 horas a 35o C. Medir com rgua o dimetro do halo de inibio, comparar com os dados da tabela e expressar seus resultados.
Meios utilizados na prtica
Agar Mueller-Hinton Composio do Meio (g/L) Infuso desidratada de carne Casena hidrolisada Amido Agar 300,0 17,5 1,5 17,0 Observaes pH do meio: 7,4 0,2 O meio no apresenta nenhum agente seletivo ou inibidor que possa interferir nos resultados do Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos.
Limites para Interpretao do Antibiograma com 32 Antimicrobianos de uso corrente na Teraputica Clnica
Antimicrobiano Smb. Conc. disco Dimetro do Halo de Inibio Resistente Amicacina BB 30 mcg 10mcg 10 mcg 14 11 20 Intermedirio 15-18 12-13 21-28 Sensvel 17 14 29
Ampicilina ao testar microorganismos AP gram-negativos e enterococos Ampicilina ao testar estafilococos e AP microorganismos sensveis penicilina G Ampicilina ao testar Haemophilus sp. AP
10 mcg
19
20
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia cido Nalidxico Bacitracina NA BC 30 mcg 10 un. 100 mcg 100 mcg 30 mcg 2 mcg 30 mcg 10 mcg 15 mcg 10 mcg 10 mcg 30 mcg 30 mcg 30 mcg 300 mcg 30 mcg 6 mcg 10 un. 10 un. 500 un. 30 mcg 25 mcg 300 mcg 30 mcg 10 mcg 30 mcg 13 8 17 13 14 14 14 12 8 13 11 12 13 13 12 14 17 9 20 11 8 8 10 10 12 14 12 9 14 -18 9-12 18-22 14-16 15-17 15-17 15-16 13 -17 9-10 14-17 12 -14 13-14 14-17 14-18 13-16 15-16 18-21 10-13 21-28 12-21 0-11 09-11 11-15 11 -15 13-16 15-18 13-14 10-11 19 13 23 17 18 18 17 18 11 18 15 15 18 19 17 17 22 14 29 22 12 12 16 16 17 19 15 12
Carbenicilina ao testar Proteus sp. e CR E. coli Carbenicilina ao testar Pseudomonas CR aeruginosa Cefalotina ao relatar sensibilidade a CF todas as cefalosporinas Cefoxitina CT
Clindamicina ao relatar sensibilidade CI clindamicina e lindomicina Cloranfenicol Colistina Eritromicina Estreptomicina Gentamicina Konanilcina Nalidxico cido Neomicina Nitrofurantona Novoblocina Oxocilina Penicilina G. ao testar Estafilococos Penicilina G. ao microorganismos Penicilina G. Polimixina Sulfa-Trimetropim Sulfazotrim Trimetoprim) Sulfonamidas Tetraciclina Tobramicina Vancomicina (Sulfamotoxazol testar CO CL EL ET GN KN AN NO NT NV OX PN outros PN PL STX + SFT SF TT TB VC
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Exerccios de fixao
1. Qual a diferena entre os mtodos de difuso e impregnao em discos? 2. Por que o mtodo de impregnao do antimicrobiano em discos mais utilizada? 3. Qual a importncia da inoculao ser realizada de modo correto, permitindo crescimento confluente? 4. Podemos comparar os halos de inibio obtidos com antimicrobianos diferentes ou em diferentes concentraes?
Observaes
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Assunto 6: Cocos Gram positivos

Introduo
Os principais gneros de Cocos Gram positivos de interesse na rea de sade so o Staphylococcus e o Streptococcus, membros da famlia Micrococcaceae. Em ambos os gneros, podemos encontrar espcies que compem a microbiota normal de diversas pessoas, como Staphylococcus epidermidis e Enterococcus (antigamente denominado Streptococcus faecalis), mas tambm existem espcies altamente patognicas, como Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes. importante ressaltar que os enterococos no so considerados como estreptococos, mas um gnero parte. Como este gnero foi por muito tempo estudado como sendo parte do gnero Streptococcus, ainda hoje comum estuda-lo junto com este, identificando as principais diferenas entre ambos. So gneros bastante parecidos, causadores de doenas denominadas piognicas (com produo de pus), a principal diferena entre ambos a produo de catalase por Staphylococcus. Ambos os gneros, Staphylococcus e Streptococcus, so importantes na rea de alimentos j que podem ser veiculados por alimentos.
Fundamentao terica
Staphylococcus
As bactrias do gnero Staphylococcus so cocos Gram-positivos, que quando vistos ao microscpio aparecem na forma de cachos de uva. So anaerbias facultativas, com maior crescimento em condies aerbias, quando produzem catalase. So amplamente distribudos na natureza e fazem parte da microbiota normal da pele e mucosas de mamferos e aves (encontrados principalmente na mucosa da nasofaringe). De todas as espcies existentes, as de maior interesse humano so Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, e Staphylococcus saprophyticus. Para diferenciao d a espcie, utilizamos as provas de fermentao do manitol, da coagulase, DNAse, sensibilidade novobiocina e reduo de nitrato. A espcie S. aureus a que est mais freqentemente associada a doenas estafiloccicas, sendo de origem alimentar ou no, est geralmente envolvida em infeces humanas (de origem comunitria e hospitalar) e apresenta uma freqncia de 30 a 40% de portadores na populao. So bactrias mesfilas, com crescimento na faixa de 7C a 47,8C, e as toxinas so produzidas entre 10C e 46C, com timo entre 40C e 45C. Quanto mais baixa for a temperatura, mais tempo ser necessrio para produzir enterotoxinas. So bactrias tolerantes a concentraes de 10% a 20% de NaCl, sendo este um fator de estimulao da produo da coagulase. Tambm so tolerantes a altas concentraes de nitratos. Crescem em faixa de pH de 4 a 9,8, com timo entre 6 e 7. E possuem capacidade de crescer em valores de atividade aquosa inferior muitas bactrias, at entre 0,86-0,83.
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia So inibidos pela presena de corantes do tipo azul de metileno e violeta de genciana. Crescem em meio de Agar simples, Agar Sangue e Chapman. Suas colnias so redondas, elevadas, opacas e de colorao amarelo dourado a branca. A intoxicao por S. aureus causada quando se ingerem alimentos onde haja a toxina pr-formada, que s liberada em concentraes entre 105 a 106 UFC/ g do alimento. Logo, se for controlada a proliferao do microorganismo no haver risco de intoxicao. As enterotoxinas produzidas por S. aureus so protenas simples, higroscpicas, facilmente solveis em gua e solues salinas, resistentes a tripsina, quimiotripsina, renina, papana e pepsina, e algumas cepas so resistentes at a vancomicina. So tambm termorresistentes. importante observar esse detalhe, j que a maioria dos alimentos sofre um tratamento trmico durante o processamento, mas se j houver a toxina formada no alimento, esta no ser inativada. Como j foi dito, mecanismo de preveno deve ser feito no sentido de evitar a proliferao do microorganismo para a no formao das enterotoxinas, o que pode ser feito atravs da manuteno dos alimentos sob refrigerao, ou manter os alimentos a uma temperatura 60C ps-preparo. As principais provas para identificao das principais espcies de Staphylococcus esto descritas na tabela a seguir: Provas Bioqumicas Cocos Gram-positivos Pigmentao Colonial Catalase Coagulase Fermentao do Manitol DNAse Sensibilidade a Novobiocina Reduo de Nitratos S. aureus + Amarela ou Branca + +/+ + R S. epidermidis + Branca + S + S. saprophyticus + Branca + R -
Streptococcus
As bactrias do gnero Streptococcus tambm so cocos Gram-positivos, mas dispostos em pares ou fileiras, ao contrrio de Staphylococcus. Outra diferena entre Streptococcus e Staphylococcus a no produo de catalase por Streptococcus. Fazem parte da microbiota normal (sendo encontrados principalmente na orofaringe), apesar disso, muitos deles so responsveis por uma variedade de manifestaes clnicas, sendo considerados importantes agentes infecciosos tanto para o homem quanto para os animais. A maioria necessita de meios enriquecidos, geralmente pela adio de sangue para o crescimento. So utilizadas dois tipos de classificao para diferenciar as espcies: potencial hemoltico (a, b e g) e os grupos de Lancefield (determinado por um carboidrato da parede celular), cujos principais grupo so o A e o B. O gnero apresenta espcies de interesse mdico como: Streptococcus viridans, Streptococcus b hemolticos do Grupo A (S. pyogenes) e do grupo B (S. agalactiae) e Streptococcus pneumoniae. Os enterococos pertencem atualmente a um gnero separado e possuem caractersticas peculiares: so resistentes a variaes de temperatura (15-45C) e a
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia presso osmtica (at 6,5 % de NaCl). So membros da microbiota normal do trato gastrintestinal de diversas pessoas. O gnero Streptococcus composto de bactrias anaerbias facultativas, com maior crescimento em atmosfera com 10% de CO2. Possuem atividade hemoltica, fator importante para a classificao das cepas patognicas em a (hemlise parcial), b (hemlise total) e g (anemoltico). Os estreptococos a hemolticos apresentam zonas de hemlise, possuindo hemcias ntegras na parte mais interna junto a colnia, e hemlise maior na parte mais externa. Freqentemente, aparece uma colorao esverdeada na rea de hemlise (devido a alterao da hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da clula bacteriana e conseqente liberao de biliverdina e bilirrubina), que originou a qualificao "estreptococos do grupo esverdescente" ou Streptococcus viridans. Os Streptococcus pneumoniae, principais agentes bacterianos de pneumonia, apresentam hemlise a, uma colnia puntiforme com um aprofundamento no pice da colnia (parecendo um pequeno vulco). Os estreptococos b hemolticos produzem uma zona de hemlise total, no se observando hemcias ntegras (microscpio ptico com objetiva de 10x). O Streptococcus pyogenes apresenta dois tipos de hemolisinas O e S. A hemolisina O destruda pela ao do oxignio atmosfrico e, portanto, s demonstrada em colnias crescidas em profundidade no Agar sangue. A hemolisina S estvel ao oxignio do ar e produz hemlise mesmo nas colnias crescidas na superfcie do meio de cultura. Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam hemolisina O, se torna necessria a semeadura do germe pela tcnica em profundidade ("pourplate") , ou a realizao de perfuraes ("stabs") nos quadrantes de esgotamento ou a incubao em atmosfera pobre em oxignio (tcnica da jarra com vela). Os estreptococos g no produzem hemlise, so anemolticos, isso significa que no tm capacidade ltica nenhuma sobre as hemcias. Muitas das espcies saprfitas so deste grupo. Para o isolamento pode-se recorrer previamente ao uso de meios seletivos ou de enriquecimento. O meio de seletivo especfico para estreptococos mais usado o Caldo Hitchens-Pike. Um meio alternativo para enriquecimento o Caldo Tioglicolato de Sdio, adequado para o crescimento de bactrias, inclusive aquelas microaerfilas e anaerbias. O meio clssico de isolamento de estreptococos o Agar Sangue aonde pode-se observar o perfil hemoltico dos mesmos. As colnias de estreptococos isoladas em Agar Sangue so puntiformes (< 1mm de dimetro), transparentes luz transmitida e peroladas luz refletida. Na identificao de estreptococos alm do perfil hemoltico, utilizam-se outras provas auxiliares para a identificao das principais espcies. O esquema abaixo apresenta estas provas:
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Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de: compreender o papel dos manipuladores de alimentos como potenciais reservatrios de S. aureus produtores de enterotoxinas; caracterizar e compreender o modo de ao dos meios utilizados para o isolamento de Staphylococcus (Chapman ou A. Manitol Salgado) e Streptococcus (Agar Sangue); caracterizar e compreender as provas bsicas de identificao e diferenciao de Staphylococcus e Streptococcus (catalase, coagulase e DNAse), compreendendo o mecanismo de ao destas.
Material
Isolamento de anfibiontes das vias areas superiores
- swabs estreis - tubo com soluo salina - Agar Chapman - Caldo Tioglicolato (ou Hitchens-Pike).
Identificao de Staphylococcus e Streptococcus I
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - Agar sangue - Caldo simples ou BHI - Agar inclinado - Agar DNAse - dessecador com vela.
Identificao de Staphylococcus e Streptococcus II
- reativo para catalase (H2O2) - reativo para DNAse (HCl 1N) - reativo para coagulase (plasma sangneo) - tubo controle positivo - lminas - conjunto de colorao de Gram.
Execuo da prtica
Isolamento de anfibiontes das vias areas superiores
- colher material da nasofaringe (fossas nasais) com o auxlio de swab previamente umedecido em soluo salina estril e inocular o meio Chapman com a tcnica de esgotamento em estria e incubar a 37oC por 24 horas, conforme o esquema a seguir:
- colher material da orofaringe (tonsilas palatinas/amdalas) com o auxlio de swab previamente umedecido em soluo salina estril e inocular o meio de Tioglicolato e incubar a 37oC por 24 horas, conforme o esquema a seguir:
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Identificao de Staphylococcus e Streptococcus I
- observar o crescimento tpico ou no de S.aureus no meio de Chapman e inocular colnia isolada em caldo BHI, Agar DNAse e Agar inclinado e incubar a 37oC por 24 horas, conforme o esquema abaixo:
- inocular por esgotamento o crescimento do meio Tioglicolato em placas de Agar sangue e incubar a 37oC por 24 horas em microaerofila pela tcnica da vela, conforme o esquema abaixo:
Identificao de Staphylococcus e Streptococcus II
- utilizando os reativos prprios, fazer as leituras das provas de catalase (H2O2), DNAse (HCl 1N) e coagulase (plasma de coelho citratado)
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OBSERVAO: As principais provas bioqumicas utilizadas para a identificao de bactrias do gnero Staphylococcus so: Fermentao do Manitol: a primeira prova a ser realizada, j na primeira etapa da prtica. verificada no meio de Chapman, ou Agar Manitol Salgado, que contm o indicador de pH vermelho de fenol. Quando o microorganismo utiliza o manitol como fonte de carbono (fermentando-o), produz cido no meio, reduzindo o pH e alterando a cor do indicador de vermelho (laranja) para amarelo. Caso o microorganismo seja isolado em Agar Sangue, a prova pode ser realizada em Caldo Vermelho de Fenol suplementado com 1,0% de manitol. Prova da Catalase: se destina a verificao da presena da enzima catalase, uma superoxidodismutase. A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio com formao de gua e oxignio molecular (H2O2 + catalase H2O + O2). A prova pode ser efetuada com o crescimento bacteriano obtido em qualquer meio de cultura, exceto meios com sangue, pois este possui catalase, levando a resultados falso-positivos. A verificao da produo dessa enzima por determinada bactria pode ser feita adicionando-se perxido de hidrognio (H2O2 a 30%) cultura em meio slido ou lquido, e verificando-se desprendimento de bolhas gasosas (O2). Se o microorganismo produzir catalase, o resultado positivo ser visto como desprendimento de gs sobre colnia (borbulhamento). Uma leitura da prova de catalase pode ser feita de maneira cuidadosa a partir de um crescimento em Agar Sangue da seguinte maneira: adiciona-se primeiramente uma gota de perxido em uma rea do meio desprovida de crescimento e em seguida sobre uma colnia a ser testada. Considera-se positivo apenas se o borbulhamento foi mais rpido e intenso sobre a colnia. Prova da Coagulase: Verifica a capacidade do microrganismo em coagular o plasma atravs da enzima coagulase. A coagulase estafiloccica se apresenta em duas formas: coagulase ligada e coagulase livre. A coagulase ligada converte fibrinognio em fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagulao, e pode ser detectada em teste direto em lmina, utilizando-se da suspenso de Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma citratado, fazendo movimentos circulares e observando-se a formao de cogulo no tempo de 1-2 minutos. Pode se tornar mais sensvel o 47
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia teste em tubo, por este detectar tanto coagulase livre como coagulase ligada, sendo a prova de escolha. A coagulase livre reage com o fator de coagulao do plasma, o CRF, formando uma substncia semelhante, mas no idntica trombina, que converte fibrinognio em fibrina. Para o teste utilizamos plasma citratado humano ou de coelho, estril, diludo na proporo 1:5 em soluo salina; a reao ocorre volume a volume (0,5ml de plasma + 0,5 ml da cultura) a 37 C. Estudos recentes demonstraram que a produo da enzima coagulase se intensifica quando o germe crescido em meio contendo alta concentrao de NaCl. Desta forma, aconselha-se a utilizao de colnias para a prova, crescidas em Agar Manitol Salgado (Chapman), este procedimento aumentaria a sensibilidade do teste. Semear uma alada do germe em estudo em um tubo contendo o plasma diludo e incubar a 37C. Devem ser feitas leituras peridicas a cada30 minutos por um perodo de at 4 horas e uma leitura final aps 24 horas, pois algumas espcies produzem tambm fibrinolisina, que dissolve o cogulo formado. A menor coagulao considerada prova positiva. Aconselha-se, tambm utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S. aureus, previamente conhecida, como comprovao do teste. Prova da DNAse: Verifica a capacidade do microorganismo utilizar DNA como fonte energtica, atravs da produo da enzima DNAse. O meio utilizado (Agar DNAse) possui DNA em sua composio. O microorganismo semeado em forma de spot ou estria reta simples. Aps o crescimento, adiciona-se ao meio HCl 1N, que vai revelar o resultado. O HCl precipitar todo o DNA presente no meio (lembrando que o DNA e protena e desnatura em presena de cidos). Se o microorganismo produzir DNAse, ter degradado todo o DNA ao redor do crescimento, e no haver precipitao. Quando colocado contra o fundo escuro, pode-se ver claramente o meio turvo e um halo claro (translcido) ao redor do crescimento. Sensibilidade a Novobiocina: Este teste no ser realizado na aula prtica, mas muito utilizado na rotina de laboratrio. Esta prova diferenciadora de espcie, pois apenas S. epidermidis resistente a este antimicrobiano. O teste realizado semelhantemente ao TSA (Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos): inocula-se a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton, de modo a obter crescimento confluente e adicionar o disco de Novobiocina com concentrao de 5 mg/ml. Aps a incubao verificar o tamanho do halo de inibio e comparar com uma tabela especfica. - caracterizar a presena de colnias tpicas de Streptococcus e seu eventual padro hemoltico no meio de Agar sangue.
- preparar lminas com esfregao de amostra coletada do Agar Inclinado (Staphylococcus) e do Agar Sangue (Streptococcus), corar pelo mtodo de Gram e observar em microscopia. 48
OBSERVAO: H provas bioqumicas que podem ser utilizadas na identificao de Streptococcus, embora ns no as utilizemos na aula prtica. Estas so: Sensibilidade a Optoquina: Esta prova diferenciadora de espcie (S. pneumoniae e S. viridans). O teste realizado semelhantemente ao TSA (Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos): inocula-se a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton, de modo a obter crescimento confluente e adicionar o disco de Optoquina. Aps a incubao verificar o tamanho do halo de inibio. Considerar como sensvel um halo de inibio de raio maior que 2 cm. Bile solubilidade: Esta prova utilizada para identificar se o microorganismo capaz de resistir presena de bile no meio. Dentre os estreptococos, apenas os enterococos so capazes de solubilizar a bile no meio. A prova realizada conforme esquema que se segue: A 1,0 mL de cultura em caldo, adicionar uma gota de vermelho de fenol. Acertar o pH em aproximadamente 7,5 com NaOH 0,1N (cor rsea). Adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sdio ou blis. Incubar juntamente com um tubo sem blis a 37 C por 3 horas. Sensibilidade a Bacitracina: Esta prova identifica os Streptococcus do grupo A, poisestes so sensveis, enquanto outros Streptococcus no grupo A so resistentes a este antimicrobiano. O teste realizado semelhantemente ao TSA (Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos): inocula-se a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton, de modo a obter crescimento confluente e adicionar o disco de Bacitracina com concentrao de 0,04U. Aps a incubao em baixa tenso de O2, verificar o tamanho do halo de inibio. Considerar como sensvel um halo de inibio de raio maior que 2 cm. Crescimento a 56C: Para evitar dvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus faecalis), submeter a cultura a um aquecimento de 56 C por 30 minutos. Somente os enterococos resistem a esse tratamento. Crescimento em Agar Chapman: Esta prova tambm diferencia os enterococos, pois estes toleram a alta concentrao de NaCl presente no meio, como acontece com os estafilococos. Crescimento em Agar EMB: Outra prova para identificao de enterococos, pois estes suportam a presena de corantes como o azul de metileno (que inibidor para a maioria dos Gram positivos).
Agar Chapman Composio do Meio (g/L) Extrato de carne Peptona Manitol Cloreto de sdio Vermelho de fenol Agar 1,0 10,0 10,0 75,0 0,025 15,0 Observaes pH do meio: 7,5 0,2 Este meio possui agentes seletivo (NaCl a uma concentrao de 7,5%), indicador (vermelho de fenol) e diferencial (manitol). Ou seja, alm de restringir o crescimento de 49
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia bactrias no halfilas, permite a diferenciao de microorganismo fermentadores de manitol, o que indicado pela viragem da cor do indicador de pH Vermelho de fenol, de laranja para amarelo.
Caldo Tioglicolato de Sdio Composio do Meio (g/L) Extrato de levedura Triptona Glicose Toglicolato de sdio Cloreto de sdio L-cistina Resazurina Agar 5,0 15,0 5,5 0,5 2,5 0,5 0,001 0,75 Observaes pH do meio: 7,1 0,2 Esse meio adequado para o cultivo de microorganismos aerbios e anaerbios. A resazurina um agente indicador de oxidao, em presena de O2 o meio adquire colorao avermelhada.
Agar Sangue Composio do Meio (g/L) Triptona Peptona neutralizada Extrato de levedura Cloreto de sdio Sangue de carneiro Agar 14,0 4,5 4,5 5,0 7,0 12,5 Observaes pH do meio: 7,3 0,2 O meio altamente nutriente, alm de ser suplementado com sangue, o que o torna um meio muito utilizado em etapas de enriquecimento e para visualizao de propriedades hemolticas de diversos microorganismos. Como na possui agentes seletivos, deve ser manipulado com bastante cuidado.
Caldo BHI (Brain Heart Infusion) Composio do Meio (g/L) Slidos de infuso de crebro de bezerro Slidos de infuso de corao de boi Proteose peptona Glicose Cloreto de sdio Fosfato dissdico 12,5 5,0 10,0 2,0 5,0 2,5 Observaes pH do meio: 7,4 0,2 Este um caldo de infuso tamponado, altamente rico em nutrientes e que no apresenta nenhum agente seletivo. muito indicado para o crescimento de estafilococos para verificao de produo de coagulase, pois potencializa essa caracterstica do microorganismo.
Agar DNAse
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Composio do Meio (g/L) Triptose cido deoxiribonuclico Cloreto de sdio Agar 20,0 2,0 5,0 12,0 Observaes pH do meio: 7,3 0,2 A produo da DNAse no meio detectada graas ao DNA adicionado. Para a leitura, necessrio adicionar HCL 1 N sobre toda a superfcie do meio e aguardar a precipitao. Esta prova utilizada para identificar estafilococos patognicos, por estar correlacionada produo de coagulase.
** O Caldo simples (TSB) e o Agar inclinado (TSA) so meios simples, sem nenhum nutriente de enriquecimento ou nenhum componente inibidor ou indicador, por isso, suas composies no sero estabelecidas aqui. Caso haja interesse, disponibilizamos os Manuais de Meios aos alunos.
Exerccios de fixao
1. Qual a finalidade do Agar Chapman na primeira etapa da aula prtica? 2. De que maneiras podemos diferenciar os estreptococos dos enterococos? 3. Qual o mtodo de classificao de estreptococos foi utilizada na aula? Em que estase baseia? 4. Quais as principais provas para identificao bioqumica de estafilocococs e quais os seus fundamentos? 5. Qual a finalidade da tcnica da Jarra com Vela?
Observaes
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Assunto 7: Colorao de Zihel-Neelsen (Visualizao de Bactrias Espiraladas)

Introduo
Algumas bactrias no se coram pelo mtodo de colorao de Gram, pelo simples fato de apresentarem composio da parede celular diferenciada das bactrias Gram positivas e Gram negativas. Entre estas bactrias esto as micobactrias, como o Mycobacterium tuberculosis, um bacilo lcool-cido resistente de importncia mdica, por ser o causador da tuberculose humana e o Mycobacterium bovis, de grande interesse na nutrio por causar tuberculose em bovinos, sendo esta uma zoonose veiculada por alimentos. As micobactrias penetram pela mucosa da orofaringe e do trato digestivo chegando aos ndulos mesentricos e a partir da pode se disseminar para outros tecidos e rgos, quando inaladas podem provocar tuberculose pulmonar idntica causada pelo Mycobacterium tuberculosis. A colorao de Ziehl-Neelsen a tcnica mais utilizada na identificao das micobactrias e de bactrias lcool-cido resistentes em geral, como as bactrias espiraladas.. Muitas bactrias espiraladas esto associadas a doenas humanas: Leptospira (leptospirose); Treponema (sfilis) e Borrelia (doena de Lyme). Como so microrganismos muito delgados e recobertos por uma bainha protica, a colorao de Gram no til na sua visualizao. Para tanto so empregados mtodos de impregnao com sais de prata (mtodo de Fontana-Tribondeau) que permite sua observao em microscopia de campo claro e a observao direta em microscopia de campo escuro. A presena de bacilos lcool-cido resistentes no escarro forte sugesto de tuberculose pulmonar. Alm disso, sangue colhido do lbulo da orelha ou material colhido da prpria leso indica o diagnstico da lepra (Mycobacterium leprae). Faz parte da prtica do Nutricionista conhecer o assunto e atentar para a importncia na orientao do consumo de leite pasteurizado, de origem conhecida e inspecionado, pois as infeces causadas por essas bactrias so graves.
Fundamentao terica
O gnero Mycobacterium contm grande nmero de espcies, as patognicas de maior importncia para o homem so Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium bovis. Com exceo da Mycobacterium leprae (que s pode ser cultivado em cultura de clulas), as micobactrias podem ser cultivadas em laboratrio (in vitro), em meio de cultura seletivo. As bactrias desse gnero so bacilos finos, diferentes das demais bactrias em vrias propriedades, a comear pela parede celular que composta de cidos graxos de cadeia longa (cidos miclicos) e ceras (steres de cidos graxos). So aerbias estritas, possuindo tropismo pela rvore respiratria. No so produtoras de esporos e possuem crescimento lento, graas composio de sua parede celular, de carter altamente lipdico, dificultando a absoro de nutrientes. Por esse mesmo motivo as micobactrias no se coram pela Colorao de Gram. Sua parede celular rica em substncias lipdicas, como ceras e cidos graxos de cadeia longa, dificulta a penetrao dos corantes utilizados neste mtodo. A velocidade de crescimento e a temperatura tima para seu crescimento so variveis.
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia So bactrias intracelulares facultativos que se proliferam no interior de macrfagos. So resistentes ao hidrxido de sdio, cido sulfrico e a certos anti-spticos. Pelas normas estabelecidas pela Campanha Nacional contra Tuberculose, a interpretao da lmina pode ser: Negativo (-) Positivo (+) Positivo (++) Positivo (+++) Ausncia de BAAR em 100 campos microscpicos Menos de 1 bacilo/campo em 100 campos 1 a 10 bacilos/campo em 50 campos Mais de 10 bacilos/campo em 20 campos
Na tcnica da colorao de Ziehl-Neelsen, aliam-se a utilizao de calor e agentes qumicos mais fortes, como a fucsina fenicada e a soluo de lcool etlico-cido clordrico (97:3), que possibilitam que a clula se core, podendo ser visualizada no microscpio. Alm disso, a utilizao destes fatores agressivos tambm elimina quaisquer contaminantes biolgicos (outras bactrias) que possam existir no esfregao, aumentando a possibilidade de visualizao e confirmao das micobactrias. Para a visualizao de bactrias espiraladas pode-se utilizar um artifcio que aumenta a espessura das mesmas permitindo assim a sua observao. Isto conseguido atravs da impregnao da superfcie da bactria com sais de prata que uma vez aquecidos sofrem oxidao e conseqente escurecimento. A utilizao de microscopia de campo escuro tambm permite a visualizao direta das bactrias. O campo escuro conseguido pelo uso de um condensador especial que faz com que os raios luminosos penetrem na objetiva apenas pelos seus bordos de modo que a iluminao das partculas se faa por reflexo e no transmisso. Desse modo apenas as partculas presentes so iluminadas contrastando com um findo escuro. Atravs desta visualizao se faz possvel inclusive a realizao do diagnstico por soroaglutinao microscpica (microaglutinao) na leptospirose.
Objetivo
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de: executar a tcnica da colorao de Zihel Neelsen; diferenciar a colorao de Zihel Neelsen da colorao de Gram; relacionar a composio qumica da parede celular das micobactrias com os corantes de Zihel; diferenciar BAAR e BNAAR; compreender o princpio do mtodo de Fontana Tribondeau;
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia diferenciar microscopia de campo claro e campo escuro e associar a importncia desta ltima na observao de espiroquetas.
Material
- Lminas com esfregaos fixados de escarro de paciente com tuberculose - Fucsina de Zihel - Azul de metileno - Soluo de lcool (97%) e cido clordrico (3%) - gua - Papel de filtro - leo de cedro - Microscpio - Bico de Bunsen
Execuo da prtica
Etapas
Preparo e fixao do esfregao

Observaes
Transferir uma alada da cultura ou uma Ao fazer o esfregao a partir de diferentes colnia da placa para uma lmina de culturas deve-se observar alguns detalhes: microscpio limpa. de placa: deve-se coletar apenas 1 colnia, espalhando-a pela lmina isso evitar a observao de colnias diferentes na lmina e que seja coletado um inculo muito carregado, o que dificultar a visualizao das clulas coradas. de caldo: deve-se coletar apenas uma alada e espalh-la na lmina isso evita que seja coletado um inculo muito carregado.
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Com o auxlio da ala, espalhar a cultura. Se Para o inculo coletado de caldo no tiver sido colhida colnia da placa, adicionar necessrio adicionar soluo salina. Mas para salina estril para facilitar o espalhamento. colnia coletada de placa necessrio fazer a diluio na lmina, evitando que o esfregao fique muito concentrado o que dificulta a visualizao das clulas coradas ao microscpio.
Passar a lmina com o esfregao sobre a importante fixar o esfregao para que este no chama do Bico de Bunsen, at que este esteja se perca durante as etapas de lavagem entre a completamente seco. utilizao de um e outro corantes
Colorao do esfregao
O que est acontecendo na parede da bactria?
Etapas da Colorao
Cobrir o esfregao com soluo fucsina Nesse momento, a fucsina no penetra na fenicada. parede da clula, pois sua composio altamente lipdica impede a difuso do corante. Esta colorao muito mais agressiva que a colorao de Gram. Note que a fucsina utilizada cerca de 5x mais concentrada que a utilizada no mtodo de Gram.
Aquecer intermitentemente at a emisso de O aquecimento torna a parede lipdica mais vapores e manter por mais 5 minutos sem fluida, permitindo a entrada do corante na parede deixar que entre em ebulio. da clula.
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Lavar rapidamente com gua.
Essa etapa realizada para que no haja excesso de corante sobre o esfregao na prxima etapa.
Lavar a lmina inclinada a 45 com soluo de lcool etlico:cido clordrico (97:3) at que no haja mais desprendimento de corante (aproximadamente 2 minutos).
A soluo lcool-cida responsvel por fixar o corante na parede da clula, impedindo sua sada. Como essas bactrias so lcool-cido resistentes, no h dissoluo da parede, mesmo esta tendo alto carter lipdico.
Lavar o esfregao com soluo de lcool importante que esta etapa seja realizada, pois etlico:cido clordrico (97:3) at que no haja se restar algum corante na lmina, o prximo mais desprendimento de corante. corante a ser utilizado no se fixar na lmina, no cumprindo seu papel.
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Cobrir o esfregao com corante Azul de importante que esta etapa seja realizada, pois Metileno por 30 segundos. se restar algum corante na lmina, o prximo corante a ser utilizado no se fixar na lmina, no cumprindo seu papel..
Lavar com gua e secar suavemente com Aps secar, observar no microscpio, objetiva de papel. imerso (100x), com leo de cedro/mineral.
Comparando com a colorao de Gram: Colorao de Gram Principal corante Fixador do corante Corante de contraste Cristal violeta Lugol Fucsina Colorao de Zihel Neelsen Fucsina fenicada lcool:cido clordrico Azul de metileno
Exerccios de fixao
1. Em que se baseia o mtodo da colorao de Zihel Neelsen? 2. Por que os corantes desse mtodo so mais agressivos que os utilizados no mtodo de Gram (por exemplo, a fucisna 5x mais concentrada)? 3. Por que os BAAR no se coram bem pelo mtodo de Gram?
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Observaes
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Assunto 8: Bacilos Gram-negativos

Introduo
As bactrias Gram negativas so de grande importncia, pois abrangem as enterobactrias, e dentro deste grupo podemos citar dois subgrupos de grande destaque na rea de alimentos: os coliformes fecais e totais, que indicam contaminao do alimento por manipulao inadequada. A famlia Enterobacteriaceae uma das mais importantes famlias bacterianas, a ela pertencem muitos dos patgenos mais importantes para o homem e para os animais. Estes patgenos esto entre os principais agentes de infeco hospitalar e constituem a principal causa de infeco intestinal em muitos pases. Alm disso, quando patgenos de animais, so importantes porque causam perdas econmicas e porque os animais se apresentam como reservatrio de patgenos humanos So de grande importncia na nutrio porque indicam contaminao de origem fecal, j que seu habitat o Trato Gastrintestinal de animais e do homem, de onde, via alimentos e gua, se disseminam no meio, contaminando homens e outros animais. Os gneros de maior importncia so: Escherichia * Shigella Salmonella Yersinia Enterobacter * Citrobacter * Klebsiella * Os gneros sublinhados so enteropatgenos (causadores de doenas intestinais) e os gneros assinalados compem o grupo dos coliformes fecais, indicadores de contaminao fecal. Dentre estes s E. coli tem como habitat primrio o TI do homem e de animais. Os demais tambm esto presentes em outros ambientes como vegetais e solo, onde persistem por tempo superior ao de bactrias patognicas de origem intestinal como Salmonella e Shigella. A espcie E. coli to varivel que existem sorotipos patognicos e no patognicos, e at da flora normal. Os principais microorganismos utilizados para indicar a qualidade microbiolgica de alimentos so os coliformes fecais e totais. Visto a grande importncia das enterobactrias na formao e atuao do nutricionista, enfocaremos estas bactrias na aula prtica.
Fundamentao terica
O uso de Escherichia coli como um indicador de contaminao de origem fecal foi proposto uma vez que este microorganismo encontrado no trato intestinal do homem e de animais de sangue quente. O indicador ideal de contaminao fecal deveria ser de rpida e fcil deteco, ser facilmente distinguvel de outros microorganismos da microbiota do alimento, ter como hbitat exclusivo o trato intestinal do homem e de outros animais, ocorrer em nmeros muito altos nas fezes, entre outras caractersticas importantes. 59
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia O grupo dos coliformes totais composto por bactrias da famlia Enterobacteriaceae capazes de fermentar a lactose com produo de gs, quando incubados a 35-37C, por 48 horas. Deste grupo, apenas a E. coli tem como hbitat primrio o trato intestinal do homem e de animais. A presena de coliformes totais no alimento no indica, necessariamente, contaminao fecal recente ou ocorrncia de enteropatgenos, j que outras espcies (Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella) no so de origem fecal. O grupo dos coliformes fecais so microorganismos pertencentes ao grupo dos totais, diferenciando-se pela capacidade de fermentar lactose com produo de gs em temperatura de 44-45C. Nessas condies, a maioria das cepas de E. coli so positivas, enquanto as outras bactrias possuem apenas algumas cepas com essa caracterstica. A pesquisa de coliformes fecais ou de E. coli nos alimentos fornece informaes sobre as condies higinicas do produto e indicao da presena de patgenos. Quanto maior a concentrao de coliformes fecais na amostra analisada, maior o risco de haver patgenos entricos naquela amostra (gua, alimentos, etc.). Em alimentos vegetais frescos, o nico indicador vlido de contaminao fecal a E. coli, j que os demais indicadores de contaminao fecal so encontrados naturalmente nesse tipo de alimento. Em alimentos de origem animal, presena de coliformes indica manipulao sem cuidados higinicos ou armazenamento inadequado. Em alimentos processados, a presena de um nmero considervel de coliformes indica processamento inadequado ou recontaminao psprocesso, e a possvel presena de microorganismos patognicos e toxignicos. importante ressaltar que os alimentos no so fonte de contaminao, e sim veculos. A contaminao provm do TI do animal (POA) e do solo (POV - neste caso, sendo apenas superficial), por isso diz que as enterobactrias causam DVAs (Doenas Veiculadas por Alimentos). A pesquisa de enteropatgenos em alimentos normalmente requer vrias etapas para que seja possvel o isolamento do mesmo. Podemos citar a pesquisa de Salmonella. A legislao prev a ausncia deste patgeno em 25g da amostra, visto a sua alta virulncia. Normalmente a pesquisa de Salmonella envolve as seguintes etapas: a) pr-enriquecimento: feito em meio lquido no seletivo, visa permitir a recuperao de bactrias injuriadas como conseqncia de algum processamento realizado no alimento (congelamento, salga, etc...): meio usado caldo lactosado b) enriquecimento seletivo: feito em meios lquidos seletivos, visa aumentar a proporo de Salmonella em relao ao restante da microbiota e facilitar seu posterior isolamento: meios usados Caldo Tetrationato, Caldo Selenito-Cistina. c) plaqueamento seletivo: em meios seletivo-indicadores slidos, a fase de isolamento. Uma grande diversidade de meios foi desenvolvida para este fim. A maioria deles apresenta lactose como acar de diferenciao: meios usados Agar EMB, Agar MacConkey, Agar Entrico de Hektoen, Agar SS, etc... d) triagem: visa uma identificao preliminar de colnias suspeitas selecionadas nos meios de isolamento, utilizando um ou dois meios que permitem a realilzao de 2 ou mais provas bioqumicas simultaneamente: meios usados Agar TSI, Agar LIA. e) confirmao bioqumica: visa uma identificao completa do gnero atravs de uma srie de provas bioqumicas: produo de urease em Caldo Uria; determinao do tipo de fermentao da glicose - provas VM e VP em caldo glicosado; utilizao do citrato em Agar Citrato de Simmons; produo de indol em gua Peptonada ou Triptonada; motilidade em meio semislido; etc... f) confirmao sorolgica: visa confirmar a identificao atravs de uma reao de aglutinao utilizando um anti-soro polivalente contra o antgeno O de Salmonella .
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Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de: Compreender o papel das enterobactrias como agentes de toxinfeces alimentares; Caracterizar e compreender o modo de ao do meio EMB utilizado para o isolamento de bacilos gram negativos, diferenciando o crescimento de fermentadores e no fermentadores da lactose; Citar outros meios utilizados no isolamento de enterobactrias; Caracterizar as provas bsicas de triagem e confirmao bioqumica para identificao e diferenciao de enterobactrias compreendendo seu mecanismo de ao.
Material
1 dia: isolamento de enterobactrias
- tubo de caldo Triptona de Soja (TSB) com crescimento de enterobactria - placa de Agar BEM
2 dia: identificao bioqumica (IMVC e provas complementares)
- tubo com Agar TSI; - tubo com Agar Citrato de Simmons - tubo com Meio SIM; - tubo com gua peptonada ou caldo triptonado; - tubo com caldo CL ou MRVP; - tubo com caldo uria; - tubos com para provas de fermentao (Vermelho de Fenol suplementado com Glicose com tubo de Durhan, Lactose e Manitol)
3 dia: interpretao das provas bioqumicas e complementares)
- Reativo de Kovacs - Vermelho de Metila - a-naftol VM - soluo de KOH
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Execuo da prtica
1 dia: isolamento de enterobactrias
- inocular o Agar EMB com a cultura pela tcnica de esgotamento em estrias
Aps a execuo da inoculao, incubar o meio a 37C por 24 - 48 horas.
2 dia: identificao bioqumica (IMVC e provas complementares)
- observar o crescimento obtido e anotar as caractersticas das colnias, comparando com os dados da tabela abaixo: Caracterstica colonial - colnias transparentes ou de cor mbar Gneros (ou espcies) Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia
- colnias com brilho verde metlico luz refletida Escherichia coli e centro negro luz transmitida - colnias maiores que as de E. coli , mucosas, Enterobacter, Klebsiella confluentes, com centro escuro luz transmitida - inocular os meios de triagem e confirmao bioqumica usando as seguintes tcnicas: - Agar TSI: picada central at o fundo do tubo e estria no bizel; - Agar Citrato de Simmons: estria sinuosa ou reta na superfcie; - Meio SIM: picada central at o meio do tubo; - Caldos Uria, Glicose, Lactose, Manitol, Clark Louis (ou Caldo MRVP), e gua Peptonada (ou gua Triptonada): difuso.
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3 dia: interpretao das provas bioqumicas e complementares)
- utilizando os reativos prprios, quando necessrio, e segundo orientao do professor, fazer as leituras das provas bioqumicas. OBSERVAO: - os reativos necessrios para a prtica so: - Reativo para verificao de Indol: Reativo de Kovacs paradimetilaminobenzaldedo; - Reativo para prova de Vermelho de Metila (VM): Corante Vermelho de Metila; - Reativos para prova de Voges Proskauer (VP): VP1 a-naftol e VP2 KOH
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - conferir os resultados obtidos nas provas bioqumicas e compar-los com a tabela abaixo, caracterizando a bactria analisada: Gnero Salmonella Escherichia Klebsiella Proteus GLI + + + + LAC + + MAN + + + H2S + + MOT + + + IND + +/CIT + + +/VM + + + VP + URE + +
Agar EMB (Eosina Azul de Metileno) Composio do Meio (g/L) Peptona Lactose Fosfato dipotssico Eosina Y Azul de metileno Agar 10,0 10,0 2,0 0,4 0,065 15,0 Observaes pH do meio: 6,8 0,2 Neste meio a combinao de eosina e azul de metileno como indicadores promove uma diferenciao entre as colnias de microorganismos que fermentam a lactose e os que no fermentam. As colnias lactosepositivas so negras e possuem halo transparente, e as lactose-negativas so incolores. O meio inibidor para microorganismos Gram-positivos, graas aos corantes presentes. As colnias apresentam colorao azul-esverdeada e algumas apresentam brilho metlico luz refletida.
Agar TSI (Trplice Acar Ferro) Composio do Meio (g/L) Extrato de carne Extrato de levedura Peptona Cloreto de sdio Lactose Sacarose Glicose Citrato de ferro Tiossulfato de sdio Vermelho de fenol Agar 3,0 3,0 20,0 5,0 10,0 10,0 1,0 0,3 0,3 0,024 12,0 Observaes pH do meio: 7,4 0,2 Este meio contm trs acares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol para deteco da fermentao de carboidratos, alm de sulfato de ferro para deteco da produo de sulfato de hidrognio (H2S), formando sulfeto ferroso. A fermentao indicada pela mudana da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo: os acares se depositam no fundo, se o microorganismo fermentar apenas a glicose (pequena concentrao) a produo de cido ser pequena e apenas o fundo do tubo 64
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia mudar de cor; se o microorganismo fermentar alm da glicose a sacarose e/ou a lactose (concentraes 10x maiores que a glicose), a produo de cido ser maior e a viragem de cor ser no fundo e no bizel. A produo de H2S indicada pela cor preta no meio. Como o Agar inclinado, ocorrem duas reaes diferentes: no bizel h metabolismo aerbio e no fundo h metabolismo anaerbio, gerando uma srie de combinaes de resultados possveis.
Agar Citrato de Simmons Composio do Meio (g/L) Sulfato de magnsio Fosfato monobsico de amnio Fosfato de amnio sdico Citrato de sdio tribsico Cloreto de sdio Azul de bromotimol Agar 0,2 0,2 0,8 2,0 5,0 0,08 15,0 Observaes pH do meio: 7,0 0,2 Nesse meio, o citrato a nica fonte de carbono disponvel para o metabolismo da bactria. Se o microorganismo descarboxilar o citrato, haver viragem de cor do indicador de pH (azul de bromotimol) de verde para azul brilhante.
Meio SIM (Sulfeto Indol Motilidade) Composio do Meio (g/L) Triptona Peptona Sulfato frrico amoniacal Tiossulfato de sdio Agar 20,0 6,1 0,2 0,2 3,5 Observaes pH do meio: 7,3 0,2 Este um meio semi-slido, com concentrao de Agar muito baixa (3,5%, ao invs dos 15% que geralmente so adicionados ao meio), o que permite a verificao de motilidade do microorganismo, com crescimento alm da rea de inoculao. Alm disso, a peptona e a triptona so fontes de triptofano, que pode ser metabolizado em indol pelo microorganismo. A produo de indol verificada ao utilizar o reagente de Kovacs (para-dimetilaminobenzaldedo), com o aparecimento de um anel vermelho na parte superior do tubo. O meio tambm permite a deteco da produo de H2S, atravs da reao deste com o sulfato frrico, formando sulfeto ferroso (de cor negra).
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia gua Peptonada Composio do Meio (g/L) Peptona Cloreto de sdio 10,0 5,0 Observaes pH do meio: 7,2 0,2 A peptona fonte de triptofano, que pode ser utilizado pelo microorganismo com produo de indol, que pode ser verificado quando da adio ao meio do Reagente do Kovacs (paradimetilaminobenzaldedo), com o aparecimento de um anel vermelho na parte superior do tubo. * gua triptonada: a nica diferena a substituio de peptona por triptona, que melhor fonte de triptofano. Caldo Uria Composio do Meio (g/L) Peptona Glicose Fosfato dissdico Fosfato monopotssico Cloreto de sdio Vermelho de fenol Soluo de uria a 40% 1,0 1,0 1,0 20,8 5,0 0,004 50 (ml) Observaes pH do meio: 6,8 0,2 O meio tamponado, para evitar mudanas bruscas de pH no meio. A produo de urease resulta em alcalinizao do meio, o que pode ser verificado atravs da viragem da cor do meio de salmon (ou laranja claro) para rosa brilhante (pink).
Caldo MRVP (Metil Red Voges Proskauer) Composio do Meio (g/L) Peptona Glicose Tampo fosfato 5,0 5,0 5,0 Observaes pH do meio: 7,5 0,2 O meio tem esse nome porque utilizado nas provas bioqumicas Vermelho de Metila e Teste de Voges Proskauer, que so provas para verificao do tipo de fermentao realizada pelo microorganismo. Prova do VM: Algumas bactrias utilizam a glicose com grande formao de cido (fermentao cido-mista), de forma que o pH do meio decaia de 6,9 para inferior a 4,4. Outras bactrias produzem menos cido, reduzindo menos o pH. Essa distino pode ser feita utilizando o Vermelho de Metila, que apresenta colorao amarela quando em pH > 5,1; e colorao vermelha quando em ph 4,4. Prova do VP: A partir da glicose muitos microorganismos formam acetona 66
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia (acetilmetilcarbinol) e 2,3-butanodiol (diacetil), que pode ser confirmado com a adio do reagente a-naftol seguida de alcalinizao do meio com KOH. A colorao do meio muda para vermelho intenso. * Caldo CL: permite a realizao das mesmas provas bioqumicas. Caldo para prova de fermentao Caldo Vermelho de Fenol Composio do Meio (g/L) Peptona de casena Peptona de carne Cloreto de sdio Vermelho de fenol 5,0 5,0 5,0 0,018 Observaes pH do meio: 7,4 0,2 Esse um caldo simples utilizado em provas de fermentao de carboidratos, com suplementao do carboidrato especfico em uma concentrao que varia de 5 10%. Se o microorganismo for fermentador do glicdio em questo, haver produo de cidos e o pH ser reduzido, alterando a cor do indicador de pH vermelho de fenol de salmon (laranja claro) para amarelo.
* carboidratos adicionados para verificao de fermentao: glicose (10%), lactose (10%), manitol (10%)
Exerccios de fixao
1. Por que no podemos dizer que os alimentos so fonte de contaminao? 2. Quais so as provas que compem o conjunto de provas IMVC? Qual o fundamento de cada prova? 3. Por que o Agar EMB utilizado na primeira etapa? Qual o seu mecanismo de ao? 4. Por que importante observar e registrar a cor de cada meio no momento da inoculao e aps a incubao?
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Observaes
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Assunto 9: Contagem em Placa e Tcnica do Nmero Mais Provvel (NMP)

Introduo
A quantificao de bactrias em alimentos, materiais, manipuladores, equipamentos, bancadas e guas uma das formas de se avaliar a sua qualidade, permitindo a caracterizao dos mesmos como apropriados ou no para consumo ou utilizao. Representa, pois uma forma de avaliao do risco que estes representam sade. Podemos quantificar os microorganismos de forma direta ou indireta. A forma direta de quantificao a contagem em placa, e a indireta mais utilizada a tcnica do NMP (Nmero Mais Provvel). A contagem de colnias em placas uma tcnica quantitativa direta aonde cada colnia crescida numa placa de Agar corresponde a uma unidade formadora de colnia (UFC) proveniente do material. A tcnica do nmero mais provvel um mtodo indireto de contagem em meio lquido, onde a partir de uma evidncia da presena de uma bactria ou grupo de bactrias possvel se estimar o nmero mais provvel desta no material analisado. Dentre os muitos microrganismos que podem ser quantificados incluem-se: contagem total de bactrias, coliformes, Staphylococcus coagulase-positivos, Bacillus cereus, etc.
Fundamentao terica
Contagem em Placa
A contagem em placa consiste em nada mais que inocular o microorganismo que se deseja quantificar em um meio slido no seletivo para que, aps incubao adequada, possam ser contadas as colnias, que na verdade chamamos de UFC (unidade formadora de colnia). A semeadura em placas ou plaqueamento revela o nmero de microorganismos capazes de se multiplicarem e formarem colnias em meios de cultivo apropriados e sob condies de incubao adequadas. Cada colnia desenvolvida suposta ter sido originada a partir de uma unidade vivel, a qual pode ser um organismo ou muitos. Como para uma maior preciso da anlise somente devero ser contadas as placas com nmero de colnias entre 30 e 300 e devemos fazer a contagem em placa sempre em duplicata ou triplicata. A contagem de bactrias mesfilas muito utilizada para indicar a qualidade sanitria dos alimentos. Um nmero elevado de microorganismos indica que o alimento insalubre, mesmo que haja ausncia de patgenos e de alteraes fsicas (na textura, aroma, sabor) no alimento. importante ressaltar que todas as bactrias patognicas so mesfilas (lembrando que os patgenos so capazes de causar doenas no nosso organismo, ou seja, se multiplicar e manter o metabolismo funcionando a temperatura de 37C temperatura de mesfilos). Para gua potvel, a legislao brasileira determina o limite mximo de bactrias heterotrficas de 500UFC/ml.
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Tcnica do Nmero Mais Provvel
A tcnica do NMP um mtodo de quantificao indireta de microorganismos. Na realidade, no podemos contar UFCs, j que a anlise realizada em meio lquido, o que se faz comparar o resultado encontrado com tabelas pr-escolhidas, obtendo um resultado aproximado da quantidade de microorganismos na amostra analisada. Estas tabelas possuem so elaboradas a partir de dados estatsticos, com os respectivos intervalos de confiana (95%) para diversas combinaes de nmero de tubos positivos em cada srie de diluio. Significa dizer que existe uma probabilidade de 95% de que o nmero verdadeiro de bactrias presentes na amostra se encontre dentro dos intervalos mnimos e mximos em torno do NMP. Muito embora o mtodo dos tubos mltiplos apresente sensibilidade elevada, permitindo a deteco de baixas densidades de bactrias, o NMP no um valor preciso, e a preciso do teste depende do nmero de tubos utilizados e dos volumes de amostra inoculados. Este mtodo muito usado para quantificar coliformes, mas pode ser utilizado para microorganismos em geral, pois o meio utilizado adaptado ao microorganismo que se deseja quantificar, com agentes seletivos e indicadores.
Colimetria em amostra de gua
A gua elemento fundamental para a sobrevivncia humana. Sua grande utilizao no abastecimento pblico, na recreao, na indstria, no uso domstico atesta essa importncia vital. A gua merece ateno especial, pois pode veicular diversos parasitos, como vrus, bactrias, fungos e protozorios, alm, de contaminantes qumicos. As principais espcies bacterianas no patognicas veiculadas pela gua so Flavobacterium, Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella e Chromobacterium. Nas guas de pases tropicais h uma maior variedade de microrganismos e o predomnio de mesfilos e termotolerantes. As espcies bacterianas patognicas de maior importncia veiculadas pela gua so: Vibrio cholerae, Salmonella spp., Lepstospira sp., Shigella spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocoltica, Vibrio parahaemolyticus e Aeromonas hydrophila. Como seria muito caro e trabalhoso avaliar diretamente todos os patgenos nas amostras de guas, uma alternativa para a avaliao da qualidade sanitria da gua a pesquisa de bioindicadroes, ou seja, organismos no patognicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de sangue quente, que quando encontrados indicam a ocorrncia de contaminao fecal, evidenciando o risco da presena de patgenos. Fezes humanas contm de 20-30% de resduos alimentares no digeridos, sendo o restante constitudo de gua e bactrias. No indivduo saudvel essas bactrias constituem os habitantes normais do intestino, onde a Escherichia coli a representante caracterstica. O nmero desses microrganismos pode atingir 109 clulas/g de fezes. Assim, a presena de Escherichia coli em alimentos e gua indicativa de contaminao fecal e possibilidade de presena de patgenos entricos. Microrganismos indicadores de poluio de gua so utilizados para monitorar, classificar e restringir o uso das guas. Um indicador ideal deveria preencher os seguintes critrios: - Ser aplicvel a todos os tipos de gua; - Estar presente simultaneamente com os microrganismos patognicos, com um tempo de sobrevivncia igual quele patgeno entrico mais resistente; - No reproduzir-se em guas contaminadas, para no resultar em valores aumentados. No se conhece nenhum microrganismo ou grupo de microrganismos que atenda a todos esses requisitos, mas h vrios que se aproximam das exigncias referidas e que so muito teis.
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia As bactrias empregadas como indicadoras de poluio fecal em guas so: os coliformes totais, coliformes fecais, estreptococos fecais e o Clostridium perfringens. O indicador microbiolgico mais empregado o grupo dos coliformes. Este e outros indicadores de poluio orientam a margem de segurana sanitria de gua potvel, da gua utilizada para fins recreativos e dos cultivos de organismos marinhos comestveis. A Organizao Mundial de sade (OMS) recomenda para guas de recreao um mximo de 100 coliformes fecais por 100 ml de gua. Coleta de Amostras A coleta de amostras para exame microbiolgico deve ser feita em garrafas esterilizadas que tenham sofrido tratamento prvio de limpeza e rinsagem com gua destilada. gua clorada: adiciona-se 0,1 mL de tiossulfato de sdio 10% para cada 250 mL de gua para neutralizar-se o cloro livre presente, impedindo que continue com propriedades desinfetantes entre o perodo da coleta e o momento da inoculao. gua com alto teor de zinco e cobre: coletar na presena de um agente quelante, de forma a reduzir a toxicidade provocada pelos metais (0,3 mL de EDTA a 15%, pH = 6,5 para cada 120 mL de gua). Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espao livre na garrafa (a amostra deve ocupar 4/5 da garrafa) para facilitar a homogeneizao antes da inoculao. As garrafas devem ser mantidas vedadas at o momento da coleta da amostra e deve-se tomar todos os cuidados de assepsia no momento da coleta, de forma a evitar-se contaminaes secundrias. Ponto de Coleta Abrir a torneira e deixar a gua correr por 5 minutos, para eliminar as impurezas e a gua acumulada na tubulao. Com algodo embebido em lcool, passar na abertura e internamente e em seguida flambar. Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos. Abrir o frasco esterilizado e coletar a gua. Introduzir gua no frasco at cerca de do seu volume. Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratrio. Preparao do frasco - amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com um barbante para facilitar a descida no poo. Descer o frasco dentro do poo sem permitir que o mesmo toque nos lados. Submergir o frasco completamente na gua. Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da gua para criar um espao de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente.
gua da torneira
Poos e Cisternas
Rios, Lagoas Mares
e Coleta da amostra de gua de rios e lagoas - nestes casos, deve-se mergulhar o frasco at uma profundidade de 20cm, com a abertura voltada em direo contrria a corrente, a fim de evitar a contaminao da gua com as mos. Coleta da gua do mar - a coleta deve ser feita na regio onde as pessoas costumam banhar-se, que corresponde profundidade aproximada de 1,0m, que a regio das praias mais utilizada para a recreao de contato primrio, na mar baixa e 24 horas sem chuvas.
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia Acondicionamento e Transporte da Amostra para o Laboratrio O ideal a anlise iniciar-se at 1 hora aps a coleta. Caso isto seja impossvel, a amostra deve ser transportada sob refrigerao. A amostra deve ser mantida entre 4 a 10 C no prazo mximo de at 30 horas aps a coleta. Amostras presumivelmente poludas tm de ser inoculadas no mximo aps 6 horas da coleta. Entre o recebimento da amostra e o incio da inoculao, a mesma deve ser mantida em geladeira (cerca de 5C). Exames Bacteriolgicos da gua O exame bacteriolgico da gua feito atravs de dois processos: Contagem de bactrias heterotrficas viveis na gua e determinao e colimetria (estimativa do nmero de coliformes). A metodologia padro empregada no exame bacteriolgico da gua, para medida do grupo coliforme, inclui a tcnica dos tubos mltiplos (NMP).
Determinao de coliformes pela tcnica dos tubos mltiplos - Nmero Mais Provvel (NMP)
A tcnica do nmero mais provvel consiste no exame de uma srie de tubos onde foram inoculados volumes diferentes de amostra. O valor obtido resulta da consulta a tabelas que foram estimadas com base em frmulas de probabilidade. Consideraes tericas e determinaes repetidas em grande escala, indicam que este tipo de tcnica tende a fornecer valores mais elevados do que o nmero real. As disparidades tendem a diminuir quando adota-se sries com maior nmero de tubos em cada diluio. Portanto, a sensibilidade do teste depende do nmero de tubos adotados. Existem vrias tabelas de NMP e a escolha da srie a ser adotada funo das caractersticas microbiolgicas da amostra. Na aula prtica, utilizamos o sistema de 3 sries de 3 tubos, com diluies decimais sucessivas. A colimetria consta de 2 etapas: teste presuntivo, onde verificamos a existncia de coliformes na amostra analisada, atravs da fermentao de lactose com produo de gs; e o teste confirmativo, onde podemos verificar se os coliformes da amostra so totais ou fecais. Teste Presuntivo Inocular a amostra em 3 sries de tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose ou Caldo Lactose, de modo que cada srie seja inoculada com um volume de amostra 10 vezes menor que a srie anterior. Os tubos devem conter tubos de Durhan invertidos. Aps incubao a 35 - 37C por 24 - 24 horas, o crescimento com formao de gs significa teste presuntivo positivo para coliformes. Os tubos que no apresentarem formao de gs com 24 horas de incubao, devem ser incubados at 48 horas. Os tubos positivos com 24 horas devem ser imediatamente inoculados nos meios de confirmao para se evitar que um crescimento muito abundante provoque o abaixamento do pH, o que pode provocar resultados falsamente negativos. Testes de Confirmao Para coliformes totais: A partir dos tubos com formao de gs obtidos na aula anterior, transferir uma alada para tubos contendo Caldo Verde Brilhante Bile Lactose. Aps incubao a 35 37 C por 48 horas, a formao de qualquer quantidade de gs constitui teste positivo para coliformes totais. Para coliformes fecais: A partir dos tubos com formao de gs obtidos na aula anterior, transferir uma alada para tubos contendo caldo EC. Aps incubao a 44,5 - 45 C por 24 horas, 72
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia a presena de gs no interior dos tubos de Durhan considerada reao positiva, indicando contaminao de origem fecal. A ausncia de gs, mesmo com evidncia de crescimento indica a presena de coliformes de outra fonte que no intestinos de animais de sangue quente. Para completar o teste, podemos estriar uma alada de cada tubo positivo na estapa confirmativa (dos caldos VBBL e EC) para placas com Agar EMB ], incubando a 35-37C por 24 horas e analisar a morfologia atravs da colorao de Gram e observao ao microscpio (bacilos pequenos, Gram negativos, no esporulados) Muitas vezes, a colimetria seguida de provas bioqumicas para a confirmao e caracterizao do coliforme em questo, as mais utilizadas so as provas do teste IMVC, j discutido no assunto anterior (Assunto 8 - Bacilos Gram Negativos). Para E. coli, podemos observar os seguintes resultados: ++-- ou -+--. Para uma explicao do fundamento destas provas veja a prtica de identificao de Bacilos Gram negativos.
Tabela do nmero mais provvel (NMP)

Tubos Positivos por: 10 mL 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 1 mL 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 0,1mL 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 2 NMP para 100 mL 3 tubos <3 3 3 6 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 30 23 39 64
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3 43 75 120 93 150 210 240 460 1100 >2400
Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de: compreender os fundamentos bsicos dos mtodos de quantificao de bactrias em gua e alimentos, diferenciando a contagem direta em placas da enumerao indireta em caldo (NMP); citar grupos de microorganismos quantificados normalmente em alimentos; definir colimetria e citar suas fases e aplicaes; compreender a denominao NMP e UFC; expressar o resultado de uma contagem direta e uma indireta.
Material
- Frasco com amostra de gua para anlise - Tubos de Caldo Lactose com tubos de Durhan (3 CL Duplo e 6 CL Simples) - 1 pipeta de 10 mL - 1 pipeta de 1 mL - 1 tubo de 9,9 mL de diluente estril - Placa estril - 1 tubo com Agar Padro de Contagem (PCA) previamente fundido
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Execuo da prtica
Primeiro dia
Contagem em placa - Antes de realizar a tcnica, devemos realizar diluies decimais da amostra, para que a chance de obteno de placas com nmeros de UFC contvel (30 - 300) seja maior.
- A tcnica utilizada ser a do pour plate, ou seja: transferir, com auxlio de uma pipeta estril, 1 ml da amostra para uma placa de Petri vazia estril. Adicionar o Agar PCA (padro para contagem) fundido e resfriado sobre a amostra e homogeneizar suavemente com movimentos circulares, conforme mostra a figura a seguir:
- Deve-se fazer em duplicata a inoculao das diluies 100 (amostra no diluda) e 10-1, ou 10-1 e 10-2. Tcnica do NMP - Homogeneizar por agitao a amostra de gua e inocular os tubos de caldo lactosado utilizando as pipetas estreis, da seguinte forma: - Na primeira srie, note que a concentrao do caldo dupla, devemos inocular 10 ml de amostra; 75
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - Na segunda srie, devemos inocular um volume 10x menos, ou seja, 1 ml; - Na terceira srie, devemos inocular um volume 10x menor que o da srie anterior, ou seja, 1 ml.
- Incubar as placas e os tubos a 35 37C por 24 48 horas
Segundo dia
- Contar as colnias no Agar, calcular o nmero mdio de colnias obtidas, multiplicar pelo fator de diluio e expressar o resultado em UFC/mL.
OBSERVAO.: No nosso caso, o fator de diluio, ou fator de correo, ser 1, pois o volume inoculado na placa de Petri foi 1 ml. O fator de correo importante para a expresso do resultado, que deve ser em UFC/ml, pois transforma o resultado obtido em um resultado por 1ml. Muitas vezes na rotina, utilizamos volumes de inculo diferentes de 1ml, como 0,1ml, ou utilizamos inculos provenientes de diluies (10-1, 10-2, etc.). Nesse caso, para a expresso do resultado devemos multiplicar o nmero de UFCs obtido por um nmero que ir corrigir a distoro do resultado. Uma dica: se o inculo utilizado for diludo decimalmente, o FD ser o inverso da diluio utilizada. Ex.1: se o inculo utilizado for 0,1ml, qual ser o FD? 10, pois 10 x 0,1 = 1ml, ou de outra maneira: 1 0,1 = 10. Ex.2: se o inculo for 1ml da diluio 10-2, qual ser o FD? 100, pois 100 x 10-2 = 1, ou de outra maneira 1 10-2 = 100. Ex. 3: se o inculo utilizado for 0,5, qual ser o FD? 2, pois 2 x 0,5 = 1, ou de outra maneira 1 0,5 = 2. - Proceder leitura dos tubos positivos no caldo lactose (ou LST) e consultar a tabela para expressar o resultado em NMP/100 mL (teste presuntivo).
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Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia - Inocular os tubos positivos na colimetria para caldos EC e VBBL atravs da tcnica de difuso (teste confirmativo), conforme o esquema a seguir:
- Incubar os tubos de calo VBBL a 35 37C por 24- 48 horas e os tubos de caldo EC a 44,5 45C por 24 48 horas.
Terceiro dia
- Proceder leitura dos tubos dos caldos EC e VBBL (teste confirmativo), considerando positivos os tubos com formao de gs no tubo de Durhan. Vale a pena lembrar que os coliformes totais sero positivos apenas no caldo VBBL e os coliformes fecais sero positivos em ambos os caldos.
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Caldo Lactose Composio do Meio (g/L) Extrato de carne Peptona Lactose 3,0 5,0 5,0 Observaes pH do meio: 6,9 0,2 A lactose presente no meio o indicador da presena de coliformes, atravs da verificao da fermentao com produo de gs no tubo de Durhan invertido introduzido no meio.
* podemos substituir o caldo lactose por caldo LST (lauril sulfato triptose), procedendo a incubao e a leitura da mesma forma. Agar Padro para Contagem (PCA) Composio do Meio (g/L) Triptona Extrato de levedura Glicose Agar 5,0 2,5 1,0 9,0 Observaes pH do meio: 7,0 0,2 Este meio um meio simples, sem agentes seletivos, inibidores ou indicadores. Ideal para contagem de microorganismos em geral.
Caldo EC (E. coli) Composio do Meio (g/L) Peptona de casena Lactose Sais biliares Cloreto de sdio Fosfato de potssio dibsico Fosfato de potssio monobsico 20,0 5,0 1,5 5,0 4,0 1,5 Observaes pH do meio: 6,9 0,2 Os sais biliares so responsveis pela inibio do crescimento da microbiota acompanhante. Alm disso, a temperatura de incubao (45,5C) e a presena de lactose so indicadores para coliformes fecais, pois estes so capazes de fermentar a lactose com produo de gs a esta temperatura. O meio tamponado para evitar que alteraes no pH prejudiquem o resultado.
Caldo VBBL (Verde Brilhante Bile Lactose) Composio do Meio (g/L) Peptona Lactose Bile de boi (purificada) Verde brilhante Observaes 10,0 pH do meio: 7,4 0,2 10,0 20,0 O meio contm 2 agentes seletivos: bile de boi 0,0133 e verde brilhante, que inibem o crescimento de Gram +. Alm disso, a lactose tem o papel de 78
Universidade Federal Fluminense Instituto biomdico Departamento de Microbiologia e Parasitologia indicador, pois os coliformes so capazes produzir gs na fermentao da lactose.
Exerccios de fixao
1. Qual a finalidade da colimetria? 2. Qual a diferena entre os mtodos diretos e indiretos de quantificao de bactrias? 3. Qual a fundamentao da etapa confirmativa da colimetria? 4. Como se realiza o clculo das UFCs na contagem em placa? 5. Por que devemos realizar diluies para executar as tcnicas de contagem em placa e do NMP?
Observaes
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Bibliografia
- Vigilncia e controle da qualidade da gua para consumo humano/ Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade. Braslia : Ministrio da Sade, 2006. - Brown, A. E. Benson Microbiological Applications Laboratory Manual in General Microbiology. 8th Edition. The McGrawHillCompanies, 2001. - Morello, J. A.; Granato, P. A.; Mizer, H. E. Laboratory Manual and Workbook in Microbiology: Applications to Patient Care. 7th Edition. The McGrawHill Companies, 2003. - Harley, J. P. Prescott, L. M. Laboratory Exercises McGrawHillCompanies, 2002. in Microbiology. 5th Edition. The
- Trabulsi, L. R.; Althernum, F. Microbiologia. 4 edio. Editora Atheneu. 2004. - Bossolan, N. R. S. Introduo Microbiologia. IFSC LCE Disciplina Biologia 3. 2002. - Vicente, E. J.; Apostila de Aulas Prticas de Microbiologia. USP ICM Disciplina Microbiologia Bsica. 2007.
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