Prctica 5

Purificacin de inmunoglobulinas utilizando cromatografa de intercambio inico con una matriz de DEAE celulosa. Mtodo de lote o tanda Semestre B-2010

Introduccin La cromatografa de intercambio inico es una tcnica que permite la separacin de protenas de una mezcla en funcin a su carga elctrica. Esta tcnica se fundamenta en las diferencias de magnitud y tipo de carga elctrica neta de las protenas a un pH dado. La cromatografa de intercambio inico est constituida por dos componentes: una resina insoluble que porta grupos cargados positivamente o negativamente y una fase mvil constituida por una solucin de iones con carga opuesta a la carga de la resina. Los iones de la fase mvil interactan con las cargas de la resina mediante interacciones electrostticas reversibles, estos iones pueden ser intercambiados por otros iones de la misma carga sin producir cambios en la resina insoluble, de all el nombre de cromatografa de intercambio inico. Si la resina porta grupos con carga positiva, los iones de la fase mvil sern negativos. Tal intercambiador de iones intercambiar iones negativos y por tanto se le denomina intercambiador de aniones. De la misma forma, si la resina porta cargas negativas, los iones de la fase mvil sern positivos. Puesto que los iones positivos son los que se intercambian, a este tipo de resina se le denomina intercambiador de cationes.

Las protenas son compuestos anfotricos, ya que portan grupos con cargas negativas y con cargas positivas. La carga general de una protena es la suma de todas las cargas individuales de los aminocidos que la componen. Puesto que la carga de cada aminocido depende del pH del medio, la carga de las protenas totales tambin depende de dicho pH. Conforme el pH disminuye, los grupos con carga negativa se neutralizan y los grupos con carga positiva se incrementan. La condicin opuesta se presenta cuando aumenta el pH. De tal manera, que a pH bajo la carga es positiva, mientras que a pH alto la carga es negativa. Existe un pH para cada protena donde las cargas negativas igualan al nmero de las cargas positivas y se denomina punto isoelctrico, es decir al pH en el cual la protena es neutra. Por estas razones, las protenas son grandes electrolitos que se pueden enlazar a un intercambiador de iones si posee una carga neta opuesta al intercambiador de iones. La escogencia del tipo de intercambiador de iones (aniones o cationes) depende de la carga neta de la protena que se desea cromatografiada. Las protenas en su punto isoelctrico no se enlazan a ningn tipo de intercambiador de iones, sino que permanecen en solucin.

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La separacin de protenas por medio de cromatografa de intercambio inico depende de la interaccin inica entre los grupos cargados de las protenas a un pH dado y los grupos con carga opuestas unidos a la resina. Las resinas que mas se emplean para el intercambio inico son la dietilaminoetil (DEAE)-celulosa y la carboximetil (CM)-celulosa. La DEAE-celulosa est cargada positivamente y por lo tanto acta unindose a molculas cargadas negativamente; constituye pues un intercambiador aninico. La CM-celulosa tiene carga negativa y acta como intercambiador catinico. Los procedimientos de cromatografa por intercambio inico se pueden realizar en columna o en lote. Esencialmente no hay diferencia en cuanto a estos mtodos, ya que ambos procedimientos requieren de tres etapas definidas. Primero se equilibra la resina de intercambio inico con una solucin de iones, de bajo peso molecular, con carga opuesta a las cargas de la resina, este enlace es electroesttico y reversible. Seguidamente se adiciona la mezcla de protenas que se desea fraccionar en el intercambiador inico, en una solucin con un pH dado. En esta etapa algunas de las protenas de la mezcla desplazan a los iones unidos a la resina de intercambio inico y se unen a ella, mientras que las protenas que no interactan con las cargas de la resina permanecen en la solucin o son eluidas del intercambio inico. Por ltimo, se cambian las condiciones para producir la des-adsorpcin de las protenas y la regeneracin del intercambiador inico mediante cambios de la concentracin de sales o el pH de la solucin. La cromatografa de intercambio inico es un mtodo muy utilizado para purificar las inmunoglobulinas del suero debido que ellas poseen un punto isoelctrico ms bsico que la mayora de las protenas del suero. Para purificar IgG mediante el mtodo del lote, se mezcla la solucin de anticuerpos con la resina de DEAE-celulosa equilibrada bajo condiciones de pH 8 y fuerza inica que permitan que todas las protenas del suero se absorban a la resina a excepcin de la IgG, la cual permanece en solucin. Al pasar esta mezcla de resina y anticuerpos por un filtro adecuado, las molculas de IgG eluirn primero y el resto de las protenas, incluyendo a la IgM, permanecern unidas a la resina. Variando el pH de la solucin (pH 6,5) es posible separar subsecuentemente la inmunoglobulina IgM del resto de las protenas del suero. El objetivo del trabajo prctico es purificar las inmunoglobulinas IgG e IgM presentes en una fraccin cruda de -globulinas mediante la tcnica de cromatografa de intercambio inico PROCEDIMIENTO Equilibrio de la resina DEAE celulosa a pH 8 (Los estudiantes recibirn la resina equilibrada ya que este paso se realizar antes de la seccin de laboratorio) 1. Coloque 50 g de resina DEAE celulosa en un beaker de 500 ml. Aada 500 ml de una solucin de HCl 0.5 N. Incube la suspencin durante 1 hora. Decante el sobrenadante. Resuspenda nuevamente la resina en 500 ml de HCl 0.5 N. Filtre utilizando un embudo Buchner con 2 filtros Whatman N 1 y en condiciones de presin negativa (bomba de vaco). Lave la resina 5 veces con 500 ml de agua destilada en el embudo Buchner. Transfiera la resina a un beaker limpio de 500 ml y resuspenda en 500 ml de NaOH 0.5 N. Incube durante 1 hora. Decante el sobrenadante. Resuspenda nuevamente la resina en

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500 ml de NaOH 0.5 N. Filtre a travs del embudo Buchner. Lave la resina 5 veces con 500 ml de agua destilada. Transfiera la resina a un beaker limpio de 500 ml y resuspenda en 500 ml de agua destilada. Ajuste el pH de la suspencin mediante titulacin con HCl 0.5 N y agitacin. Lave tres veces la resina con 500 ml de buffer fosfato 0.01 M pH 8. Verifique el pH de los lavados y contine lavando hasta que el pH sea 8. Despus de equilibrada la resina deje secar durante 30 segundos en el embudo para eliminar el exceso de lquido.

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Purificacin de las inmunoglobulinas IgG e IgM 1. Pese la cantidad de resina hmeda requerida en buffer fosfato 0.01 M, pH 8, en un vaso de precipitacin. Para 1 ml de suero o preparacin de globulinas precipitadas por sulfato de amonio y dializadas utilice 5 g. de resina hmeda y equilibrada. Esta proporcin permite obtener una preparacin de inmunoglobulinas IgG 96% pura. Mezcle la resina hmeda pesada con el volumen de la solucin de anticuerpos. Incube la mezcla con ligera agitacin durante 1 hora a 4C.

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Filtre la mezcla utilizando el embudo Buchner y dos filtros Whatman N 1. Recoja el lquido eluido en una fiola, el cual contiene la inmunoglobulina IgG. Lave la resina con 3 volmenes de buffer fosfato 0.01 M, pH 8 (3 x volumen inicial de las globulinas). Recoja el eluente de lavado. El lquido eluente combinado contiene la inmunoglobulina IgG. Alicuote la solucin de IgG en viales que contengan 1ml. Mezcle ahora la resina con un volumen de buffer fosfato 0.01 M, pH 6.5 (volumen inicial de las globulinas). Incube la mezcla, con agitacin suave durante 1 hora a temperatura ambiente. A travs del embudo Buchner succione el sobrenadante. Recoja el lquido eluido en una fiola. Lave la resina con 3 volmenes de buffer fosfato 0.01 M, pH 6.5. El lquido eluente combinado contiene la inmunoglobulina IgM. Almacene las preparaciones de inmunoglobulinas puras en viales Ependorff y conserve a 20C.

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Examine las preparaciones de IgG e IgM 1. Determine la concentracin de protenas de las preparaciones purificadas de IgG e IgM y la fraccin de gamma-globulinas mediante el mtodo de Lowry, o por absorvancia de luz ultravioleta. Determine el contenido de IgG e IgM especfica para los Leishmania mexicana o T. cruzi mediante inmunodifusin radial simple y calcule la cantidad de IgG e IgM especfica obtenida. Calcule el porcentaje de pureza de la IgG. Si la concentracin de protenas es baja, concentre utilizando el AMICON.

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Materiales, equipo y reactivos necesarios Embudo Buchner 2 Filtros Whatman N1 3 vasos de precipitacin 500 ml 1 vaso de precipitacin de 150 ml. 2 quitasatos Bomba de vaco Balanza 1000 ml de solucin HCl 0.5N 1000 ml de solucin NaOH 0.5N 2500 ml de Buffer Fosfato 0.01M pH 8 200ml de Buffer Fosfato 0.01M pH 6,5 50 g DEAE celulosa DE52 Whatman (celulosa macrogranular) Muestra de fraccin cruda de globulinas precipitada con sulfato de amonio al 40% provenientes del suero de conejos inmunizados con antgenos de Leishmania mexicana AZV o T. cruzi,

Cuantificacin de protenas segn el mtodo de LOWRY El mtodo de Lowry permite la cuantificacin colorimtrica de protenas en solucin mediante el uso del reactivo de fenol Folin-Ciocalteu, el cual reacciona con los residuos de tirosina y triptofano presentes en las protenas para producir una solucin de color azul que puede ser leida en un colormetro o espectrofotmetro. Debido que la intensidad del color azul desarrollado puede variar con diferentes protenas, es esencial trazar una curva estandar de calibracin haciendo reaccionar muestras de diferentes concentraciones conocidas de una protena con el reactivo Folin-Ciocalteu en paralelo con muestras de la solucin de protena desconocida. La intensidad del color de las muestras se mide en un espectrofotmetro de tubos, a una longitud de onda de 750 nm o 550 nm. La curva estandar se construye con los valores obtenidos de absorbancia (A750) versus los g o concentracin de la protena conocida. La concentracin desconocida de la muestra de protena problema puede estimarse utilizando como referencia la curva estandar. Para generar la curva estandar se debe tener en cuenta las siguientes consideraciones: Todas las muestras deben ser leidas secuencialmente despus de la aparicin del color. Cada ensayo de una solucin de protena desconocida debe estar acompaada por una nueva curva estandar. Las muestras se deben ensayar por duplicado o triplicado. La curva estandar permanece lineal slo en el rango de 5g-100g de albmina de suero bovino (BSA). Despus de determinar la absorbancia a A750, se construye una curva estandar con los valores promedios de A750 versus g (o concentracin) de protena estandar. En la grfica la cantidad de BSA se expresa como g en el eje de las abcisas (eje x), mientras que los valores promedio de la A750 se grafican en el eje de las ordenadas (eje y). Este mtodo es un ensayo confiable para la cuantificacin de protenas en solucin, con pocas variaciones entre diferentes clases de protenas. Sin embargo, tiene la desventaja que la reaccin es lenta y algunas sustancias pueden causar interferencias.

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Reactivo y equipo para el mtodo de Lowry: 1mg/ml Albmina de suero bovino cristalizada (BSA) 20 g Carbonato de sodio (Na2CO3), PM=105,99 g/mol 0,1 N Hidrxido de sodio (NaOH), PM=40 g/mol 1 g Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 5H2O), PM=249,68 g/mol 2 g Tartrato de sodio Na2C4H4O6(2 H2O), PM=230,089 g/mol Reactivo de fenol Folin-Ciocalteu Agua destilada Espectrofotmetro ( Spectronic 20) 13 Tubos de ensayo de 5 ml de capacidad (13x 100 mm) pipetas gradilla vortex parafilm Prepare las soluciones siguientes: 1. Solucin A, 1 litro Na2CO3 al 2% en NaOH 0,1 N Solucin B1, 100 ml CuSO4 5H2O al 1% en agua Agregue agua destilada hasta completar 100 ml Solucin B2, 100 ml Na2C4H4O6 (2 H2O) al 2% en agua Agregue agua destilada hasta completar 100 ml Solucin C, 100 ml 98 ml Solucin A 1 ml Solucin B1 1 ml Solucin B2 Solucin D, 5 ml 2,5 ml de reactivo de fenol Folin-Ciocalteu 2,5 ml de agua destilada

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Estimacin de la concentracin de una protena en solucin 1. Prepare una solucin estandar de 1mg/ml de albmina de suero bovino (BSA) en agua destilada. En 12 tubos de ensayo prepare por duplicado diluciones seriadas de la solucin de albmina bovina estandar (1mg/ml) en agua destilada, en 6 pasos entre 0 y 200 g de protena en un volumen final de 600 l, como se indica en la tabla siguiente. Prepare por duplicado una dilucin de la muestra de protena que desea determinar su concentracin. Como primera aproximacin prepare 25g:600 l de agua.

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Tubo 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6

g Solucin estandar BSA 1mg/ml 25 25 50 50 100 100 150 150 200 200

M M 4. 5. 6. 7. 8.

? ?

l Solucin estandarB SA 1mg/ml 25 25 50 50 100 100 150 150 200 200 l Volumen muestra 25 25

l H2O dest. 600 600 575 575 550 550 500 500 450 450 400 400 l H2O dest. 575 575

ml Solucin C 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 ml Solucin C 3 3

ml Solucin D 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 ml Solucin D 0.3 0.3

A550

A550

Agregue 3.0 ml de solucin C a las muestras en cada tubo. Agite en el vortex y deje reposar a temperatura ambiente 10 minutos. Agregue 0.3 ml de solucin D. Agite vigorosamente en el vortex. Despus de 30 minutos, cuantifique la absorbancia a 550 nm en el Spectronic 20. Grafique la curva estandar de absorbancia (color) versus g o concentracin de BSA, colocando la absorbancia A550 en las ordenadas y los g o a concentracin calculada de BSA en la abscisa. A partir de este grfico determine la concentracin de protenas de la muestra problema. Si la absorbancia de la muestra de protena desconocida se encuentra fuera del rango de sensibilidad del ensayo, el margen de error se hace muy grande. En tales circunstancias, la muestra de protena de concentracin desconocida debe diluirse o concentrarse, segn sea el caso, y realizar un nuevo ensayo.

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Bibliografa Practical Immunology por L. Hudson y F. C. Hay, segunda edicin. Editorial Blackwell Scientific Publications, pp. 169, 1980. Antibodies. A laboratory Manual por E. Harlow y D. Lane. Cold Spring Harbor Laboratory., pp. 283, 1988. mc/MC, Septiembre 2010