PRACTICA DE LABORATORIO 1

Practica de laboratorio 1 2013

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS FACULTAD DE MEDICINA MEDICINA HUMANA

CURSO DE BIOQUIMICA INFORME DE LABORATORIO N1 FOTOCOLORIMETRIA GRUPO C2 MESA 6 Castillo Tarrillo Giancarlo Gomez Silva Henrry Meza Capcha Kelly Jasmin Ramos Tascca Christian Tiravantti Barrientos Franco 28 DE MARZO 2013

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I.

MARCO TERICO

La fotocolorimetra es un mtodo ptico de anlisis que mide la cantidad de luz absorbida por una sustancia coloreada. Como cualquier otro mtodo espectroscpico, se basa en la medida de la intensidad y la longitud de onda de la radiacin . En general, las medidas se realizan dentro del espectro comprendido entre 220 y 800 nm, y este espectro, a su vez, puede dividirse en dos amplias zonas: la zona de la radiacin visible, situada por encima de 380 nm, y la zona de la radiacin ultravioleta situada por debajo de estos 380 nm. La regin del infrarrojo se sita por encima de los 800 nm. En el proceso de absorcin de la radiacin, un fotn incidente transmite su energa a una molcula (llamada absorbente) lo que da lugar a su excitacin pasando a un nivel de energa superior. Este proceso se representa de la siguiente forma: A + h -> A* -> A + calor en la que A es el absorbente en su estado de energa bajo, A* en su nuevo estado de excitacin energtica y (h es la constante de Planck y la frecuencia) es la energa del fotn incidente, el cual posee una longitud de onda (* = c, donde c es la velocidad de la luz). A* es ordinariamente inestable y rpidamente revierte a su estado energtico ms bajo, perdiendo as la energa trmica correspondiente. Slo se absorben determinadas frecuencias luminosas, y la seleccin de las mismas depende de la estructura de la molcula absorbente. Leyes de la absorcin de energa radiante Se refieren a las relaciones existentes entre la cantidad de absorbente y el grado con el que es absorbida la energa radiante. En trminos generales, puede decirse que hay dos variables capaces de afectar al grado de absorcin: la concentracin del absorbente y la longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre a travs de la solucin. La relacin entre ambas se expresa con la frmula denominada Ley de Beer: P = Po 10-abc P = potencia radiante transmitida Po = potencia radiante incidente una cantidad proporcional a la misma, medida colocando en la cubeta el solvente puro. a = absortividad, constante caracterstica del absorbente y de la longitud de onda de la radiacin incidente. b = longitud del paso de la luz a travs de la solucin del absorbente, expresada generalmente en cm. c = concentracin del absorbente Algunos autores prefieren utilizar trminos de Io e I, expresando entonces intensidad en lugar de potencia. En la prctica lo que tiene importancia es la proporcin P / Po denominada transmitancia (T) o cuando se multiplica por 100, porcentaje de transmitancia (%T). La ley de Beer tambin puede escribirse de la siguiente forma log (Po / P) = abc El trmino log (Po / P) se define como la Absorbancia. Cuando las medidas se efectan utilizando siempre la misma cubeta (o bien un grupo de cubetas estandarizadas que

Practica de laboratorio 1 2013 posean un paso de luz constante) y los efectos pticos debidos a la cubeta son reproducibles, el trmino b de la expresin de la absorbancia se hace constante. Dado que a es tambin constante para un determinado absorbente y una concreta longitud de onda, resulta entonces que la absorbancia es directamente proporcional a la concentracin: A = kc (k = ab). La ventaja fundamental que ofrece el empleo de la Absorbancia en lugar de la Transmitancia es que la relacin existente entre la concentracin y la absorbancia es lineal, cosa que no sucede con el %T. Dado que la Absorbancia es proporcional a la concentracin, tendremos que: A1 / A2 = C1 / C2 donde, A1 = Absorbancia del problema A2 = Absorbancia de un estndar de concentracin conocida C1 = Concentracin del problema C2 = Concentracin del estndar Concentracin (problema) = A1 (problema) / A2 (estndar)* Concentracin estndar Curvas de calibracin Una curva de calibracin relaciona las A %T con las concentraciones y su empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentracin del absorbente. Siempre que sea posible, es aconsejable la construccin de una curva de calibracin que cubra la zona de concentraciones que se van a encontrar en la prctica. La elaboracin de la curva debe ser la fase primera al montar y estandarizar cualquier procedimiento fotomtrico. Las concentraciones pueden expresarse en cualquier tipo de unidades de medida; sin embargo, la medida ms conveniente es emplear para las curvas las mismas unidades en las que se debe expresar el resultado final.

II.

OBJETIVOS
Determinar la concentracin de la muestra problema a travs del MTODO DE LA CURVA ESTANDAR ,para ello se deber utilizar varios estndares de concentraciones conocidas y a partir de la elaboracin de la curva (absorbancia vs concentracin) . Determinar la concentracin de la muestra problema a travs del MTODO DEL FACTOR DE CALIBRACIN, mediante la determinacin del valor del factor de calibracin a partir de una concentracin estndar y su respectiva absorbancia. Tratar de conseguir valores experimentales similares a los tericos. Comparar los valores de concentracin de la muestra problema a partir de los dos mtodos.

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III.

RESULTADOS

PARTE EXPERIMENTAL METODO DEL FACTOR DE CALIBRACIN (METODO ANALITICO) 1.-Preparar la siguiente batera de tubos. Solucin stock: Permanganato de potasio (KMnO4) 10mg%

Tubos N

Tubo 1

Tubo2

Tubo 3

Tubo 4

ml KMnO4 ml Agua destilada adicional Volumen final Concentracin mg % A410 A525 A650 Fc [ ]
P1C2M4

0.5 4,5

1 4

2 3

4 1

5 1 mg % 0,018 0,118 0,009 8,474

5 2 mg % 0,023 0,256 0,015 7,812

5 4 mg % 0,031 0,506 0,032 7,905

5 8 mg % 0,060 1,002 0,061 7,984

Practica de laboratorio 1 2013 1. Hallando Concentracin mg% :

N1.V1=N2.V
10.0,5 = X.5 10.1 = X.5 10.2 = X.5 10.4 = X.5 ..X1 = 1 ..X2 = 2 ..X3 = 4 ..X4 = 8

2. Con las grficas elegir la longitud de onda ptima para el KMnO4 Para elegir la longitud de onda ptima tenemos que tener en cuenta la ley de Lambert- Beer que nos dice que el tipo de longitud de onda que va a incidir sobre la muestra debe tener como caracterstica principal obtener la mxima absorcin en la solucin, por lo tanto entre las 3 longitudes de onda aplicadas en la prctica de laboratorio y llevadas a las grficas (A410, A525, A650) la longitud de onda ptima para el KMnO4 es A525

0.14 0.12

ABSORBANCIAS PARA TUBO 1

0.1 0.08

0.06
0.04 0.02 0 0 100 200 300 400 500 600 700 LONGITUD DE ONDA

0.3

0.25

ABSORBANCIAS PARA TUBO 2

0.2

0.15

0.1

0.05 LONGITUD DE ONDA

0 0 100 200 300 400 500 600 700

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0.6

0.5

ABSORBANCIAS PARA TUBO 3

0.4

0.3

0.2

0.1 LONGITUD DE ONDA

0 0 100 200 300 400 500 600 700

1.2

ABSORBANCIAS PARA TUBO 4

0.8

0.6

0.4

0.2 LONGITUD DE ONDA

0 0 100 200 300 400 500 600 700

3. Calculando el Factor de Calibracin :

Fc 2= 2/0,256 ..Fc2= 7,812 Fc 3= 4/0,506 ..Fc3= 7,905 Fc 4= 8/1,002 ..Fc4= 7,984

Fc = [ ] tubo n / Abs tubo Fc1 = 1/0,118 ..Fc1= 8,474 n

4. Calculando el factor de calibracin promedio de las 4 muestras: (8,474 + 7,812 + 7,905 + 7,984 )/4= 8,043

Practica de laboratorio 1 2013 5. Reemplazando en la frmula: Muestra problema Volumen de KMnO4 Volumen de H2O aadido Volumen total Dilucin Factor de dilucin Factor de calibracin Abs MP 0.9 ml 8.1 ml 9 ml (0.9)/9 =0.1 10 8.043 0.486

[ MP] = Fc. Abs MP. Fd

Fc = 8,043 Abs MP = 0,486 Fd = 10 [ MP] = 39.08

METODO DE LA CURVA ESTANDAR Empleamos para medir la concentracin de la muestra problema [MP] por comparacin con una serie de elementos de concentracin conocido estndar. Se basa en la existencia de una relacin en principio lineal entre un carcter medible que fueron la absorbancia en los enfoques de espectrofotometra y la variable a determinar que es la concentracin. Para ello, se efectan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una funcin matemtica que relacione ambas; despus, se lee el mismo carcter en la muestra problema y, mediante la sustitucin de la variable independiente de esa funcin, se obtiene la concentracin de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva de calibracin, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentracin .

Practica de laboratorio 1 2013 Tubos N Tubo 1 Tubo2 Tubo 3 Tubo 4

ml KMnO4 ml Agua destilada adicional Volumen final Concentracin mg % A410 A525 A650

0.5 4,5

1 4

2 3

4 1

5 1 mg % 0,018 0,118 0,009

5 2 mg % 0,023 0,256 0,015

5 4 mg % 0,031 0,506 0,032

5 8 mg % 0,060 1,002 0,061

Practica de laboratorio 1 2013 La formula de la recta que se forma es: y = 0.1245x ,reemplazando el valor de la absorbancia en y se halla el x .0.486= x. (0.1245)x=3.8725 Para hallar [MP]= (3.904) . Fd [MP]= (3.904) . 10 [MP]= 39.04

V. CONCLUSIONES

VI. CUESTIONARIO
1. Por qu es necesario hacer dilaciones en algunas muestras.? Porque al vaciar en el tubo de ensayo el KMnO4 y luego tambin la cantidad de agua mencionada, el soluto tiende a no diluirse adecuadamente en la solucin, entonces las molculas estn ms juntas y va a haber mayor molculas que absorban la luz visible; y como nosotros vamos a medir el grado de absorbancia en de las molculas, al llevarlo al espectrofotmetro saldra una absorbancia alta adems de errada. Por lo tanto se debe agitar el tubo de ensayo de tal modo que el color del KMnO4 cambie a una tonalidad menor y con ello estaramos asegurando que el soluto este bien diluido en otras palabras las molculas no estn tan juntas; y obtendremos un mejor resultado a la hora de llevarlo al espectrofotmetro. 2. MENCIONE LOS FACTORES QUE AFECTAN LA LEY DE LAMBERT Y BEER La luz debe ser preferiblemente monocromtica o la longitud de onda debe estar entre los limites estrechos. La longitud de onda de la luz empleada debe coincidir con el mximo de absorcin de la solucin .Esto permite tambin conseguir la sensibilidad optima. No debe haber ionizacin,disociacin o solvatacin del soluto con respecto a la concentracin o la tiempo. La solucin es muy concentrada,originando un color intenso.La ley solo se cumple para -7 2 rangos de 10 - 10 M,es decir no debe ser ni muy concentrada ni diluida. El PH La T

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3.

4. Una solucion coloreada presenta una A de 0.450 en una cubeta de 2 cm, hallar la A cuando la sustancia se ha diluido 5 veces y se lee en una cubeta de 1 cm. Base teorica: El factor de dilucin es el nmero total de volmenes al que se lleva un volumen dado de muestra original, o parte alcuota. En otros trminos, el factor de dilucin tambin corresponde a la divisin de la concentracin de la muestra original sobre la concentracin de la muestra diluida. Resolucin: La cantidad de diluciones que se le ha hecho son 5 veces por ende ,la dilucion es 1/6 , entonces la concentracin ha disminuido a 1/6 de la inicial. A=0.450 A=? l= 2cm l=1cm C=c C=c/6

La extincin molar prescinde porque no varia Relacionando con la ley de Lambert y Beer Obtenemos: (0.450).(1).(c/6)=(A).(2).(c) A=0.0375 5. Hallar el coeficiente de extincin molar del KMnO4 realizado en la prctica Sabemos que: ABS (mp) = x C x l Donde: ABS (mp): absorbancia de la muestra problema : coeficiente de extincin molar C: concentracin l: longitud de la cubeta de la lectura Resolviendo: ABS (mp) = x C x l 0,486= x 39,08 x 1 0,012 =

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