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Trichoderma en Tomate

Trichoderma en Tomate

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02/23/2014

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47
RESUMEN
Fue documentada la inmovilización de
Trichodermaharzianum
en hidrogeles de quitosano y sus efectos enlas plantas de tomate (
Solanum
 
lycopersicum
) bajocondiciones de invernadero. El experimento se realizóen dos ciclos. En los meses de julio-agosto de 2009 ymarzo-abril de 2010. Esta consistió en la germinaciónde semillas de tomate en macetas con turba comosustrato. Se establecieron 6 tratamientos, estos fueron:dos tratamientos con el
T. harzianum
inmovilizado enlos hidrogeles de quitosano aplicado al sustrato a dosdosis (6 y 3 g por kg de sustrato), dos tratamientos conlos hidrogeles de quitosano aplicado a las mismas dosis pero sin el hongo, un tratamiento donde se aplicó el hongoen forma de suspensión al sustrato, y un testigo absoluto(solo sustrato). En ambos ciclos se realizaron pruebasde viabilidad de
T. harzianum
en las muestras desustrato usadas de los tratamientos correspondientes; almomento de la inmovilización y a los 30 y 51 días despuésde la siembra. Los resultados obtenidos muestran que elcrecimiento de los hongos inmovilizados en el primer ciclo fue similar en todos los tratamientoscorrespondientes, en el segundo ciclo sobresale lasuperioridad del hongo inmovilizado al mantener por mástiempo una concentración alta de
T. harzianum
(Th).En cuanto a los efectos sobre las plantas de tomatecorrespondientes a las variables estudiadas, se observóque los tratamientos con el hongo inmovilizado en loshidrogeles producían plantas con menor crecimiento y biomasa vegetal, sin embargo, el contenido mineral deP, Ca y Cu fue mayor en los tratamientos con la presencia del hongo. No se observó ningún efecto sobrela epidermis foliar, tejido vascular de las hojas, tallos yraíces, y la asimilación de CO
2
(
 P 
 
£
0.05).
 Palabras clave:
biopolímeros, control biológico.
SUMMARY
The immobilization of 
Trichoderma
 
harzianum
onchitosan hydrogels and their effects on greenhousetomato plants (
Solanum lycopersicum
) wasdocumented. The experiment was conducted in twocycles. In July-August 2009 and March-April 2010. Thisconsisted in the germination of tomato seeds in pots withturb as substrate. Six treatments were established: twotreatments of 
T. harzianum
immobilized on chitosanhydrogels applied to two doses (6 and 3 g kg
-1
of substrate), two treatments with chitosan hydrogelsapplied to the same doses without the fungus, a treatmentwhere the fungus was applied to the substrate as asuspension, and a control (only substrate). In both cyclesthe viability of 
T. harzianum
in the substrate samplesused for treatments, at the time of immobilization and30 and 51 days after sowing was tested. The resultsshow that the growth of fungi immobilized in the firstcycle was similar in all treatments, in the second cycle,when the high concentration of 
T. harzianum
(Th) wasmaintained for a longer time, the superiority of theimmobilized fungus was evident. In terms of effects ontomato plants of the variables studied, we observed thattreatments with the fungus immobilized in the hydrogels produced less plant growth and plant biomass, but the P,Ca, and Cu mineral content was higher in treatmentswith the presence of fungus. There was no effect onthe leaf epidermis, vascular tissue of leaves, stems androots, or CO
2
assimilation (
 P 
 
£
0.05).
 Index words:
biopolymers, biological control.
INMOVILIZACIÓN DE
Trichoderma harzianum
EN HIDROGELES DEQUITOSANO Y SU USO EN TOMATE (
 Solanum
 
lycopersicum
)
Immobilization of 
Trichoderma harzianum
on Chitosan Hydrogelsand its Use in Tomato (
 Solanum lycopersicum
)Nazario Francisco-Francisco
1
, Hortensia Ortega-Ortiz
2
, Adalberto Benavides-Mendoza
1‡
,Homero Ramírez
1
, Laura Olivia Fuentes-Lara
1
y Valentín Robledo-Torres
1
1
Departamento de Horticultura, Universidad Autónoma AgrariaAntonio Narro. Calzada Antonio Narro 1923. 25315 Buenavista,Saltillo, Coahuila, México.
Autor responsable (abenmen@gmail.com)
2
Centro de Investigación en Química Aplicada. Blvd. Enrique Reyna140. 25250 Saltillo, Coahuila, México.Recibido: octubre de 2010. Aceptado: julio de 2011.Publicado en Terra Latinoamericana 30: 47-57.
 
48TERRA LATINOAMERICANA VOLUMEN 30 NÚMERO 1, 2012
INTRODUCCIÓN
El uso de los productos biológicos es una alternativaa los químicos convencionales en la agricultura y en augeen los últimos años (Pérez, 2010). En particular loselaborados a base de microorganismos benéficos sonlos que presentan atractivos beneficios a los cultivosdebido a sus múltiples efectos sobre los fitopatógenos(Ibarra
et al 
., 2006). No obstante, se ha visto que el usode los productos comerciales no ha garantizado mejoresresultados en la producción de cultivos en comparación por ejemplo al uso de microorganismos nativos (Elliot
et al.
, 2009), ya que su presencia en el sitio de aplicacióndepende de varios factores que disminuyen suefectividad como el uso de agroquímicos (Moliszewska,2001). Actualmente algunas técnicas biotecnológicascomo la inmovilización celular y enzimática se hanconvertido en una herramienta de manejo de losmicroorganismos y sus subproductos, lo cual permitemantener o mejorar su actividad protegiéndola de losfactores adversos (Alvarez
et al.
, 2009). Dichas técnicas pudieran ser aprovechadas en la agricultura (Mahmoudy Helmy, 2009). Por lo general, estas inmovilizacionesse han realizado en materiales de sílice y polímerossintéticos que son de alto costo; razón por la que se halimitado su aplicación extensiva en la agricultura. Elquitosano es un polímero natural obtenido de ladesacetilación de la quitina, el cual se encuentra en gran proporción en el caparazón de los crustáceos (Lamarque
et al 
., 2007). Este biopolímero posee característicasútiles en la agricultura, como su actividad antimicrobianay la inducción de las respuestas de defensa de la propia planta (Rabea
et al.
, 2003), el cual también ha mostradocompatibilidad en la inmovilización enzimática dada suversatilidad en las formas físicas disponibles como laformación de geles (Çetinus
et al.
, 2009). Con todo, noexiste información relacionada a la inmovilización demicroorganismos benéficos en este biopolímero que pueda ser aplicado en la agricultura.Por otro lado, es bien sabido de la existencia delmicroorganismo benéfico
T. harzianum
, el cual muestraactividad biológica significativa (Harman
et al.
, 2004)que pudiera tal vez mejorarse para su aplicación agrícolamediante una técnica de inmovilización. Sin embargo,no existe información de los efectos sobre las plantas por parte de microorganismos inmovilizados en soportesactivos como el quitosano. Estudios previos demuestranque la inducción de las respuestas de defensa provocados por el
T. harzianum
en plantas de maíz induce cambiosmetabólicos y anatómicos marcados (Shoresh y Harman,2008).Para contar con información en este campo, elobjetivo del presente trabajo fue documentar lainmovilización del hongo
T. harzianum
en hidrogeles dequitosano como una alternativa para conservar suactividad al aplicarse al sustrato. Se verificó el efectodel microorganismo inmovilizado sobre el crecimiento,absorción de minerales, epidermis foliar, tejido vascular de hojas, raíz y tallo, así como sobre la asimilación deCO
2
en plantas de tomate (
Solanum lycopersicum
) encondiciones de invernadero.
MATERIALES Y MÉTODOS
El experimento se estableció en dos ciclos diferentes,uno en los meses de julio-agosto del 2009 y otro en losmeses de marzo-abril de 2010. La síntesis de loshidrogeles de quitosano (Cs) y la inmovilización del
T. harzianum
(Th) fueron realizados en el departamentode Agroplásticos del Centro de Investigación en QuímicaAplicada (CIQA) de Saltillo, Coahuila, México. Las pruebas biológicas con las plantas de tomate serealizaron en la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN) de Saltillo, Coahuila, México.
Preparación de Reactivos y del Material Biológico
Los materiales utilizados en ambos ciclos fueronquitosano (Cs) grado técnico marca Marine Chemicalscon un peso molecular viscosimétrico de 200 000, el cualse determinó en un viscosímetro tipo Ubbelohde, y un87% de desacetilación determinado por infrarrojo(Brugnerotto, 2001). Se uso una cepa experimental de
T. harzianum
(Th) aislada de una huerta de nogal delmunicipio de San Pedro Las Colonias, Coahuila, México,cedida por el Departamento de Parasitología de laUAAAN. Los microorganismos se manejaron a unaconcentración de 1 × 10
9
UFC. Esta cepa fue reactivadaen Papa-dextrosa-agar (PDA) marca Bioxon. Seutilizaron semillas certificadas de tomate cv. Río Grande(SEMINIS) de hábito determinado tipo saladette. Estasfueron sembradas en un invernadero tipo túnel.El Cs inicialmente fue purificado a partir de unasolución al 2% (p/v) en ácido acético al 1% (v/v), precipitado con NaOH, filtrado y lavado con etanol.La síntesis de los hidrogeles se hizo a partir de unasolución al 2% (m/v) del Cs purificado en ácido acéticoal 1% (v/v), después se entrecruzó con glutaraldehído
 
49FRANCISCO
ET AL.
INMOVILIZACIÓN DE
Trichoderma harzianum
EN HIDROGELES DE QUITOSANO
al 50% en solución acuosa, y por último se secaron losgeles a 60 °C en estufa de aire circulante por 24 h. Losgeles se dejan hinchar en agua, se secan y se pesan enambos casos para determinar el porcentaje dehinchamiento con la siguiente fórmula:
( )
100- %H
´=
 Ps Ps Ph
donde:%H = porcentaje de hinchamientoPh = peso del hidrogel hinchadoPs = peso del hidrogel seco
Inmovilización de
T. harzianum
y Establecimientodel Experimento
La inmovillización del
T. harzianum
se realizó de lasiguiente manera: se colocaron en 5g de gel seco enmatraces erlenmeyer con 100 mL de caldo de papa ydextrosa previamente esterilizados en autoclave a120 °C, posteriormente se agregó una aliquota de 1 mLde una suspensión de la cepa con una concentración de1 × 10
9
UFC y finalmente fueron incubados por 72 h a28 °C con agitación constante.En el verano de 2009 se sembraron las semillas detomate en invernadero. Para la siembra se utilizaron por tratamiento 20 macetas de polietileno color negro concapacidad de 0.5 kg. Las plantas fueron regadas cada3 días con una solución nutritiva Douglas completa(Douglas, 1976). Se establecieron 6 tratamientos, éstosconsistieron en dos tratamientos con
T. harzianum
inmovilizado en los hidrogeles de quitosano, los cualesfueron aplicados en dosis de 6 y 3 g por kg de sustrato(T1: P + 6gH + Th y T2: P + 3gH + Th); dos tratamientoscon los hidrogeles de quitosano a las mismas dosis perosin el hongo (T3: P + 6gH y T4: P + 3gH); un tratamientodonde se aplicó el hongo en forma de suspensión(T5: P + Ths), el cual fue preparado al mezclar elcontenido de 3 cajas petri en 3.5 L de agua corriente ydistribuido el contenido en las 20 macetascorrespondientes al tratamiento, conservándose la mismaconcentración antes mencionada de 1 × 10
9
UFC encada una de las macetas y un testigo absoluto dondesólo está la turba (T6: P). Las variables evaluadas fueron:crecimiento (longitud y diámetro de tallos y número dehojas); biomasa vegetal (peso seco y fresco); anatomíade hojas, tallo y raíz; epidermis foliar; y contenido deminerales en materia seca.
Longitud y Diámetro de Tallos y Número de Hojas
La medición de la longitud de los tallos se tomó a los20, 27, y 34 días después de la siembra (dds). Esta serealizó desde la base del tallo hasta el ápice. La medicióndel diámetro de los tallos y el conteo de las hojas seefectuó a los 20 y 34 dds. La medición del diámetro serealizó con un vernier ajustándola a la parte media deltallo.
Biomasa Fresca y Seca (Aérea y Radical)
Para medir esta variable se colectaron 3 plantas alazar de cada tratamiento a los 30 y 40 dds. La raíz seseparó de la parte aérea, se pesó por separado y sesecó en una estufa a 60 °C durante 24 h. Las muestrasse almacenaron para un posterior uso.
Tejido Vascular de Raíz, Tallo y Hojas
Se realizó un estudio del tejido vascular de la raíz,tallo y las hojas. Para ello se tomaron 2 plantas por tratamiento al azar, a las cuales se les extrajeron3 secciones tanto de la raíz, el tallo y las láminas foliares,a los 42 dds. Las secciones radicales de 1 cm fueron lasubicadas en la parte más cercana al tallo. Las seccionesde tallo de 1 cm fueron las ubicadas en la parte máscercana a la raíz. Las láminas foliares muestreadas seubicaron en la parte media de las hojas a dos tercios dealtura de la planta, las secciones extraídas incluyeronun área de 1.5 cm
2
de la región media de las nervaduras.Una vez extraídos los tejidos, se colocaron en mezclafijadora de alcohol, ácido acético y formaldehido en unarelación 18:1:1, seguido por la deshidratación en mezclasde xilol y alcohol a concentraciones 1:3, 1:1, y 3:1sucesivamente, y se incluyeron en parafina. Lasinclusiones en parafina se realizaron en placas de papelaluminio, de la cual se tomaron los moldes para realizar los cortes en un microtomo de rotación, el grosor delos cortes fue de 20 micras. Los cortes finos fueroncolocados en portaobjetos, los cuales fueron sumergidosen 3 mezclas de alcohol (al 70, 96, y 100%) y posteriormente en xilol, carbol xilol, verde rápido ysafranina. Por último se analizaron en microscopioVistaVision a 40x con cámara digital (Pixera) integrada.En esta se realizaron mediciones del área vascular 

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