MicroB.

YULY JAZMIN SANCHEZ URAZAN DOCENTE MICROBIOLOGIA

TALLER DE BIOSEGURIDAD EN EL LABOTARIO DE MICROBIOLOGIA

FIGURA

1.

SMBOLO INTERNACIONAL DE PELIGRO BIOLGICO

SESIN ACTIVADORA

En los laboratorios destinados a trabajos microbiolgicos deben seguirse normas de seguridad e higiene en que garanticen la proteccin contra infecciones del personal que labora en ellos, as como su extensin a la comunidad y al medio ambiente y que adems aseguren la calidad de las tcnicas y la confiabilidad de los resultados.

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1. En qu consisten las cabinas de seguridad?:

SESIN DE CONSTRUCCIN TERICA Teniendo en cuenta la patogenicidad de los microorganismos presentes en las muestras procesadas en el laboratorio, el Centro de Control de Enfermedades (CDE), y el Instituto Nacional de Salud han establecido 4 niveles de seguridad biolgica y determinado normas especficas para el trabajo en cada uno de ellos. En el nivel 1 se trabaja con microorganismos no patgenos bien conocidos y con patgenos oportunistas, como los estudiados en laboratorios de fundamentos de microbiologa. En el nivel 2 se trabaja con microorganismos y muestras con un potencial de riesgo que va de moderado a alto, como los estudiados en laboratorios de enseanza, en diagnstico microbiolgico, y laboratorios de microbiologa en un centro de atencin primaria. En el nivel 3 con microorganismos y muestras de alto riesgo, como los estudiados en laboratorios de diagnstico especializado. En el nivel 4 con microorganismos de altsimo riesgo o que son exticos en el pas y requieren mxima seguridad. Los especmenes estudiados contienen un nmero relativamente pequeo de microorganismos oportunistas o francamente patgenos, los cuales se cultivan para obtener poblaciones millones de veces mayores que la de la muestra original; por consiguiente, el microbilogo est expuesto permanentemente a graves contaminaciones, al no cumplir con las normas de bioseguridad establecidas.

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NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA EL PRIMER NIVEL En este nivel se trabaja con microorganismos no patgenos o patgenos oportunistas, se cumplirn las siguientes normas: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Utilizar bata y gorro. Trabajar con la puerta del laboratorio cerrada No comer, beber, masticar chicle, ni fumar. Mantener el puesto de trabajo slo con el material necesario. Trabajar cerca al mechero prendido. No poner ningn elemento de trabajo en contacto con el cuerpo. Evitar al mximo transitar por el laboratorio. Evitar la formacin de aerosoles.

9. Descartar el material contaminado en las bolsas o recipientes destinados para tal fin. 10. Esterilizar el material contaminado antes de desecharlo. Pipetear aspirando con dispositivos adecuados y nunca con la boca directamente 11. Evitar el uso de joyas durante el trabajo. 12. Informar inmediatamente cualquier accidente como cortaduras y quemaduras. En caso de rompimiento de tubos con cultivos microbianos, cubrir el tubo con hipoclorito de sodio al 2% o fenol al 5%, tapar con una hoja de papel peridico y dejar sedimentar los aerosoles durante media hora, luego recoger el material, envolverlo en papel, y llevarlo a esterilizacin antes de descartarlo. 13. Lavar las manos antes de salir del laboratorio. 14. No deambular con la bata de trabajo fuera del laboratorio. 15. Lavar la bata y gorro independiente de otra ropa. 16. Trapear el piso del laboratorio con un detergente, no barrer en seco, para evitar dispersar en el ambiente los microorganismos sedimentados.

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SESIN DE CONSOLIDACIN Registre los datos solicitados en la siguiente tabla: TABLA! . NIVELES DE BIOSEGURIDAD. Nivel de seguridad Biologica Tipo de Laboratorio Microorganismos procesados

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FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGA Diga si en el nivel de seguridad con el que se trabaja en la asignatura de fundamentos de microbiologa se deben cumplir las siguientes normas y porqu. Uso de: 1. Batas abiertas en la espalda.

2.

Gorro y guantes.

3.

Cabinas de seguridad I, II o III.

4.

Tapabocas

5.

Mascarillas rgidas

6.

Filtros HEPA

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NORMAS DE TRABAJO EN EL LABOTARIO DE MICROBIOLOGIA

INTRODUCCIN Para trabajar en microbiologa se deben seguir cuidadosamente las normas de seguridad biolgica, poner en prctica los conceptos tericos y concentrar la atencin en los procesos realizados, para obtener resultados confiables y evitar accidentes microbiolgicos. Antes de comenzar el trabajo se debe tener en cuenta lo siguiente: 1. Desinfectar con un detergente el rea de trabajo.

2. Poner una hoja de papel en el rea desinfectada, sobre la cual se ubica el mechero y la gradilla con los elementos de trabajo necesarios. La hoja se descarta al terminar el trabajo en la bolsa establecida para material contaminado. 3. Prender el mechero antes de comenzar a trabajar. Al utilizar el asa para siembras, debe calentarse el alambre de ferroniquel en toda su extensin al igual que la base del mango, a la llama del mechero hasta que se ponga roja, este proceso debe realizarse antes y despus del uso; el flameado o proceso de esterilizacin por incineracin destruye cualquier forma de vida sobre la superficie del asa o de las agujas de diseccin (Vase figura 2.1).
FIGURA 2.1 ESTERILIZACIN DEL ASA.

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1. Durante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el tapn en la mano derecha sostenido entre el dedo meique y la palma de la mano, cerca a la llama del mechero, con esta misma mano debe cogerse el asa entre el dedo ndice y el pulgar (Vase figura 2.2 ).
FIGURA 2.2 MANEJO DE TUBOS.

Del correcto manejo de los tubos depende el xito de los cultivos y por consiguiente de los resultados microbiolgicos. Obsrvese cmo se sostiene el tapn del tubo destapado, entre el dedo meique y la palma de la mano derecha, realizando el trabajo cerca de la llama del mechero. 2. Flamear la boca de los tubos despus de quitarles el tapn y antes de volverlos a tapar para evitar la formacin de aerosoles o la contaminacin del contenido del tubo con bacterias del medio ambiente. (Vase figura 2.3).
FIGURA 2.3 MTODO CORRECTO DE SOSTENER LOS TUBOS MIENTRAS SE HACE UNA RESIEMBRA O PASE BACTERIANO.

3. Destapar las cajas de Petri manteniendo la base y la tapa simultneamente en la mano izquierda, abriendo la caja parcialmente y cerca de la llama del mechero. Para tener esta posibilidad la caja debe estar sobre la mesa con el medio hacia arriba, esta se debe coger con la mano izquierda y voltear para destaparla con el dedo pulgar de la misma mano (Vase figura 2.4).

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FIGURA

2.4

MANEJO DE CAJAS DE PETRI.

4. Los bajalenguas y escobillones se deben quemar en la llama del mechero, dejar enfriar y descartar. Si con ellos se han procesado muestras de tuberculosis, antes de quemarlos se deben sumergir en un recipiente que contenga hipoclorito de sodio al 2% y arena, para evitar la formacin de aerosoles y posibles contaminaciones. 5. Todo el material que se use en microbiologa debe estar libre de toda forma de vida, es decir estril. 6. Las lminas deben estar -limpias y desengrasadas (Vase detalles en limpieza de cristalera. Lab. 4). 7. El material se debe marcar con cinta de enmascarar antes de llevarlo a la incubadora. Las cajas de Petri se marcan en el borde de la base para evitar que tapen las superficies de los cultivos (Vase figura 2.5).
FIGURA 2.5 MARCACIN DE CAJAS DE PETRI.

En este primer laboratorio se asignar el sitio permanente de trabajo, el microscopio y se revisar el siguiente material que fue solicitado ocho dias antes en la plenaria: 1 lonchera para guardar el material 10 lminas 10 laminillas 1 caja de colores 1 sobre de papel para lentes

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1 rollo de cinta de enmascarar 1 asa recta y 1 con argolla 2 agujas de diseccin 1 tijera 1 pinza 6 frascos plsticos marcados as: cristal violeta, lugol, alcohol acetona, fucsina de Gram, azul de metileno y Wayson, puestos dentro de una bolsa marcada con el nombre del alumno 10 tubos de 13 x 100 con tapa de rosca 1 lupa grande 1 frasco de jabn lquido y 1 toalla de manos 1 caja de fsforos 1 mechero de alcohol - 10 palillos Durante el trabajo de laboratorio los alumnos usarn bata blanca, totalmente apuntada y un gorro que cubra todo el cabello. Llevarn un frasco de boca ancha con hipoclorito de sodio (decol) para descartar las lminas utilizadas en el laboratorio, las cuales permanecern all durante la noche y luego sern lavadas con un detergente lquido para ser reutilizadas. OBJETIVOS 1. Aplicar las normas de bioseguridad establecidas en el laboratorio anterior. 2. Practicar el manejo de material empleado en microbiologa.

MATERIAL 2 1 1 1 tubos de ensayo con agua, tapados con algodn en rama asa con argolla caja de Petri hoja de papel blanco

PROCEDIMIENTO 1. Practicar el proceso de esterilizacin del asa. 2. Hacer pases de una muestra de un tubo a otro. 3. Hacer pases de un medio lquido a una caja de Petri 4. Realizar un diagrama de aislamiento de colonias, en un crculo de papel de 8 cms, para colocarlo en el fondo de la caja de Petri (Vase figura 2.6)

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FIGURA 2.6 TCNICA DE AISLAMIENTO DE COLONIAS.

5. Practicar el manejo de la caja de Petri, realizando movimientos de siembra, deslizando el asa sobre las lneas dibujadas en la hoja, colocada sta en el fondo de la caja de Petri. CUESTIONARIO 1. Qu se entiende por resiembra o pase bacteriano?

2. Cmo se regula el calor de la llama del mechero Bunsen? Cul es la llama ideal para trabajar y por qu?

3.

Cul es la utilidad del asa recta y curva?

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4.

Qu

caractersticas tiene el algodn utilizado

en microbiologa?

5. Qu caractersticas debe tener el vidrio con el cual se elabora el material utilizado en microbiologa?

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PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MATERIAL MICROBIOLGICO

INTRODUCCIN Para trabajar en microbiologa, el material que se utiliza debe estar completamente libre de clulas microbianas vivas, por lo tanto ste debe ser lavado rigurosamente con detergentes, enjuagado repetidamente, secado, envuelto en papel kraft y tapado el orificio de entrada de los recipientes con algodn en rama para luego ser sometido a esterilizacin, de acuerdo con las caractersticas de cada elemento. Hay varios mtodos de esterilizacin, a saber: Calor Seco. Este mtodo utiliza el horno elctrico a temperatura de 160C durante 1 a 2 horas (Vase figura 4.1)
FIGURA 4.1 UN TIPO DE HORNO DE ESTERILIZACIN PARA MICROBIOLOGA

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Calor hmedo. Se emplea el autoclave, a temperatura de 121C. 15 libras/ pulgada2 de presin, durante 15 a 30 minutos (Vase figura 4.2). Realizar el dibujo del autoclave, identificando cada una de sus partes.
FIGURA 4.2. AUTOCLAVE UTILIZADA EN MICROBIOLOGA.

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Esterilizacin en fro. Utilizando xido de etileno, formaldehdo o perxido de hidrgeno, en cmaras especiales. (Vase figura 4.3).
FIGURA 4.3. AUTOCLAVE PARA XIDO DE ETILENO, DEBAJO DE LA PUERTA DE ACERO SE OBSERVAN LOS RECIPIENTES PARA EL GAS Y UNA ENTRADA DE AGUA PARA MEZCLARSE CON EL GAS ANTES DE INGRESAR A LA CMARA DEL AUTOCLAVE.

Radiaciones ionizantes. Son rayos gamma provenientes de una fuente de cobalto 68 o cesio 139. Rayos catdicos. Provenientes de generadores y aceleradores de electrones, Rayos X. Mortales para todas las clulas. Son muy utilizados en la industria en artculos que no soportan calor aunque son radiaciones costosas, en especial para los laboratorios clnicos. Luz ultravioleta. Es bactericida desde la longitud de onda de 333 nm, aumentando su efectividad a longitudes menores. Se utiliza frecuentemente para reducir el nmero de bacterias aerotransportadas en quirfanos, bioterios y laboratorios, donde se maneja material altamente infeccioso. En material de laboratorio es poco efectiva debido a su poca penetrabilidad.

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FILTRACION Este mtodo emplea tres tipos de filtros. Filtro de profundidad. Consiste en placas de papel, asbesto, o fibra de vidrio, cuyas fibras se superponen y en ellas quedan atrapadas las partculas. Filtros de membrana. Elaborados especialmente de acetato o nitrato de celulosa, conocidos como filtros Millipore. Pueden obtenerse con dimensiones de poros muy diversos, que van desde 0.45 hasta 0.01 mieras. Las membranas porosas se colocan dentro del recipiente, en el cual se pone el lquido que se va a esterilizar y ste pasa a travs del filtro, recogindose en una ola con presin negativa para acelerar el paso del lquido a travs del filtro (Vase figura 4.3).
FIGURA 4.3 FILTROS DE MEMBRANA

Filtros de huella de nucleacin. Elaborados con delgadas pelculas de policarbonato de 10 (i de espesor, tratadas con radiacin nuclear y despus grabadas con una sustancia qumica. La radiacin causa daos localizados en la pelcula y la sustancia grabadora ampla estos sitios causando agujeros. El tamao de estos se puede graduar dependiendo del tiempo que se deja actuar el grabado y de la fuerza de la solucin de grabado. Esos filtros son empleados especialmente en microscopa electrnica. OBJETIVOS 1. Hacer el reconocimiento de los principales elementos utilizados en microbiologa. 2. Preparar para esterilizacin el material empleado en microbiologa. 3. Realizar los procesos de esterilizacin

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MATERIALES 1 asa bacteriolgica 1 caja de Petri 1 baln 1 fila tubo de ensayo de 13 x 100, 16 x 150, Khan pipeta de 5 mi. y 1 mi. 1elemento de caucho o plstico Escobillones 2 bajalenguas 1 elemento de tela gasa para elaborar tapones piola algodn en rama 1 lmpara de luz ultravioleta 1 autoclave 1 equipo de filtracin PROCEDIMIENTO 1. DISCUSIN SOBRE LIMPIEZA Y LAVADO DEL MATERIAL. El xito en el diagnstico microbiolgico y la confiabilidad de los resultados dependen, en gran parte, del proceso de lavado y esterilizacin del material utilizado, por consiguiente es importante seguir las recomendaciones establecidas para este propsito. Material de vidrio nuevo. Los recipientes de vidrio que no se han utilizado anteriormente son ligeramente alcalinos. Para neutralizarlos se deben sumergir en una solucin al 2% de cido clorhdrico, durante 24 horas, despus se enjuagan abudantemente con agua del chorro y luego con agua desmineralizada, para, finalmente, secarlos y esterilizarlos. Material de vidrio usado. Cuando los recipientes de vidrio contienen medios de cultivo contaminados se deben esterilizar en autoclave con las tapas flojas, para que pueda circular el vapor dentro de los recipientes. - Dejar en remojo, en agua con detergente, de 2 a 3 horas, luego cepillar. - Enjuagar abundantemente con agua del chorro, dejar durante 30 minutos en un recipiente con agua limpia para quitar cualquier resto de detergente y hacer el enjuague final. Dejar las pipetas contaminadas en un recipiente con fenol o

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hipoclorito de sodio al 2%, durante 24 horas, y luego continuar con el procedimiento anterior. - Dejar escurrir todo el material con la boca hacia abajo en canastillas metlicas, luego secar ya sea en el horno a 60C o en un sitio soleado cubierto con una tela delgada. - Taponar la boca de los recipientes con algodn en rama y envolver las cajas y las pipetas en papel kraft, para llevarlos al horno a esterilizacin. Lminas nuevas. Se deben dejar separadas dentro de un recipiente con agua y detergente durante 24 horas. Enjuagarlas con abundante agua del chorro. Sumergirlas en alcohol de 95% por unos minutos. Secarlas con un pedazo de tela de hilo que no suelte pelusa. Envolverlas en papel en grupos de diez.

Lminas sucias. Quitar el aceite de inmersin con papel peridico y si tienen laminilla, quitarlas con la punta de una aguja y ponerlas separadas dentro de un vaso de precipitado con hipoclorito de sodio al 2%. Poner las lminas en remoj o en una solucin con decol al 2% durante 24 horas. Pasarlas a una solucin con detergente y frotarlas con un algodn. Coger cada lmina por los bordes y enjuagar abundantemente en el chorro y continuar con el proceso realizado a lminas nuevas. Laminillas usadas. Dejarlas en remojo de dos a tres horas en una solucin de hipoclorito de sodio al 2%, movindolas suavemente de vez en cuando. Enjuagarlas abundantemente en el mismo vaso, agitando suavemente. Escurrirlas colocndolas de punta sobre una pieza de gasa doblada. Conservarlas en una caja de Petri.

Precaucin. La vidriera debe estar libre de restos de detergente para iniciar el proceso de esterilizacin. Material de plstico. Debe tenerse en cuenta la clase de plstico con el que estn elaborados los elementos, para seguir el proceso de limpieza y esterilizacin adecuados. Las caractersticas del material plstico son las siguientes:

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Polipropileno ..................... translcido Policarbonato .................... claro Poliestireno .................... claro Nitrato de celulosa ............ claro Politetrafluoroetileno (tefln). . . . opaco Polietileno ......................... opaco Niln ................................ opaco El material translcido y claro no se puede autoclavar ni someter a calor intenso. El material opaco, como las pipetas probetas, tubos de centrfuga y de ensayo, es reutilizable y tolera la esterilizacin. Otros pueden reutilizarse pero no autoclavarse como: frascos, vasos de precipitado, botellas para lavado y buretas, los cuales se emplean cuando no es necesaria la esterilidad. Los frascos de polietileno pueden utilizarse para guardar en el congelador a menos 50C.

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Los plsticos descartables se esterilizan con xido de etileno o con calor seco, segn la termoestabilidad recomendada por la casa comercial. Los productos preempacados y preesterilizados permanecen estriles por lo menos un ao mientras que el paquete permanezca sellado. 2. ELABORACIN DE TAPONES

Cortar, presionar y enrollar longitudinalmente la tira de algodn en rama. Los tapones para recipientes de boca grande como balones y filas se envuelven en gasa, haciendo un nudo para que tengan mayor consistencia, se cubren con papel krafty se sujetan con piola (Vase figura 4.4) FIGURA 4.4 ELABORACIN DE TAPONES.

3. ENVOLTURA DE MATERIAL Para envolver pipetas de 1 y 5 mi se recortan tiras de papel kraft, de 60 cm de largo x 5 cm de ancho y para pipetas de 10 mi, tiras de 60 cm de largo x 5 cm de ancho. Se comienza a envolver por la punta, la cual debe quedar totalmente protegida. La pipeta se va rotando sobre la tira de papel de manera que ste cubra firmemente la totalidad de la pipeta. Al finalizar, en la boquilla de la pipeta se enrolla el papel para evitar que se desenvuelva. Este mismo proceso se realiza con los baj alenguas y escobillones, cortando tiras de papel de 30 cm x 5 cm (Vase figura 4.5).

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FIGURA 4.5 PROCESO DE ENVOLTURA DE PIPETAS.

Las cajas de Petri, el material de caucho, el plstico, la tela y dems tambin deben ser envueltos en papel kraft antes de someterlos al proceso de esterilizacin, para protegerlos de la contaminacin ambiental despus de realizado el proceso. Llevar el material de vidrio al horno y el resto al autoclave, en las condiciones establecidas anteriormente. Precaucin. El material de caucho y de plstico se debe llevar al autoclave a 110C a 10 libras de presin y por 10 minutos. Los medios de cultivo que contienen polisacridos se deben esterilizar por filtracin. MANEJO DEL AUTOCLAVE El autoclave consta de dos recipientes metlicos, adaptado uno dentro del otro. Llenar el recipiente externo con una tercera parte de agua, y en el interno, poner el material que se va a esterilizar en forma ordenada y sin sobrecargarlo para permitir el adecuado flujo de vapor. Cerrar el autoclave, teniendo presente que la flecha que se encuentra en el borde de la tapa coincida con la ranura que est en el borde de la olla externa y, adems que el tubo conductor de vapor que est adherido a la tapa, encaje en la canal del recipiente interno. Ajustar las llaves que estn en la tapa, por parejas, tomando una frente a la otra, para ejercer la misma fuerza y as permitir un cierre nivelado de la tapa evitando que se escape vapor y por consiguiente el fracaso del mtodo de esterilizacin. Aplicar calor al autoclave, ya sea por medio del mechero o de electricidad. En este momento la vlvula de escape debe estar abierta y permanecer as hasta cuando el vapor desaloje el aire, lo cual se percibe cuando se produce un chorro continuo de vapor a travs de la vlvula, seguidamente cerrar la vlvula para permitir la concentracin de vapor y el consecuente aumento de la temperatura y la presin, factores que deben ser controlados por medio del manmetro, que se encuentra ubicado sobre la tapa del autoclave.

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Las condiciones establecidas que garantizan una verdadera esterilizacin son: 121C, presin de 15 libras/pulgada2 y tiempo de 15 a 30 minutos. Cumplido el tiempo de esterilizacin, se deja enfriar el autoclave hasta cuando la aguja del manmetro descienda a cero. Precaucin. Abrir la vlvula de escape despus de que la aguja del manmetro est en cero para evitar quemaduras graves y derrame de medios dentro del autoclave CUESTIONARIO 1. Cmo se esterilizan los medios que contienen antibiticos?

2. Por qu la esterilizacin en horno requiere ms tiempo que en el autoclave, siendo la temperatura del horno mayor?

3. Qu utilidad tiene la esterilizacin en fro?

4. Cmo se esterilizan elementos con filo como tijeras, cuchillas, etc.?