Prosedur Percobaan 1. Kolom untuk KCV disiapkan .

Bagian dalamnya di masukkan penjerap (bubur silika gel) hingga batas tertentu . Perhatikan keserbasamaan penjerap ke semua tempat dalam kolom , karena adanya rongga-rongga udara dalam kolom atau ketidakserbasamaan penjerap dalam kolom akan berpengaruh buruk pada proses pemisahan . 2. Setelah kolom siap (pengkondisian kolom) , ekstrak yang akan di pisahkan ditempatkan di atas lapisan penjerap dalam bentuk lapisan tipis yang rata diatas seluruh permukaan penjerap . Setelah itu dilakukan proses elusi dengan campuran pelarut berbagai perbandingan . Elusi di percepat dengan cara penghisapan melalui pompa vakum . 3. Eluen di ganti dengan campuran yang mempunyai perbandingan berbeda dengan volume eluen yang sama dengan volume eluen pada proses pertama . Fraksi yang keluar kolom di tampung dan di gunakan untuk analisis lanjutan .

Komposisi larutan dan eluen adalah sebagai berikut : n-Heksana (ml) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Etil Asetat (ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

DATA FRAKSI :

Fraksi 1 2 3 4 5 6

Warna Bening Bening Bening Bening Kuning muda Kuning muda

Fraksi 7 8 9 10 11 12

Warna Kuning muda Kuning Kuning tua Kuning tua Kuning kecoklatan -

Data Rf : Penjerap Pengembang Penampang Bercak Pola Kromatogram : Silika Gel GF 254 : n-Heksana : AlCL3 :

No. bercak E1

Rf Sinar tampak 0,9125 -

Pengamatan UV 254 Ungu UV 366 Coklat AlCl3 -

F2 F3 F4 G5 G6 G7 G8 G9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 I16 I17 J18 J19 K20

0,90625 0,875 0,7375 0,8875 0,85 0,75 0,5625 0,525 0,8375 0,75 0,7125 0,5625 0,525 0,4875 0,7375 0,5 0,725 0,4625 0,3625

Ada Ada Ada Ada Ada -

Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu

Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat

Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning -

Setelah dilakukan optimasi : Pengamatan Sinar Tampak Ada UV 254 Ungu UV 366 Coklat AlCl3 Kuning

Rf 0,283

Pembahasan Kromatografi Cair vakum merupakan kromatografi kolom yang dipercepat dan bekerja pada kondisi vakum, fase gerak digerakkan dengan kondisi vakum sehingga prosesnya berlangsung cepat. Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan maksimum. Alat yang digunakan terdiri dari tabung kolom, sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung fraksi. KCV memerlukan jumlah sampel yang lebih banyak dari pada kromatografi lapis tipis (KLT) . Kromatografi kolom cair dapat dilakukan pada tekanan atmosfer atau pada tekanan lebih besar dari atmosfer dengan menggunakan bantuan tekanan luar misalnya gas nitrogen. Untuk keberhasilan praktikan di dalam bekerja dengan menggunakan kromatografi kolom vakum cair,oleh karena itu syarat utama adalah mengetahui gambaran pemisahan cuplikan padakromatografi lapis tipis.

Kromatografi vakum cair dilakukan untuk memisahkan golongan senyawa metabolitsekunder secara kasar dengan menggunakan silika gel sebagai absorben dan berbagai perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat : metanol (elusi gradien) dan menggunakan pompavakum untuk memudahkan penarikan eluen Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen campuran dimana cuplikan berkesetimbangan di antara dua fasa, fasa gerak yang membawa cuplikan dan fasa diam yang menahan cuplikan secara selektif. Bila fasa gerak berupa gas,

disebutkromatografi gas, dan sebaliknya kalau fasa gerak berupa zat cair, disebut kromatografi cair . Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas kering (biasanya dengan penjerap mutu KLT 10-40 m) dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai kering dan sekarang siap dipakai . Kromatografi ialah cara pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan zat-zat terlarut yang bergerak bersama-sama dengan pelarutnya pada permukaan suatu benda penyerap. Cara ini umum dilakukan pada pemisahan zat-zat berwarna (bahasa Yunani: chromos = warna). Kromatografi vakum cair merupakan salah satu jenis dari kromatografi kolom.Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan campuran larutan dengan perbandingan pelarut dan kerapatan dengan menggunakan bahan kolom. Kromatografi kolom lazim digunakan untuk pemisahan dan pemurnian senyawa . Yang pertama kali dilakukan adalah menyiapkan tabung kolom , kolom yang di gunakan pada percobaan kali ini adalah kolom dengan diameter 4cm . Kolom dicuci terlebih dahulu menggunakan etanol sebelum di gunakan untuk menghilangkan bekas-bekas senyawa yang tertinggal di dalam kolom sehingga hasil yang didapatkan bisa murni . setelah di cuci , kolom di bilas dengan n-heksan untuk menghilangkan sisa-sisa etanol dan pelarut-pelarut lainnya di dalam kolom agar tidak mengkontaminasi sampel . kemudian kolom di keringkan sampai benar-benar kering tanpa ada nya air . Pada percobaan KCV ini fasa diam yang digunakan adalah silika gel . fasa diam adalah fasa yang menahan sampel agar tidak terlarut semua hanya ekstraknya saja . silika gel termasuk senyawa polar .Ciri-ciri senyawa polar :

dapat larut dalam air dan pelarut polar lain memiliki kutub + dan kutub - , akibat tidak meratanya distribusi elektron memiliki pasangan elektron bebas (bila bentuk molekul diketahui) atau memiliki perbedaan keelektronegatifan .

silika gel yang digunakan di sini adalah silika gel 60 . maksud 60 pada silika gel ini yaitu rata-rata diameter partikel silika gel ini adalah 60 . silika gel ini juga bisa di sebut silika gel 230-400 . penggunaan silika gel ini karena dapat menghasilkan hasil pemisahan yang baik

dengan partikel-partikel dengan ukuran yang sangat kecil sehingga senyawa bisa terpisah dengan baik . sedangkan fasa gerak yang di gunakan adalah n-heksana . fasa gerak adalah fasa yang membawa senyawa yang berada di sampel keluar dari penjerap . n-heksana merupakan senyawa non polar . ciri-ciri senyawa non-polar :

tidak larut dalam air dan pelarut polar lain Tidak memiliki kutub + dan kutub - , akibat meratanya distribusi elektron tidak memiliki pasangan elektron bebas (bila bentuk molekul diketahui) atau keelektronegatifannya sama

Silika gel pada mulanya masih belum aktif, dan untuk mengaktifkannya sebaiknya setelah dicampurkan dengan n-heksana lalu dipanaskan pada suhu diatas 45C. Namun, pada percobaan ini tidak dilakukan pemanasan. Ada dua cara melapisi kolom dengan silika gel yaitu proses basah dan proses kering. Proses basah yaitu silika gel ditambahkan dengan nheksana hingga berbentuk seperti bubur, lalu dituangkan kedalam kolom, dan dihisap pelarutnya dengan mesin vakum, dan dihentikan sampai panjang kolom sesuai dengan yang diinginkan, maka diperoleh silika gel yang padat pada kolom. Yang kedua proses kering yaitu memasukkan silika gel yang dalam bentuk padat langsung kekolom lalu dipadatkan. Pada percobaan ini, pembuatan kolom dengan silika gel dilakukan dengan cara proses basah. Pada saat silika gel dicampurkan dengann-heksana terlihat bahwa kedua senyawa ini tidak bercampur, hal ini dikarenakan n- heksana dan silika gel berbeda kepolarannya, yaitu nheksana merupakan non polar dan silika gel polar. Kita tidak menggunakan metanol (CH3OH) karena senyawa ini polar, dan dapat mengakibatkan semua senyawa akan turun . Silika gel sebanyak 30 gr di timbang , dipisahkan menjadi 2 , 28 gr untuk membuat bubur silika gel , 2 gr untuk mencampurkannya dengan sampel . pembuatan bubur silika gel yaitu dengan mencampurkan silika dengan n-heksan sampai semua silika basah yaitu sekitar 15-30 ml . setelah jadi , silika di masukan kedalam kolom yang telah di siapkan tadi menggunakan batang pengaduk yang di tempelkan di dinding tabung sedikit demi sedikit agar jatuhnya silika secara merata dan di jaga agar tidak adanya rongga dalam lapisan silika gel ini , sambil dinyalakan vakum untuk menampung eluen , sehingga sisa-sisa silika gel dan bagian-bagian dinding tabung kolom yang tertinggal silika gel dapat di bilas lagi dengan eluen agar merata dan di tuangkan lagi sampai semua silika berada dalam kolom dan untuk pemadatan silika agar tidak adanya rongga . Kolom sambil di ketuk-ketukan agar tidak terdapat rongga yang dapat menyebabkan ekstrak akan ikut turun memasuki rongga sehingga ekstrak yang di hasilkan tidak murni . tinggi silika pada kolom ini adalah 5 cm .

Setelah itu disiapkan ekstrak dengan cara kering . ekstrak kental di timbang sebanyak 2 gr kemudian di tambahkan silka gel sebanyak 2 gr dan di gerus sampai homogen . ekstrak yang sudah di campurkan dengan silika gel kemudian di masukkan ke dalam kolom secara merata dengan cara memasukkanya sedikit demi sedikit jangan sampai miring atau terlalu banyak di bagian kanan atau kiri sehingga terbentuk pita-pita warna pada kolom . KVC merupakan pemisahan fraksi berdasarkan pelarutnya. Agar fraksi tertentu turun, maka harus ditingkatkan kepolarannya dari non polar, sedikit polar, semi polar,agak polar sampai 100% polar, hal ini dikarenakan didalam sampel itu terdapat senyawa yang berbeda kepolarannya. Untuk meningkatkan kepolaran pelarut dilakukan perbandingan campuran pelarut, pada mulanya pelarut non polar dicampur dengan pelarut semi polar dengan perbandingan tertentu, dan sampai nanti pelarut semipolar dicampur dengan pelarut polar dengan perbandingan tertentu. Sampel atau fraksi yang turun itu sesuai dengan kepolaran pelarut yang digunakan. Bila pelarut yang digunakan adalah n-heksana (non polar) maka fraksi yang akan turun adalah senyawa non polar, sedangkan senyawa polar tidak turun karena tidak larut dengan pelarut n-heksana. Perbandingan pelarut yang di gunakan adalah :

n-Heksana (ml) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Etil Asetat (ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Pelarut yang pertama di tuangkan adalah eluen yang tidak polar , sebelum vakum di nyalakan ,di siapkan wadah fraksi di bawah kolom untuk menampung fraksinya . setelah tertampung , langsung di tuangkan eluen dengan tingkat kepolaran yang bertingkat secara bertahap jangan

sampai silika dalam keadaan kering karena dapat merusak kolom dengan adanya rongga udara yang terbentuk jika silika kering , ini dapat mempengaruhi hasil fraksinasi sehingga senyawa lain dapat ikut terbawa dan hasil fraksi menjadi tidak murni . dalam pengerjaan kromatografi cair ini terjadi kerusakan kolom (kolom menjadi berongga sehingga tidak terbentuk pita lagi) sehingga fraksi yang di hasilkan tidak sempurna . Setiap fraksi hasil KCV ditampung kemudian dipekatkan untuk selanjutnya dianalisis dengan menggunakan KLT. Analisis KLT dilakukan dengan menggunakan fase diam lempeng silica gel GF254 berukuran 10 cm untuk setiap fraksi dan fase gerak.perbandingan pengembang yang di gunakan adalah 5:5(n-heksan : etil asetat ). Pada analisis KLT ini untuk setiap fraksi dibuat 12 spot. spot pertama sebagai spot dari ekstrak dan 11 spot lain dari hasil ekstraksi yang akan dideteksi dengan menggunakan pereaksi semprot AlCl3 yang dilihat berdasarkan literatur . Deteksi hasil bercak hasil elusi dilakukan dengan dilihat dibawah sinar UV 254 nm dan UV 366 nm

Didapatkan 11 fraksi dalam percobaan ini : Fraksi 1 2 3 4 5 6 Warna Bening Bening Bening Bening Kuning muda Kuning muda Fraksi 7 8 9 10 11 12 Warna Kuning muda Kuning Kuning tua Kuning tua Kuning kecoklatan -

Didapatkan pola kromatografi :

No. bercak E1 F2 F3 F4 G5 G6 G7 G8 G9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 I16 I17 J18 J19

Rf Sinar tampak 0,9125 0,90625 0,875 0,7375 0,8875 0,85 0,75 0,5625 0,525 0,8375 0,75 0,7125 0,5625 0,525 0,4875 0,7375 0,5 0,725 0,4625 Ada Ada Ada Ada Ada -

Pengamatan UV 254 Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu Ungu UV 366 Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat Coklat AlCl3 Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning -

K20

0,3625

Ungu

Coklat

Fraksi 1 Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar yaitu (100:0) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya juga yang bersifat nonpolar . Fraksi ini berwarna bening , dan saat di KLT tidak terdapat bercak. sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone . Fraksi 2 Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar yaitu (90:10) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya juga yang bersifat nonpolar . Fraksi ini berwarna bening , dan saat di KLT tidak terdapat bercak . sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone . Fraksi 3 Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar yaitu (80:20) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya juga yang bersifat nonpolar . Fraksi ini berwarna bening , dan saat di KLT tidak terdapat bercak. sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone . Fraksi 4 Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar yaitu (70:30) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat nonpolar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya juga yang bersifat nonpolar . Fraksi ini berwarna bening , dan saat di KLT tidak terdapat bercak. sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone . Fraksi 5 Pada fraksi ini menggunakan pelarut non polar (60:40) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat non polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat

non polar. Fraksi ini berwarna kuning, dan saat di KLT terdapat 1 bercak dengan nilai rf 0,9125 . dan setelah di semprotkan dengan AlCl3 tidak terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat . sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone . Fraksi 6 Pada fraksi ini menggunakan pelarut dengan perbandingan yang sama (50:50) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat semi polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bisa bersifat polar maupun non polar . Fraksi ini berwarna kuning muda, dan saat di KLT terdapat 3 bercak dengan nilai rf 0,90625 , 0,875 , dan 0,7375 . dan setelah di

semprotkan dengan AlCl3 terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat di nilai rf 0,7375. sehingga fraksi ini mengandung senyawa xanthone . Fraksi 7 Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (40:60) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 5 bercak dengan nilai rf 0,8875 , 0,85 , 0,75 , 0,5625 , 0,525 dan setelah di semprotkan dengan AlCl3 terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat di nilai rf 0,75 . sehingga fraksi ini mengandung senyawa xanthone . Fraksi 8 Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (30:70) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 6 bercak dengan nilai rf 0,8375 , 0,75 , 0,7125 , 0,5625 , 0,525 , 0,5625 , 0,4875 dan setelah di semprotkan dengan AlCl3 terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat di nilai rf 0,75 . sehingga fraksi ini mengandung senyawa xanthone . Fraksi 9 Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (20:80) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 2 bercak dengan nilai rf 0,7375 dan 0,5 , setelah di semprotkan dengan AlCl3 terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat di nilai rf 0,7375 . sehingga fraksi ini mengandung senyawa xanthone . Fraksi 10 Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (10:90) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 2 bercak dengan nilai rf 0,725 dan 0,4625, setelah di semprotkan dengan AlCl3 terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat di nilai rf 0,725 . sehingga fraksi ini mengandung senyawa xanthone . Fraksi 11 Pada fraksi ini menggunakan pelarut polar (100:0) n-heksana : etil asetat . Fraksi ini bersifat polar sehingga senyawa-senyawa yang akan terlarut di dalamnya bersifat polar. Fraksi ini berwarna kuning muda , dan saat di KLT terdapat 1 bercak dengan nilai rf 0,3625 setelah di semprotkan dengan AlCl3 tidak terdapat bercak yang berflorosensi berwarna coklat. sehingga fraksi ini tidak mengandung senyawa xanthone .

Setelah dilakukan optimasi , di KLT lagi menggunakan perbandingan pelarut 7:3 (nheksan:etil asetat ) agar nilai rf yang dihasil kan berkisar 0,2-0,3 yang akan di gunakan untuk isolasi senyawa menggunakan kolom . Rf 0,283 Pengamatan Sinar Tampak Ada UV 254 Ungu UV 366 Coklat AlCl3 Kuning