Qumica Combinatoria

SNTESIS DE DERIVADOS DEL EUGENOL E IDENTIFICACIN DE SU ACTIVIDAD MICROBIOLGICA

Rony J. Letona (200960024) | Qumica Orgnica IV | May 6, 2013

ndice
Introduccin ........................................................................................................................................................... 2 Marco Terico ........................................................................................................................................................ 2 Qumica combinatoria en el desarrollo de nuevos frmacos a partir de productos naturales .................. 2 El eugenol y su actividad microbiolgica ........................................................................................................ 4 Extraccin y Aislamiento del Eugenol ............................................................................................................. 5 Posibles Reacciones sobre el Eugenol.............................................................................................................. 8 Pruebas Microbiolgicas de Aceites Esenciales y eugenol ............................................................................ 9 Estudios previos sobre el Eugenol con Qumica Combinatoria .................................................................... 9 Prctica Aplicada ................................................................................................................................................. 10 Ttulo ................................................................................................................................................................ 10 Objetivos .......................................................................................................................................................... 10 Procedimiento.................................................................................................................................................. 10 Extraccin .................................................................................................................................................... 10 Purificacin del eugenol a partir del aceite esencial .................................................................................. 10 Sntesis ........................................................................................................................................................... 11 Purificacin de los productos ....................................................................................................................... 11 Pruebas microbiolgicas............................................................................................................................... 12 Evaluacin de Resultados ................................................................................................................................ 12 Identificacin del eugenol ............................................................................................................................. 12 Identificacin de los productos de reaccin ................................................................................................ 12 Identificacin y cuantificacin de la actividad bactericida ........................................................................ 13 Reactivos, Materiales y Equipo....................................................................................................................... 14 Reactivos........................................................................................................................................................14 Materiales ..................................................................................................................................................... 16 Equipo ........................................................................................................................................................... 16 Resultados de la Prctica Aplicada ..................................................................................................................... 17 Tablas de Resultados ........................................................................................................................................ 17 Principales Resultados Obtenidos ................................................................................................................. 18 Conclusiones ........................................................................................................................................................ 19 Bibliografa ........................................................................................................................................................... 20 Anexos.................................................................................................................................................................... 21

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Introduccin
El proyecto const en la sntesis de 3 derivados del eugenol, un producto natural, para simular la sntesis de nuevos frmacos en la industria va qumica combinatoria. Se parti de un compuesto cuya actividad biocida y anestsica ya se conoce: el eugenol. Para obtenerlo se comenz extrayendo el aceite esencial por hidrodestilacin con un aparato de Clevenger. El rendimiento obtenido con este mtodo fue el mejor comparado con lo reportado. Posteriormente se extrajo el eugenol en buen porcentaje y se aisl para despus llevar a cabo las reacciones. Para la derivatizacin se llev a cabo sustituciones nucleoflicas tipo 2 sobre halogenuros de alquilo a modo de sintetizar teres. Los halogenuros de alquilo utilizados fueron: 1-bromo-2-cloroetano para dar el Producto No. 1, 1,3dibromopropano para dar el Producto No. 2 y 1,2-dibromopropano para dar el Producto No. 3. Los porcentajes de rendimiento obtenidos (19%, 57%, 38% respectivamente) no fueron tan altos como se esperaba, y fueron apenas suficientes para lleva a cabo el anlisis microbiolgico. Para este anlisis se sembr Escherichia coli y Staphylococcus aureus en cajas con agar Mller-Hinton. Se coloc discos de 6mm de dimetro impregnados con el aceite esencial, eugenol y cada producto en las cajas y se dej incubar las bacterias por 24h. Los halos de inhibicin hallados mostraron que solo el Producto No. 2 tuvo actividad. Con esto se pudo concluir que el fenol es la parte importante de la molcula de eugenol como bactericida y que alterar este grupo llevar a la prdida de esa actividad.

Marco Terico
QUMICA COMBINATORIA EN EL DESARROLLO DE NUEVOS FRMACOS A PARTIR DE PRODUCTOS NATURALES

En el rea de qumica medicinal, esta poca se ha caracterizado por el enfoque en la construccin de bibliotecas de molculas para el posterior desarrollo de frmacos o compuestos lder. Estas bibliotecas son colecciones de molculas sintticas o a veces biolgicas que sern tamizadas en diferentes formas a modo de obtener una que presente actividad biolgica elevada sobre un receptor determinado. (Pandeya & Thakkar, 2004) El tamizaje molecular de alto rendimiento (o HTS por sus siglas en ingls) ha sido ampliamente criticado. Desde la elaboracin de las bibliotecas de compuestos sintticos hasta el anlisis de su actividad sobre receptores determinados, se ha buscado muchas razones para vincularlo con el descenso en la productividad de la industria farmacutica. Por el contrario, la generacin de estas bibliotecas y las
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pruebas realizadas han mostrado tener muy alta calidad, estar bien validadas, no ser costosas ni lentas y tener porcentajes de acierto mayores al 60%. El nico problema que se le ve a esta tcnica es que es todava muy joven. (Macarron, y otros, 2011) La qumica combinatoria ha sido la herramienta principal para esto en las ltimas 3 dcadas. Mediante ella se producen las bibliotecas a travs de la sntesis de nuevas molculas o derivatizacin de algn compuesto conocido. Considerando esto, se puede decir que la qumica combinatoria es la sntesis rpida y paralela de grandes colecciones de compuestos para facilitar la identificacin de nuevos compuestos bioactivos por medio de HTS. (Pandeya & Thakkar, 2004) Los mtodos y las tcnicas de la qumica combinatoria ya no se limitan a la sntesis sobre superficies slidas o en zeolitas, como se haba comenzado en los aos 60. Esta se ha expandido a diversas tcnicas que comprenden desde sntesis en hmedo hasta in silico. Se ha mejorado las tcnicas de purificacin de los compuestos y finalmente se ha perfeccionado tambin las tcnicas para la identificacin de las estructuras producidas. Estas tcnicas van ahora desde anlisis colorimtricos hasta por espectrometra de masas. (Carell, y otros, 1995) Todas estas tcnicas han hecho posible la obtencin de mejores bibliotecas de compuestos, llevando a un mejor tamizaje molecular que resulta en mejores y ms diversos frmacos o compuestos lderes a ser producidos. (Silverman & Hergenrother, 2006) El desarrollo de bibliotecas y el tamizaje molecular de alto rendimiento han sido tcnicas utilizadas generalmente por las grandes farmacuticas, mientras que en el mbito acadmico, slo se cubra los principios bsicos ya que no se tena acceso a la informacin. Recientemente se ha comenzado a crear alianzas entre el mbito acadmico y la industria para realizar los tamizajes moleculares, ya que estos se han aprobado como un mtodo legtimo para el desarrollo de nuevos frmacos. Por esta razn, en los ltimos aos el mbito acadmico ha comenzado a jugar un papel clave en el desarrollo de frmacos. Las plataformas ofrecidas por las universidades han comenzado a ser desde competitivas hasta las mejores y finalmente, la lnea de divisin entre la academia y la industria se ha ido borrando progresivamente ocupndose as de las necesidades mdicas. (Frearson & Collie, 2009) (Dove, 2007) A pesar de sus grandes logros en el desarrollo de nuevos molculas bioactivas, la qumica combinatoria ha sido muy criticada por su incapacidad de generar compuestos lderes y frmacos. Esto ha llevado a la reconsideracin de un campo

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que se haba hecho de menos en la dcada de los 80s y 90s: los productos naturales. (Boldi & Dragoli, 2006) Los productos naturales han sido objeto de estudio desde que la humanidad not que estos podan curar muchos de sus males. Recientemente, alrededor de 1980, el uso de productos naturales para el desarrollo y descubrimiento de nuevos frmacos fue dejado por un lado a cambio del tamizaje de bibliotecas de compuestos sintticos. Esto dio paso e impuls a la qumica combinatoria. Los tamizajes probaron ser ms rpidos, menos costosos y daban resultados ms fciles de sintetizar que los productos naturales. Sin embargo, cerca del 2000, se observ que la cantidad de frmacos nuevos desarrollados a partir de las bibliotecas de compuestos sintticos no era suficiente en comparacin a lo que se descubra basndose en productos naturales. Por ello, y en estos ltimos aos, se ha recomenzado a usar los productos naturales pero esta vez se ha construido bibliotecas a partir de sus derivados y se han sometido estos a procesos de tamizaje tambin. (Ortholand & Ganesan, 2004) Una alternativa que se ha utilizado mucho recientemente en la elaboracin de las grandes bibliotecas de productos sintticos es la representacin virtual de estas. El diseo de frmacos asistido por computadora es el nuevo y ltimo avance en el rea. El trmino in silico se ha comenzado a ver en las publicaciones cientficas debido a que el manejo de estas bibliotecas (su evaluacin, su almacenamiento y su transporte) es ms rpido y ms barato. Los mtodos para producir derivados a partir de bibliotecas y la capacidad de tamizaje virtual ofrecen resultados prometedores de las evaluaciones de bibliotecas con millones de compuestos. El anlisis para ello no se queda en una representacin y una evaluacin, sino que va ms all proponiendo una lnea de pensamiento diferente que unifica varias disciplinas. (Song, Lim, & Tong, 2009)
EL EUGENOL Y SU ACTIVIDAD MICROBIOLGICA

Las propiedades antispticas de las plantas medicinales o aromticas y sus extractos se han podido reconocer desde la antigedad. Los aceites voltiles, generalmente extrados de las hojas o las flores de las plantas se han podido aislar mediante varias tcnicas de destilacin entre las que destaca la destilacin por arrastre de vapor e hidrodestilacin. A pesar de que los aceites hallados son en su mayora terpenoides, se han hallado algunas otras molculas ricas en oxgeno, nitrgeno y azufre. (Dorman & Deans, 2000) La actividad antibacterial de los aceites de especias ha sido atribuida a la cantidad de compuestos aromticos sustituidos, como es el caso del eugenol. Este ltimo ha

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sido de especial inters en la industria alimenticia como agente antimicrobiano debido a su actividad contra las bacterias Gram-positivas como contra las Gramnegativas. Ha sido reportado que el eugenol, en particular, inhibe el crecimiento de las bacterias Escherichia coli y Listeria monocytogenes. (Gill & Holley, 2004) El clavo (Eugenia caryophyllata) es ampliamente cultivada en Madagascar, Sri Lanka, Indonesia y el sur de China. Los bulbos, que son los que comnmente se utilizan en cocina, han presentado actividad biolgica tal como: antibacterial, antifngica, insecticida, antioxidante y otras que los hacen atractivos como agentes saborizantes y antimicrobiales en la industria alimenticia. La actividad microbiolgica se le ha adjudicado a la capacidad que tiene como fenol de desnaturalizar las protenas y de cambiar la permeabilidad de la membrana celular de fosfolpidos. (Wenqiang, Shufen, Ruixiang, Shaokun, & Can, 2007)

Ilustracin 1. Molcula del eugenol

El mecanismo de accin antibacterial del eugenol se ha mantenido oscurecido debido a que no se conoce los efectos de este ltimo sobre la membrana bacterial. Los mecanismos propuestos hasta la fecha revelan que de alguna manera esta molcula lleva a cabo un rompimiento o lisis de la membrana celular liberando su contenido. Tambin se ha hallado que no solo es la membrana la que ha sufrido daos, sino tambin la pared celular en algunos casos. (Oyedemi, Okoh, Mabinya, Pirochenva, & Afolayan, 2009)
EXTRACCIN Y AISLAMIENTO DEL EUGENOL

Se han estudiado varios mtodos para la extraccin del aceite esencial de clavo y posteriormente el aislamiento del eugenol. Uno de ellos es la extraccin por fluido supercrtico. Esta tcnica consta de la maceracin de los bulbos de clavo y la extraccin del aceite por medio de dixido de carbono a presin y temperaturas

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moderadas. El mtodo ha probado ser el ms eficiente logrando extraer hasta un 16% de aceite esencial. (Wenqiang, Shufen, Ruixiang, Shaokun, & Can, 2007)

Ilustracin 2. Diagrama de un equipo de extraccin por fluido supercrtico

Otro mtodo es la destilacin por arrastre de vapor e hidrodestilacin. Si bien ambos mtodos utilizan el mismo principio, el equipo utilizado es diferente. Estos mtodos son los ms antiguos para la obtencin de aceites esenciales y quiz no son los ms eficientes, pero garantizan un alto rendimiento de aceite esencial. La extraccin se lleva a cabo a temperaturas ms elevadas (c.a. 100C) y luego se requiere que el aceite sea decantado. Se pueden utilizar aparatos tan sencillos como un ensamble de destilacin como un aparato de Clevenger. En el caso del eugenol, se han obtenido porcentajes de hasta el 10% de aceite esencial con esta tcnica en donde el 60%-90% es eugenol. (Wenqiang, Shufen, Ruixiang, Shaokun, & Can, 2007)

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Ilustracin 3. Aparato de Clevenger

Ilustracin 4. Aparato de destilacin por arrastre de vapor

El ltimo mtodo utilizado para la extraccin del aceite esencial es la extraccin por solvente. Para ello se utilizar un aparato de Soxhlet y algn solvente. El problema con este mtodo es el uso de un solvente. Esto, en la industria alimenticia y de cosmticos es poco conveniente, puesto que posteriormente se debe de limpiar el aceite esencial del solvente. En el caso del eugenol el solvente ms utilizado es etanol y la extraccin se lleva a cabo a 50C. El rendimiento obtenido de aceite esencial es aproximadamente de 40%, pero el aceite resulta muchas veces contaminado. (Wenqiang, Shufen, Ruixiang, Shaokun, & Can, 2007)

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Ilustracin 5. Aparato de Soxhlet

Finalmente, despus de extrado el aceite esencial se debe proceder a aislar el eugenol. Este procedimiento es el que requiere de muchas veces del uso de un solvente. Generalmente se realiza una extraccin del eugenol haciendo uso de medios cidos y bsicos adems de un solvente apolar. El resultado suele ser un lquido amarillo plido o anaranjado/caf rojizo y el porcentaje de eugenol en el aceite esencial depende mucho del mtodo utilizado para la extraccin. (Wenqiang, Shufen, Ruixiang, Shaokun, & Can, 2007)
POSIBLES REACCIONES SOBRE EL EUGENOL

Una de las reacciones ms comunes sobre el eugenol es la sntesis de vainillina. Anteriormente se llevaba a cabo sntesis de vainillina a partir de eugenol, ya que este era un punto de partida ms barato que la extraccin de la esencia de vainilla de la misma planta que la produce. Posteriormente se comenz a partir de fenoles, en vez de eugenol, pero el inters en esta molcula por sus facilidades sintticas siempre ha llevado a que se considere como sustrato. (Lampman, y otros, 1977) Tambin se comenz a hacer uso del metileugenol en muchos productos cosmticos y alimenticios durante la ltima dcada. El problema con este es que mostr ser carcingeno. Su sntesis se lleva a cabo a partir del eugenol con sulfato de dimetilo o con carbonato de dimetilo. Los rendimientos reportados no son nada bajos, pero este producto ya no es utilizado en la industria por la razn descrita previamente. (Sebelius, 2011) Entre otros estudios se ha intentado halogenar el eugenol directamente, pero los resultados han sido poco fructferos. La bromacin resulta en productos

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polibromados que despus cuesta mucho purificar o hacer reaccionar de manera selectiva. En el caso de usar cloro, los resultados son an peores que con bromo. Si se desea bromar el eugenol, se recomienda hacerlo muy diluido y a bajas temperaturas. (Frankforter & Lando, 1905)
PRUEBAS MICROBIOLGICAS DE ACEITES ESENCIALES Y EUGENOL

Las pruebas microbiolgicas de aceites esenciales se pueden hacer de varias maneras dependiendo de la sustancia a evaluar y de las especies de bacterias utilizadas. Sin embargo, el mtodo ms comn es el de Kirby-Bauer. Este mtodo requiere la preparacin de cajas de Petri con agar Mller-Hinton para tener un medio de cultivo bacteriano de alta difusin y baja selectividad. Las bacterias se siembran rayando sobre el agar a modo de formar una capa homognea que cubra la mayor parte del agar. Finalmente se colocan los discos de papel filtro, impregnados con una concentracin conocida del antibacterial o antibitico a ser probado. Se deja incubar la caja el tiempo necesario para el crecimiento bacteriano y finalmente se miden los halos de inhibicin formados alrededor de los discos. El dimetro de los halos proporciona una manera de medir cuantitativamente la actividad de la sustancia probada. (Hudzicki, 2009) Las pruebas realizadas a varios aceites esenciales en presencia de 25 bacterias revelaron que de todos los aceites probados, los de mayor actividad antibacterial fueron los extrados del organo, del clavo y del tomillo. Posteriormente se analiz cada componente del aceite esencial y se pudo llegar a la conclusin que de los 21 compuestos probados, 7 mostraron alta actividad de inhibicin. Uno de ellos fue el eugenol. La nica especie bacteriana que no se ve inhibida por ninguno de los compuestos de los aceites esenciales fue el Leucostonoc cremoris. Fuera de eso, existe una alta sensibilidad de las bacterias Gram-negativas frente a los aceites esenciales. (Dorman & Deans, 2000)
ESTUDIOS PREVIOS SOBRE EL EUGENOL CON QUMICA COMBINATORIA

Existen solo algunos estudios en los que se ha llevado a cabo reacciones sobre el eugenol para obtener productos diferentes y con algn fin especfico. Uno de ellos busc sintetizar un grupo de steres de eugenol a modo de poder inhibir una enzima en la soya. (Sadeghian, Seyedi, Saberi, Arghiani, & Riazi, 2008) Otro busc mejorar las capacidades antioxidantes de varios aceites esenciales, entre ellos el eugenol. (Mastelic, Jerkovic, & Blazevic, 2008) En la Universidad de San Carlos se utiliz eugenol como sustrato para sintetizar algunos anlogos de las ampakinas que han mostrado actividad contra la enfermedad de Alzheimer. (Torres, 2007)

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Prctica Aplicada
TTULO

Prctica No. 4: Qumica Combinatoria Extraccin de Eugenol, Derivatizacin por medio de Reacciones SN2 en Paralelo y Determinacin de Bioactividad de los Derivados
OBJETIVOS

Extraer suficiente eugenol del clavo (los botones secos de Syzygium aromaticum) por medio de destilacin por arrastre de vapor, como para poder realizar varias reacciones despus con l. Derivatizar el eugenol, por medio de diferentes reacciones SN2 a modo de obtener una familia de compuestos con propiedades similares. Mediante pruebas microbiolgicas, determinar la actividad bactericida del eugenol y sus derivados sobre las bacterias Bacilus cereus y Escherichia coli.

PROCEDIMIENTO Extraccin Pesar aproximadamente 75g de clavo y pulverizarlo por medio de maceracin o picndolo finamente. De esto, pesar 60g e introducirlos a un matraz redondo de 500mL agregando agua posteriormente hasta llenar el 50% del matraz. Armar un aparato de destilacin sencillo y calentar con manta de calentamiento. El refrigerante debera de estar enfriado con agua enfriada con hielo idealmente. Mantener el reflujo constante por aproximadamente 3 horas (evitando que se acabe el agua). Permitir que todo llegue a temperatura ambiente y finalmente tomar el destilado. Extraer el aceite esencial de la emulsin con 3 porciones de 25mL de ter dietlico en una ampolla de decantacin. Combinar los extractos etreos y secar con 5g de sulfato de sodio anhidro. Tarar un beaker y transferir el extracto. Colocar el beaker en una estufa de calentamiento y lentamente evaporar el solvente. Volver a pesar el beaker y calcular el porcentaje de rendimiento.
(OShea, Von Riesen, & Rossi, 2012)

Purificacin del eugenol a partir del aceite esencial Disolver el aceite esencial en 100mL de hexano y agregar a ampolla de decantacin. Agregar 50mL de NaOH al 5% y extraer la fase acuosa. Realizar el procedimiento anterior 2 veces.

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Posteriormente, tomar el extracto acuoso y acidificarlo gota a gota con cido clorhdrico 6M hasta que la solucin est cida (tomar pH con papel pH). Agregar 50mL de hexano y extraer la fase acuosa. Separar el hexano en un Erlenmeyer, volver a introducir la fase acuosa en la ampolla de decantacin y volver a extraer con 50mL de hexano. Combinar los dos extractos de 50mL de hexano y agregar 5g de sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua. Evaporar el solvente (dejando en una campana por 24 horas o mediante un rotaevaporador). Almacenar el aceite en un vial y preferiblemente refrigerado.

(Miles & Smiley, 2002)

Sntesis Agregar 1mL de eugenol y 0.5g de NaOH a 5mL de etanol en un matraz redondo de 25mL. Agitar hasta que la mezcla se torne traslcida y posteriormente calentar a reflujo. Agregar 8.8mmol de halogenuro de alquilo de manera lenta (ver Tabla de Halogenuros de Alquilo). Continuar el reflujo por 30 minutos y luego dejar enfriar.
(Esteb, Magers, McNulty, Morgan, & Wilson, 2009) Tabla 1. Halogenuros de Alquilo

Nmero 1 2 3 4

Nombre 1-bromobutano 1-bromo-2-cloroetano 2-bromo-1-cloropropano 1,2-dibromoetano

Estructura

Cantidad 0.95 mL 0.73 mL 0.90 mL 0.38 mL

Purificacin de los productos No existen datos suficientes para saber si los productos pueden ser recristalizados. El punto de fusin del eugenol es de -7.5C, el del metileugenol es de -4C. Se esperara que los productos s se pudieran recristalizar a 0C. Por facilidad de trabajo y considerando que ninguno de los productos debera presentar solubilidad en soluciones bsicas, se utilizar el mismo procedimiento que se plantea para la purificacin del eugenol con dos modificaciones: o Se trabajar con una cuarta parte de las cantidades all planteadas.

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Los productos deberan de extraerse en la primera extraccin (con hexano y NaOH 5%). El extracto orgnico debe de colocarse en un beaker tarado para la evaporacin del solvente. Finalmente se vuelve a pesar el beaker y se calcula el porcentaje de rendimiento.

(Miles & Smiley, 2002) (Esteb, Magers, McNulty, Morgan, & Wilson, 2009)

Pruebas microbiolgicas Tomar una placa con Bacilus cereus y tomar, con un asa, un poco de la bacteria para posteriormente rayar una nueva placa con agar. Preparar una solucin (5% p/v) de eugenol (o derivados) en acetona (10mL). Tomar un disco estril y sumergirlo en la solucin de eugenol (o derivados) y dejarlo all por 10min. Sacar el disco y dejarlo secar al aire y luego colocarlo contra una varilla de agitacin (estril) a que se seque por 10min. Colocar el disco en la placa recin rayada con Bacilus cereus. Repetir el mismo procedimiento para los derivados. Utilizar siempre un disco como control que solo haya sido sumergido en acetona pura. Una placa soporta hasta 6 discos, pero cuidar de trabajar solo con 4 por placa para mayor resolucin. Cerrar la placa con cinta adhesiva, identificar qu disco tiene qu compuesto y dejar incubando por 24 horas. En el caso de Escherichia coli el procedimiento es igual, pero se debe tener mucho cuidado por la patogenicidad de la bacteria y recordar que la incubacin se lleva a cabo en incubadora a 37C. Despus de 24 horas incubndose, medir el tamao del halo (si lo hay) de cada disco en la placa. Dependiendo del dimetro del halo, medido con un escalmetro Vernier, es la actividad inhibitoria del compuesto que se prob.
(Miles & Smiley, 2002)

EVALUACIN DE RESULTADOS Identificacin del eugenol Preparar 30mL de fase mvil para TLC (acetato de etilo, hexano 1:9) Preparar solucin estndar de eugenol en acetato de etilo (Eug: 0.159g, AE: 10mL) Sembrar estndar, aceite esencial y eugenol extrado en una placa de slica gel y llevar a cabo cromatografa con la fase mvil antes mencionada. Revelar con lmpara UV a 254nm y calcular Rf. Consultar Rf (Rf = 0.25) en el artculo en el que se bas la prctica.
(OShea, Von Riesen, & Rossi, 2012)

Identificacin de los productos de reaccin La identificacin de los productos se llevar a cabo de la misma manera en que se identific el eugenol: por TLC y con las mismas condiciones.

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(OShea, Von Riesen, & Rossi, 2012) (Esteb, Magers, McNulty, Morgan, & Wilson, 2009)

Identificacin y cuantificacin de la actividad bactericida La presencia del halo alrededor de los discos en la placa de Petri es una prueba confirmatoria de actividad bactericida. El dimetro del halo alrededor de un disco es una manera de cuantificar la actividad bactericida: entre ms grande sea el halo, mayor actividad tiene el compuesto probado.
(Miles & Smiley, 2002) (Dorman & Deans, 2000)

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REACTIVOS, MATERIALES Y EQUIPO Reactivos

Cantidades No.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Reactivo/Producto
ter dietlico anhidro sulfato de sodio anhidro n-hexano hidrxido de sodio cido clorhdrico conc. 1,2-dibromoetano 1-bromo-2-cloroetano 2-bromo-1cloropropano 1-bromobutano etanol acetona acetato de etilo eugenol

Cantidad g - mL mmol
150 mL 20.0 g 410 mL 8.0 g 20 mL 0.38 mL 0.73 mL 0.90 mL 0.95 mL 25 mL 100 mL 10 mL 1.0 mL 1430 141 3140 200 206 4.4 8.8 8.8 8.8 428 1360 102 6.5

Calidad
Para anlisis Grado reactivo Para anlisis Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Grado reactivo Para anlisis Para anlisis Para anlisis Estndar

Pureza
>99% >99% >98% >98% 37.5% >99% >99% >99% >99% >90% >98% >98% 100%

Lo provee
Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. U.A.I.

Propiedades fsicas y qumicas No .

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Reactivo/Producto
ter dietlico anhidro sulfato de sodio anhidro hexano hidrxido de sodio cido clorhdrico conc. 1,2-dibromoetano 1-bromo-2-cloroetano 2-bromo-1cloropropano 1-bromobutano etanol acetona

PM -1 g mol
74.12 142.06 86.18 40 36.46 187.87 143.41 157.44 137.03 46.04 58.08

P. F. C
-116.3 888 -95 323 -25.4 9.3 -14 N.D. -112.4 -114.1 -95.3

P. E. C
34.6 1100 68 1388 50.5 131.4 106 116 101.4 78 56.2

Densida d -1 g mL
0.7134 2.671 0.66 2.13 1.19 2.18 1.723 1.537 1.276 0.79 0.79

Solubilidad
Poco soluble en agua Soluble en agua Insoluble en agua Muy soluble en agua. Muy soluble en agua. Poco soluble en agua Soluble en agua N.D. Insoluble en agua Miscible en agua Miscible en agua

Caractersticas
Lquido incoloro con olor etreo. Polvo blanco amargo. Lquido incoloro con olor a gasolina. Slido blanco. Lquido incoloro irritante. Lquido con fuerte olor a cloroformo. Lquido incoloro. Lquido incoloro. Lquido incoloro. Lquido incoloro con olor afrutado. Lquido incoloro con olor afrutado o a menta. Lquido incoloro con olor etreo y afrutado. Lquido incoloro oleoso con fuerte olor a clavo.

12

acetato de etilo

88.11

-83

77

0.902

Soluble en agua Insoluble en agua

13

eugenol

164.2

-7.5

253.2

1.055

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Toxicidades No.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Reactivo/Producto
ter dietlico anhidro sulfato de sodio anhidro hexano hidrxido de sodio cido clorhdrico conc. 1,2-dibromoetano 1-bromo-2-cloroetano 2-bromo-1cloropropano 1-bromobutano etanol acetona acetato de etilo eugenol

LD50 / LC50
1215 mg/kg 5989 mg/kg 25000 mg/kg N.D. 4701 mg/kg 180 mg/kg 64 mg/kg N.D. N.D. 7060 mg/kg 5800 mg/kg 5620 mg/kg 1930 mg/kg

Efectos en el Organismo
Narctico, daos a los rganos, irritante. Irritante. Irritante y permeador. Corrosivo, irritante, permeador. Corrosivo, irritante, permeador. Carcingeno, txico, potencialmente letal. Carcingeno, txico, irritante. Irritante, txico. Irritante, txico. Irritante, permeador. Irritante, permeador. Irritante, permeador. Irritante, permeador.

Cuidados Especiales
NO inducir vmito, 1 administrar O2 AM NO inducir vmito, administrar O2 AM NO inducir vmito, administrar O2 AM NO inducir vmito, administrar O2 AM NO inducir vmito, administrar O2 AM NO inducir vmito, administrar O2 AM AM AM NO inducir vmito, administrar O2 AM NO inducir vmito, dar leche, administrar O2 AM NO inducir vmito, administrar O2 AM NO inducir vmito, administrar O2 AM NO inducir vmito, revisar tejidos AM

AM: buscar Atencin Mdica.

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Materiales Nombre Placas de Agar Discos para pruebas de antibiticos Clavo Equipo
Cristalera

Cantidad 2 8 75 g

Lo provee Depto. de Microbiologa El estudiante El estudiante

Nombre Kit de sntesis orgnica CORNING 24/40 Kit de sntesis orgnica CORNING 19/22 Ampolla de decantacin de 250mL Ampolla de decantacin de 125mL Cmara para cromatografa en capa fina

Cantidad 1 4 1 4 1

Lo provee Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O.

Equipo

Nombre Manta de calentamiento Estufa de calentamiento Pipeta automtica Incubadora Escalmetro Vernier

Cantidad 1 2 1 1 1

Lo provee Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Q.O. Depto. de Microbiologa El estudiante

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Resultados de la Prctica Aplicada

TABLAS DE RESULTADOS
Tabla 2. Propiedades del aceite esencial

Propiedad Color Olor Aspecto

Observacin Amarillo plido Fuerte a clavo Aceite viscoso con densidad mayor a la del agua

Tabla 3. Propiedades del eugenol despus de la extraccin

Propiedad Color Olor Aspecto

Observacin Anaranjado rojizo Suave, clido, a clavo Aceite menos viscoso que el aceite esencial y ms denso que el agua

Tabla 4. Propiedades de los productos de reaccin

Propiedad Producto No. 1 Color Blanco, trasparente Olor Suave a eugenol Aspecto Slido pastoso Solubilidad Hexano, acetona

Producto No. 2 Amarillento, transparente Suave a eugenol Lquido muy viscoso Hexano, acetona

Producto No. 3 Blanco, transparente Suave a eugenol Slido cristalino Hexano, acetona

Tabla 5. Peso y porcentaje de rendimiento de diferentes fases en la prctica

Producto Aceite Esencial Eugenol Producto No. 1 Producto No. 2 Producto No. 3

Peso 6.0g 5.1g 0.2g 0.6g 0.4g

Porcentaje de rendimiento 10% 85% 19% 57% 38%

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Tabla 6. Dimetro de los halos de inhibicin

Sustancia probada Blanco (acetona) Aceite esencial Eugenol Producto No. 1 Producto No. 2 Producto No. 3

Escherichia coli 14mm 16mm 6mm -

Staphylococcus aureus 12mm 13mm 10mm -

PRINCIPALES RESULTADOS OBTENIDOS

Se comenz extrayendo el aceite esencial del clavo, el cual se obtuvo en un 10% de rendimiento como se haba hallado en la literatura. El aceite, como se describe en la Tabla 1, mostr mayor densidad que el agua y se emulsific bastante bien a pesar de no mezclarse con ella. Su color fue amarillo plido, como se hall en la literatura, y transparente. La tcnica de hidrodestilacin con aparato de Clevenger dio muy buen rendimiento, sin embargo, el aceite se tuvo que estar sacando del aparato constantemente para evitar que este regresara al matraz de destilacin. Su mayor densidad que la del agua dificulta la recuperacin. Posteriormente se llev a cabo la extraccin del eugenol. Para ello se comenz decantando el aceite esencial del agua. Despus se extrajo el eugenol del aceite esencial por medio de hexano, medio bsico y medio cido. Finalmente se evapor el solvente. Se obtuvo 5.1g del compuesto activo, as como se describe en la Tabla 4. El aceite extrado mostr mayor densidad a la del agua, un olor menos fuerte que el aceite esencial y un color ms oscuro ( Tabla 2). Este color se not fue oscureciendo poco a poco con el tiempo. Se puede inferir entonces que el color oscuro se debe a productos de oxidacin del eugenol y que la evaporacin de solvente con calor no es quiz la mejor manera de aislarlo. A continuacin se llev a cabo la sntesis. En esta parte se realiz un par de modificaciones muy importantes al procedimiento original, puesto que no se pudo trabajar con los halogenuros de alquilo solicitados. En cambio, se trabaj con 1-bromo-2-cloroetano, 1,3-dibromopropano y 1,2dibromopropano. La sntesis del primer derivado se llev a cabo como estaba establecido en el procedimiento. Despus, el tiempo de media hora de reflujo se extendi a 45 minutos para las siguientes dos reacciones con fines de aumentar el porcentaje de rendimiento. Los productos obtenidos fueron slidos en su mayora y de color blanco como se aprecia en la Tabla 3. Todos los porcentajes de rendimiento estuvieron debajo del 80% (lo esperado), como se puede ver en la Tabla 4. Esto indica una falta de optimizacin en la reaccin. Al acidificar la fase acuosa despus de aislar el producto, no se observ una emulsificacin como se haba notado al extraer el eugenol del aceite esencial. Un detalle que muestra evidencia de restos del eugenol en la fase acuosa es el color amarillo plido que tena esta al acidificar el medio. Finalmente, el Producto No. 2 se mostr como un lquido amarillento ms viscoso como se ve en la Tabla 3. Este pudo haber contenido restos de eugenol mezclado con el producto, ya que su peso molecular no le debera de permitir ser un lquido. Para las pruebas microbiolgicas se utiliz el agar Mller-Hinton debido a su baja selectividad a las molculas y su alta capacidad de difusin de agentes biocidas y antibiticos. De las bacterias se escogi trabajar con el Staphylococcus aureus y Escherichia coli para ver los efectos de los

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productos sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas respectivamente. La nica diferencia observada en los halos de inhibicin en S. aureus fue que no fueron muy definidos; se mostraron difusos de las orillas. E. coli mostr halos de inhibicin un poco ms grandes en el caso del aceite esencial y el eugenol, pero no con el Producto No. 2 (Tabla 5). Finalmente, de la prueba microbiolgica se observ que ni el Producto No. 1 ni el Producto No. 3 son activos bactericidas. El aceite esencial mostr un halo de inhibicin moderado, como se haba hallado en la literatura. El eugenol mostr el mayor halo de inhibicin, como se esperaba. Finalmente, el Producto No. 2 mostr un pequeo halo de inhibicin. Finalmente, as como se puede observar en la Tabla 5 y considerando lo hallado en la literatura, se pudo concluir que el fenol es la parte del eugenol que tiene la actividad bactericida y que modificar este grupo (quitndole su identidad) le disminuye o le quita la actividad al eugenol.

Conclusiones
El diseo de nuevos medicamentos por medio de tamizaje molecular de alto rendimiento es un procedimiento largo que puede llevar a buenos resultados en poco tiempo. La alternativa de utilizar productos naturales y sus derivados en vez de bibliotecas de compuestos pre-existentes lleva a la posibilidad de hallar mejores alternativas y a un precio menor. El eugenol, como sustancia, presenta muchas formas de actividad y se recomienda seguir trabajando con l, ya que este no se ha utilizado tanto en qumica combinatoria. Las pruebas microbiolgicas que se pueden realizar para determinar la bioactividad de una sustancia no son tan complicadas como se esperaba. La extraccin de aceite esencial de clavo mediante hidrodestilacin con aparato de Clevenger resulta muy eficiente, aunque se debe de tener cuidado por la densidad del aceite. El eugenol se puede extraer del aceite esencial de manera efectiva, pero no se recomienda calentar el eugenol para remover el solvente. Los porcentajes de rendimiento de la reaccin no fueron altos, por lo que se concluye que la reaccin requiere de una optimizacin. La extraccin de cada producto de la mezcla de reaccin tampoco fue la mejor por la presencia del etanol. Las caractersticas de cada producto revelaron que se trataba de diferente compuesto en cada caso y, por ende, que s se haba llevado a cabo la reaccin al menos parcialmente. El S. aureus mostr halos difusos al llevar a cabo la prueba microbiolgica y por ello se dificult la toma de medidas del dimetro de cada halo. Fuera del aceite esencial y el eugenol, de los que se sabe que tienen actividad bactericida, solo el Producto No. 2 (el derivado del 1,3-dibromopropano) mostr actividad leve. Sin embargo, se pudo haber tratado de contaminantes.

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Bibliografa
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Anexos

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Ilustracin 6. Aceite esencial de clavo (izquierda) y eugenol (derecha)

Ilustracin 7. Aceite esencial, eugenol, Prods. 1, 3 y 2 y fase acuosa acidificada

Ilustracin 8. Mezcla de reaccin 2 despus de 45 mins de reflujo

Ilustracin 9. Aparatos de reflujo utilizados en las reacciones

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Ilustracin 10. Caja sembrada con E. coli y con discos impregnados con Aceite Esencial, Eugenol y un blanco

Ilustracin 11. Caja sembrada con S. aureus y con discos impregnados con Aceite Esencial, Eugenol y un blanco

Ilustracin 12. Caja sembrada con E. coli y con discos impregnados con productos 1 (3), 2(1) y 3(2)

Ilustracin 13. Caja sembrada con S. aureus y con discos impregnados con productos 1 (3), 2(1) y 3(2)

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