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6.- Cromatografia en Columna

6.- Cromatografia en Columna

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Conocer la cromatografía en columna como técnica de separación de mezclas de sustancias, sus características y los factores que en ella intervienen.
Utilizar la cromatografía en columna para la purificación de una sustancia contaminada con un colorante.
Controlar con cromatografía en capa fina el proceso de separación de mezclas por cromatografía en columna.
Conocer la cromatografía en columna como técnica de separación de mezclas de sustancias, sus características y los factores que en ella intervienen.
Utilizar la cromatografía en columna para la purificación de una sustancia contaminada con un colorante.
Controlar con cromatografía en capa fina el proceso de separación de mezclas por cromatografía en columna.

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PRÁCTICA # 6“CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA”
OBJETIVOS:
Conocer la cromatografía en columna como técnica de separación de mezclas de sustancias,sus características y los factores que en ella intervienen.
Utilizar la cromatografía en columna para la purificación de una sustancia contaminada con uncolorante.
Controlar con cromatografía en capa fina el proceso de separación de mezclas por cromatografíaen columna.
INTRODUCCIÓN:
Las técnicas cromatográficas se emplean para separar los componentes individuales de una mezcla y, enciertos casos, para identificar un compuesto comparando su comportamiento cromatográfico con el desustancias conocidas empleadas como patrón.La base de la técnica es que cuando un determinado soluto interactúa con dos fases, una de ellas,habitualmente sólida, llamada fase estacionaria, experimenta una serie de procesos (adsorción en fasesólida, solubilización en cada fase, arrastre por la fase móvil, etc.) que, en último extremo, llevan a que elsoluto se reparta entre ambas fases. En el equilibrio, la relación entre las concentraciones del soluto entreambas fases es constante, y se denomina
coeficiente de reparto
. Si en una mezcla, cada componentetiene un coeficiente de reparto diferente del de los otros, la separación será buena. Naturalmente, dichocoeficiente depende de la naturaleza de las fases, así como de las condiciones de la cromatografía.Una de las técnicas cromatográficas más sencillas es la que se realiza en capa fina, llamada así porque lafase estacionaria es una capa fina de un material poroso (gel de sílice, alúmina, etc.) extendida para sumanejo mecánico sobre un soporte inerte. La fase móvil es una mezcla de disolventes en diferentesproporciones, que emigra por la fase estacionaria debido, sobre todo, a la capilaridad. En su movimiento,arrastra más o menos a los componentes de una mezcla en función de sus mayores o menorescoeficientes de reparto.El coeficiente de reparto es poco empleado en la práctica. En su lugar, y relacionado con él, se emplea eldenominado Rf, característico de cada sustancia, definido como la relación entre la distancia que recorredicha sustancia y la que recorre la fase móvil. Las más insolubles tendrán, en el disolvente empleado, unRf próximo a cero, mientras las más solubles se acercarán a uno.
Cromatografía en columna:
Se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa. Como faseestacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna. La elección deldisolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efectode la gravedad o bien por aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se prepara mezclandoel soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de ésta un poco de algodón o lanade vidrio, para evitar que la sílica o la alúmina queden retenidas en la columna y que el disolvente seengrasada hasta el nivel del soporte. A continuación se introduce la muestra por la parte superior de lacolumna y se eluye con el disolvente elegido, recogiéndose por lo general en tubos de ensayo.Una columna de cromatografía es un tubo de vidrio relleno con una sustancia sólida de propiedades
adsorbentes
constituida por pequeñas partículas: gel de sílice y alúmina son las más usadas. Este rellenoes lo que se conoce en cromatografía como la
fase estacionaria
. A través de la columna se hará pasar una corriente de un disolvente o mezcla de disolventes denominada
eluyente
y/o
fase móvil 
.La mezcla de compuestos a separar se disuelve en una pequeña cantidad de disolvente y se coloca sobreel adsorbente, en la parte superior de la columna, quedando adsorbida por el mismo. A continuación sepasa un flujo de eluyente a través de la columna. Los compuestos constituyentes de la mezcla sonarrastrados por el eluyente a su paso, haciéndoles avanzar a lo largo de la columna. Sin embargo,
notodos los compuestos avanzan a la misma velocidad 
, y esta es precisamente la clave de la cromatografía.Algunos compuestos se ven más fuertemente retenidos por el adsorbente (
fase estacionaria
) y por lotanto avanzarán más despacio. Por el contrario, otros apenas son retenidos y avanzarán a mayor velocidad.En general se dice que la separación en la cromatografía se basa en la
afinidad diferencial 
de los distintoscompuestos por la
fase móvil 
o la
fase estacionaria
.
1
 
El orden aproximado de elución de compuestos y de polaridad es aproximadamente el que se indica:Cromatografía en Capa finaLa separación de mezclas de moléculas mediante la cromatografía de capa fina se basa en el principiodel reparto entre dos fases. En general, una cromatografía se realiza permitiendo que la mezcla demoléculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que sedenomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase móvil) que es inmiscible con la fase estacionariase hace fluir a través de ésta para "lavar" (eluír) a las moléculas en la muestra. Debido a que las distintasmoléculas en la muestra presentan diferente coeficiente de reparto, la fase móvil "lavará" a los distintoscomponentes con diferente eficiencia, de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la fase móvilserán eluídos más rápido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria.En la cromatografía de capa fina, la fase estacionaria es una delgada capa de un soporte sólidogranulado, tal como gel de sílica, alumina, ácido silícico u otros, que se depositan sobre una placa devidrio, aluminio u otro soporte inerte. Para que adquiera firmeza y no se desmorone, la capa de faseestacionaria se aglutina con una pequeña cantidad de sulfato de calcio u otro agente cementante. Lasmuestras se aplican añadiendo pequeñas gotas de solución en un pequeño círculo cerca del extremoinferior de la placa. La gota se deja secar y si se desea poner más muestra se pueden aplicar más gotas,cuidando de que la mancha no se haga demasiado grande.La placa seca se sumerge en un pequeño volumen de fase móvil (mezcla de solventes). La polaridad dela mezcla de solventes se elige de acuerdo a la mezcla de compuestos que se desea separar. Encromatografía de capa fina la fase estacionaria está hidratada, por lo que se le considera como la fasepolar.Como sólo la base de la placa queda sumergida, el solvente comienza a mojar la fase estacionaria yasciende por capilaridad. Al recorrer la placa la fase móvil va arrastrando a las substancias apolares yaquellas más polares son retenidas por la fase estacionario dando lugar a la separación.La placa desarrollada se deja secar y se revela con un reactivo que tiña a las substancias de interés. Lamovilidad relativa o R
es la relación entre la distancia recorrida por la mancha de un compuesto, divididapor la distancia recorrida por el frente de solvente al momento de sacar la placa del solvente.La técnica de cromatografía en capa fina (TLC), entre otras cosas permite:
Determinar el grado de pureza de un compuesto
Comparar muestras
Realizar el seguimiento de una reacción
Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografía de columnaCromatografía en columna (por fase inversa): Esta es una cromatografía de interacción en la que la faseestacionaria, con moléculas hidrofóbicas, interactúa con moléculas hidrofóbicas en la muestra. La matrizconsiste de fibras de silicato con cadenas de hidrocarburos. Estas atraerán a las moléculas hidrofóbicasde la muestra mientras que las hidrofílicas salen con el amortiguador. Las moléculas son eluídas de lacolumna lavando con soluciones de distinta concentración de alcohol o cualquier otro solvente no polar.= PARTE EXPERIMENTAL=MATERIAL:Frasco vial de 15 mlPlacas p/cromatografía(portaobjetos)8102Colector Embudo de vidrioPipeta Pasteur 111
2
 
Vasos de pp. de 250 mlVasos de pp. de 150 mlPinzas de 3 dedos c/nuezBaño maría. eléctrico c/extensiónRefrigerante de agua c/manguerasMatraz pera de una bocaT de destilaciónTapón quickfit1211111EspátulaColumna p/cromatografíaFrasco cámaraProbeta de 25 mlVarilla de vidrio(50 cm. de longitud)CapilaresAlgodónLámpara de luz U.V113114SUSTANCIAS:Azul de metilenogel de sílice para columnagel de sílice p/cromatografía en capa finaacetato de etilohexanosulfato de sodio anhidroyodoEQUIPO: Rotavapor, Parrilla de calentamiento.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
°
Se le proporcionará 0.5026 g de una mezcla de ácido benzóico/azul de metileno, de la cual separará elproducto principal, por cromatografía en columna.
°
Para empacar la columna sujétela en el soporte con las pinzas. Engrase la llave y manténgala enposición de cerrado.
°
Prepare una suspensión de 10g de alúmina para columna en 10mL de AcOEt y agite durante 5 minutospara eliminar las burbujas.
°
A través del embudo vierta la suspensión en la columna golpeando ligeramente con los dedos para queel empacado sea uniforme.
°
Abra la llave para eliminar el exceso de disolvente teniendo cuidado de no dejar secar la alúmina.
°
En el vaso de 150 mL disuelva la mezcla problema con la mínima cantidad de AcOEt, y ayudándose conel agitador viértala con cuidado, para que quede colocada uniformemente por encima de la alúmina,abra la llave para que salga el eluyente y se adsorba la muestra aplicada, cuidando que no se seque laalúmina, eluya la mezcla con AcOEt. Agregue 0.5cm de Na
2
SO
4.
°
Colecte las fracciones (eluatos) de 10 mL de los frascos viales y controle la separación, haciendo c.c.f. acada una de las fracciones ante una muestra de referencia (testigo).
°
Eluya las cromatoplacas en mezcla de Hexano-Acetato de Etilo (1:1), revele con luz U.V.
°
En cada cromatoplaca observe el cambio de la intensidad de la coloración de la mancha del productoprincipal. La elución y la separación terminan en el momento en que no aparece mancha.
°
En un matraz reúna las fracciones que contienen la misma sustancia.
°
Para recuperar la sustancia destile el exceso de disolvente, utilizando una destilación simple, calentandocon un baño maría eléctrico, deje en el matraz pera un residuo de 5 mL aproximadamente y viértalo enun vaso que termine de evaporar en la campana.
°
Pese el producto recuperado, calcule el rendimiento.
RESULTADOS:Matraces: Se realizaron 6 eluatos:Placas: (s = testigo de ácido benzóico), eluyente: Hex /AcOet (6:4)
3

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Muchas gracias, me ayudo mucho este documento.

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