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3.- Estudio Microscopico de Los Microorganismos

3.- Estudio Microscopico de Los Microorganismos

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Realizar adecuadamente las preparaciones y tinciones más utilizadas para el estudio microscópico de los microorganismos.
Identificar y describir correctamente las características morfológicas y de locomoción de algas y protozoarios.
Identificar y describir correctamente las características microscópicas y tintoriales de las bacterias, tales como forma, agrupación, cápsulas y si son Grampositivas o gramnegativas.
Realizar adecuadamente las preparaciones y tinciones más utilizadas para el estudio microscópico de los microorganismos.
Identificar y describir correctamente las características morfológicas y de locomoción de algas y protozoarios.
Identificar y describir correctamente las características microscópicas y tintoriales de las bacterias, tales como forma, agrupación, cápsulas y si son Grampositivas o gramnegativas.

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Categories:Types, Research
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PRÁCTICA # 3
“ 
ESTUDIO MICROSCÓPICO DE LOS MICROORGANISMOS
” 
INTRODUCCIÓN:
Una de las características más importantes de los microorganismos es su tamaño minúsculo que los haceimperceptibles a simple vista y, aunado a su transparencia, obliga a utilizar (además del microscopio)técnicas especiales para observar y estudiar su morfología y algunas de sus estructuras.Desde Leewenhoek, los pioneros de la microbiología los observaban en gotas de algún fluido, pero elescaso contraste con el medio y el continuo movimiento impedían el estudio detallado o prolongado de losmicroorganismos. Koch fue el primero en “fijar” las preparaciones y teñirlas como había hecho Weigert enhistología.Hoy en día se dispone de una amplia variedad de tinciones microbiológicas que constituyen herramientasmuy importantes para la detección, identificación y control de los microorganismos, que van desdetécnicas sencillas y rutinarias, hasta tinciones altamente sofisticadas para el diagnóstico y la investigación.
OBJETIVOS:
Mediante esta practica, el alumno lograra:
Realizar adecuadamente las preparaciones y tinciones más utilizadas para el estudio microscópico delos microorganismos.
Identificar y describir correctamente las características morfológicas y de locomoción de algas yprotozoarios.
Identificar y describir correctamente las características microscópicas y tintoriales de las bacterias,tales como forma, agrupación, cápsulas y si son Grampositivas o gramnegativas.
REPORTE:Tipos de preparaciones:
Preparaciones en fresco:
La forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico es hacer una
 preparaciónen fresco
.
Existen dos técnicas, una preparación en fresco
 
simple
que consiste en colocar una gota delíquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y a continuación cubrirla con un cubreobjetos. Una
 preparación en gota pendiente;
 
esta preparación se realiza colocando una gota de la suspensiónbacteriana en un cubreobjetos en el cual se ha hecho previamente un círculo con vaselina (actúa comosellador) o parafina; sobre el cubreobjetos se coloca un portaobjetos con una excavación central quequeda adherido gracias a la vaselina. Se invierte la preparación y se observa colocándola en la platina delmicroscopio. La ventaja de esta última técnica, es que la preparación no se seca y puede ser observadadurante un tiempo más largo.Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos y observar: la movilidad, eltamaño y la forma de agrupación de los microorganismos en su estado natural y sin alteraciones; asícomo gránulos refráctiles, esporas si teñir y cloroplastos dentro de las células vivas. Sin embargo, elinconveniente de la observación en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparación por la escasa diferencia entre los índices de refracción del medio y de los microorganismos; por otra parte, elmovimiento continuo de los microorganismos, así como el causado por las corrientes de fluido,frecuentemente hacen difícil la observación. Por tanto, su uso, con un microscopio óptico de campo claro,está bastante limitado.A este tipo de preparaciones se pueden agregar colorantes muy diluidos como el cristal violeta, rojoneutro, verde Janus, que aumentan el contraste de las células sin afectar su viabilidad.
Preparaciones fijas y teñidas:
La preparación consiste en una capa de la muestra extendida sobre un portaobjetos libre de grasa. Estapreparación debe ser lo suficientemente delgada para permitir el paso de la luz a través de ella. El“extendido” o “frote” se puede hacer de varias maneras:
°
Suspendiendo el desarrollo microbiano en una pequa gota de agua mediante el asa ydistribuyéndolo en el portaobjetos.
1
 
°
Por “impronta”, presionando el porta sobre la muestra.
°
Con cinta adhesiva transparente
°
Con hisopo
°
Colocando una gota de la muestra fluida en el porta.Los extendidos o frotes se dejan secar al aíre; para asegurar que las células queden adheridas alportaobjetos y no se desprendan durante los lavados que se realizan durante la tinción; la preparación sefija con calor moderado, pasando el portaobjetos 5 o 6 veces sobre la flama del mechero, o adicionandosustancias deshidratantes y/o precipitantes como metanol o cloruro mercúrico, procediendo a hacer latinción. Esta puede ser:
Positiva: Cuando se colorea directamente a los microorganismos o a las estructuras en estudio;utilizan colorantes.
Negativa: Cuando se oscurece el fondo de la preparación y se observa la silueta incolora de losmicroorganismos.
Colorantes:
Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste; son compuestos coloridosque al combinarse con otras sustancias les confieren color. Están formados por un grupo cromóforo, queen la parte de la molécula responsable del color y un grupo auxócromo que, al formar sales, les permitedisociarse y combinarse. Existen algunos, llamados
colorantes vitales
, que pueden añadirse directamentea una preparación en fresco; por tanto, colorean células vivas. No obstante, la mayoría de los colorantesson solamente efectivos después de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentrenmuertos y adheridos al portaobjetos. Para la
fijación por calor,
 
se realiza una fina extensión
 
de una gotade muestra líquida sobre un portaobjetos y se deja secar al aire; a continuación, se pasa la preparaciónde Forma rápida sobre la llama de un mechero; El calor de la llama mata las células microbianas por desnaturalización de sus proteínas. Las proteínas coaguladas unen las células al porta. Cuando se deseafijar especimenes delicados se utiliza
la fijación química,
que es menos agresiva que el calor. Para ello seañade una gota del fijador, por ejemplo, ácido ósmico, formaldehído, o glutaraldehído, sobre la muestralíquida con los microorganismos.La fijación posee algunos inconvenientes. Por ejemplo, a menudo distorsiona la apariencia real de lascélulas, lo cual dificulta la identificación; además, no permite la observación del movimiento de losmicroorganismos. Después de la fijación, se añade el colorante, que debe permanecer el tiemposuficiente en contacto con el espécimen, para que pueda ser absorbido. A continuación, se retira elexceso de colorante, normalmente lavando con agua.
Tipos de colorantes
 
Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados. Loscolorantes básicos son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el ion cargado positivamente (elcromóforo) y se combinan con los componentes ácidos de la célula como ADN y ARN, mientras que enlos ácidos, el colorante es el ion cargado negativamente y se combinan con los componentes básicos dela célula, como el citoplasma; es decir se combinan con los componentes celulares en función de susrespectivas cargas; por lo tanto, los factores como fuerza iónica, composición del medio, temperatura ypH afectan las tinciones.Los colorantes más utilizados son los de tipo básico, ya que la mayor parte de las células microbianasposeen cargas débilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su unión. Entre los colorantesbásicos más comunes se encuentran la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno.Los colorantes ácidos se unen a las partes de las células cargadas positivamente. Se utilizan para teñir tejidos animales infectados con microorganismos. Entre los más frecuentes están la eosina, la fucsinaácida y el rojo Congo.Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran importancia en algunas técnicas de tinción. Losmordientes intensifican la tinción porque aumentan la afinidad de la célula por el colorante. Se usa cuandola afinidad química entre el componente celular y el colorante es baja; también se pueden utilizar paraproducir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a sudelgadez no podrían ser visualizados de otra forma.Finalmente, algunos colorantes precipitan o se disuelven en componentes celulares tales como el negrode Sudán, que es liposoluble y permite distinguir los glóbulos de grasa.Tipos de tinciones:Pueden agruparse en: tinciones simples, diferenciales y selectivas.
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TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA BACTERIASTinciónUsoTécnicas
Tincionessimples
Un colorante; proporcionacontraste para observar mejor un organismocompletoSe tiñe con un colorante básico (azul de metileno, cristalvioleta, o fucsina básica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tiñen casi todas las bacterias; larnayoría de los tejidos no se tiñen.
Tinciones diferenciales
Tinción deGram.
Dos o s colorantes;distingue entre bacteriasGram positivas y GramnegativasSe cubre la preparación de bacterias fijadas con cristalvioleta y después con una solución de iodo (mordiente).Todas las células quedan tenidas de color violeta oscuro. Sedecolora con acetona al 95%.Las células Gram positivas permanecen tenidas, pero lasnegativas pierden el colorante. Se tiñe con safranina(contraste). El color violeta de las Gram positivas se vuelvemás oscuro y las Gram negativas se tiñen de rosa.
Tinción deácido-alcohol resistencia(Ziehl-Neelsen)
Dos colorantes; distingueentre las micobacterias(ácido-alcoholresistentes) y el resto delas bacteriasSe tiñen las células con fucsina básica y se calienta aemisión de vapores durante 5 minutos. Todas las bacteriasse tiñen de rojo. Se decolora brevemente con una mezcla dealcohol-HCl. Las bacterias resistentes permanecen teñidasde rojo; todas las demás se decoloran. Se trata con elcolorante de contraste azul de metileno. Las bacterias ácido-alcohol resistentes continúan tenidas de rojo, las otras setiñen de azul.
Tinciones selectivas
Tinción deesporas deWirtz-Cortitlin
Tiñe selectivamente lasendosporasSe cubre la preparacn con verde de malaquita y secalienta a emisión de vapores durante 60 segundos. Se lavacon agua durante 30 segundos y se tiñe con safranina. Lasendosporas retienen el color verde; el resto de la célulatoma el color rosa.
Tinción deflagelos deLeifson
Permite observar losflagelosA las células previamente fijadas, se le añade una mezcla deácido nico (mordiente) y del colorante rosanilina. Elmordiente engruesa los flagelos y el colorante los fine.
Tinciónnegativa
Revela la presencia decápsulasSe utiliza tinta china o nigrosina para teñir una preparaciónen fresco del espécimen. Las partículas de colorante nopueden penetrar en la cápsula, que se observa como unaregión clara alrededor de la célula.
1) Tinciones simples
En las tinciones simples se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico como safranina, azul demetileno o cristal violeta. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las célulasabsorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple mejora laobservación de la célula completa. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempoadecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente, hay que añadirlo justo antes del colorante.
2) Tinciones diferenciales
Las tinciones diferenciales se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La técnica de tincióndiferencial consta de dos etapas: una tinción primaria (siguiendo el mismo método que en una tinciónsimple) seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se utiliza otro colorante que tiñe (ypor tanto, revela) las células no teñidas por el primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas enmicrobiología. Por ejemplo, la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia, ambas aplicadas abacterias.
a) Tinción de Gram
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