PRÁCTICA # 5
“TÉCNICAS BÁSICAS PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS: SIEMBRA Y ESTUDIO DE BACTERIAS”
INTRODUCCIÓN
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseñado diversos métodos que permiten cultivarlos bajocondicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones experimentales y manejar un solo tipo demicroorganismo. Una de las técnicas más usadas en el laboratorio de microbiología consiste en transferir unamuestra microbiológica de un ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivosmicrobianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchosotros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren ycontaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también lascondiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH yconcentración de sales y durante la incubación condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad.La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así comosu aislamiento y la obtención de cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, caracterización, aplicación ycontrol de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de microorganismo y propósitoespecífico del estudio.
OBJETIVOS:
ξ
Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar contaminaciones.
ξ
Organizar el material para su fácil manejo e identificación.
ξ
Manipular adecuadamente los cultivos puros.
ξ
Seleccionar y aplicar las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar propósitos específicos.
ξ
Identificar y describir correctamente las características culturales y microscópicas de algunas bacterias.
ξ
Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscópico y microscópico de bacterias.
MARCO TEÓRICO:
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo ycondiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denominacultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina
cultivo puro
o
axénico
, cuandocontiene más de una especie de microorganismos se denomina
cultivo mixto
. Un cultivo tipo contiene una especieconocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula. Los cultivos axénicosson muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivoaxénico se obtiene artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio yen los instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados ocontaminantes
deben ser eliminados de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso paraobtener un cultivo axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido oliquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del resto y se podrámultiplicar en condiciones favorables. Un
clon
está constituido por una población de células descendientes de unsolo microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficiede un medio sólido.Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz, debe ser transferidoa un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En estatransferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables(contaminantes) y concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.
Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la ubicuidad de losmicroorganismos, lo que determina que el aíre y todas las superficies estén densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra microbiológica a otro recipiente, se debentener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de contaminación. Estos incluyen el área de trabajo, ellavado de las manos, la esterilización de todos los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar latransferencia del microorganismo en una zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero.Al conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminación se le llama técnica aséptica; elseguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:
o
La contaminación y pérdida del cultivo en estudio
o
La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la contaminación de utensilios,productos y del personal. Este último aspecto es particularmente importante cuando se trabaja concultivos de microorganismos patógenos.Con relación a la concentración del inóculo, un error frecuente del principiante consiste en tomar muestrasgrandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene variosmillones de microorganismos, es obvio que con una cantidad pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa,será más que suficiente para efectuar una transferencia exitosa.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas:
hisopo, pipeta (para uso microbiológico sonterminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta pasteur, cable de Kolleo portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho.En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación, hisopos, pipetas o pipetaspasteur que deberán esterilizarse previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los diferentesmedios de cultivo tienen aplicaciones específicas. Por ejemplo: los medios líquidos se preparan en tubos omatraces que se cubren con tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferidomediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inóculo se deposita dentro del caldo omedio líquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiestaen la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a laposibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo decultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo que permite estandarizar laconcentración del inóculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e difícil detectar contaminación a simplevista.Los medios semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o pipeta pasteur; eneste último caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en estado líquido y a una temperatura deaproximadamente 42ºC se agrega el inóculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean paraestudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con diferentesrequerimientos de oxígeno.Los medios sólidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las necesidades, despuésde esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La siembra se realiza con el asa, inoculando lasuperficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregadosque se hacen visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentancaracterísticas que varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado.En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aún cuando la mayoría de losmicroorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con estemismo propósito durante la incubación se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismoen estudio. El crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de lasveces están relacionadas con la de su hábitat natural.Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas más elevadas (30 a 45ºC) yalgunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede usar una incubadora microbiológicao un baño de agua a temperatura constante, en tanto que para lo microorganismos que presentan su crecimientoóptimo a temperaturas entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperaturaambiente.En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a los rangos de temperaturarequeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos aparatos funcionan con aíre seco, loque determina la deshidratación de los medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo
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experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por más de nueve días. Con relación a lasnecesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de oxígeno atmosférico; los que sólocrecen en presencia de aíre se llaman aerobios obligados; los que sólo crecen en ausencia de oxígeno sedenominan anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conocecomo facultativos. Existe una cuarta categoría que comprende bacterias que requieren oxígeno, pero sólo loutilizan cuando éste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama microaerofílicos. El desarrollo deestos diferentes grupos e favorece mediante la agitación de los cultivos o mediante la exclusión de oxígeno paralo que se emplean sustancias reductoras o equipos especiales.Las bacterias son organismos procarióticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan enel agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir enforma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea como parásitos, comensales o mutualistas.Fisiológicamente este grupo presenta características muy variables, hay bacterias móviles e inmóvilesfotosintéticas y quimiotróficas, autótrofas y heterótrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura,pH y condiciones gaseosas.En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen:tamaño, morfología celular, forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de esporas, movilidad,presencia de inclusiones de reserva y características culturales en medios líquidos y sólidos en los que presentanpatrones de desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.
Técnicas de siembra:El método de siembra por estría en placa
Es el
método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se tomauna muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólidopreparado en una placa Petri
(a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se vanhaciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menosmicroorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimasestrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo esteproceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula, no podemosasegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir deuna colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con todaseguridad, cultivos axénicos.
Los métodos de vertido en placa y extensión en placa
En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen
antes
de su siembra en placa. Se siguenestas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en unasola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida 10
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veces paraobtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas
(envarias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez endiez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (le medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Seagita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, sepuede proceder de dos maneras diferentes.En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa.Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales seextenderán y serán más grandes. En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembrandirectamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con avuda de un asa de Diralsky de cristalestéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambastécnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por estría, noexiste la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso.Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número decolonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepaa partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.Para obtener un cultivo axénico mediante este método:
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5.- Tecnicas Basicas Para El Cultivo de Microorganismos
Aplicar la técnica adecuada para preparar el área de trabajo y evitar contaminaciones.
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