PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE VALPARASO FACULTAD DE INGENIERA ESCUELA DE INGENIERA BIOQUMICA

ICB-690 Laboratorio de Bioprocesos INFORME PRELIMINAR DE LABORATORIO: RECUPERACIN Y MOLIENDA DE BIOMASA

Alumnos: Blanca Araya A. Ernesto Gonzlez R. Francisco Mesa L. Felipe Scott C. Fabrizio Venturini E. Profesores Gua: Ral Conejeros Oscar Romero

RESUMEN

El presente documento describe la propuesta de trabajo para la determinacin del efecto de la adicin de etanol como agente deshidratante de S. cerevisiae en el rendimiento global de recuperacin de protena intracelular. Este trabajo se enmarca en las experiencias a realizar en la asignatura ICB 690, Laboratorio de Bioprocesos. Adems presenta una revisin bibliogrfica de las operaciones unitarias que sern realizadas, los mtodos analticos a utilizar y una descripcin de los principales equipos necesarios y su operacin.

NDICE
1 2 2.1 2.2 3 3.1 3.1.1 3.1.2 3.2 3.2.1 3.2.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.4 3.4.1 3.5 3.5.1 3.5.2 3.5.3 4 Introduccin 1 Revisin Bibliogrfica 2 Separacin centrfuga de slidos 2 Disrupcin celular 5 Materiales y mtodos 8 Propuesta de trabajo 8 Curvas de eficiencia y factor de concentracin v/s caudal 8 Molienda y cuantificacin de protenas 8 Mtodos analticos 9 Determinacin de biomasa 9 Cuantificacin de protenas 10 Descripcin de Equipos 12 Centrifuga de discos Westfalia 12 Molino 12 Procedimientos 12 Centrifugacin 12 Materiales y equipos menores 14 Reactivos 14 Materiales 14 Equipos menores 14 Referencias bibliogrficas 16

NDICE DE TABLAS
Tabla 2.1: Mtodos de disrupcin celular, principios de operacin y aplicacin a gran escala 6 Tabla 3.1: Volmenes de etanol y agua a utilizar durante la molienda y concentracin de etanol estimada 9 Tabla 3.2: Cantidad de BSA a agregar para la preparacin de la curva patrn 12 Tabla 3.3: Reactivos que se consumirn durante la experiencia de laboratorio 15 Tabla 3.5: Materiales a utilizar durante la experiencia 16

pg.

NDICE DE FIGURAS
Figura 1: Trayectoria de una partcula en el canal de flujo entre discos. 3

pg.

1 INTRODUCCIN
Este informe preliminar expone los objetivos de la experiencia de laboratorio Recuperacin y molienda de biomasa, especificando los objetivos de la prctica; una descripcin de equipos a utilizar; las metodologas experimentales y analticas, y finalmente un plan de trabajo. Como objetivo general se ha definido la determinacin del rendimiento global de una operacin de recuperacin de protena intracelular de Saccharomyces cerevisiae utilizando etanol como agente deshidratante en la molienda. A partir de este objetivo se han generado dos objetivos especficos: obtener una relacin entre la eficiencia de separacin y el flujo alimentado a la centrfuga, y determinar el efecto de diferentes concentraciones de etanol sobre la extraccin de protenas durante la molienda. Estos objetivos han sido definidos de manera que puedan ser cumplidos con las tareas descritas en la gua de trabajo del laboratorio, realizando algunas modificaciones y consideraciones sugeridas. La motivacin de determinar la eficiencia de la extraccin de protenas intracelulares utilizando etanol como agente deshidratante es reducir el tiempo necesario durante la molienda al mejorar la liberacin de protenas. Si bien el etanol a altas concentraciones ha sido utilizado tradicionalmente en la separacin de mezclas proteicas mediante precipitacin fraccionada, en el presente trabajo se propone su uso a menores concentraciones para mejorar la liberacin de protenas de membrana, posibilidad que hasta ahora no ha sido estudiada.

2 REVISIN BIBLIOGRFICA
Existe evidencia de que la respuesta del estrs generado por etanol tiene caractersticas similares a la respuesta generada por estrs trmico, lo que se asocia al efecto sinrgico que tiene el etanol y el calor para desordenar la membrana celular (Piper et al., 2004). Por otro lado se ha demostrado que la composicin de la membrana celular juega un papel crucial en la viabilidad celular en presencia de etanol y adems una adaptacin necesaria para la clula es modificar la composicin de la membrana celular cuando se expone a este ambiente (Thomas et al., 1978), otros autores han demostrado que la clula incluso cambia su tamao bajo estas condiciones (Dinh et al., 2008). Otros efectos del etanol sobre la funcionalidad y estructura de la membrana celular en levaduras son: la induccin de la liplisis de fosfolpidos, aumentar la permeabilidad inica, inhibir la entrada de nutrientes y la hiperpolarizacin de la membrana (Walker, 1998). Debido a que la pared celular, que constituye aproximadamente el 30% del peso seco de S. cerevisiae, est compuesta principalmente por polisacridos (Lesage and Bussey, 2006), se espera que el etanol no genere un efecto importante en la liberacin de protenas por s mismo, y sea necesaria una fase de molienda para romper esta primera barrera. Desde hace mucho se ha utilizado etanol a altas concentraciones para separar protenas de membrana (Rosenberg and Guidotti, 1968), lo que demuestra su efectividad para separar lpidos de protenas.

2.1 Separacin centrfuga de slidos

Un mtodo comnmente utilizado para describir la operacin de una centrfuga, considerando variables operacionales, propiedades de la suspensin y caractersticas del equipo, es la utilizacin del factor sigma ( ) o rea equivalente de sedimentacin. Este mtodo supone que la sedimentacin de las partculas puede ser adecuadamente descrita por la ley de Stokes. La modificacin de dicha ecuacin permite su adaptacin a la sedimentacin de partculas esfricas en un campo centrfugo, suponiendo rgimen de flujo laminar y una baja concentracin de partculas (Maybury et al., 1998). La ultima consideracin es necesaria para suponer la inexistencia de interacciones partcula-

partcula, las que disminuiran la velocidad de sedimentacin.

Figura 1: Trayectoria de una partcula en el canal de flujo entre discos. El siguiente anlisis ha sido adaptado parcialmente desde bibliografa (Richardson et al, 2002). Con las suposiciones antes mencionadas, y en relacin a la Figura 1 es posible representar la velocidad en la direccin tangencial al disco como:

Ecuacin 1

Donde

es el espacio entre discos,

el caudal alimentado y

representa el nmero de

canales de flujo (nmero de discos menos 1). La velocidad de sedimentacin de una

partcula en un radio

cualquiera puede aproximarse mediante la ley de Stokes:

Ecuacin 2

En la que

es la velocidad angular,

la densidad del slido,

la densidad del lquido,

el dimetro de la partcula y

la viscosidad cinemtica del lquido. Considerando que

los discos estn inclinados un ngulo

es posible establecer que:

Ecuacin 3 Luego combinando la Ecuacin 1 y la Ecuacin 3:

Ecuacin 4 Adems:

Ecuacin 5 Combinando la Ecuacin 2 y la Ecuacin 5, se tiene:

Ecuacin 6 Dividiendo la Ecuacin 6 por la Ecuacin 4 se obtiene:

Ecuacin 7 Las partculas de menor dimetro (menor velocidad de sedimentacin) y que hayan entrado en la posicin menos favorable (disco inferior y radio R1) solo quedarn retenidas si impactan en la cara inferior del disco superior en el radio R2, luego:

Ecuacin 8 Despejando el caudal de la Ecuacin 8 integrada se obtiene:

Ecuacin 9 A partir de la Ecuacin 9 y la definicin de velocidad de sedimentacin en un campo gravitatorio (Ecuacin 1), es posible despejar el dimetro crtico de partcula, es decir el dimetro de corte de las partculas retenidas. Partculas con dimetros mayores al dimetro crtico quedarn retenidas, el resto saldr en la corriente de lquido clarificado.

Ecuacin 10 Luego, a medida que aumenta el flujo alimentado a la centrfuga, manteniendo constantes las restantes variables en la Ecuacin 10, aumenta el dimetro de las partculas ms pequeas que son recuperadas en la corriente concentrada. Cuando se alcance un flujo que lleve a que el dimetro crtico de las partculas separadas sea mayor al dimetro medio de S. cerevisiae, buena parte de las clulas se recuperarn en lo que debera ser la corriente clarificada, por lo que no se efectuar la separacin. La fraccin de clulas recuperadas en la corriente clarificada es una funcin de la

distribucin de tamao de las clulas. Adems, las variables consideradas en la Ecuacin 10 no son las nicas involucradas en el proceso, a este conjunto se debe sumar el efecto de la concentracin celular de la suspensin alimentada. Como se indic para que sea vlido asumir la ley de Stokes la suspensin debe ser diluida, de otra forma la interaccin entre las partculas que estn sedimentando causa la disminucin de la velocidad de sedimentacin, disminuyendo el flujo mximo que puede ser alimentado a la centrfuga (vase Ecuacin 9). Para analizar el efecto del flujo de alimentacin sobre la separacin se definirn dos parmetros: eficiencia msica de recuperacin y factor de concentracin. El primer parmetro es el cociente entre la masa de clulas recuperada en la corriente concentrada y la masa de clulas alimentada a la centrfuga. El factor de concentracin ser definido como el cociente entre la concentracin de la corriente de purga de slidos y la concentracin de clulas en la alimentacin.

2.2 Disrupcin celular

Los productos de inters de una fermentacin pueden ser la biomasa o algn compuesto especfico producido por sta. Este compuesto en particular puede ser liberado al caldo de cultivo o permanecer al interior de la clula. En estos casos como primer paso se realiza una separacin slido-lquido y segn la ubicacin del producto de inters se continuar procesando el caldo o la biomasa. Para los casos en que el producto de inters es intracelular se debe realizar una ruptura celular. Para tales efectos se encuentran disponibles varios equipos, que operan bajo distintos principios, y que pueden ser factibles a escala laboratorio y/o a escala industrial. En la Tabla 2.1 se muestran distintos mtodos de extraccin de productos intracelulares, para el caso particular en que ste sea una enzima.

Tabla 2.1: Mtodos de disrupcin celular, principios de operacin y aplicacin a gran escala Mtodo Ruptura Celular Presin Homogenizacin Molienda Sonicacin Descompresin Congelamiento y descongelamiento Dispersin en agua Termolisis Permeabilizacin Celular Compresin, esfuerzo de corte Esfuerzo de corte, cavitacin Compresin, esfuerzo de corte Cavitacin Descompresin explosiva Esfuerzo de corte Shock osmtico Ruptura de la pared celular Moderada Altamente factible Altamente factible Moderada Moderada Improbable Improbable Moderada Principio Aplicacin a gran escala

Tratamiento alcalino Tratamiento con solvente Lisis enzimtica Autolisis Tomada de Illanes, 2008

Digestin de la pared celular Digestin de la membrana Digestin de la pared celular y ruptura osmtica Digestin de la pared celular y ruptura osmtica

Improbable Moderada Factible Factible

Como se aprecia en la Tabla 2.1 los equipos de molienda (en particular los molinos de bolas) han mostrado ser muy tiles tanto a escala de laboratorio como a nivel industrial. Los molinos de bolas consisten en un recipiente cilndrico que contiene bolas (de vidrio, cermica o metal) en su interior. En esta cmara se carga la pasta celular de la que se desea recuperar el material de inters. Mientras el cilindro gira, va ocurriendo la disrupcin por medio de la compresin y las fuerzas de corte que se generan. Estos equipos han mostrado ser tiles con levaduras, bacterias y organismos filamentosos, pudiendo operar en continuo o mediante lotes, y suelen contar con sistemas de enfriamiento para disipar el calor que se genera durante la operacin. La cintica de disrupcin puede ser modelada adecuadamente por medio de una ecuacin diferencial donde la disrupcin celular es proporcional a la cantidad de material celular sin romper. Debido a que la cantidad de clulas cuya integridad fue comprometida es difcil de medir, se considera que el grado de disrupcin es proporcional a la protena liberada ( ), vase la Ecuacin 11, del mismo modo el

material no roto remanente es proporcional a la protena interna remanente ( ). Luego, la suma de ambas cantidades de protena se corresponde con el contenido proteico total ( ).

Ecuacin 11 Ecuacin 12

Considerando que al inicio la concentracin de protenas libres es

, la concentracin

de protenas libres en el tiempo puede expresarse por la siguiente ecuacin:

Ecuacin 13

3 MATERIALES Y MTODOS
3.1 Propuesta de trabajo
Se prepararn 50 L de una suspensin S. cerevisiae, a partir de levadura fresca de uso comercial, con una concentracin estimada de 20 g/L. Se determinar la concentracin de esta suspensin mediante peso seco y realizando distintas diluciones a partir de ella se realizar una curva de calibrado entre absorbancia y peso seco. De los 50 L se tomarn 10 L, los que sern reservados para las pruebas de molienda, el volumen restante se utilizar para realizar la curva de eficiencia v/s caudal, reutilizndolo luego de cada experiencia. 3.1.1 Curvas de eficiencia y factor de concentracin v/s caudal

La centrfuga ser operada con las caractersticas detalladas en la seccin 3.3: Descripcin de Equipos y se alimentarn, mediante una bomba peristltica, flujos de 2, 4, 6, 8 y 10 L/min. La concentracin de la alimentacin y la fase ligera sern medidas por turbidimetra; el volumen alimentado ser estimado mediante el caudal impulsado por la bomba y el tiempo utilizado, el volumen de la corriente concentrada ser estimado mediante la utilizacin de baldes los que sern descargados en un recipiente con volumen cercano a 15 L. El volumen recuperado de lquido clarificado ser medido en el recipiente en que se recolecte, en forma tentativa ste debera ser uno de los mezcladores de acero inoxidable o cualquier otro recipiente con capacidad de 30 L. Finalmente la composicin de la fase pesada ser estimada mediante balance de masa. 3.1.2 Molienda y cuantificacin de protenas

Los 10 L reservados para la molienda sern centrifugados a la mejor condicin de eficiencia flujo, esperando alcanzar una concentracin de salida de fase pesada de 65 g/L, recuperando alrededor de 3 L de crema. La cuantificacin de la concentracin celular en la corriente concentrada ser realizada mediante peso seco. Para evaluar el efecto del etanol se realizaran 6 series a partir de 230 ml de pasta y las proporciones de etanol y agua mostradas en la Tabla 3.1. Tabla 3.1: Volmenes de etanol y agua a utilizar durante la molienda y concentracin de etanol estimada Seri e 1 2 3 4 Etanol agregado [ml] 0 1,7 3,3 5,0 Agua agregada [ml] 34 32,3 30,7 29,0 Concentracin etanol estimada [g/L] 0 5 10 15 Volumen suspensin 264 264 264 264

5 6 7

6,7 16,7 33,5

27,3 17,3 0,5

20 50 100

264 264 264

Al molino, llenado previamente con un 85% v/v de elementos de molienda entre 0,75 y 1 mm de dimetro, se alimentarn 250 ml de suspensin concentrada de clulas. Dicho volumen se basa en una fraccin de huecos en el lecho de bolas de 0,31 estimado a

partir de un cubo de lado

conteniendo dos esferas de radio

(Chang, 1992).

Para descartar o confirmar si el etanol libera protenas de la clula, se medir la concentracin de protena libre a la suspensin antes de agregar etanol y luego de 1 hora de agregadas las dosis de etanol, tomando 1 ml de la suspensin para determinar la concentracin de protena libre Para determinar la protena total extrable se realizar una molienda sin etanol hasta alcanzar un punto en el que no se observe un aumento de la protena liberada. El rendimiento de la extraccin ser el cociente entre la protena medida en cada muestra y la protena total extrable. Debido a que el etanol es un lquido inflamable podra pensarse que es riesgoso utilizarlo en un equipo en rpida rotacin. Sin embargo, el punto de ignicin (flash point) de una mezcla de etanol-agua al 10% es de 49C (NFPA, 2002) por lo que el riesgo de incendio est descartado a la temperatura de trabajo, la cual se espera sea siempre menor a 10 C gracias al lquido refrigerante.

3.2 Mtodos analticos

3.2.1 Determinacin de biomasa

Para determinar la concentracin celular de la suspensin a centrifugar se tomarn 3 muestras de 20 ml cada una, dos de estas muestras sern centrifugadas en capachos a 10000 rpm por 15 minutos. El sobrenadante de cada tubo ser reservado para servir como blanco en la confeccin de una curva de calibrado absorbancia versus concentracin celular. Se agregarn 10 ml de agua destilada a cada capacho para resuspender las clulas. Los pellets resuspendidos sern sometidos a una segunda

centrifugacin, posterior eliminacin del sobrenadante y resuspensin agregando 10 ml de agua destilada. Las muestras resuspendidas sern depositadas en capachos de aluminio y llevadas a estufa a 103 C hasta alcanzar peso constante. La tercera muestra de 20 ml obtenida de la suspensin de clulas no ser centrifugada, ya que a partir de sta se prepararn diluciones para confeccionar una curva de calibrado absorbancia vs concentracin celular. La absorbancia de cada una de las diluciones de la muestra ser medida a 650 nm en un espectrofotmetro. Luego se correlacionar dicho valor con la concentracin celular esperable para la dilucin utilizada; dicha concentracin ser obtenida de la relacin entre la masa de clulas en los capachos dispuestos en la estufa, la dilucin de la muestra y el volumen tomado de suspensin (20 ml). La concentracin celular en la corriente clarificada para cada flujo alimentado a la centrfuga ser determinada por turbidimetra utilizando la curva de calibrado obtenida y el siguiente procedimiento: Tomar 5 ml de muestra de la corriente clarificada recolectada. Depositar aproximadamente 2 ml de la muestra en una cubeta para espectrofotometra Determinar la absorbancia de la muestra mediante espectrofotometra a 650 nm.

Para la medicin de soluciones concentradas de clulas obtenidas por centrifugacin se preferir la cuantificacin de la concentracin celular mediante peso seco. Para esto se seguir el siguiente protocolo: Tomar una muestra de 10 ml de la suspensin recolectada, depositarla en un capacho y centrifugar a 10000 rpm por 15 minutos Eliminar el sobrenadante, resuspender el pellet en 10 ml de agua destilada y repetir la centrifugacin. Eliminar el sobrenadante, resuspender el pellet en 10 ml de agua y depositar en un capacho de aluminio el que ser llevado a estufa a 103C hasta peso constante.

3.2.2

Cuantificacin de protenas

El mtodo de Bradford para la determinacin de protenas se caracteriza por ser simple, rpido y ms sensible que el mtodo de Lowry, presentando adems una menor interferencia. Las sustancias que pueden causar interferencias en la medicin son detergentes y anfolitos. stos pueden ser removidos mediante filtracin en gel, dilisis, precipitacin de las protenas con fosfato de calcio, o se pueden incluir en la curva de calibrado para obtener resultados ms representativos. El mtodo de Bradford se basa en la unin del colorante azul de Coomassie a la protena. Estudios indican que el colorante presenta 3 formas inicas las cuales tienen valores de pKa de 1,15; 1,82 y 12,4 (Chia et al., 1993). A la protena se une la forma aninica del colorante que tiene mxima absorbancia a 590 nm. Sin embargo, la medicin se realiza a 595 nm ya que representa el mejor compromiso entre la mxima absorbancia del complejo coloranteprotena y una menor interferencia de la forma verde del colorante que se encuentra libre. Para preparar el reactivo de Bradford se disuelven 100 mg de azul de Coomassie en 50 ml de etanol al 95%, luego se agregan 100 ml de acido fosfrico al 85% y se afora a 1L con agua destilada. La curva de calibrado se realiza con una solucin estndar de albumina de suero bovino (BSA) de 1 mg/ml de concentracin, con la cual se preparan distintas soluciones segn lo propuesto en la Tabla 3.2. Tabla 3.2: Cantidad de BSA a agregar para la preparacin de la curva patrn Muestr a Blanco 1 2 3 4 5 6 Solucin BSA [L] 0 10 20 40 60 80 100

A cada muestra se le adiciona agua destilada hasta completar un volumen total de 100 L, en seguida se deben agregar 5 ml de reactivo de Bradford a cada tubo, esperar 2 minutos y medir absorbancia a 595 nm.

Para analizar las muestras se debe trabajar en base al procedimiento siguiente: Desde el molino tomar 1 ml de muestra en un Eppendorf cada 40 segundos (la frecuencia es solo referencial y podr ser cambiada de acuerdo a circunstancias operacional), centrifugar y finalmente tomar 100 L de sobrenadante para realizar el ensayo de Bradford. Realizar diluciones en caso que sea necesario. Agregar 5 ml de reactivo de Bradford. Despus de 2 min medir absorbancia a 595 nm. Mediante la curva de calibrado y aplicando los factores de dilucin correspondientes se puede calcular la cantidad de protenas en la muestra.

3.3 Descripcin de equipos

3.3.1 Centrifuga de discos Westfalia

Centrfuga de discos modelo SA 1-01-175 fabricada por Westfalia Separator AG. Posee un conjunto de 36 discos inclinados y es capaz de desarrollar una velocidad 9700 rpm. El equipo cuenta con un doble rodete que permite la separacin lquido- lquido, descargando las fases lquidas liviana y pesada por conductos diferentes. Adems es posible descargar en forma intermitente los slidos acumulados en el tambor mediante el accionamiento hidrulico de un pistn que desliza un labio situado en la periferia del estator. El manual de operacin recomienda que el contenido de slidos de la suspensin alimentada no sea superior al 2% para evitar una alta frecuencia de desenlodado. 3.3.2 Molino

El molino de bolas a emplear es el DYNO-Mill Tipo KDL. ste equipo tiene 3 posibles cmaras de molienda de 150 ml, 300 ml y 600 ml, las dos de menor tamao se utilizan para operaciones por lotes, mientras que las dos de mayor tamao se emplean para operacin en continuo. La cmara se llena entre un 80 y 85% de su volumen con los elementos de molienda, que pueden ser de vidrio, cermica o acero. La velocidad puede ser cambiada mediante una correa que tiene cuatro posiciones, lo que permite velocidades de 2000, 2500, 3200 y 4200 rpm. El equipo tambin cuenta con un sistema para refrigerar el contenedor y el eje agitador.

3.4 Procedimientos
3.4.1 Centrifugacin

Las acciones necesarias para la operacin correcta de la centrifuga de discos han sido divididas, para facilitar su consulta, en cuatro fases de operacin. Comprobacin del estado de la centrfuga Las siguientes acciones deben ser realizadas en forma previa a la puesta en marcha del equipo. Revisar si los tornillos de fijacin del tambor han sido aflojados Comprobar si el crter tiene aceite suficiente, es decir si el nivel llega un poco ms arriba de la mitad de la mirilla. Revisar si estn correctamente apretadas las garras de sujecin del cap y la pieza de empuadura del equipo de alimentacin y descarga. Liberar los frenos del tambor girando el puo de freno (ubicado en el costado del cap) a la derecha para descomprimir el resorte que presiona la zapata de freno contra el tambor Puesta en marcha de la centrfuga Los siguientes pasos deben ser realizados para la puesta en marcha de la centrfuga: Verificar que hay tensin elctrica en el panel de fuerza y control (led rojo encendido) Pulsan el botn verde del panel, con el cual se dar inicio al proceso de aceleracin de la centrfuga. La centrfuga tardar cerca de 90 segundos en alcanzar la velocidad de operacin (9700 rpm) Esperar hasta que la intensidad de corriente indicada en el panel de control descienda al mnimo, seal de que ha terminado el periodo de aceleracin. Luego abrir la vlvula de alimentacin de agua de maniobra situada en la pared.

Una vez en rgimen pulsar en dos oportunidades el botn de descarga (botn negro en el panel de control) para provocar el cierre del tambor.

Descarga parcial de slidos Para descargar parcialmente los slidos acumulados en el tambor presionar brevemente el botn de descarga. Previamente se debe interrumpir la alimentacin de lquido a tratar. Detencin de la centrfuga Se deben seguir los siguientes pasos para lograr la detencin de la centrfuga: Cerrar la alimentacin de producto. Enjuagar con agua y desenlodar varias veces el tambor. Detener el motor. Aplicar los frenos para detener el tambor. Cerrar la vlvula de agua de maniobra para evitar la entrada de agua al crter cuando el tambor est detenido. 3.4.2 Molienda

Inicio de la molienda: Montar el contenedor con los discos del agitador. Agregar los elementos de molienda hasta ocupar entre un 80 y 85% del volmen de cmara, y se gira el eje del agitador. Llenar el contenedor con la suspensin hasta alcanzar la superficie inferior del tubo de entrada. Poner el tapn de sellado y asegurar el final del tubo. Cerrar la cubierta protectora. Verificar que el equipo de refrigeracin est operando.

Iniciar la molienda.

Fin de la molienda: Quitar el tapn del sistema de cierre. Vaciar a travs del tubo de descarga.

3.5 Materiales y equipos menores

A continuacin se presenta un detalle de los materiales y reactivos a utilizar para el desarrollo de la experiencia. 3.5.1 Reactivos

La Tabla 3.3 detalla los reactivos, y la cantidad de los mismos, a utilizar durante la experiencia de laboratorio. Tabla 3.3: Reactivos que se consumirn durante la experiencia de laboratorio Reactivo Azul de Coomassie Solucin estndar de BSA cido fosfrico Etanol Levadura fresca comercial Cantidad 100 mg 1 ml 150 ml 100 ml 2 kg (app. 1 kg de clulas secas)

3.5.2

Materiales

La Tabla 3.5 resume los materiales necesarios para la realizacin de la experiencia de laboratorio. Tabla 3.5: Materiales a utilizar durante la experiencia Material Eppendorf Elementos de molienda de 0,75-1 mm Baldes de 10 L Mangueras de in para bomba peristltica Cantidad 70 unidades 500 ml 2 unidades 5m

Manguera de in para agua (clarificado)

5m

3.5.3

Equipos menores

La siguiente es una lista de los equipos menores a utilizar: Bomba peristltica Espectrofotmetro Agitador magntico y vortex Micropipetas de 1000 y 200 L Mezcladores de 90 L (2) Centrifuga para tubos

4 PROGRAMACIN DE LA EXPERIENCIA
La Figura 2 resume las tareas a realizar durante el da martes 9 de junio. Contempla como actividad principal la recoleccin de los datos necesarios para determinar las curvas de eficiencia msica de recuperacin y factor de concentracin para la centrfuga de discos.
10:0 0 11:0 0 Martes 9/6/09 12:0 13:0 14:0 0 0 0 15:0 0 16:0 0 17:0 0

9:00

Met. cuantif. Prot. Preparacin pasta Met. cuantif. biomasa Preparacin Equipo Serie 1 Serie 2 Serie 3 Serie 4 Serie 5 Centrif. para molienda Limpieza General

A;G V A;G S;M V;S ;M V;S ;M T T T T T

Figura 2: Planificacin de tareas a realizar el da 9 de junio Se presenta la inicial del apellido de la(s) persona(s) que realiza(n) la actividad.

La Figura 3 pormenoriza las actividades contempladas para el da mircoles 10 de junio, estas incluyen la molienda de la biomasa concentrada el da anterior y la determinacin de protenas. El da jueves 11 de junio queda reservado para contingencias.

9:00

10:0 0

11:0 0

12:0 0

Mircoles 10/6/09 13:0 14:0 15:0 0 0 0

16:0 0

17:0 0

18:0 0

19:0 0

Prep. Met. analticos Preparar equipos Preparar Serie 1 Moler Serie 1 Anlisis Serie 1 Preparar Serie 2 Moler Serie 2 Anlisis Serie 2 Preparar Serie 3 Moler Serie 3 Anlisis Serie 3 Preparar Serie 4 Moler Serie 4 Anlisis Serie 4 Preparar Serie 5 Moler Serie 5 Anlisis Serie 5 Preparar Serie 6 Moler Serie 6 Anlisis Serie 6 Molienda prot. total Anlisis prot. total Limpieza General

A; G S; M V S; M A; G; V V S; M A; G; V V S; M A; G; V V S; M A; G; V V S; M A; G; V V S; M A; G; V S; M A; G T

Figura 3: Actividades a realizar durante el da 10 de junio Se presenta la inicial del apellido de la(s) persona(s) que realiza(n) la actividad.

5 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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