Professional Documents
Culture Documents
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Sntese do cDNA
A manipulao e o estudo do RNA difcil por causa da sua sensibilidade aos ribonucleases que os degradam; necessrio ento recopiar a sequncia de RNA em sequncia de DNA, mais estvel ...
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Cromatografia de Afinidade
Na Cromatografia de afinidade (C.A): um ligante ligado covalentemente a uma matriz; Quando uma soluo impura passada atravs da coluna, a molcula desejada liga-se ao ligante imobilizado;
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Cromatografia de Afinidade
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Sntese do cDNA
O RNAm purificado por cromatografia de afinidade em colona de oligo-d(T); Os oligonucletidos poly(T) vo hibridar com a cauda poly(A).
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Sntese do cDNA
A Reverse Transcriptase (RT) (=DNA polymrase) sintetiza uma fita de DNA complementar do RNAm a partir da extremidade 3' do primer poly(T)...
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Sntese do cDNA
O RNA degradado utilizando uma base forte (NaOH) ou uma ribonuclease especfica; A Ext. 3 da fita de DNA sintetizada hibrida espontaneamente sobre ela mesma e forma um anel...
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Sntese do cDNA
A Ext. 3' do anel vai servir de sitio de iniciao para a DNA polimerase responsvel pela sntese da fita complementar do DNA...
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Sntese do cDNA
10
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
11
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Hind III uma enzima de restrio produzida por uma bactria chamada Haemophilus influenzae; O DNA da bactria metilado no hidrolizado; O DNA parasita no metilado hidrolizado.
12
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Os stios de restrio so em geral palndroma (Ex: AAGCTT) O sitio de ligao ao DNA constitudo por 6 pares de Ntdos A Metilao da primeira Adenna ou da Citosina no sitio da hidrlise inibe (impede) o reconhecimento do sitio por Hind III
13
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
14
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Electroforese do DNA - Os fragmentos de DNA digeridos por enzimas de restrio so anies; - Os fragmentos vo migrar no sentido do polo positivo (nodo) - A velocidade da migrao depende do tamanho destes fragmentos
nodo - No primeiro poo coloca-se o Indicador do tamanho constitudo por fragmentos de DNA de tamanho conhecido
15
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Electroforese do DNA
Aos depsitos adiciona-se: Corante azul aninico visvel no gel BROMETO DE ETDIO, liga-se especificamente ao cidos nuclicos nodo
16
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Electroforese do DNA
nodo O
BROMETO
DE
ETDIO
emite
uma
cor
uorescente
lils
quando
esta
iluminado
por
UV;
Em
presena
da
luz
UV
254
nm
os
fragmentos
tornam-se;
visveis.
O
gel
pode
ser
depois
fotografado.
17 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
18
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Aos
desnaturado Com um arrefecimento rapido o DNA fica desnaturado; Com um arrefecimento lento a hlice dupla volta a se formar progressivamente
20
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
A Tm de uma sonda a temperatura em qual esta sonda vai hibridar com o fragmento complementar do DNA
21 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
22
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Calcular a Tm
Oligonucletido < 20 Ntdos : Tm em C = (A+T)x2 + (G+C)x4 Oligonucletido > 20 Ntdos : Tm em C = [(A+T)x2 + (G+C)x4] x (1+[(N-20)/20])
A partir de N = 20, corrija-se com um multiplicador proporcional ao comprimento que ultrapassa este nmero: 1 + [(N-20)/20].
23
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
24
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Sonda de Hibridao
Para poder detectar especificamente uma sequncia de DNA alvo, sintetiza-se um pequeno fragmento de DNA chamado sonda cuja a sequncia corresponde a uma parte do DNA alvo
25
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
qA hibridao de uma sonda marcada (tomos radioactivos, radicais fluorescentes ou ligante especfico) com o DNA alvo desnaturado permite detectar (marcar) especificamente todos os fragmentos de DNA tendo uma sequncia complementar esta sonda...
26
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Southern blot
Southern blot uma tcnica elaborada por Edward M. Southern em 1975 para procurar fragmentos de DNA de uma electroforese depois de os hibridar com uma sonda complementar....
27
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
1. A degradao do DNA pelas Enz. Res. Resulta numa mistura de fragmentos : Fragmentos de restrio, quando submetidos uma electroforese vo migrar dentro do gel em funo dos seus tamanhos...
28 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
2. Realiza-se uma montagem que permite, com ajuda do tampo, fazer passar os fragmentos do gel uma membrana de nilon onde o DNA vai se fixar com ligaes estveis....
29 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
3. A membrana de nilon com os fragmentos de DNA incubada dentro de um saco com uma soluo da sonda radioactiva complementar ao fragmento do DNA alvo....
30 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica Temperatura de incubao ?
4. A membrana lavada e colocada com um filme radiogrfico virgem numa caixa opaca para que a sonda radioactiva ligada aos fragmentos de DNA complementar marca a sua impresso no filme...
31 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
5. O filme revelado com manchas negras que correspondem aos local onde imigraram os fragmentos do DNA alvo complementares da sonda.
32 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
qA drepanocitose (anemia) uma doena dos glbulos vermelhos que se encontram desformados por causa da cristalizao anormal da hemoglobina; qEsta cristalizao o resultado de uma substituio do A por T no sexto codo; qEsta substituio traduz-se por uma mutao Glu por Val da cadeia da globina;
33 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica ASO = Allele Specific Oligonucleotide
A Electroforese do DNA do gene HBB que codifica para a cadeia das globinas revelada utilizando duas sondas : qUma especifica sequncia normal (A) qOutra especifica sequncia com mutao (S)
34 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
qO DNA de um indivduo revelado unicamente pela sonda normal: qO indivduo tem os dois genes HBB normais (homozigotico normal); qO DNA de um indivduo revelado unicamente pela sonda com mutao: qO indivduo tem os dois genes HBB com mutao (homozigotico com mutao); qO DNA de um indivduo revelado pelas duas sondas : qO indivduo tem um gene normal e outro com mutao Doutor (heterozigotico). Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
35
qCada sistema de restrio de alelos define um locus polimorfo; qSouthern blot permite a deteco dos polimorfismos de tamanho dos fragmentos de restrio (RFLP)
36 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica RFLPJean = Restriction Fragment Length Polymorphism
qO polimorfismo do gene apolipoproteina A-II altera a sequncia do sitio reconhecido pela Enz. Res. Msp I situado depois do gene; q19 % dos ingleses no tem stio de restrio neste local....
37 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
qA electroforese separa os fragmentos em funo do tamanho; qO southern Blot utilizando uma sonda complementar dos exes do apoA-II e a autoradiografia revela os fragmentos; qA maioria dos individuos (81 %) tm 3 stios de restrio a volta do gene, revelando assim um fragmento de 3000 pb (3,0 kb).
38 Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
qIndivduos mais raros (19 %) no tm um stio de restrio e revelam um fragmento maior de 3700 pb (3,7 kb) (indivduo n3); qO indivduo n4 revela os dois fragmentos (3 e 3,7 kb)
39
???
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
PCR
PCR (polymerase chain reaction) permite amplificar especificamente uma regio com centenas de pb do DNA fita dupla;
40
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
qO DNA separado primeiro em fitas simples (desnaturao 95C). qAdiciona-se uma grande quantidade de primers (oligonucletidos sintetizados) complementares das duas extremidades da zona amplificar; qOs primers vo hibridar uma temperatura Tm 50-60C com as sequncias complementares;
41
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
qA Taq polimerase (DNA polimerase) sintetiza uma temperatura de 72C a fita complementar partir do 3'OH dos primers; qOs 4 dNTP serviro de substratos da Taq poli; qO resultado a sntese de 4 fitas de DNA
42
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
qO ciclo repetido com a desnaturao das 4 fitas de DNA, e a Taq poli sintetiza 8 fitas; partir das 8 fitas de DNA a Taq poli sintetiza 16 fitas; qDepois de 35 ciclos o resultado so 34.359.738.368 fitas de DNA; qEsta quantidade suficiente para estudar o fragmento de DNA
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica 43 amplificado.
44
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
qO dideoxiadenosina trifosfato (ddATP) no tem a funo lcool em 3'. qAnlogo estrutural do nucletido, o ddA usado como inibidor da replicao (DNA polimerase). qA ausncia da funo lcool em 3' impede a condensao com o nucletido seguinte; qEsta inibio utilizada no sequnciao de DNA ...
45
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
46
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
47
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
qetapas da sequnciaa: qHibridao do primer do lad 3 qSntese da cadeia complementar. qPara esta sntese adiciona-se : qOs quatro dNTP (dATP, dCTP, dGTP et dTTP). qUma pequena quantidade de ddNTP fluorescente (ddATP-JOE, ddCTP-5-FAM, ddGTPP-TAMRA e ddTTP-ROX).
48
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
qA incorporao do ddNTP fluorescente na reaco de condensao impede a continuao detsa (no h extremidade 3 -OH); qPequenos fragmentos so assim sintetizados e marcados por uma fluorescncia correspondente ao ultimo nucletido incorporado;
49
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
50
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
51
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
qA separao por electroforese destes fragmentos permite ler as letras sucessivas que aparecem como um electroforegrama qCada electroforegrama tem a florescncia do ultimo nucletido...
52
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
Extraco e purificao de DNA Sntese do cDNA Enzima de restrio (Hind III) Electroforese de DNA Hibridao de uma sonda Calculo da Tm Sonda em hibridao Sonda especifica do alello (ASO) Southern blot Polimorfismo de restrio Polimorfismo Msp I do apoA-II Mapa de restrio PCR Dideoxiadenina trifosfate Reaco de sequncia Sequniao do ADN Gel de squenciao
53
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
54
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica
qA separao por electroforese destes fragmentos permite ler as letras sucessivas que aparecem como um electroforegrama qCada electroforegrama tem a florescncia do ultimo nucletido...
55
Doutor Fouad Nejmeddine I Universidade Jean Piaget I Cabo Verde I Biologia Molecular I Terico_Prtica