I. Nomor Percobaan II.

Nama Percobaan

: IX : Penentuan Kadar Tirosina Dalam Kaseina

III. Tujuan Percobaan : Menentukan kadar tirosin dalam kasein serta dapat membuat kurva kalibrasinya. IV. Landasan Teori :

Kita dapat memperoleh protein dari makanan yang berasal dari hewan atau tumbuhan. Protein yang berasal dari hewan disebut dengan protein hewani,sedangkan protein yang berasal dari tumbuhan disebut dengan protein nabati. Beberapa makanan sumber protein ialah daging, telur, susu , ikan , beras, kacang, kedelai, gandum, jagung dan buah-buahan. Tumbuhan membentuk protein dari CO2, H2O dan senyawa nitrogen. Hewan yang makan tumbuhan mengubah protein nabati menjadi protein hewani. Disamping digunakan untuk pembentukan sel-sel tubuh, protein juga dapat digunakan sebagai sumber energi bila tubuh kita kekurangan karbohidrat atau lemak. Komposisi ratarata unsur kimia yang terdapat dalam protein ialah sebagai berikut : Karbon 50%, Hidrogen 7%, Oksigen 23%, nitrogen 16%, belerang 0-3%, dan fosfor 0-3%. Dengan berpedoman pada kadar nitrogen sebesar 16% dapat dilakukan penentuan kandungan protein dalam suatu bahan makanan. Unsur nitrogen ditentukan secara kuantitatif, misalnya dengan cara Kjeldahl, yaitu dengan cara destruksi dengan asam pekat. Berat protein yang ditentukan adalah 6,25 kali berat unsur nitrogen. Protein juga memiliki molekul besar dengan bobot molekul bervariasi antara 5000 sampai jutaan. Dengan cara hidrolisis oleh asam atau oleh enzim, protein akan menghasilkan asam-asam amino. Ada 20 jenis asam amino yang terdapat dalam molekul protein. Asam-asam amino ini terikat satu dengan yang lainnya oleh ikatan peptida. Protein mempunyai sifat yang sangat dipengaruhi oleh suhu tinggi, pH, dan pelarut organik. Jenis asam amino yang kita gunakan adalah Tirosin dengan rumus :
O OH HO NH2

Tirosin adalah salah satu jenis asam amino dalam protein. Tirosin ini mempunyai gugus fenol dan bersifat asam lemah. Tirosin dapat diperoleh dari kasein, yaitu protein dalam keju atau susu. Pada percobaan ini kita akan melakukan pemurnian tirosin dari kaseinnya dengan melarutkan tirosin ke dalam berbagai larutan yang bersifat asam, alkohol, maupun senyawa yang mengandung logam berat. Dengan demikian, kita harus memperhatikan sifat-sifat protein antara lain : 1. ionisasi seperti asam amino, protein juga larut dalam air akan membentuk ion yang mempunyai muatan positif dan negatif. Dalam suasana asam molekul protein akan membentuk ion positif, sedangkan dalam suasana basa akan membentuk ion negatif. Pada titik isolistriknya protein mempunyai muatan positif dan negatif yang sama, sehingga tidak bergerak kearah elektroda positif maupun negatif apabila ditempatkan diantara kedua elektrode tersebut. Ionisasi protein dapat digambarkan sebagai berikut protein+ kation H+ + +proteinion zwitter

protein memiliki titik isolistrik yang berbeda-beda sebagaimana yang tertera dalam tabel berikut : Tabel Titik Isolistrik Berbagai Protein : Protein Albumin telur Insulin Albumin serum Kasein Gelatin Globulin serum Fibroin Gliadin Sumber Telur Pancreas Darah Susu sapi Kulit sapi Darah Sutera Terigu pH isolistrik 4,55 4,90 5,3 5,35 4,88 4,6 4,8 4,85 5,4 5,5 2,0 2,4 6,5

Titik isolistrik protein mempunyai arti penting karena pada umunya sifat fisika, dan kimia erat hubungannya dengan pH isolistrik. Pada pH diatas titik isolistrik protein bermuatan positif, sedangkan di bawah titik isolistrik protein bermuatan negatif. Oleh karena itu untuk mengendapkan protein dengan ion logam, diperlukan pH larutan diatas titik isolistrik, sedangkan pengendapan oleh ion negatif memerlukan pH dibawah titik isolistrik. Ion-ion posisitf yang mengendapkan protein antara lain ialah Ag+, Ca++, Zn++, Hg++, Fe++, CU++, dan Pb++, sedangkan ion negatif yang dapat mengendapkan protein adalah ion salisilat, triklorasetat, pikrat, tanat dan sulfosalisilat. Berdasarkan sifat tersebut putih telur atau susu dapat digunakan sebagai antidotum atau penawar racun apabila orang keracunan logam berat. 2. Denaturasi Protein akan mengalami koalgulasi apabila dipanaskan pada suhu 50oC atau lebih. Koagulasi ini hanya terjadi apabila larutan protein berada pada titik isolistriknya. Protein yang terdenaturasi pada titik isolistriknya masih dapat larut pada pH di luar titik isolistrik tersebut. Air ternyata diperlukan untuk proses denaturasi oleh panas. Disamping pH, susu tinggi dan ion logam berat, denaturasi dapat pula terjadi oleh adanya gerakan mekanik, alkohol aseton, eter dan detergen. 3. Viskositas Viskositas adalah tahanan yang timbul karena adanya gesekan antara molekulmolekul di dalam zat cair yang mengalir. Suatu larutan protein dalam air mempunyai viskositas atau kekentalan yang relatif besar daripada viskositas air sebagai pelarutnya. 4. Kristalisasi Banyak protein yang telah diperoleh dalam bentuk kristal. Meskipun demikian proses kristalisasi untuk berbagai jenis protein tidak selalu sama, artinya ada yang dengan mudah dapat terkristalisasi, tetapi ada pula yang sukar. 5. Sistem Koloid Molekul protein apabila dilarutkan dalam air mempunyai sifat koloid, yang tidak dapat menembus membran atau kertas perkamen.

Pemurnian Protein Langkah awal yang dalam pemurnian protein ini ialah menentukan bahan alam yang akan diproses. Penentuan ini didasarkan pada kadar protein yang terkandung didalamnya. Tentu saja dipilih bahan alam yang mempunyai kadar protein tinggi dan mudah diperoleh. Analisis terhadap kadar protein dalam bahan alam tersebut perlu dilakukan untuk memperoleh data tentang kadar protein yang akan dimurnikan. Setelah itu protein akan dilarutkan ke dalam air atau pelarut lainnya. Namun, disini juga harus diperhatikan susu dan pH larutan agar tidak merusak protein. Dalam percobaan ini untuk menentukan kadar atau konsentrasi protein ini kita menggunakan spektrometer yang berfungsi untuk menentukan transmittan maupun adsorbannya. V. Alat dan Bahan Alat : Tabung reaksi Gelas ukur Beker gelas Spektrometer Erlenmeyer Refluks kondensor Penangas air Statif dan klem Pipet tetes

Bahan : Kasein 1 mg NaOH 6 N 20 ml H2SO4 7 N 30 ml Larutan Tirosina standard 1 ml HgSO4 (5%) 3 ml H2SO4 5 N

H2SO4 7 N 2 ml NaNO2 (0,2%) 2 ml 12 ml air

VI. Prosedur Percobaan Hidrolisa 1,0 gram kaseina dengan 20, 0 ml NaOH 6 N pada refluks kondensor dalam penangas air selama 4 jam. Tambahkan hati-hati 30 ml H2SO4 7 N. campur. Tempatkan 1,0 ml hidrolisat ke dalam tabung yang bersih dan kering. Pada tabung-tabung lain pipet masing-masing 1,0 ml larutan tirosina standar dengan lima macam kadar yang berbeda. Tambahkan 3 ml HgSO4 5 % dalam H2SO4 5 N pada semua tabung. Panaskan dalam penangas air yang mendidih selama 10 menit. Dinginkan dan tambahkan ke dalam masing-masing tabung 2 ml H2SO4 7 N dan 2 ml NaNO2 0,2 %. Campur dan tambahkan 12 ml air ke dalam masing-masing tabung. Baca ekstingsinya pada spektrometer dengan maks = 470 nm.

VII. Hasil Pengamatan

No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Uji Larutan Aquades 1% 2% 3% 4% 5% Sampel Absorban (A) 0,00 0,001 0,008 0,011 0,019 0,022 0,013

Grafik Absorbansi Tirosin

0.025 5%, 0.022 0.02 0.015 0.01 0.005 0 0% 1%, 0.001 2% 4% 6% 3.30%, 0.013 3%, 0.011 2%, 0.008 4%, 0.019 Larutan Tirosin Sampel Larutan Tirosin Sampel

VIII. Analisa Data

Membuat Kurva Standar Konsentrasi Protein Vs Absorban

No. 1 2 3 4 5 Persentase larutan (X) 1 2 3 4 5 12 Absorban (Y) 0,001 0,008 0,011 0,019 0,022 0,061 XY 0,001 0,016 0,033 0,076 0,11 0,236 X2 1 4 9 16 25 55 Y2 0,000001 0,000064 0,000121 0,000361 0,000484 0,001031

Slope(A)

5.55 12 1,18 0,732 275 144 0,448 131 0,003 Intersep(B)

n. X 2 X 5.0,236 (12)0,061
2 2

n. XY X. Y

5.55 12 3,35 2,832 275 144 0,518 131 0,0039 Maka diperoleh persamaan regresi linier : Y=AX+B Y = 0,003X + 0,0039
2

n. X 2 X 0,061 . 55 0,236 . 12
2

Y. X 2 XY . X

X Y

0 0,0039

1 0,0069

2 0,0099

3 0,0129

4 0,0159

5 0,0189

Kurva Persamaan Regresi

0.02 0.018 0.016 0.014 0.012 0.01 0.008 0.006 0.004 0.002 0 0 1 2 3 4 5 6 Series1

IX. Reaksi Kimia

O O

HO

NH 3

NaOH
HO NH2

Na

H2O

O
O

2 HO NH 3
+

H2SO 4 2
HO
+ NH 3

OH

SO 4

O OH HO NH2

HgSO 4

O C O Hg CH 2 CH NH 2
++

O O C

+
CH CH 2 OH

SO 4

HO

NH 2

X. PEMBAHASAN Percobaan kali ini yakni percobaan yang dilakukan dengan tujuan menentukan kadar tirosin dalam kasein yang dilakukan dengan menghitung kadar tirosin yang berada dalam kasein susu. Dalam percobaan ini, setelah kita mendapat kadar tirosin maka kita juga dapat menentukan adsorbansi dari larutan yang menjadi sampel pada masing-masing konsentrasi. Penentuan nilai adsorban ini dilakukan menggunakan alat spektrometer. Kasein yang digunakan dalam percobaan ini merupakan hasil yang didapatkan dari hasil percobaan sebelumnya yang kemudian diteruskan untuk dilakukan pengujian terhadap kadar tirosinnya. Pelarutan kasein didalam NaOH pada percobaan ini menyebabkan terikatnya protein oleh larutan basa kuat yang digunakan ini. Hal seperti ini dapat terjadi karena konsentrasi (HO-) yang tinggi mampu mengikat ion-ion H+ yang terdapat pada gugus NH3+. Kemudian larutan dimasukan ke dalam refluks pada penangas air yaitu pada suhu 40oC. Temperatur pada proses refluks ini harus dijaga tetap konstan (tidak berubah-ubah) karena hal ini akan mempengaruhi hasil yang diinginkan dari proses refluks ini. Selama dilangsungkannya proses refluks, larutan kasein ditambahkan dengan larutan H2SO4 untuk mengikat basa oleh asam dari kasein. Refluks dilakukan selama 4 jam, dari hasil refluks didapatkan larutan yang bening tak berwarna. Kemudian larutan standar tirosin ditambahkan dengan HgSO4 5 % dalam H2SO4 5 N dengan kadar konsentrasi yang berbeda. Hal ini bertujuan untuk mengendapkan protein dengan ion logam positif yaitu Hg++. Penambahan H2SO4 pada larutan protein akan menyebabkan struktur molekul asam amino. Hal ini terjadi karena konsentrasi H+ yang tinggi mampu berikatan dengan ion COO-, sehingga membentuk gugus COOH. Setelah itu larutan yang telah dicampurkan dengan kadar yang berbeda dipanaskan menggunakan bunsen yang mendidih selama 10 menit dan untuk selanjutnya dinginkan lalu tambahkan ke dalam masing-masing tabung tadi H2SO4 dan NaNO2. Penambahan NaNO2 pada larutan tirosin bertujuan untuk memberikan warna. Warna yang terjadi akibat penambahan NaNO2 yaitu terjadinya warna merah pada larutan protein. Adanya warna merah pada larutan protein ini karena kita akan

menghitung adsorban pada larutan protein dengan menggunakan spektrofotometer. Karena alat spektrofotometer ini menggunakan cahaya UV-Vis yang menggunakan warna dalam penganalisisannya. Dari hasil pengukuran diperoleh harga absorbansi yang sebanding lurus dengan konsentrasi larutan. Semakin besar konsentrasi larutan maka harga absorbansinya semakin besar. Pengukuran absorbansi larutan ini harus dilakukan dengan cepat karena jika larutan dibiarkan terlalu lama hal ini akan mengubah warna larutan karena adanya reaksi dengan lingkungan. Pengukuran dengan spektrofotometer, analit diletakkan di dalam kuvet untuk menghindari pengaruh luar dimana kuvet yang digunakan berupa sel kaca yang permukaannya halus (bersih) dan permukaan yang kasar. Sedangkan yang digunakan untuk meneruskan energi cahaya dalam daerah tampak adalah kuvet yang halus (bersih) agar dapat meneruskan. Dan permukaan yang kasar tidak digunakan untuk meneruskan cahaya. Penambahan larutan yang ingin diidentifikasi ini juga tidak boleh berlebihan harus sesuai dengan batas yang terlihat pada kuvet.

XI.

Kesimpulan 1. Berdasarkan hasil pengamatan,semakin besar konsentrasi larutan asam amino maka semakin besar pula nilai adsorbannya. 2. Semakin besar konsentrasi larutan tirosin yang digunakan, maka warna yang ditimbulkan akan semakin pekat, sesuai dengan semakin besarnya kuantitas analit yang ada dalam larutan. 3. Proses kondensasi menggunakan suhu konstan yakni 40oC 4. Alat spektrofotometer ini menggunakan cahaya UV-Vis yang menggunakan warna dalam penganalisisannya. 5. Pengukuran absorbansi larutan dengan menggunakan spektrometri ini harus dilakukan dengan cepat karena jika didiamkan terlalu lama akan mempengaruhi hasil pengamatan yang didapat karena warna larutan akan berubah seiring dengan bereaksinya dengan udara luar.

6. Penambahan NaNO2 bertujuan untuk mengubah larutan yang awalnya bening pada saat penambahan dengan H2SO4 menjadi kemerahan saat penambahan NaNO2. 7. Dari hasil pengukuran diperoleh harga absorbansi yang sebanding lurus dengan konsentrasi larutan. Semakin besar konsentrasi larutan maka harga absorbansinya semakin besar. 8. Kondensor merupakan tempat terjadinya proses kondensasi dimana pada saat larutan menguap menjadi cair uapnya tidak keluar atau pun habis.

XII.

DAFTAR PUSTAKA

Arbianto, Purwo. 1993. Biokimia Konsep-Konsep Dasar. Bandung:ITB

Khopkar, S.M, 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta :UI Press

Martoharsono, Soeharsono. 1998. Biokimia Jilid 1. Yogyakarta :Gajah Mada University Press .

Pudjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta:Universitas Indonesia

Sukaryawan, Made. 2011. Petunjuk Praktikum Biokimia. Universitas Sriwijaya:Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan.

XIII. GAMBAR ALAT