Manua-L-Prueba de Sensibilidad Antimicrobiana

O N A C IO N
DE
SALUD
MINISTERIO DE SALUD DEL PER
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Organismo Pblico Descentralizado de Sector Salud
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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA POR EL MTODO DE DISCO DIFUSIN
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Serie de Normas Tcnicas N 30 Lima - 2002
Manual de Procedimientos para la Prueba de Sensibilidad Antimicrobiana por el Mtodo de Disco Difusin
MINISTERIO DE SALUD Ministro Dr. Fernando Carbone Campoverde

Vice-Ministro Dr. Oscar Ugarte Ubillz
Comit Editor Presidente Dra. Aida Palacios Ramrez Secretario Tcnico Dr. Csar Cabezas Snchez
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jefe Dr. Luis Fernando Llanos Zavalaga

Sub-Jefe Dra. Aida Cecilia Palacios Ramrez Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica Dra. Susana Zurita Macalup Directora General Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin Dra. Doris Jhusey Schreiber Directora General Centro Nacional de Control de Calidad Dra. Rosa Guevara Ormeo Directora General Centro Nacional de Produccin de Biolgicos Ing. Arnaldo Baquerizo Valladolid Director General Programa de Complementacin Alimentaria Para grupos de Mayor Riesgo (PACFO) Dr. Napolen Chvez Villanueva Director General Oficina Ejecutiva de Informacin Cientfica Dr. Jorge Barnaby Rodrguez
Miembros Dr. Jorge Alarcn Villaverde Q.F. Zulema Arvalo Chong Dr. Jorge Barnaby Rodrguez Dr. Zuo Burstein Rodrguez Dr. Javier Cieza Zevallos Dr. Jos Espinoza Babiln Lic. Ivn Gmez-Snchez Prieto Dr. Eduardo Gotuzzo Herencia Dr. Alfredo Guilln Oneeglio Dr. Csar Nquira Velarde Lic. Margarita Rodrguez Gutarra Dr. Vctor Surez Moreno Edicin Dr. Leonid Lecca Garca Sub-Comit Editor Dr. Vctor Suarez Moreno Dr. Carlos Carrillo Parodi Dr. Jos Guevara Duncan
Cartula: Frontis del local central de Instituto Nacional de Salud
Esta publicacin se termin de imprimir en Febrero del 2002.
Instituto Nacional de Salud
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA POR EL MTODO DE DISCO DIFUSIN
ELABORACIN:
Rosa Elena Sacsaquispe Contreras Bilogo Microbilogo Laboratorio de Bacteriologa Especial Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pblica Instituto Nacional de Salud Jorge Velsquez Pomar Mdico Microbilogo Instituto de Investigacin Facultad de Medicina Universidad Particular de San Martn de Porres Laboratorio de Microbiologa Hospital Arsobispo Loayza
COLABORACIN EN LA REVISIN DEL MANUAL: Instituto Nacional de Salud Dr. Vctor Surez Moreno Blga. Microblga. Gladis Ventura Egsquiza Blga. Isabel Arias Bustamante Blga. Susana Daz Velasco Blga. Mara Luz Zamudio Rojas Instituto de Salud del Nio Dr. Rito Zerpa Larrauri Instituto Nacional de Enfermedades Neoplsicas Dr. Luis Cuellar Ponce de Len Dra. Mara Elena Silva Daz Hospital Nacional Docente Madre-Nio San Bartolom Dr. Augusto Valencia Ramrez Dr. Nazario Silva Hospital Daniel A. Carrin Dr. Jess Chacaltana Proyecto Viga-MINSA Dr. Martn Yagui Moscoso
Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin del INS

Sacsaquispe Contreras, Rosa Manual de procedimientos para la prueba de sensibilidad antimicrobiana por el mtodo de Disco Difusin / Elaboracin: Rosa Sacsaquispe Contreras y Jorge Velsquez Pomar. -- Lima: Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2002. 68 p. . : il. ; 30 cm. -- (Serie de Normas Tcnicas; 30) 1. TEST DE SENSIBILIDAD MICROBIANA/mtodos 2. TEST DE SENSIBILIDAD MICROBIANA/normas 3. MANUALES DE LABORATORIO I. Sacsaquispe Contreras, Rosa II. Velsquez Pomar, Jorge III. Instituto Nacional de Salud (Per) IV. Per. Ministerio de Salud
ISBN 9972 - 857 - 18 - 2 ISSN 1607 - 4904 Hecho el Depsito Legal N 1501012002-0446
Ministerio de Salud, 2002
Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, Per Te1f.: 431-0410
Instituto Nacional de Salud, 2002
Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima, Per Te1f.: 471-9920 Fax 471-0179 e-mail: postmaster@ins.sld.pe Pgina Web: www.ins.sld.p
CONTENIDO
INTRODUCCIN

9 10 10 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 16 16 16 16 17 18 18 18 19 19 19 20 20 20 20 20 20 21 21 21 21 21 22 22 23 23 23 23 23 23 24 24 24 24 24 25 25
SECCIN 1 : GENERALIDADES 1.1 Objetivo 1.2 Campo de aplicacin 1.3 Responsabilidades 1.4 Documentos de Referencia 1.5 Definiciones y abreviaturas

SECCIN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 2.1 Principales medidas de bioseguridad

SECCIN 3: PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIN DEL ANTIBIOGRAMA 3.1 Valores crticos del antibiograma 3.2 Procedimientos de categorizacin 3.3 Materiales y equipos 3.4 Medios de cultivo y reactivos 3.4.1 Medios de cultivo y reactivos necesarios para la prueba 3.4.2 Preparacin del Agar Mueller Hinton 3.4.3 Preparacin del estndar 0,5 Mc. Farland para el inculo 3.4.4 Seleccin de los discos de sensibilidad antibiotica 3.5 Inoculacin 3.5.1 Preparacin del inculo 3.5.2 Inoculacin en placas 3.6 Aplicacin de los discos de sensibilidad 3.7 Incubacin 3.8 Lectura de las placas e interpretacin de los resultados

SECCIN 4: ANTIBIOGRAMA PARA Staphylococcus spp 4.1 Medio de cultivo 4.2 Inoculo 4.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma 4.3.1 Grupo I 4.3.2 Grupo II 4.3.3 Resistencias naturales 4.4 Incubacin 4.5 Lectura 4.6 Interpretacin de los dimetros crticos 4.6.1 Antibiticos y dimetros crticos 4.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma 4.7 Cepa de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 5: ANTIBIOGRAMA PARA Enterococcus spp 5.1 Medio de cultivo 5.2 Inoculo 5.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma 5.3.1 Grupo I 5.3.2 Grupo II 5.3.3 Resistencias naturales 5.4 Incubacin 5.5 Lectura 5.6 Interpretacin de los dimetros crticos 5.6.1 Antibiticos y dimetros crticos 5.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma 5.7 Cepa de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 6: ANTIBIOGRAMA PARA Pseudomonas aeruginosa 6.1 Medio de cultivo 6.2 Inculo 6.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma 6.3.1 Grupo I 6.3.2 Grupo II 6.3.3 Resistencias naturales 6.4 Incubacin 6.5 Lectura 6.6 Interpretacin de los dimetros crticos 6.6.1 Antibiticos y dimetros crticos 6.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma 6.7 Cepa de referencia para el control de calidad interno

25 25 25 26 26 26 26 26 26 26 26 27 27 28 28 28 28 28 28 29 29 29 29 29 30 30 30 30 30 31 31 31 32 32 32 32 32 32 33 34 35 35 35 36 36 36 36 36 36 36
SECCIN 7: ANTIBIOGRAMA PARA Acinetobacter spp 7.1 Medio de cultivo 7.2 Inculo 7.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma 7.3.1 Grupo I 7.3.2 Grupo II 7.3.3 Resistencias naturales 7.4 Incubacin 7.5 Lectura 7.6 Interpretacin de los dimetros crticos 7.6.1 Antibiticos y dimetros crticos 7.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma 7.7 Cepas de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 8: ANTIBIOGRAMA PARA Enterobacteriaceae 8.1 Medio de cultivo 8.2 Inculo 8.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma 8.3.1 Grupo I 8.3.2 Grupo II 8.3.3 Antibiticos a utilizar en el antibiograma de Salmonella spp y Shigella spp aisladas de coprocultivo 8.3.4 Resistencias naturales 8.4 Incubacin 8.5 Lectura 8.6 Interpretacin de los dimetros crticos 8.6.1 Antibiticos y dimetros crticos 8.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma 8.7 Deteccin de las enterobacterias productoras de betalactamasa de espectro extendido Test confirmatorio de la presencia de betalactamasas de espectro extendido (segn el NCCLS USA) 8.7.1 8.7.2 Tets confirmatorio de la presencia de betalactamasa de espectro extendido (segn el Comit de Antibiograma de la Sociedad Francesa de Microbiologa) 8.7.3 Reporte del antibiograma de las enterobacterias productoras de betalactamasas de espectro extendido 8.8 Cepas de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 9: ANTIBIOGRAMA DE Streptococcus pneumoniae (NEUMOCOCO) 9.1 Medio de cultivo 9.2 Inculo 9.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma 9.3.1 Grupo I 9.3.2 Grupo II

9.3.3 9.4 9.5 9.6 9.6.1 9.6.2 9.7
Resistencias naturales Incubacin Lectura Interpretacin de los dimetros crticos Antibiticos y dimetros crticos Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma Cepa de referencia para el control de calidad interno

37 37 37 37 37 37 38 38 38 38 39 39 39 39 39 39 39 39 40 40 41 41 41 41 41 41 42 42 42 42 42 43 43 43 43 43 43 43 44 44 44 44 44 44 44 45 45 45 46 47 47
SECCIN 10: ANTIBIOGRAMA PARA Streptococcus spp 10.1 Medio de cultivo 10.2 Inculo 10.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma 10.3.1 Grupo I 10.3.2 Grupo II 10.3.3 Resistencias naturales 10.4 Incubacin 10.5 Lectura 10.6 Interpretacin de los dimetros crticos 10.6.1 Antibiticos y dimetros crticos 10.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma 10.7 Cepa de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 11: ANTIBIOGRAMA PARA Haemophilus spp 11.1 Medio de cultivo 11.2 Inculo 11.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma 11.3.1 Grupo I 11.3.2 Grupo II 11.3.3 Resistencias naturales 11.4 Incubacin 11.5 Lectura 11.6 Interpretacin de los dimetros crticos 11.6.1 Antibiticos y dimetros crticos 11.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma 11.7 Cepas de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 12: ANTIBIOGRAMA PARA Vibrio cholerae 12.1 Medio de cultivo 12.2 Inculo 12.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma 12.3.1 Grupo I 12.3.2 Resistencias naturales 12.4 Incubacin 12.5 Lectura 12.6 Interpretacin de los dimetros crticos 12.6.1 Antibiticos y dimetros crticos 12.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma 12.7 Cepas de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 13: CONTROL DE CALIDAD INTERNO 13.1 Control de calidad de los medios de cultivo 13.2 Cepas de referencia para controles de calidad 13.3 Procedimientos con las cepas de referencia 13.4 Lmites de los dimetros de los halos de inhibicin para el control de calidad 13.5 Frecuencia de los controles

13.5.1 13.5.2 13.5.3 13.6 13.6.1 13.6.2
Control diario Control semanal Control mensual Acciones correctivas Accin correctiva inmediata Accin correctiva adicional

47 48 49 50 51 51 51
SECCIN 14: REGISTROS
ANEXOS ANEXO A: ANEXO B: ANEXO C: ANEXO D: ANEXO E. ANEXO F: CLASIFICACIN DE LOS ANTIBITICOS ACTUALMENTE DISPONIBLES EN EL PER (A EXCEPCIN DE LOS ANTIMICOBACTERIANOS) RESUMEN DE LAS CONDICIONES Y CARACTERSTICAS PARA EL MTODO DE DISCO DIFUSIN MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS - RECOMENDACIONES DETECCIN DE BETALACTAMASAS: MTODO DE NITROCEFIN TCNICAS PARA LA OBTENCIN DE LA CONCENTRACIN INHIBITORIA MNIMA CONCENTRACIONES CRTICAS DE LOS ANTIBITICOS PARA SU CATEGORIZACIN SEGN LOS RESULTADOS DE LA DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN INHIBITORIA MNIMA MODELO DE REGISTRO DE RESULTADOS CONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS REFERENCIALES (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis pseudomonas aeruginosa)

52 55 55 57 58
ANEXO G: ANEXO H:
64 65 66
INTRODUCCION
El diagnstico y tratamiento de un paciente son muy complejos. Desde su llegada a un establecimiento de salud hasta el alta reciben la prestacin de muchos profesionales. Esto a su vez genera diferentes procesos, siendo el laboratorio uno de los ms importantes. Para que los resultados de laboratorio sean tiles en el manejo del paciente, debemos asegurar la confiabilidad y validez de stos. Es necesario entonces, asegurar el cumplimiento adecuado de todos los pasos involucrados, desde la solicitud del tipo de examen y muestra, su transporte, procesamiento, la emisin de un resultado, y la adecuada interpretacin de ste. De un examen solicitado y mal orientado, se obtendr una muestra inadecuada y por tanto una informacin errada. El control de estos procesos es lo que se conoce como programa de garanta de calidad. Para ello, es necesario contar con Normas que marquen las pautas y estandaricen las tcnicas entre los diferentes laboratorios. La resistencia bacteriana es un tema de importancia en la salud pblica. Su extensin a nivel mundial, desarrollo de resistencia a nuevos agentes antimicrobianos, as como su presencia en patgenos relacionados con enfermedades prevalentes, como son la enfermedad diarreica aguda, las infecciones respiratorias agudas y las infecciones intrahospitalarias, le dan el carcter de problema prioritario. Por ello, el conocimiento de los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana debe orientar a la elaboracin de esquemas de tratamiento ms eficaces y adems, la informacin proporcionada por la vigilancia debe servir de insumo para la elaboracin de un programa de uso racional de antibiticos. Considerando estos aspectos preliminares, se desprende que la vigilancia de la resistencia antimicrobiana es necesaria, pero es fundamental asegurar la calidad de los resultados de laboratorio, siendo indispensable por tanto, estandarizar los procedimientos, ello involucra desarrollar normas tcnicas, capacitar al personal de los laboratorios y supervisar y participar en un programa de control de calidad externo. Por ello, el Instituto Nacional de Salud se ha abocado a la ardua tarea de recabar la informacin disponible y validada para sistematizarlas y presentarlas en Manuales de Procedimientos que sirvan como instrumentos para estos procesos. Una de las escuelas de mayor influencia en el rea de evaluacin de la susceptibilidad antimicrobiana es la americana, que cuenta con la Norma editada anualmente por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Este Manual que presentamos a continuacin, toma como base estas normas. Tiene un carcter prctico y permite hacer consultas de acuerdo a la bacteria con la que se esta trabajando. Un elemento importante es que se establece cuales son los antibiticos que deben ser evaluados para cada bacteria, ubicndolos en dos categoras, siendo la primera la que debe hacerse de manera obligatoria. Con ello aseguramos una evaluacin completa y racional de la susceptibilidad antibitica. Sin embargo, debemos recordar que el reporte de la sensibilidad a algunos antibiticos puede inducir el uso indiscriminado de estos. Por ello, si bien la evaluacin de todos los antibiticos es necesaria, el reporte de todos o solo algunos de ellos, es decisin de cada hospital, basndose en las estrategias de control y uso racional de los mismos. Otro aspecto importante es que, considerando que el clnico es el usuario de los resultados de sensibilidad, se ha realizado un taller para la revisin del Manual con la participacin de los responsables de la vigilancia de las infecciones intrahospitalarias, junto con los responsables de laboratorio. Creemos que esto le da un valor agregado al documento, adems del compromiso de actualizacin peridica. Confiamos que el presente Manual pueda satisfacer las expectativas de los profesionales interesados y se convierta en una herramienta til en el proceso de estandarizacin de los procedimientos de laboratorio.
SECCIN 1
GENERALIDADES 1.1. OBJETIVO Describir los procedimientos para la determinacin de la susceptibilidad antimicrobiana mediante el mtodo de disco difusin ( Kirby Bauer) 1.2. 1.2.1. CAMPO DE APLICACIN Comprende la determinacin de la susceptibilidad antibitica mediante el mtodo de disco difusin (Kirby Bauer) e interpretacin de los resultados, de las bacterias que a continuacin se sealan : Staphylococcus spp Enterococcus spp Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp Enterobacterias Streptococcus pneumoniae Streptococcus spp Haemophilus spp Vibrio cholerae Se aplica en los laboratorios de Microbiologa del Instituto Nacional de Salud (INS), establecimientos de la Red Nacional de Laboratorios en Salud Pblica, Laboratorios de las Fuerzas Armadas y de ESSALUD. RESPONSABILIDADES El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pblica (CNLSP) a travs de su Direccin Ejecutiva de Laboratorios de Referencia, es responsable de autorizar la elaboracin, revisin y actualizacin del presente Manual, de acuerdo a los procedimientos aprobados por el Instituto Nacional de Salud (INS). Los Directores de los establecimientos de salud, son responsables de autorizar el aprovisionamiento de recursos necesarios para el cumplimiento del presente manual de procedimientos, as como designar al personal idneo y calificado para realizar las disposiciones contenidas en el mismo. El personal de los establecimientos de salud, es responsable de planificar las acciones, organizar, controlar y capacitar al personal para cumplir las disposiciones contenidas en el presente Manual.
1.2.1.1. 1.2.1.2. 1.2.1.3. 1.2.1.4. 1.2.1.5. 1.2.1.6. 1.2.1.7. 1.2.1.8. 1.2.1.9. 1.2.2.
1.3. 1.3.1.
1.3.2.
1.3.3.
10
1.3.4. 1.3.5. 1.4. 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5 1.5.
Los jefes o responsables de los laboratorios, deben asegurar el control interno de la calidad, la idoneidad del personal, equipos, materiales, reactivos e instalaciones. El personal mdico, tcnico y operativo, es responsable de seguir las especificaciones contenidas en el presente Manual y aplicar los procedimientos especficos indicados. DOCUMENTOS DE REFERENCIA Instituto Nacional de Salud. MANUAL DE NORMAS DE BIOSEGURIDAD. Serie de Normas Tcnicas N 18. Diciembre de 1997. NCCLS. Performance standards for antimicrobial disk Susceptibility Test: Approved Standard. Seventh Edition M2-A7. Vol. 20 N1 2000. NCCLS. Performance standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Eleventh Informational Supplement M100-S11. Vol. 21 N1 January 2001. Comit de lantibiogramme de la Societ Franaise de Microbiologie. Communiqu 2000 2001. Recomendaciones de la Mesa Espaola de Normalizacin de la Sensibilidad y Resistencia a los Antimicrobianos (MENSURA). 2000 DEFINICIONES Y ABREVIATURAS Para los propsitos del presente manual de procedimientos se aplican las siguientes definiciones:
1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4 1.5.5 1.5.6 1.5.7 1.5.8 1.5.9 1.5.10
antibitico: Agente biolgico o qumico que inhibe el crecimiento de los microorganismos. ATCC: American Type Culture Collection. bioseguridad: Conjunto de medidas preventivas para proteger la salud y la seguridad humana y del ambiente, frente a diferentes riesgos producidos por agentes biolgicos, fsicos, qumicos o mecnico. cepa: Cultivo puro formado por bacterias descendientes de un solo aislamiento. colonia: Crecimiento visible bacteriano, generalmente en medios slidos, originada por la multiplicacin de una sola bacteria preexistente. concentracin inhibitoria mnima (CIM): Corresponde a la concentracin ms dbil de un antibitico capaz de inhibir el crecimiento visible de una cepa bacteriana al cabo de 18 24 horas de incubacin. crioconservacin: Congelamiento y almacenamiento de clulas vivas a muy bajas temperaturas disco de sensibilidad: Discos impregnados con algn antimicrobiano usados para determinar la susceptibilidad antimicrobiana por disco difusin. escala de Mc. Farland: Estndar de turbidez de sulfato de bario. La escala usada para el inculo de las pruebas de susceptibilidad por el mtodo de disco difusin es 0.5. esterilizacin: Proceso validado que permite la eliminacin de toda forma de vida microbiana incluyendo endosporas bacterianas. Puede conseguirse por medio de mtodos qumicos, fsicos o gaseosos.
11 Instituto Nacional de Salud
1.5.11
incubacin: Mantenimiento de cultivos bacterianos en condiciones favorables para su desarrollo y multiplicacin. inculo: Alcuota de un cultivo bacteriano transferida a un medio de cultivo. intermedio (i): Categora clnica definida para las pruebas de susceptibilidad in vitro. Esta categora incluye las cepas bacterianas que pueden ser inhibidas por concentraciones del antibitico superiores a las obtenidas con las dosis habituales, siempre y cuando se puedan aumentar las dosis empleadas y/o que el antibitico se concentre fisiolgicamente en el tejido o lugar infectado. medio de cultivo: Medio artificial de sustancias nutritivas, que puede ser slido, semislido o lquido, necesarias para el crecimiento y multiplicacin bacteriana in vitro. microaeroflico: Organismo que crece y se reproduce mejor en la presencia de una tensin de 5% de oxgeno, 10% de anhdrido carbnico y 85% de nitrgeno. reconstituir: Restablecer la forma original de una sustancia previamente alterada para su conservacin y almacenamiento, mediante la combinacin con un lquido adecuado. registro: Documento que provee evidencias objetivas de las actividades efectuadas o de los resultados obtenidos. resistente (R): Categora clnica definida para las pruebas de susceptibilidad in vitro. Las cepas bacterianas incluidas en esta categora no son inhibidas por las concentraciones sricas del antibitico normalmente alcanzadas con las dosis habituales del mismo, poseen comnmente mecanismos especficos de resistencia bacteriana o la eficacia clnica del antibitico frente a la bacteria no ha sido comprobada. sensible (S): Categora clnica definida para las pruebas de susceptibilidad in vitro. Implica que una infeccin debida a la cepa bacteriana estudiada puede ser tratada apropiadamente con la dosis de antibitico recomendada para el tipo de infeccin y la especie infectante, a menos que existan contraindicaciones. UFC: Unidad formadora de colonias.
1.5.12 1.5.13
1.5.14
1.5.15
1.5.16
1.5.17
1.5.18
1.5.19
1.5.20
SECCIN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 2.1 2.1.1 PRINCIPALES MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD El personal involucrado en los diferentes procesos debe aplicar las medidas de bioseguridad establecidas en las Normas de Bioseguridad (Serie Normas Tcnicas N 18-INS), aplicable al personal, uso y desecho de sustancias y materiales, acceso a los locales , y el medio ambiente. Las bacterias mencionadas en el presente manual corresponden trabajarlas a un nivel de bioseguridad 2. La principales medidas de bioseguridad incluyen: Ingreso restringido al laboratorio.
2.1.2 2.1.2.1
12
2.1.2.2 2.1.2.3 2.1.2.4 2.1.2.5 2.1.2.6 2.1.2.7 2.1.2.8 2.1.2.9 2.1.2.10 2.1.2.11 2.1.2.12 2.1.2.13 2.1.2.14 2.1.2.15 2.1.2.16 2.1.2.17 2.1.2.18 2.1.2.19 2.1.2.20
Utilizar siempre guardapolvo o mandilones de laboratorio en la zona de trabajo. El guardapolvo no debe de salir de la zona del laboratorio, salvo para enviarlo a lavar. No pipetear con la boca. Est prohibido comer, beber, fumar, guardar alimentos, ni aplicarse cosmticos en el laboratorio. En caso de tener cabello largo, recogerlo y cubrirlo. Lavarse las manos luego de quitarse los guantes y antes de salir del laboratorio. Utilizar proteccin para los ojos cuando el procedimiento genere gotas o aerosoles. Utilizar siempre guantes estriles y mascarillas. Las cortaduras o rasguos en las manos y brazos deben protegerse bien. Utilizar zapatos protectores que cubran completamente los pies (no usar sandalias o zapatos abiertos). El procesamiento de las muestras debe realizarse sobre una superficie de trabajo cubierta con papel absorbente plastificado o papel de filtro. Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas por el operador antes y despus de cada actividad. Los reactivos deben estar etiquetados y almacenados en viales adecuados con tapa rosca. Todos los laboratorios deben tener a disposicin un equipo de primeros auxilios. Informar inmediatamente cualquier accidente al jefe de laboratorio. Debe disponer de un lugar para el lavado de ojos en caso de exposicin accidental a salpicaduras. Todos los desechos del laboratorio deben descontaminarse adecuadamente, antes de eliminarlos en solucin desinfectante o ser autoclavados a 121C durante 20 minutos, o incinerarse. El material infeccioso debe ser fcilmente identificado como tal y ser esterilizado lo antes posible. Limpiar a diario los pisos con un trapeador limpio y solucin desinfectante.
SECCIN 3
PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACION DEL ANTIBIOGRAMA 3.1 VALORES CRTICOS DEL ANTIBIOGRAMA Los valores de las concentraciones y de los dimetros crticos que delimitan las categoras sensible, intermedio y resistente (S, I, R), son el resultado de la integracin de un conjunto de elementos: la
distribucin de las CIM para diversas poblaciones de cepas sensibles y resistentes, las concentraciones sricas y tisulares de los antibiticos, la confrontacin de los resultados in vitro y de los resultados clnicos, as como la variabilidad estadstica de los mtodos utilizados. 3.2 3.2.1 PROCEDIMIENTO DE CATEGORIZACIN Para los principales antibiticos, los valores crticos de las concentraciones bajas (c) y altas (C) y de sus dimetros correspondientes (d, D), permiten la categorizacin segn los siguientes criterios (Tabla1):
Tabla 1. Categorizacin Categoras Concentracin inhibitoria mnima (mg/L) CIM c CIM > C c < CIM C Dimetro del halo de inhibicin (mm) DHI D DHI < d d DHI < D
S R I
3.2.2
Por otra parte la lectura interpretativa del antibiograma, fundada en el conocimiento de los antibiofenotipos de sensibilidad y resistencia permite recategorizar un resultado inicialmente S en I o R debido al riesgo de fracaso teraputico. Esta lectura interpretativa requiere la identificacin correcta de la bacteria y una correcta realizacin del antibiograma.
3.3 3.3.1
MATERIALES Y EQUIPOS Todos los equipos utilizados en el procesamiento de las muestras clnicas deben estar en condiciones ptimas. El correcto funcionamiento de los instrumentos y equipos nos asegura la garanta de la calidad, as como el mantenimiento de buenas prcticas de seguridad tiene una importante influencia sobre el trabajo y productividad global del laboratorio, pues si un equipo o instrumental se daa por algn motivo puede haber una interrupcin del ritmo de trabajo y una demora en la emisin de los resultados. Recomendaciones Generales Cada instrumento tiene sus propias caractersticas y por lo tanto indicaciones especificas de mantenimiento y su respectivo control de calidad; sin embargo, hay recomendaciones generales que son aplicables a todo equipo de laboratorio como: Precauciones elctricas: Todo equipo elctrico debe estar apropiadamente conectado a tierra y no sobrecargar los circuitos, as como debe controlarse al menos una vez al ao o cada vez que se va a conectar un nuevo equipo a la lnea de electricidad. Los equipos de funcionamiento continuo como estufas, refrigeradoras, congeladores etc deben conectarse a un generador electrgeno de emergencia. Designar a una persona para que se encargue del mantenimiento preventivo de un determinado equipo.
3.3.2 3.3.2.1
a.
14
El personal de laboratorio debe informar de cualquier choque elctrico con el uso de un aparato. Los cordones de los equipos deben controlarse en forma regular . b. Limpieza de las superficies externas: Uilizar toallas de material suave embebidas con alguna solucin desinfectante como alcohol de 70%, desinfectante fenlico correctamente diluido otro desinfectante cualquiera. Si se usa desinfectante, enjuagar profundamente con agua para retirar los residuos de la solucin de limpieza, sobre todo si se usa hipoclorito de sodio para evitar corrosiones. c. Actividades dependientes de la Temperatura: En los equipos que funcionan con regulacin trmica se deben de tener en cuenta las tolerancias recomendadas para cada equipo: incubadoras ( 1C), baos de agua ( 1C), refrigeradoras (48C), congeladores estndar ( 5C), autoclaves empleados en microbiologa 121C/ 15 min ( 1C), y en cabinas de bioseguridad (tener en cuenta que la velocidad del flujo de aire debe estar entre los lmites de tolerancia de 45 55 pies/min). Adems en este ltimo, el flujo de aire, luz UV y el filtro deben ser verificado cada 6 meses. 3.3.3 3.3.3.1 3.3.3.2 3.3.3.3 3.3.3.4 3.3.3.5 3.3.3.6 3.3.3.7 3.3.3.8 3.3.4 3.3.4.1 3.3.4.2 3.3.4.3 3.3.4.4 Equipos Potenciometro pH metros Incubadoras Refrigeradores Autoclave Cabinas de bioseguridad Bao mara Espectrofotmetro o Fotocolormetro Vortex (digitador para tubos) Materiales Vernier o Regla Termmetros Pinza punta plana Placas petri
15
3.3.4.5 3.3.4.6 3.3.4.7 3.3.4.8 3.4 3.4.1 3.4.1.1 3.4.1.2 3.4.1.3 3.4.1.4 3.4.1.5 3.4.1.6 3.4.1.7 3.4.2 3.4.2.1 3.4.2.2 3.4.2.3 a. b. c. 3.4.2.4 3.4.2.5 3.4.3 3.4.3.1
Erlenmeyer Hisopos de Algodn Tubos con Tapa Rosca Pipetas MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Medios de cultivo y reactivos necesarios para la prueba Agar Mueller Hinton Caldo Mueller Hinton Agar Mueller Hinton con 5% de sangre de carnero Haemophilus test medium (HTM) Discos de sensibilidad antibitica Cloruro de Bario (BaCl2) cido Sulfrico (H2SO4) Preparacin del Agar Mueller Hinton Preparar el medio a partir de la base deshidratada de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Autoclavar y dejar enfriar en bao de agua hasta que alcance los 45C - 50C. Una vez esterilizado y solidificado, medir el pH del agar . El valor del mismo debe encontrarse entre 7,2 y 7,4 a temperatura ambiente. Esta medicin puede realizarse: Utilizando un electrodo de superficie Macerando el medio en agua destilada y utilizando un electrodo de inmersin Solidificando el agar con el electrodo del potenciometro Repartir el medio en placas petri (60 ml 70 ml o 25 ml 30 ml, para placas de 150 mm o 100 mm de dimetro interno respectivamente), de manera que el grosor del agar en la placa sea de 4 mm. Realizar las pruebas de esterilidad para cada lote de Mueller Hinton, incubando una o dos placas de cada lote a 30C 35C durante 24 horas o ms. Estas placas utilizadas deben ser, luego, descartadas. Preparacin del estndar (0,5 Mc. Farland) para el inculo Para estandarizar la densidad del inculo se usa una suspensin de sulfato de bario (0,5 de la escala de Mac Farland) como estndar.
3.4.3.2 a.
Preparacin del estndar de turbidez. Agregar 0,5 ml de una solucin de BaCl2 0,048 M (BaCl22H2O al 1,175% P/V) a 99,5 mL de una solucin de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1% V/V) en constante movimiento para mantener la suspensin. Verificar la densidad correcta del estndar usando un fotocolormetro espectrofotmetro, cuya absorbancia a 625 nm es 0,08 a 0,10 para el estndar 0,5 de Mc. Farland. Distribuir de 4 ml a 6 ml en tubos con tapa de rosca o tapn de jebe, similares a los que se usarn para preparar el inculo. Ajustar bien las tapas o tapones y conservarlos en la oscuridad a temperatura ambiente y anotar la fecha de preparacin. Antes de ser usado agitar vigorosamente dicho estndar de preferencia, en un agitador mecnico. Verificar mensualmente la densidad de los estndares de sulfato de bario, y reemplazarlo cuando sea necesario. Seleccin de los discos de sensibilidad antibitica En el presente documento se establece la relacin de los discos de antibiticos que debern ser utilizados en los antibiogramas de rutina, segn las diferentes bacterias o grupos bacterianos, as como la modalidad del reporte de los mismos por parte de los laboratorios de Microbiologa. La seleccin de los antibiticos que figuran en esta relacin ha sido realizada teniendo en cuenta los siguientes criterios: Eficacia clnica documentada. Representatividad de una familia de antibiticos. Disponibilidad de criterios tcnicos fiables para la determinacin in vitro de su eficacia clnica. Estabilidad de la molcula en los discos para antibiograma. Presencia en el mercado nacional. Importancia para la vigilancia de la resistencia bacteriana. Los antibiticos han sido distribuidos para este efecto en dos grupos: Grupo 1: En este grupo se encuentran los antibiticos de base indispensables para orientar el tratamiento de las diferentes infecciones, cuya inclusin en el antibiograma y reporte de los mismos es de carcter OBLIGATORIO (Ver seccin de el agente). Grupo 2: Este grupo rene antibiticos complementarios cuya inclusin en el antibiograma y reporte es de carcter OPCIONAL, pues depende de los esquemas de antibioterapia vigentes en cada hospital y de la epidemiologa local de la resistencia bacteriana (Ver seccin de cada agente).
b.
c.
d.
e. f.
3.4.4 3.4.4.1
a. b. c. d. e. f. 3.4.4.2 a.
b.
17
3.5 3.5.1
INOCULACIN Preparacin del inculo Puede realizarse de dos formas:
3.5.1.1 a. b.
Mtodo de desarrollo previo Seleccionar cuatro a cinco colonias bien aisladas, del mismo tipo morfolgico, de un cultivo en placa. Tocar la superficie de cada colonia con una asa de siembra y transferirlo a un tubo que contiene de 4 a 5 mL de caldo apropiado (Ej. Caldo Tripticasa soya). Incubar el caldo a una temperatura entre 35C a 37C, hasta que alcance o exceda la turbidez del estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland (por lo general de 2 a 6 horas). Ajustar la turbidez del inculo con solucin salina o caldo apropiado hasta el tubo 0.5 de la escala de Mc. Farland, por comparacin visual con el estndar. Para realizar este paso correctamente usar una luz apropiada y mirar los tubos contra un fondo blanco con lneas negras como contraste. La suspensin preparada contendr aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/mL para E. coli ATCC 25922. Mtodo directo de inoculacin a partir de colonias aisladas De una placa de cultivo con agar no selectivo e incubada por 18 - 24 h, seleccionar colonias aisladas y preparar una suspensim directa en solucin salina caldo. La suspensin debe ser inmediatamente ajustada a la escala 0,5 de Mc. Farland. Inoculacin de las Placas Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez del inculo, sumergir un hisopo estril en la suspensin, rotar el hisopo varias veces presionando firmemente sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del lquido para remover el exceso de inculo. Inocular la superficie seca de la placa de Mueller Hinton, estriando con el hisopo en tres direcciones para asegurar una distribucin uniforme del inculo (Figura 1). Antes de colocar los discos dejar secar la placa a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido.
c.
d.
e. 3.5.1.2 a.
b. 3.5.2 3.5.2.1
3.5.2.2
Figura 1. Direcciones en el sembrado del inculo sobre la superficie del agar
18
3.6 3.6.1
APLICACIN DE LOS DISCOS Colocar los discos individuales o multidiscos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estril o la punta de una aguja presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto completo con la superficie del agar. Distribuir los discos uniformemente, de modo que estn a una distancia mnima de 25 mm uno del otro (el dimetro de los discos segn las normas de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) debe ser de 6 mm). No deben colocarse ms de 12 discos en una placa de 150 mm, ni ms de 6 en una placa de 100 mm de dimetro interno, para evitar la superposicin de las zonas de inhibicin. Un disco no debe ser removido una vez que tom contacto con la superficie del agar debido a que algunos antibiticos se difunden rpidamente.
3.6.2
3.7 3.7.1
INCUBACIN Incubar lar placas en posicin invertida a 35C dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicacin de los discos. Las placas de Haemophilus spp y Streptococcus spp, deben ser incubadas en atmsfera del 5% de CO2. Despus del tiempo recomendado de incubacin (Anexo B) examinar cada placa y medir los dimetros de los halos de inhibicin alrededor de cada disco. En los casos de Staphylococcus spp y Enterococcus spp el tiempo de incubacin debe prolongarse por 24 horas para una mejor deteccin de la resistencia a Oxacilina y Vancomicina, respectivamente.
3.7.2 3.7.3
3.8 3.8.1
LECTURA DE LAS PLACAS E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Medir los dimetros de las zonas de inhibicin completa (incluyendo el dimetro del disco), usando una regla o calibrador. Se debe mantener iluminada la parte posterior de la placa petri con una luz reflejada localizada a unos cuantos centmetros sobre un fondo negro. Tener la precaucin de observar la placa siguiendo una vertical directa para evitar una lectura errnea de las marcas de la regla por efecto de paralelismo. En los medios suplementados con sangre, las zonas son medidas en la parte superior de la superficie del agar y retirando la tapa. Tener cuidado de no medir la zona de la hemlisis sino la de inhibicin del crecimiento. Para Staphylococcus spp o Enterococcus spp, usar luz transmitida ,manteniendo la placa arriba de la luz para examinar un posible ligero crecimiento de cepas resistentes a Oxacilina/Meticilina o Vancomicina dentro de los halos aparentes de inhibicin. Cualquier desarrollo dentro de la zona de inhibicin es indicativo de resistencia a Meticilina (Oxacilina) o Vancomicina. El punto final debe tomarse como el rea que no muestra un crecimiento obvio, visible, que puede ser detectado mediante observacin visual, no incluyendo velo de crecimiento o colonias muy pequeas que puedan ser detectadas solo con mucha dificultad en el borde de la zona. Sin embargo las colonias mayores creciendo dentro de la zona clara debern ser subcultivadas, reidentificadas y reensayadas. Algunos Proteus spp, debido a su gran movilidad, pueden presentar un velo de invasin o swarming dentro de las zonas de inhibicin de algunos antibiticos. En estos casos el velo del swarming debe ser ignorado al momento de medir los halos de inhibicin.
3.8.2
3.8.3
3.8.4
Cuando se prueban discos de Cotrimoxazol puede arrastrarse sustancias antagnicas que producen un crecimiento con aspecto de niebla dentro de la zona del halo de inhibicin, en estos casos no considerar en la lectura un crecimiento del 20% o menos del desarrollo total. Los dimetros de inhibicin son interpretados basndose en las Tablas N 1 al 9. La sensibilidad de la cepa bacteriana ser reportada como sensible (S), intermedio (I), o resistente (R).
3.8.5
SECCIN 4
ANTIBIOGRAMA PARA Staphylococcus spp
4.1
MEDIO DE CULTIVO Agar Mueller Hinton
4.2
INCULO Suspensin directa de la colonia en caldo Mueller Hinton o solucin salina al 0.9 % a partir de un cultivo en agar no selectivo de 18 24 h de incubacin. Ajustar a la turbidez equivalente al estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland.
4.3 4.3.1 4.3.1.1 4.3.1.2 4.3.1.3 4.3.1.4 4.3.1.5 4.3.1.6 4.3.1.7 4.3.1.8 4.3.2 4.3.2.1 4.3.2.2
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA Grupo I: Oxacilina Penicilina Eritromicina Clindamicina Cotrimoxazol (Trimetoprim/Sulfametoxazol) Vancomicina Gentamicina Ciprofloxacina Grupo II: Cloramfenicol. Rifampicina.
20
4.3.2.3 4.3.2.4 4.3.2.5 4.3.2.6
Tetraciclina. Teicoplanina Nitrofurantona(1) Norfloxacina(1)

(1)
Disco utilizado exclusivamente en cepas provenientes de infecciones de las vas urinarias
4.3.3 4.3.3.1 4.3.3.2 4.3.3.3 4.4
Resistencias Naturales Los estafilococos son resistentes a cido Nalidxico, cido Pipemdico y Aztreonam Staphylococcus saprophyticus es resistente a Fosfomicina y Novobiocina Staphylococcus cohnii y Staphylococcus xylosus son resistentes a Novobiocina y a Lincomicina INCUBACIN 35C
4.5
LECTURA A las 16 18 h. A las 24 h para el disco de Oxacilina
4.6 4.6.1
INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS CRTICOS Antibiticos y dimetros crticos

Tabla 2. Antibiticos y Dimetros Crticos para Staphylococcus spp.
ANTIMICROBIANO PENICILINAS Penicilina Oxacilina (S. Aureus) (Estafilococos coagulasa negativos) GLICOPEPTIDOS Vancomicina Teicoplanina AMINOGLUCOSIDOS Gentamicina FLUOROQUINOLONAS Norfloxacina Ciprofloxacina TETRACICLINA Tetraciclina MACROLIDOS Eritromicina LINCOSAMIDAS Clindamicina OTROS Cloramfenicol Rifampicina Nitrofurantona Trimetoprim/sulfametoxazol CONTENIDO DEL DISCO 10 unidades 1 g 1 g 30 g 30 g 10 g 10 g 5 g 30 g 15 g 2 g 30 g 5 g 300 g 1.25/23.75g R 28 10 17 10 12 12 15 14 13 14 12 16 14 10 DIAMETRO EN mm I 11-12 11-13 13-14 13-16 16-20 15-18 14-22 15-20 13-17 17-19 15-16 11-15 S 29 13 18 15 14 15 17 21 19 23 21 18 20 17 16
21
4.6.2 4.6.2.1
Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma Disco de Penicilina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Penicilina es vlido tambin para Ampicilina y Amoxicilina.
4.6.2.2 a.
Disco de Oxacilina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Oxacilina es vlido tambin para Dicloxacilina y Cloxacilina. La resistencia a Oxacilina seala una resistencia cruzada a todas las penicilinas (asociadas o no a inhibidores de betalactamasas), cefalosporinas de todas las generaciones y carbapenems, sin excepcin. Las cepas resistentes a Penicilina y sensibles a Oxacilina son sensibles a las penicilinas asociadas a los inhibidores de betalactamasas, a las cefalosporinas y a los carbapenems. El disco de Oxacilina no debe incluirse en el antibiograma de Staphylococcus saprophyticus pues con frecuencia al utilizar los dimetros crticos vlidos para los otros estafilococos coagulasa negativos, se le clasifica incorrectamente como resistente a este antibitico. Disco de Tetraciclina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Tetraciclina es vlido tambin para Doxiciclina y Minociclina.
b.
c.
d.
4.6.2.3
4.6.2.4
Disco de Eritromicina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Eritromicina es vlido tambin para la Azitromicina, Claritromicina y Roxitromicina.
4.6.2.5
Disco de Ciprofloxacina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Ciprofloxacina es vlido tambin para la Ofloxacina y Levofloxacina.
4.6.2.6
Disco de Vancomicina: Si se tiene una zona de inhibicin de 14 mm o menos, se recomienda la medicin de la CIM de este antibitico para descartar una posible sensibilidad disminuida (Ver Anexo E).
4.7
CEPA DE REFERENCIA PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO Staphylococcus aureus ATCC 25923
22
SECCION 5
ANTIBIOGRAMA DE Enterococcus spp.
5.1
5.2
INOCULO Mtodo del crecimiento o suspensin directa de la colonia.
5.3 5.3.1 5.3.2.1 5.3.2.2 5.3.2.3 5.3.2.4 5.3.2 5.3.2.1 5.3.2.2 5.3.2.3 5.3.2.4 5.3.2.5 5.3.2.6 5.3.2.7 5.3.2.8 5.3.2.9
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA Grupo I: Ampicilina Gentamicina (disco con contenido de 120 mg) Estreptomicina (disco con contenido de 300 mg) Vancomicina Grupo II: Teicoplanina Rifampicina Cloramfenicol Tetraciclina Eritromicina Nitrofurantona(1) Norfloxacina(1) Ciprofloxacina(1) Levofloxacina(1)
(1)
Disco utilizado exclusivamente en cepas provenientes de infecciones de las vas urinarias
23
5.3.3 5.3.3.1 5.3.3.2
Resistencias Naturales Los enterococos son resistentes a oxacilina, cefalosporinas, Clindamicina, y Cotrimoxazol. Los enterococos presentan una resistencia de bajo nivel a los aminoglucsidos, lo cual no suprime la sinergia con los betalactmicos, por tanto deben utilizarse discos con mayores concentraciones de antibitico que las habituales buscando detectar una resistencia de alto nivel que si elimina el efecto sinrgico. Enterococcus gallinarum y Enterococcus casseliflavus son resistentes a los glicopptidos. Incubacin 35C
5.3.3.3 5.4
5.5
Lectura A las 16 18 h. A las 24 h para el disco de Vancomicina
5.6 5.6.1

Tabla 3. Antibiticos y dimetros crticos para Enterococcus spp.
ANTIMICROBIANO PENICILINAS Ampicilina GLICOPEPTIDOS Vancomicina Teicoplanina AMINOGLUCOSIDOS Gentamicina Estreptomicina FLUOROQUINOLONAS Ciprofloxacina Levofloxacina Norfloxacina TETRACICLINA Tetraciclina MACROLIDOS Eritromicina OTROS Rifampicina Nitrofurantona CONTENIDO DEL DISCO 10 g 30 g 30 g 120 g 300 g 5 g 5 g 10 g 30 g 15 g 5 g 300 g DIAMETRO EN MM I 15-16 11-13 79 79 16-20 14-16 13-16 15-18 14-22 17-19 15-16
R 16 14 10 6 6 15 13 12 14 13 16 14
S 17 17 14 10 10 21 17 17 19 23 20 17
24
5.6.2 5.6.2.1 a.
Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma Disco de Ampicilina: Si la cepa es sensible a Ampicilina lo es tambin a Penicilina, la Amoxicilina, asociaciones de penicilinas e inhibidores de betalactamasas, e Imipenem. En caso de resistencia a Ampicilina, se recomienda la realizacin del test de la nitrocefina para la deteccin de una penicilinasa. Esta resistencia enzimtica a Ampicilina (test de la nitrocefina positivo) es cruzada con Penicilina y Amoxicilina. Discos de Vancomicina y Teicoplanina: Si la cepa es intermedia a Vancomicina y/o Teicoplanina, se recomienda la medicin de la CIM de estos antibiticos para descartar una posible resistencia (Ver anexo E)
b.
5.6.2.2
5.6.2.3
Discos de Gentamicina y Estreptomicina: Si la cepa es intermedia a Gentamicina y/o Estreptomicina, se recomienda la medicin de la CIM de estos antibiticos para descartar una posible resistencia de alto nivel (Ver anexo E).
5.6.2.4
Disco de Tetraciclina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Tetraciclina es vlido tambin para Doxiciclina y Minociclina.
5.6.2.5
Disco de Eritromicina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Eritromicina es vlido tambin para Azitromicina, Claritromicina y Roxitromicina.
5.7
CEPA DE REFERENCIA PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO Staphylococcus aureus ATCC 25923
SECCIN 6
ANTIBIOGRAMA PARA Pseudomonas aeruginosa
6.1
MEDIO DE CULTIVO Agar Mueller Hinton.
6.2
INOCULO Mtodo del crecimiento o suspensin directa de la colonia. Ajustar a la turbidez equivalente al estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland.
25
6.3 6.3.1 6.3.1.2 6.3.1.3 6.3.1.4 6.3.1.5 6.3.1.6 6.3.2 6.3.2.2 6.3.2.3 6.3.2.4 6.3.2.5 6.3.2.6
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA Grupo I: Ceftazidima Imipenem y/o Meropenem Gentamicina Amikacina Ciprofloxacina Grupo II: Aztreonam Cefoperazona/sulbactam Cefepime Norfloxacina(1) Ofloxacina(1)
(1)
Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vas urinarias
6.3.3
Resistencias Naturales: Pseudomonas aeruginosa es resistente a Penicilina, Ampicilina, Amoxicilina, cefalosporinas de primera y segunda generacin, Cefotaxima, Ceftriaxona, Kanamicina, Tetraciclina, Cloramfenicol, cido Nalidxico y cido Pipemdico.
6.4
INCUBACIN 35C
6.5
LECTURA A las 16 18 h.
6.6 6.6.1
26
Tabla 4. Antibiticos y Dimetros Crticos para Pseudomonas aeruginosa

ANTIMICROBIANO CONTENIDO DEL DISCO DIAMETRO EN mm I 15-17 15-17 16-20 14-15 14-15 16-21 13-14 15-16 16-20 13-16 13-15
R 14 14 15 13 13 15 12 14 15 12 12
S 18 18 21 16 16 22 15 17 21 17 16
CEFALOSPORINAS Ceftazidima 30 g Cefepime 30 g LACTAMICO/ INHIBIDOR DE BETALACTAMASA 75 g/30 g Cefoperazona/sulbactam* CARBAPENEMS Imipenem 10 g Meropenem 10 g MONOBACTAMS Aztreonam 30 g AMINOGLUCOSIDO Gentamicina 10 g Amikacina 30 g QUINOLONAS Ciprofloxacina 5 g Norfloxacina 10 g Ofloxacina 5 g
* Adaptado a partir de los dimetros crticos de la Cefoperazona segn el NCCLS 2001
6.6.2 6.6.2.1
Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma Disco de Ceftazidima: Si la cepa tiene susceptibilidad intermedia (I) o resistente (R) a Ceftazidima debe informarse tambin como intermedia (I) o resistente (R) al Aztreonam an cuando el resultado del disco indique sensibilidad (resistencia cruzada).
6.6.2.2
Disco de Aztreonam: Una resistencia aislada del Aztreonam en relacin con una sensibilidad conservada para los otros betalactmicos (cefalosporinas y carbapenems) es posible y debe informarse como tal.
6.6.2.3 a.
Discos de carbapenems: Si una resistencia disociada entre Meropenem e Imipenem (sensible a uno y resistente al otro) es detectada deber verificarse la tcnica y repetirse la prueba. Si la resistencia disociada se confirma, la cepa deber ser enviada al INS. Una resistencia aislada a Imipenem y/o Meropenem en relacin con una sensibilidad conservada para otros betalactmicos (cefalosporinas, monobactams y combinaciones cefalosporina / inhibidor de betalactamasas) es posible y debe informarse como tal. Cepa de Referencia para el control de calidad interno Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
b.
6.7
SECCIN 7
ANTIBIOGRAMA PARA Acinetobacter spp
7.1
7.2
INOCULO Mtodo del crecimiento o suspensin directa de la colonia. Ajustar a la turbidez equivalente al estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland.
7.3 7.3.1 7.3.1.1 7.3.1.2 7.3.1.3 7.3.1.4 7.3.1.5 7.3.2 7.3.2.1 7.3.2.2 7.3.2.3 7.3.2.4 7.3.2.5 7.3.2.6 7.3.2.7 7.3.2.8 7.3.2.9
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA Grupo I: Ceftazidima Imipenem o Meropenem Gentamicina Amikacina Ciprofloxacina. Grupo II: Ampicilina/Sulbactam Aztreonam Cefotaxima o Ceftriaxona Cefepime Norfloxacina(1) Ofloxacina(1) Tetraciclina(1) Cotrimoxazol (Trimetoprim/Sulfametoxazol) 1 Cloramfenicol
(1)
Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vas urinarias
28
7.3.3 7.3.3.1
Resistencias Naturales: Acinetobacter baumannii y Acinetobacter calcoaceticus son resistentes a Penicilina, Ampicilina, Amoxicilina, cefalosporinas de primera y segunda generacin y a furanos. Acinetobacter haemolyticus es resistente a Gentamicina y Amikacina. INCUBACIN 35C
7.3.3.2 7.4
7.5
LECTURA 16 18 h
7.6 7.6.1
Tabla 5. Antibiticos y Dimetros Crticos para Acinetobacter spp

ANTIMICROBIANO CONTENIDO DEL DISCO COMBINACION DE LACTAMICO/ INHIBIDOR DE BETALACTAMASA Ampicilina/Sulbactam 10/10 g CEFALOSPORINAS Ceftazidima 30 g Ceftriaxona 30 g Cefotaxima 30 g Cefepime 30 g CARBAPENEMS Imipenem 10 g Meropenem 10 g MONOBACTAMS Aztreonam 30 g AMINOGLUCOSIDO Gentamicina 10 g Amikacina 30 g QUINOLONAS Ciprofloxacina 5 g Norfloxacina 5 g Ofloxacina 5 g TETRACICLINA Tetraciclina 30 g OTROS Cloramfenicol 30 g Trimetoprim/sulfametoxazol 1,25/23,75g DIAMETRO EN mm I 12-14 15-17 14-20 15-22 15-17 14-15 14-15 16-21 13-14 15-16 16-20 13-16 13-15 15-18 13-17 11-15
R 11 14 13 14 14 13 13 15 12 14 15 12 12 14 12 10
S 15 18 21 23 18 16 16 22 15 17 21 17 16 19 18 16
29
7.6.2 7.6.2.1
Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma Disco de Tetraciclina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Tetraciclina no es necesariamente vlido para Doxiciclina y Minociclina.
7.6.2.2 a. b.
Actividad del Sulbactam: El Sulbactam, un inhibidor de betalactamasas, posee una actividad intrnseca sobre el Acinetobacter spp. La reciente aparicin en EE.UU. de dimetros crticos para medir la actividad de Ampicilina/Sulbactam sobre Acinetobacter spp. permite incluir esta asociacin entre los antibiticos para el antibiograma de esta especie. Actividad de la Rifampicina: La Rifampicina es utilizada en algunos pases para el tratamiento en asociacin de infecciones ocasionadas por Acinetobacter spp multirresistente. Sin embargo debido a la inexistencia de dimetros crticos en el sistema norteamericano (NCCLS) para medir la actividad de Rifampicina sobre Acinetobacter spp no hemos incluido este antibitico en ninguno de los dos grupos de antibiticos para esta especie. CEPAS DE REFERENCIA PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Escherichia coli ATCC 35218 (para combinaciones de betalactmicos con inhibidores de betalactamasas).
7.6.2.3 a)
b)
7.7 7.7.1 7.7.2
SECCION 8
ANTIBIOGRAMA PARA Enterobacteriaceae
8.1
8.2
INOCULO Mtodo de crecimiento o suspensin directa de la colonia. Ajustar a la turbidez equivalente al estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland.
30
8.3 8.3.1 8.3.1.1 8.3.1.2 8.3.1.3 8.3.1.4 8.3.1.5 8.3.1.6 8.3.1.7 8.3.1.8 8.3.1.9 8.3.1.10 8.3.1.11 8.3.1.12 8.3.2 8.3.2.1 8.3.2.2 8.3.2.3 8.3.2.4 8.3.2.5 8.3.2.6 8.3.2.7 8.3.2.8 8.3.2.9
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA Grupo I: Ampicilina Cefalotina Ampicilina / Sulbactam o Amoxicilina / cido Clavulnico. Cefuroxima Cefotaxima o Ceftriaxona Gentamicina Amikacina cido Nalidxico(1) Norfloxacina(1) Ciprofloxacina Cotrimoxazol (Trimetoprim/Sulfametoxazol) Nitrofurantona(1) Grupo II: Cefoxitina Aztreonam Ceftazidima Cefixima Cefoperazona/Sulbactam Cefepime o Cefpirome Imipenem o Meropenem Cloramfenicol Ofloxacina (1)
(1)
Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vas urinarias.

31
8.3.3
Antibiticos a utilizar en el antibiograma de Salmonella spp y Shigella spp aisladas de coprocultivos: Ampicilina Cloramfenicol Cotrimoxazol (Trimetoprim/Sulfametoxazol) Ciprofloxacina Cefotaxima Resistencias Naturales: Las enterobacterias son resistentes a Penicilina, Oxacilina, Macrlidos, Clindamicina y Glicopptidos. Klebsiella spp es resistente a las Aminopenicilinas. Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae y Enterobacter aerogenes son resistentes a las Aminopenicilinas, Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas, Cefalosporinas de primera generacin y Cefuroxima. Serratia marcescens es resistente a las Aminopenicilinas, Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas, Cefalosporinas de primera generacin y Cefoxitina. Proteus mirabilis es resistente a Nitrofurantona. Proteus vulgaris es resistente a las Aminopenicilinas, Cefalosporinas de primera generacin, Cefuroxima y Nitrofurantona. Morganella morganii es resistente a las Aminopenicilinas, Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas, Cefalosporinas de primera generacin, Cefuroxima y Nitrofurantona. Providentia stuartii es resistente a las Aminopenicilinas, Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas, Cefalosporinas de primera generacin, Gentamicina (bajo nivel) y Nitrofurantona. INCUBACIN 35C
8.3.3.1 8.3.3.2 8.3.3.3 8.3.3.4 8.3.3.5 8.3.4 8.3.4.1 8.3.4.2 8.3.4.3
8.3.4.4
8.3.4.5 8.3.4.6
8.3.4.7
8.3.4.8
8.4
8.5
LECTURA 15-18 h
8.6 8.6.1
32
Tabla 6. Antibiticos y Dimetros Crticos para Enterobacterias

ANTIMICROBIANO CONTENIDO DEL DISCO 10 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 5 g 30 g 30 g 10/10 g 20/10 g 75 g/30 g 30 g 10 g 10 g 10 g 30 g 30 g 10 g 5 g 5 g 30 g 30 g 1,25/23,75g DIAMETRO EN mm I 14-16 15-17 15-22 15-17 15-17 15-22 14-20 15-17 16-18 15-17 15-17 12-14 14-17 16-20 16-21 14-15 14-15 13-14 15-16 14-18 13-16 16-20 13-15 15-18 13-17 11-15
R 13 14 14 14 14 14 13 14 15 14 14 11 13 15 15 13 13 12 14 13 12 15 12 14 12 10
S 17 18 23 18 18 23 21 18 19 18 18 15 18 21 22 16 16 15 17 19 17 21 16 19 18 16
PENICILINAS Ampicilina CEFALOSPORINAS Cefalotina Cefuroxima axetil (oral) Cefuroxima sodium (parenteral) Cefoxitina Cefotaxima Ceftriaxona Ceftazidima Cefixima Cefpirome * Cefepime LACTAMICO/ INHIBIDOR DE BETALACTAMASA Ampicilina/Sulbactam Amoxicilina/cido Clavulnico Cefoperazona/sulbactam + MONOBACTAMS Aztreonam CARBAPENEMS Imipenem Meropenem AMINOGLUCOSIDOS Gentamicina Amikacina QUINOLONAS Acido nalidxico Norfloxacina Ciprofloxacina Ofloxacina TETRACICLINA Tetraciclina OTROS Cloramfenicol Trimetoprim/sulfametoxazol
* Dimetros crticos adaptados del CFA SFM, 2000 2001. + Adaptado a partir de los dimetros crticos de la Cefoperazona segn el NCCLS 2001
8.6.2 8.6.2.1 a. b.
Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma Disco de Ampicilina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Ampicilina es tambin vlido para Amoxicilina. Tomar en cuenta las resistencias naturales de las enterobacterias para el reporte.
33
8.6.2.2 a.
Disco de Ampicilina/Sulbactam y Amoxicilina/cido Clavulnico: En enterobacterias no existe una disociacin de resultados para estos discos por lo que debe utilizarse uno solo de ellos en el antibiograma. Tomar en cuenta las resistencias naturales de las enterobacterias para el reporte. Disco de Cefalotina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Cefalotina es generalmente vlido para la Cefazolina. Tambin es vlido para Cefadroxilo, Cefradina, Cefalexina, Cefaclor y Loracarbef pero nicamente de las cepas aisladas de infecciones urinarias. En el caso de Salmonella spp y Shigella spp las Cefalosporinas de primera y segunda generacin no son eficaces clnicamente por lo que deben ser reportadas como resistentes a estos antibiticos an cuando se observe actividad in vitro. Tomar en cuenta las resistencias naturales de las enterobacterias para el reporte. Discos de Aminoglucsidos: En el caso de Salmonella spp. y Shigella spp los Aminoglucsidos no son eficaces clnicamente por lo que deben ser reportadas como resistentes a estos antibiticos an cuando se observe actividad in vitro.
b. 8.6.2.3 a.
b.
c. 8.6.2.4
8.6.2.5
Disco de Tetraciclina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Tetraciclina es vlido tambin para la Doxiciclina y Minociclina.
8.6.2.6 a.
Discos de Cefalosporinas de tercera generacin y Aztreonam: Para Enterobacter spp., Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Morganella morganii y Providentia stuartii un resultado intermedio o resistente a Cefotaxima, Ceftriaxona, Ceftazidima o Aztreonam obliga a reportar como intermedio o resistente a todo este grupo de antibiticos. El disco de Cefixima no debe utilizarse en el antibiograma de Morganella morganii. Algunas cepas de enterobacterias, principalmente de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, son clnicamente resistentes a las Cefalosporinas de tercera generacin y al Aztreonam debido a la produccin de betalactamasas de espectro extendido. Este tipo de resistencia puede ser difcil de detectar en el antibiograma estndar. DETECCIN DE LAS ENTEROBACTERIAS PRODUCTORAS DE BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO Algunas cepas productoras de estas enzimas pueden presentar halos de inhibicin lo suficientemente grandes como para ser clasificadas errneamente como sensibles a las Cefalosporinas de tercera
b. c.
8.7
generacin y a Aztreonam. Con el objeto de superar esta dificultad, la tabla 7 seala los dimetros para Ceftazidima, Cefotaxima, Ceftriaxona y Aztreonam que sern utilizados como test de tamizaje y que permiten sospechar la presencia de estas enzimas: Si la cepa estudiada presenta halos de inhibicin, para al menos uno de estos antibiticos, iguales o inferiores a los dimetros referidos en tabla 7 deber realizarse un test confirmatorio de la presencia de betalactamasas de espectro extendido.
Tabla 7. Dimetros crticos de tamizaje para la deteccin de Bectalactamasas de espectro extendido
ANTIBIOTICO-CONCENTRACION Aztreonam 30 mg Ceftazidima 30 mg Cefotaxima 30 mg Ceftriaxona 30 mg
HALO DE INHIBICION 27 mm 22 mm 27 mm 25 mm
8.7.1 8.7.1.1
Test confirmatorio de la presencia de betalactamasas de espectro extendido (segn el NCCLS - USA): Este test requiere el uso de discos habituales de Ceftazidima (30 mg) ,Cefotaxima (30 mg), as como de Ceftazidima/Acido Clavulnico (30/10 mg) y Cefotaxima/Acido Clavulnico (30/10 mg), con los que se realiza un test de disco difusin sin ninguna variante. Si los discos de Ceftazidima/Acido Clavulnico y Cefotaxima/Acido Clavulnico presentan zonas de inhibicin superiores 5 mm a aquellos producidos por los discos de Ceftazidima y Cefotaxima, respectivamente, se considera el test como positivo. Test confirmatorio de la presencia de betalactamasas de espectro extendido (segn el Comit de Antibiograma de la Sociedad Francesa de Microbiologa): Este test requiere el uso de discos habituales de Amoxicilina/Acido Clavulnico (20/10 mg), Ceftazidima (30 mg) y/o Cefotaxima (30 mg) y/o Aztreonam (30 mg) y/o Ceftriaxona, con los que se realiza un test de disco difusin sin ninguna variante. Los discos de Ceftazidima, Aztreonam, Cefotaxima y Ceftriaxona se disponen a 30 mm del disco de Amoxicilina/cido Clavulnico (distancia de centro a centro de los discos). Si una imagen de sinergia aparece entre el disco Amoxicilina/cido Clavulnico y los discos de Ceftazidima y/o Aztreonam y/o Cefotaxima y/o Ceftriaxona, se considera el test como positivo. Reporte de antibiograma de las enterobacterias productoras de betalactamasas de espectro extendido: Una vez detectadas las cepas productoras de estas betalactamasas de espectro extendido deben ser reportadas como resistentes a todas las penicilinas, las cefalosporinas de todas las generaciones (icluyendo los de cuarta generacin) y al Aztreonam, cualquiera que sea el dimetro de los discos de estos antibiticos.
8.7.1.2
8.7.2
8.7.2.1
8.7.2.2
8.7.2.3
8.7.3
8.8 8.8.1 8.8.2
Cepas de Referencia para el control de calidad interno Escherichia coli ATCC 25922. Escherichia coli ATCC 35218 (para combinaciones de betalactmicos e inhibidores de betalactamasas).
SECCION 9
ANTIBIOGRAMA DE Streptococcus pneumoniae (Neumococo)
9.1
MEDIO DE CULTIVO Agar Mueller Hinton con un suplemento de 5% sangre de carnero NOTA: No aplicar ms de 9 discos en las placas de 150 mm, ni ms de 5 en las placas de 100 mm.
9.2
INOCULO Suspensin directa de la colonia en caldo Mueller Hinton o solucin salina al 0.9% a partir de una placa de agar sangre de carnero de crecimiento, incubada 16 18 horas. Ajustar a la turbidez equivalente al estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland.
9.3 9.3.1 9.3.1.1 9.3.1.2 9.3.1.3 9.3.1.4 9.3.1.5 9.3.1.6 9.3.2 9.3.2.1 9.3.2.2 9.3.2.3
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA Grupo I: Oxacilina Eritromicina Cotrimoxazol (trimetoprim/sulfametoxazol) Cloramfenicol Vancomicina Tetraciclina Grupo II: Rifampicina Teicoplanina Levofloxacina o Esparfloxacina o Moxifloxacina.
36
9.3.3 9.3.3.1 9.3.3.2 9.4
Resistencias Naturales: El Neumococo es resistente a Aztreonam y Pefloxacina. El Neumococo presenta una resistencia de bajo nivel a los aminoglucsidos. INCUBACIN 35C en atmsfera de 5% de CO2.
9.5
LECTURA 20 24 h
9.6 9.6.1

Tabla 8. Antibiticos y Dimetros para Streptococcus pneumoniae
ANTIMICROBIANO CONTENIDO DEL DISCO R PENICILINAS Oxacilina GLICOPEPTIDOS Vancomicina Teicoplanina* QUINOLONAS Levofloxacina Esparfloxacina Moxifloxacina TETRACICLINA Tetraciclina MACROLIDOS Eritromicina OTROS Cloramfenicol Rifampicina Trimetoprim/sulfametoxazol 1 g 30 g 30 g 5 g 5 g 5 g 30 g 15 g 30 g 5 g 1.25/23.75g 13 15 14 18 15 20 16 15
DIAMETRO EN mm I 14-16 16-18 15-17 19-22 16-20 17-18 16-18
S 20 17 17 17 19 18 23 21 21 19 19
* Dimetros crticos adaptados del CFA SFM 2000 20001.
9.6.2 9.6.2.1 a.
Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma Disco de Oxacilina: Cuando el halo de inhibicin del disco de Oxacilina es igual o superior a 20 mm, la cepa de Neumococo es sensible a Penicilina y a los siguientes antibiticos: Ampicilina, Amoxicilina, Amoxicilina/cido
37
Clavulnico, Ampicilina/Sulbactam, Cefaclor, Cefuroxima, Cefotaxima, Ceftriaxona, Cefixima, Cefepime, Loracarbef, Imipenem y Meropenem. b. Cuando el halo de inhibicin del disco de Oxacilina es igual o inferior a 19 mm puede tratarse de una cepa de Neumococo sensible, de bajo nivel de resistencia o de alto nivel de resistencia a Penicilina. En estas cepas debe determinarse la CIM de la Penicilina pues no es posible categorizar al Neumococo como resistente a este antibitico basado nicamente en el resultado del disco de Oxacilina. Tampoco es posible determinar el grado de resistencia a los otros betalactmicos basado nicamente en los resultados del disco de Oxacilina, por lo que se recomienda determinar la CIM de ciertos antibiticos que pueden ser eficaces en el tratamiento de infecciones debidas a Neumococo resistente a Penicilina (Amoxicilina, Cefuroxima, Cefotaxima, Ceftriaxona, Imipenem y Meropenem). En infecciones severas debidas a Neumococo (meningitis, bacteriemia) se recomienda determinar la CIM de la cepa para Penicilina, Cefotaxima (o Ceftriaxona) y Meropenem. La Vancomicina debe tambin estudiarse en estos casos, sea incluyendo el disco de este antibitico en el antibiograma o por determinacin de la CIM. Disco de Eritromicina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Eritromicina es tambin vlido para Azitromicina, Roxitromicina y Claritromicina. 9.7 CEPA DE REFERENCIA PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
c.
d.
9.6.2.2
SECCIN 10
ANTIBIOGRAMA DE Streptococcus spp
10.1
MEDIO DE CULTIVO Agar Mueller Hinton con 5% sangre de carnero. NOTA: No aplicar ms de 9 discos en las placas de 150 mm, ni ms de 5 en las placas de 100 mm.
10.2
INOCULO Suspensin directa de la colonia (a partir de una placa de agar sangre de carnero incubada 16 18 horas). Ajustar a la turbidez equivalente al estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland.
38
10.3 10.3.1 10.3.1.1 10.3.1.2 10.3.1.3 10.3.1.4 10.3.1.5 10.3.2 10.3.2.1 10.3.2.2 10.3.2.3 10.3.2.4 10.3.2.5 10.3.3 10.3.3.1 10.3.3.2 10.4
DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA Grupo I: Ampicilina o Penicilina G (solo para Estreptococos betahemolticos) Eritromicina Clindamicina Cefotaxima o Ceftriaxona Cloramfenicol Grupo II: Levofloxacina (solo para estreptococos betahemolticos) Ofloxacina (solo para estreptococos betahemolticos) Cefepime Vancomicina Teicoplanina Resistencias Naturales: Los Estreptococos son resistentes a Aztreonam y Pefloxacina. Los Estreptococos presentan una resistencia de bajo nivel a los Aminoglucsidos. INCUBACIN 35C en atmsfera de 5% de CO2.
10.5
LECTURA 20 24 h
10.6 10.6.1
39
Tabla 9. Antibiticos y Dimetros Crticos para Streptococcus spp (excepto Neumococo)

ANTIMICROBIANO PENICILINAS Ampicilina (beta hemoliticos) Penicilina CEFALOSPORINAS Cefotaxima (beta hemolticos)30 g Cefotaxima (viridans) Ceftriaxona (beta hemolticos) Ceftriaxona (viridans) Cefepime (beta hemolticos) Cefepime (viridans) GLICOPEPTIDOS Vancomicina Teicoplanina* MACROLIDOS Eritromicina LINCOSAMIDAS Clindamicina QUINOLONAS Levofloxacina Ofloxacina OTROS Cloramfenicol CONTENIDO DEL DISCO 10 g 10 unidades 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g 15 g 2 g 5 g 5 g 30 g DIAMETRO EN mm I 26-27 25-26 22-23 16-20 16-18 14-16 13-15 18-20
R 25 24 15 15 13 12 17
S 24 24 24 28 24 27 24 24 17 17 21 19 17 16 21
* Concentraciones crticas adaptadas del CFA SFM 2000 2001.
10.6.2 10.6.2.1 a) b) c)
Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma Discos de Penicilina - Ampicilina: La interpretacin del resultado de estos discos es solo vlida para los Streptococcus beta - hemolticos. Para el estudio de la sensibilidad a Penicilina del Streptococcus viridans aislado de lquidos normalmente estriles debe determinarse la CIM. Las cepas sensibles a Penicilina deben ser consideradas sensibles igualmente a: Amoxicilina, Amoxicilina/cido Clavulnico, Ampicilina/Sulbactam, Cefalotina, Cefaclor, Cefazolina, Cefradina, Cefuroxima, Cefotaxima, Ceftriaxona, Loracarbef, Cefepime, Imipenem y Meropenem. Disco de Eritromicina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Eritromicina es tambin vlido para Azitromicina, Roxitromicina y Claritromicina.
10.6.2.2
10.6.2.3
Discos de Ofloxacina y Levofloxacina: La interpretacin del resultado de estos discos es solo vlida para los Streptococcus beta - hemolticos.
10.7
CEPA DE REFERENCIA PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
SECCIN 11
ANTIBIOGRAMA DE Haemophilus spp. 11.1 11.1.1 MEDIO DE CULTIVO Haemophilus test medium (HTM). Ver Anexo C para su preparacin. NOTA: No aplicar ms de 9 discos en las placas de 150 mm, y ni ms de 5 en las placas de 100 mm. 11.2 11.2.1 INOCULO Suspensin directa de la colonia en caldo Mueller Hinton o solucin salina al 0,9 % a partir de un cultivo en agar chocolate de 20 24 h de incubacin. Ajustar a la turbidez equivalente al estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland. NOTA: No preparar inculos densos superiores a 0,5 de la escala de Mc. Farland, especialmente con H. influenzae productores de betalactamasas, que pueden conducir a resultados falsamente resistentes a las cefalosporinas. 11.3 11.3.1 11.3.1.1 11.3.1.2 11.3.1.3 11.3.1.4 11.3.1.5 11.3.1.6 11.3.1.7 11.3.2 11.3.2.1 11.3.2.2 11.3.2.3 11.3.2.4 11.3.2.5 11.3.2.6 11.3.2.7 11.3.2.8 DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA Grupo I: Ampicilina Ampicilina/Sulbactam o Amoxicilina/cido Clavulnico Cefaclor Cefuroxima Ceftriaxona o Cefotaxima Cotrimoxazol (Trimetoprim/Sulfametoxazol) Cloramfenicol Grupo II: Cefixima. Cefepime Aztreonam Azitromicina o Claritromicina Levofloxacina o Ciprofloxacina o Moxifloxacina u Ofloxacina Rifampicina Tetraciclina Meropenem
41
11.3.3
Resistencias Naturales: Los Haemophilus son resistentes a Clindamicina y Lincomicina.
11.4
INCUBACIN 35C en atmsfera de 5% de CO2
11.5 11.5.1 11.5.2 11.6 11.6.1
LECTURA 16 18 h Al realizar la medicin del halo de inhibicin no considerar la zona de desarrollo dbil o de pequeas colonias que pueden encontrarse cercanas al borde neto del halo. INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS CRTICOS Antibiticos y dimetros crticos
Tabla 10. Antibiticos y Dimetros Crticos para Haemophilus spp
ANTIMICROBIANO CONTENIDO DEL DISCO R 18 19 19 16 16 16 10 25 25 10 16 DIAMETRO EN mm I 19-21 17-19 17-19 17-19 11-12 26-28 26-28 11-15 17-19 S 22 20 20 20 20 20 26 26 21 26 20 26 12 13 17 21 18 16 29 29 16 20
PENICILINAS Ampicilina 30 g COMBINACIN DE PENICILINA/ INHIBIDOR DE BETALACTAMASAS Ampicilina/Sulbactam 10/10 g Amoxicilina/cido Clavulnico 20/10 g CEFALOSPORINAS Cefaclor 30 g Cefuroxima sdica (parenteral) 30 g Cefuroxima sdica (oral) 30 g Cefotaxima 30 g Ceftriaxona 30 g Cefixima 5 g Cefepime 30 g CARBAPENEMS Meropenem 10 g MONOBACTAMS Aztreonam 30 g MACRLIDOS Azitromicina 15 g Claritromicina 15 g QUINOLONAS Levofloxacina 5 g Ciprofloxacina 5 g Moxifloxacina 5 g Ofloxacina 5 g TETRACICLINA Tetraciclina 30 g OTROS Cloramfenicol 30 g Trimetoprim/sulfametoxazol 1,25/23,75g Rifampicina 5 g
42
11.6.2 11.6.2.1 a. b.
Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma Disco de Ampicilina: El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Ampicilina es tambin vlido para Amoxicilina. Para detectar una posible resistencia a Ampicilina y Amoxicilina por produccin de una betalactamasa recomendamos la realizacin del test de la nitrocefina. Una resistencia a Ampicilina con un test de nitrocefina negativo obliga a informar la cepa como resistente a Amoxicilina, Ampicilina/Sulbactam, Amoxicilina/cido Clavulnico, Cefaclor y Cefuroxima, a pesar de una aparente actividad in vitro. Cepas de referencia para el control de calidad interno Haemophilus influenzae ATCC 49247 Haemophilus influenzae ATCC 49766 E. coli ATCC 35218 (para combinaciones de betalactmicos e inhibidores de betalactamasas
c.
11.7 11.7.1 11.7.2 11.7.3
SECCIN 12
ANTIBIOGRAMA DE Vibrio cholerae 12.1 MEDIO DE CULTIVO Agar Mueller Hinton 12.2 INOCULO Mtodo del crecimiento o suspensin directa de la colonia. Ajustar a la turbidez equivalente al estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland. 12.3 12.3.1 12.3.1.1 12.3.1.2 12.3.1.3 12.3.1.4 12.3.1.5 DISCOS DE SENSIBILIDAD A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA Grupo I: Ampicilina Cloramfenicol Cotrimoxazol (Trimetoprim/Sulfametoxazol) Tetraciclina Adems, pueden incluirse otros antibiticos ausentes en la lista segn necesidades de la vigilancia de resitencia antimicrobiana.
43
12.3.2 12.3.2.1 12.4
Resistencias Naturales: Son resistentes a Penicilina, Oxacilina, Macrlidos, Clindamicina y Glicopptidos. INCUBACIN 35C
12.5
LECTURA 16 18 h
12.6 12.6.1
Tabla 11. Antibiticos y Dimetros Crticos para V. cholerae

ANTIMICROBIANO PENICILINAS Ampicilina TETRACICLINA Tetraciclina OTROS Cloramfenicol Trimetoprim/sulfametoxazol CONTENIDO DEL DISCO 10 g 30 g 30 g 1.25/23.75g DIAMETRO EN mm I 14-16 15-18 13-17 11-15
R 13 14 12 10
S 17 19 18 16
12.6.2 12.6.2.1
Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma Disco de Ampicilina: Es la clase representativa de la Ampicilina y Amoxicilina.
12.6.2.2
Disco de Tetraciclina: Los resultados con discos de Tetraciclina pueden ser usados para predecir la sensibilidad a la Doxiciclina.
12.7 12.7.2 12.7.2.1
Cepas de Referencia para el control de calidad interno Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli ATCC 35218 (para combinaciones de betalactmicos e inhibidores de betalactamasas).
44
SECCIN 13
CONTROL DE CALIDAD INTERNO Incluye la descripcin de las especificaciones que se deben aplicar para verificar la validez y confiabilidad de los resultados de las pruebas de sensibilidad. 13.1 13.1.1 CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Apariencia de los medios: Observar cualquier signo de deterioro, como: evidencias de deshidratacin, cambio de color, escaso volumen, etc. 13.1.2 Control de calidad de desarrollo bacteriano: Controlar el crecimiento de las bacterias a evaluar y que muestre resultados aceptables en pruebas de sensibilidad. Utilizar cepas referenciales. 13.1.3 Control de esterilidad: Tomar el 5-10% del total del lote producido, e incubar en estufa de 35C durante 48 h. Luego, observar cualquier presencia de contaminacin, si ste fuera significativo (>10% del medio controlado) descartar el lote completo. Adems se debe descartar todo medio utilizado. 13.1.4 Control de pH: Controlar todo lote preparado (autoclavado) ya fro y a temperatura ambiente. 13.1.5 13.1.6 Control de la profundidad del agar: Medir la profundidad introduciendo un elemento fino y estril, el cual tenga una marca en 3 y 5 mm de uno de sus extremos. Contenido de calcio y magnesio: Utilizar la cepa de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. 13.1.7 Contenido de timidina: Realizar pruebas de sensibilidad con Enterococcus faecalis ATCC 29212 y discos de trimeoprim/ sulfametoxazol. Se debe obtener un halo 20 mm. 13.2 13.2.1 13.2.2 13.2.3 13.2.4 Cepas de referencia para controles de calidad (Tabla 12) Staphylococcus. aureus (ATCC 25923) Escherichia coli (ATCC 25922) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) Enterococcus faecalis (ATCC 29212)
45
13.2.5 13.2.6 13.2.7 13.2.8
Escherichia coli (ATCC 35218) Haemophilus influenzae (ATCC 49247) Haemophilus influenzae (ATCC 49766) Streptococcus pneumoniae (ATCC 49619)
Tabla 12. Cepas referenciales para control de calidad de los discos de sensibilidad
CEPA Staphylococcus aureus ATCC 25923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 FACTORES A EVALUAR
Calidad de la prueba de sensibilidad Concentracin de cationes pH Frente a la presencia de doble halo alrededor del
disco de imipenem cambiar el lote de Mueller Hinton
Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli 35218
Calidad de la prueba de sensibilidad Calidad de la prueba de sensibilidad de los discos

que contengan la combinacin de Betalactmicos inhibidores de beta-lactamasas (Clavulanato, Sulbactam o Tazobactam).
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Deteccin de altos niveles de inhibidores de

trimetoprim y sulfonamidas en el medio Mueller Hinton (timidina) Control de los discos de alta carga de aminoglucsidos.
13.3 13.3.1
PROCEDIMIENTOS CON LAS CEPAS DE REFERENCIA Trabajar segn el procedimiento previamente descrito y usando los mismos materiales y mtodos empleados para evaluar las cepas clnicas. Conservar las cepas de referencia de trabajo diario en agar tripticasa soja, agar nutritivo (bacterias no exigentes) o en agar chocolate enriquecido (bacterias exigentes) a 4C y 8C, realizar subcultivos semanales, y reemplazar los cultivos de trabajo al menos mensualmente, a partir de los cultivos congelados, liofilizados o comerciales. Los cultivos stock pueden ser almacenados a una temperatura 20C (de preferencia a 60C o en nitrgeno lquido) en caldo 50% de suero fetal bovino o TSB con 10-15% glicerol, sangre desfibrinada de carnero o leche descremada. Antes de evaluar las cepas con los antimicrobianos deben ser subcultivadas en placas de agar para tener colonias aisladas. Si se parte de cultivos congelados o liofilizados, stos deber ser sub-cultivados antes de ser utilizados como controles de calidad.
13.3.2
13.3.3
13.3.4
46
13.4
LMITES DE LOS DIMETROS DE LOS HALOS DE INHIBICIN PARA EL CONTROL DE CALIDAD En la Tabla 13 se enumeran los dimetros mnimos y mximos de los halos que deben ser observados en las pruebas de control de calidad. La eficiencia del sistema debe ser controlada utilizando estos lmites.
Tabla 13. Lmites aceptables (mm) de los Dimetros de los Halos de Inhibicin Lmites de Control en Pruebas de Disco Difusin
ANTIMICROBIANO CONTENIDO DEL DISCO 30 mg 20/10 mg 10 mg 10/10 mg 15 mg 30 mg 30 mg 30 mg 30 mg 30 mg 5 mg 75 mg 30 mg 30 mg 30 mg 30 mg 30 mg 30 mg 5 mg 2 mg 30 mg 15 mg 5 mg 10 mg 300 mg 10 mg 120 mg 10 mg 30 mg 5 mg 10 mg 30 mg 300 mg 10 mg 5 mg 1 mg 10 unidades 5 mg 10 mg 30 mg 30 mg 1.25/23.75 mg 30 mg Escherichia coli ATCC 25922 19-26 19-25 16-22 20-24 28-36 23-27 15-21 23-29 29-35 23-27 28-34 29-35 23-29 25-32 29-35 20-26 21-27 30-40 18-24 30-38 12-20 19-26 26-32 17-25 29-37 28-34 22-28 20-25 28-35 29-33 8-10 12-20 18-25 24-32 Staphylococcus aureus ATCC 25923 20-26 28-36 27-35 29-37 21-26 27-31 29-37 29-35 23-29 24-33 25-31 23-29 16-20 22-28 27-35 19-26 22-30 24-30 23-29 22-30 27 33 14-22 19-27 19-26 25-30 29-37 18-22 17-28 24-28 18-24 26-37 26-34 14-22 15-21 24-30 24-32 17-21 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 18-26 23-29 24-30 23-29 18-22 22-29 17-23 25-33 21-29 16-21 20-28 19-26 27-33 22-29 17-21 Escherichia coli ATCC 5218 18-22 13-19 Enterococcus faecalis ATCC 25212 14-19 16-22 -
Amikacina Amoxicilina/cido clavulnico Ampicilina Ampicilina/sulbactam Azitromicina Aztreonam Cefaclor Cefalotina Cefazolina Cefepime Cefixima Cefoperazona Cefotaxima Cefoxitina Ceftazidima Ceftriaxona Cefuroxima Cloranfenicol Ciprofloxacina Clindamicina Doxiciclina Eritromicina Esparfloxacina Estreptomicina Estreptomicina Gentamicina Q Gentamicina Imipenem Kanamicina Levofloxacina Meropenem Acido Nalidxico Nitrofurantona Norfloxacina Ofloxacina Oxacilina Penicilina Rifampicina Estreptomicina Q Teicoplanina Tetraciclina Trimetoprim/Sulfametoxazol Vancomicina
13.5 13.5.1 13.5.1.1
FRECUENCIA DE LOS CONTROLES Control diario (Ver Figura 2) Para cada combinacin bacteria/antimicrobiano solo uno de cada 20 ensayos consecutivos puede estar fuera del los lmites permitidos en caso contrario, se requieren acciones correctivas.
PRUEBA DIARIA
CONTINUAR CON LAS PRUEBAS DIARIAS
SI
1/20 FUERA DEL RANGO ACEPTABLE
NO
ACCIONES CORRECTIVAS
REPETIR LA PRUEBA EL MISMO DIA
SI
RAZON: ERROR OBVIO
NO
ACCIONES CORRECTIVAS INMEDIATAS
RESULTADOS DENTRO DEL RANGO: CONTINUAR CON LAS PRUEBAS DIARIAS
REPETIR LA PRUEBA EL MISMO DIA, POR 5 DIAS CONSECUTIVOS
CONTINUAR CON LAS PRUEBAS DIARIAS
SI
RESULTADOS DENTRO DEL RANGO E ACEPTABL
NO
ACCIONES CORRECTIVAS ADICIONALES
INVESTIGAR POSIBLE FUENTE DEL ERROR
Figura 2. Protocolo de Control de Calidad Diario
13.5.2 13.5.2.1 13.5.2.2 13.5.2.3
Control semanal (Ver Figura 3) Primero hay que demostrar una eficiencia satisfactoria para las pruebas diarias. Trabajar con todas las cepas controles durante 30 das consecutivos y registrar los resultados. Para pasar del control diario al semanal, no ms de tres de cada 30 dimetros de inhibicin obtenidos diariamente (es decir, durante 30 das consecutivos de ensayos) pueden estar fuera de los lmites aceptables para cada combinacin bacteria/antimicrobiano (Ver Tabla 10). Luego de ello, se puede implementar el control de calidad semanal. Continuar con el control de calidad una vez por semana y cada vez que se cambie algn reactivo involucrado en el procedimiento. Si uno de los controles semanales resulta fuera del rango aceptable se requiere acciones correctivas. NOTA: Si se adiciona un nuevo antimicrobiano, ste debe ser probado por 30 das consecutivos y se debe documentar su correcto comportamiento.
13.5.2.4 13.5.2.5
PRUEBAS DURANTE 30 DIAS CONSECUTIVOS <= 3/30 RESULTADOS : FUERA DEL RANGO ACEPTABLE
IMPLEMENTAR CONTROLES SEMANALES
CONTINUAR CON LAS PRUEBAS SEMANALES
NO
AL MENOS1 DE LAS PRUEBAS SEMANALES FUERA DEL
SI
SI
RAZON: ERROR OBVIO
NO
CONTINUAR CON SI LAS PRUEBAS SEMANALES
RESULTADOS DENTRO DEL RANGO
NO
ACCIONES CORRECTIVAS INMEDIATAS
NO
REPETIR LA PRUEBA EL MISMO DIA, POR 5
DIAS CONSECUTIVOS
SI
SI CONTINUAR CON LAS PRUEBAS SEMANALES
TODOS LOS RESULTADOS DENTRO DEL RANGO ACEPTABL E
NO
ACCIONES CORRECTIVAS ADICIONALES
INVESTIGAR POSIBLE FUENTE DEL ERROR
Figura 3. Protocolo de Control de Calidad Semanal

NOTA: Las Normas NCCLS sugieren un control de calidad diario y semanal. De no tener las facilidades se sugiere un control de calidad mensual, debiendo incrementar la frecuencia del mismo de acuerdo a las posibilidades del laboratorio. Pero, se debe realizar por lo menos un control de calidad quincenal para los siguientes antibiticos: Oxacilina, imipenem, meropenem y beta-lacatamicos/ inhibidores de beta-lactamasa.
13.5.3. 13.5.3.1
Control Mensual (Ver Figura 4) Se sugiere cuando no se puede realizar el control de calidad semanal. Primero hay que demostrar eficiencia satisfactoria para las pruebas diarias. Trabajar con todas las cepas controles durante 20 das consecutivos y registrar los resultados. Para pasar de control diario a mensual todos los 20 dimetros de zonas de inhibicin obtenidos diariamente (es decir, durante 20 das consecutivos de ensayos) deben estar dentro de los lmites aceptables para cada combinacin bacteria/antimicrobiano enumerados en la Tabla 13. Registrar los resultados.
13.5.3.2 13.5.3.3
13.5.3.4
Continuar con el control de calidad una vez al mes (excepto los que deben realizarse al menos quincenalmente) y cada vez que se cambie algn reactivo involucrado en el procedimiento. Si uno o ms de los controles mensuales resulta fuera del rango aceptable se requieren acciones correctivas. NOTA: Si se adiciona un nuevo antimicrobiano, ste debe ser probado por 20 das consecutivos y se debe documentar su correcto comportamiento.
PRUEBAS DURANTE 20 DIAS CONSECUTIVOS TODOS LOS RESULTADOS ESTAN DENTRO DEL RANGO ACEPTABLE
13.5.3.5
IMPLEMENTAR CONTROLES MENSUALES
CONTINUAR CON LAS PRUEBAS MENSUALES
SI
AL MENOS 1 DE LAS PRUEBAS MENSUALES FUERA DEL RANGO
NO
SI
RAZON: ERROR OBVIO
NO
SI
RESULTADOS DENTRO DEL RANGO
NO CORRECTIVAS
INMEDIATAS
ACCIONES
NO
REPETIR LA PRUEBA EL MISMO DIA, POR 5 DIAS CONSECUTIVOS
SI
SI
TODOS LOS RESULTADOS DENTRO DEL RANGO ACEPTABLE
NO
ACCIONES CORRECTIVAS ADICIONALES INVESTIGAR POSIBLE FUENTE DEL ERROR
Figura 4. Protocolo sugerido para un control de calidad mensual
13.6 13.6.1
ACCIONES CORRECTIVAS Los resultados pueden ser debidos a errores obvios como usar discos o cepas equivocadas, condiciones de incubacin incorrectas etc. Si al repetir la prueba, el resultado cae dentro del rango, entonces no se requiere acciones correctivas. Si no hay una razn obvia que justifique el resultado fuera de los rangos aceptables se debe tomar una accin correctiva inmediata.
50
13.6.2 13.6.2.1 13.6.2.2
Accin correctiva inmediata: Probar la combinacin bacteria/antimicrobiano el da que se observ el error y monitorear durante cinco das consecutivos. Documentar los resultados. Si para cada combinacin bacteria/antimicrobiano, todos los 5 dimetros de zonas de inhibicin (durante cinco das consecutivos de pruebas) estn dentro de los lmites controles establecidos (Tabla 10) no se necesitan ms acciones correctivas. Si uno o ms de los dimetros permanecen fuera de los rangos aceptables entonces se requiere de accin correctiva adicional. Se debe continuar con las pruebas diarias hasta que se resuelva totalmente el problema. Accin correctiva adicional: Cuando las acciones correctivas no resuelven el problema, probablemente se deba al sistema o un error al azar. Entonces, verificar lo siguiente:
13.6.2.3 13.6.2.4 13.6.3
13.6.3.1 13.6.3.2 13.6.3.3 13.6.3.4 13.6.3.5 13.6.3.6 13.6.3.7 13.6.3.8 13.6.4
Si los dimetros fueron medidos o transcritos correctamente. Examinar la turbidez estndar antes de ser usados, las fechas de vencimiento de los insumos, condiciones de almacenamiento y homogeneizacin. Verificar que los medios y discos empleados no estn fuera de la fecha de expiracin. Verificar la temperatura y atmsfera de la incubadora. Verificar el correcto funcionamiento de otros equipos empleados. Verificar el correcto almacenamiento de los discos (con desecadores y a temperatura adecuada). Verificar la pureza de la cepa y que no haya cambiado. Verificar la preparacin y ajuste de la suspensin del inculo. Una vez que el problema sea corregido, para volver al control de calidad mensual, se debe documentar el comportamiento satisfactorio de las pruebas de control diario por otros 20 das consecutivos. NOTA: Puede ser necesario utilizar una nueva cepa de control de calidad (del congelado o de una fuente confiable) y nuevos lotes de medios y reactivos posiblemente de distinto fabricante (incluyendo un nuevo estndar de turbidez). En algunos casos puede ser til intercambiar cepas de control de calidad y materiales con otro laboratorio que utilice la misma metodologa. Si el problema parece estar relacionado con un determinado fabricante, se debe establecer el contacto.
SECCIN 14
REGISTROS Descripcin del registro que se debe conservar para demostrar el cumplimiento o aplicacin de las especificaciones contenidas en el presente Manual (Ver Anexo G).
ANEXO A CLASIFICACIN DE LOS ANTIBITICOS ACTUALMENTE DISPONIBLES EN EL PER (A EXCEPCIN DE LOS ANTIMICOBACTERIANOS) BETALACTMICOS: Penicilinas: Penicilinas naturales: - Penicilina G - Penicilina V Penicilinas antiestafiloccicas: - Oxacilina - Cloxacilina - Dicloxacilina Aminopenicilinas: - Ampicilina - Amoxicilina Penicilinas asociadas a inhibidores de betalactamasas: - Ampicilina/Sulbactam - Amoxicilina/cido Clavulnico - Amoxicilina/Sulbactam Cefalosporinas: Cefalosporinas de primera generacin: Cefalotina Cefazolina Cefadroxilo Cefradina Cefalexina
Cefalosporinas de segunda generacin: Cefaclor Cefuroxima Loracarbef
Cefalosporinas de tercera generacin: Cefotaxima Cefixima

Ceftriaxona Ceftazidima Cefpodoxima
Cefalosporinas de cuarta generacin: Cefpirome Cefepime
Cefalosporinas asociadas a inhibidores de betalactamasas: Cefoperazona/Sulbactam
Monobactams: Aztreonam
Carbapenems: Imipenem Meropenem
AMINOGLUCSIDOS: Gentamicina Tobramicina Kanamicina Amikacina Neomicina Netilmicina Espectinomicina (AMINOCICLITOL)
QUINOLONAS: cido Nalidxico cido Pipemdico Enoxacina
FLUOROQUINOLONAS: Norfloxacina Ofloxacina Pefloxacina Ciprofloxacin Levofloxacina Esparfloxacina Moxifloxacina
53
MACRLIDOS: Eritromicina Roxitromicina Claritromicina Azitromicina
LINCOSAMIDAS: Lincomicina Clindamicina
OXAZOLIDINONAS: Linezolide
GLICOPPTIDOS: Vancomicina Teicoplanina
TETRACICLINAS: Oxitetraciclina Clortetraciclina Doxiciclina Minociclina
SULFONAMIDAS: OTROS: Cloramfenicol Rifampicina Metronidazol Fosfomicina Trometamol Cotrimoxazol Sulfisoxazol (en asociacin) Sulfametoxazol (en asociacin) Sulfametizol (en asociacin) Sulfacetamida Sulfadiazina Sulfatiazol
54
ANEXO B CUADRO RESUMEN DE LAS CONDICIONES Y CARACTERISTICAS PARA EL METODO DE KIRBY BAUER
MICROORGANISMO MEDIO INOCULO CONDICIONES DE INCUBACION 35C En aire atmosfrico 35C En aire atmosfrico TIEMPO DE INCUBACION 16 18 h. CEPAS CONTROL E. coli ATCC 25922 E. coli ATCC 35218 (para combinaciones de b lactam/ inhibidores de b -lactamasas) P. aeruginosa ATCC 25922 E. coli ATCC 35218 (para combinaciones de b lactam/ nhibidores de b -lactamasas Staphylococcus aureus ATCC 25923 E. coli ATCC 35218 (para combinaciones de b lactam/ nhibidores de b -lactamasas Staphylococcus aureus ATCC 25923 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Haemophilus influenzae ATCC 49247 Haemophilus influenzae ATCC 49766 E. coli ATCC 35218 (para combinaciones de b lactam/ inhibidores de b -lactamasas E. coli ATCC 25922
Enterobacteriaceae
Agar Mueller Hinton
Mtodo de crecimiento o Suspensin directa de la colonia Mtodo de crecimiento o Suspensin directa de la colonia
Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp
Agar Mueller Hinton
16 18 h.
Staphylococcus spp
Agar Mueller Hinton
Suspensin directa de la colonia
Enterococcus spp Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus Haemophilus spp
Mtodo de crecimiento o Suspensin directa de la colonia Agar Mueller Hinton con 5% Suspensin directa de la colonia sangre de carnero Haemophilus test medium Suspensin directa de la colonia (HTM) Agar Mueller Hinton Mtodo de crecimiento o Suspensin directa de la colonia
Agar Mueller Hinton
16 18 h. 35C 24 h para oxacilina, En aire atmosfrico meticilina, nafcilina y vancomicina 35C 16 18 h. En aire atmosfrico 24 h para vancomicina 35C 20 24 h 5% CO2 35C 5% CO2 35C En aire atmosfrico 16 18 h.
Vibrio cholerae
16 18 h
ANEXO C MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS RECOMENDACIONES
C.1. MEDIO MUELLER HINTON: Composicin por litro de medio de cultivo: Infusin de carne 300 g Acido casamino 17,5 g Almidn 1,5 g Agar 17 g
C.2. MEDIO HTM: Composicin: Agar Mueller Hinton b - NAD (b-nicotina adenine dinucleotide Hematina bovina Extracto de levadura pH 7,2 7,4
1L 15 mg/mL 15 mg/mL 5 mg/mL
Preparacin: Solucin stock fresca de hematina: Disolver 50 mg de hematina en 100 mL de NaOH 0,01 N (0,01 mol/L) con calor y agitacin hasta que el polvo est totalmente disuelto.
55
Solucin stock de NAD: Disolver 50 mg de NAD en 10 mL de agua destilada. Esterilizar por filtracin utilizando filtro de nitrocelulosa de 0,22 m de poro. Medio Base: Preparar 1 L de medio adicionando 5 gr de extracto de levadura. Autoclavar por 15 min a 1.5 atm. Agregar 3 mL de la solucin stock de hematina y 3 mL de una solucin stock de NAD a 1 L de Agar Mueller Hinton con 5 g de extracto de levadura licuado y a una temperatura no mayor de 50 C.
C.3 RECOMENDACIONES: C.3.1. MEDIO pH: Se debe controlar el pH del medio de cada lote de preparacin. Un pH fuera del rango de 7.2 a 7.4 a temperatura ambiente puede afectar la sensibilidad de la prueba. Algunos antibiticos parecen perder potencia mientras que en otros los efectos opuestos son posibles si el pH es demasiado alto. Espesor del medio: Es importante que el medio alcance en la placa un espesor uniforme de 4 mm. Si es ms fino dar una falsa sensibilidad y ,si es ms grueso, dar una falsa resistencia. Humedad Las placas deben mantenerse hmedas pero sin mostrar gotas sobre su superficie. El exceso de humedad debe ser eliminado incubndolas a 35C durante 10-30 min. Almacenamiento Las placas de Mueller Hinton pueden conservarse en el refrigerador (2C 8C) hasta 1 semana sin precauciones particulares. Si el tiempo de conservacin debe superar los 7 das se recomienda sellarlas con parafilm y guardarlas en bolsas de plstico para evitar la desecacin del agar (2C 8C). Efecto de la timina o timidina: La excesiva cantidad de timina o timidina en los medios pueden revertir los efectos inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprim, produciendo as zonas mas pequeas, no tan ntidas o sin halo dando una falsa resistencia en la lectura. Se debe evaluar cada lote de Mueller Hinton en su contenido de timidina utilizando la cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212 o ATCC 33186 y probndola con discos de cotrimoxazol. Se debe obtener un halo de inhibicin claro y definido de 20 mm o ms. Efectos por variacin en la composicin de cationes divalentes: La variacin en cationes divalentes principalmente Ca++ y Mg++ afectarn los resultados con tetraciclina y aminoglucsidos frente a P. aeruginosa. Un exceso de dichos cationes reducirn las zonas de inhibicin, y bajas concentraciones aumentarn las zonas de inhibicin. El exceso de zinc podra reducir las zonas de inhibicin de los carbapenems. Los resultados de las pruebas con las cepas patrones deben estar de acuerdo con los lmites de control referidos en la Tabla 10.
56
C.3.2. DISCOS: Conservacin y uso: Los discos para antibiograma individuales o en multidiscos deben conservarse en refrigeracin a 8C o ser congelados a 14C (o a temperaturas an menores). Los discos para antibiograma nunca deben ser utilizados ms all de su fecha de expiracin. Los discos que contienen un antibitico betalactmico deben ser almacenados en el congelador para mantener su potencia. Una pequea cantidad de discos y/o multidiscos que sern usados en el trabajo diario pueden ser solo refrigerados. Retirar los envases del refrigerador o del congelador una o dos horas antes de usarlos y dejarlos atemperar antes de abrirlos. Reemplazar los cartuchos cuando el indicador del desecador usado cambia de color, el cual se interpreta como un exceso de humedad. Una vez colocados los discos y multidiscos en el agar stos no deben retirarse, debido a que algunos antibiticos difunden casi instantneamente. Dar preferencia al uso de discos y multidiscos para antibiograma que han pasado por los controles de calidad del INS.
ANEXO D DETECCION DE BETALACTAMASAS: METODO DE NITROCEFIN PRINCIPIO: Se basa en el cambio qumico producido en la molcula de cefalosporina al ser hidrolizado el anillo beta lactamico por estas enzimas. El disco de nitrocefin muestra un rpido cambio de color de amarillo a rojo cuando la prueba es positiva. PROCEDIMIENTO: Seguir las instrucciones del fabricante. CONTROL DE CALIDAD: Se debe utilizar cepas referenciales para realizar el control de calidad de la prueba como:
Tabla D1. Cepas referenciales
Cepa Staphylococcus aureus ATCC 29213 Haemophilus influenzae ATCC 10211
Resultado esperado Positivo Negativo
57
ANEXO E TCNICAS PARA LA OBTENCIN DE LA CONCENTRACIN INHIBITORIA MNIMA E.1. E-TEST Es una tcnica cuantitativa para la determinacin de la susceptibilidad antimicrobiana de enterobacterias, Pseudomonas, Staphylococcus, Enterococcus, Haemophilus, y est basado en los mtodos de dilucin y difusin. Condiciones Tcnicas Generales: Se describir el procedimiento para las bacterias y antimicrobianos recomendados en el presente manual. Materiales y Reactivos: Tiras E-test Placas petri (90-100 mm o 150 mm) Medio de cultivo (recomendado por la NCCLS para las pruebas de sensibilidad de acuerdo al microorganismo a estudiar) Solucin fisiolgica 0,85% Caldo Mueller Hinton (para Haemophilus influenzae o Streptococcus pneumoniae). Pinza estril o aplicador de la tira Hisopo estril Incubadora a 35C
Medio: La profundidad del agar debe ser de 4mm ( 0.5 mm) y el pH de 7.2 7.4. Seguir el procedimiento descrito en la seccin 3.4. Preparar el medio con los suplementos necesarios de acuerdo a la bacteria a estudiar. Estndar para la preparacin del inculo: Se usa una suspensin de sulfato de bario (0,5 de la escala de Mac Farland) como estndar. Para su prepara cin ver la seccin 34.3
Preparacin del inculo: Seguir las recomendaciones de la seccin 34.4 considerando el siguiente cuadro:
Tabla E1. Resumen de los medios, inoculo y condiciones de incubacin recomendados para realizar el E-test
Aerobios Medio de cultivo Suspensin del inculo Temperatura de incubacin Atmosfera Tiempo 48 hr MRSE Mueller Hinton 0.85% ClNa 35C Aire atmosfrico 16 20 hr 20 24 hr MRSA/MRSE Mueller Hinton + 2% ClNa 0.85% ClNa 35C Aire atmosfrico 24 hr MRSA S. pneumoniae Mueller Hinton + 5% sangre de carnero Caldo Mueller Hinton 35C 5% CO2
58
Inoculacn de las Placas: Seguir los procedimientos descritos en la seccin 3.5. Dejar que absorba toda la humedad por 10 15 minutos, de tal manera que la superficie quede completamente seca antes de colocar las tiras.
Aplicacin de las Tiras: Retirar la caja de la congeladora y dejar que tome temperatura ambiente (aproximadamente 30 minutos). Colocar las tiras sobre la superficie del agar con una pinza o aplicador, asegurndose que la escala de la CIM est hacia arriba y que la mxima concentracin este hacia el borde de la placa. Dejar que toda la superficie de la tira est en contacto completo con la superficie del agar. Colocar de 4 6 tiras en las placas de 150 mm (Se puede usar un molde para distribuirlos uniformemente en la placa). Colocar 1 2 tiras en las placas de 90 mm - 100 mm. Para microorganismos de crecimiento difcil como S. pneumoniae, en el cual puede sospecharse que es muy sensible a ciertos antibiticos, usar menos tiras por placa.
NOTA: Si se observa algunas burbjas (entre la tira y el agar), retirarlos presionando suavemente en la tira con la ayuda de una pinza. Una vez colocada la tira, sta no puede ser retirada porque el antibitico difunde inmediatamente en el agar. Incubacin: Seguir las recomendaciones de la Tabla E1. Lectura e Interpretacin de Resultados: Realizar la lectura despus del perodo de incubacin recomendado (Tabla E1) slo si se observa desarrollo visible. El valor de la CIM se lee donde la elipse de inhibicin intersecta la escala en el borde de la tira. Si se observa crecimiento a lo largo de toda la tira (no se observa ninguna elipse) se debe interpretar como mayor (>) que el valor ms alto de la escala de lectura. Cuando la elipse de inhibicin est por debajo de la tira (es decir, cuando el borde lmite no intersecta la tira, el CIM debe ser reportado menor (<) que el valor mas bajo de la escala de lectura. Usualmente los puntos de corte son agudos pero, cuando muestran diferentes patrones se debe seguir las recomendaciones del laboratorio fabricante para realizar la lectura e interpretacin. No realizar la lectura si el cultivo pareciera tener algn contaminante, o el crecimiento es muy pobre o abundante. En esos casos repetir la prueba. Una CIM por E test que cae entre dos diluciones debe ser redondeado a la dilucin ms alta antes de categorizarla. Ej: si los puntos de corte de la CIM para Ampicilina en mg/mL son: S 8 I 16 R 32
Una CIM por E test de 16 mg/mL es reportado como intermedio (I), mientras que 24 mg/mL se redondea a 32 mg/mL y se categoriza como resistente (R).
59
Control de Calidad: El procedimiento es satisfactorio si los valores de la CIM obtenidos estn dentro de las especificaciones de control de calidad que da el fabricante. No se debe reportar ningn resultado si se observan valores fuera de los rangos establecidos. La frecuencia del control de calidad debe ser establecido por el personal de laboratorio, considerando la gua que proporciona las normas de la NCCLS. Peridicamente, se deben realizar cuentas para verificar que la suspensin contiene el nmero correcto de clulas viables en UFC/mL. Ej.: Diluir 1:1000 la suspensin del inculo y subcultivar 1 ml en los medios descritos en la Tabla E1, y hacer el recuento. Un inculo aceptable dar aproximadamente 100 a 500 colonias (1 5 x 108 UFC/mL).
E.2. METODO DE MACRODILUCION EN CALDO Es un mtodo referencial para la determinacin de la sensibilidad a los antimicrobianos. Se requiere de una serie de tubos con caldo a los cuales se les agrega el antimicrobiano en distintas concentraciones, luego se inoculan con una suspensin estandarizada del microorganismo en estudio y se incuban bajo condiciones y tiempos recomendados. A continuacin, se describirn las condiciones generales y la metodologa para la determinacin de la CIM en los casos recomendados y presentados en el presente manual para Staphylococcus, Enterococcus y Streptococcus pneumoniae. Consideraciones Generales: Fuentes: Se debe conocer el lote, la potencia y la fecha de vencimiento de los antimicrobianos de referencia a usarse. Almacenarlos de acuerdo a las recomendaciones del laboratorio productor, o a una temperatura igual o menor a 20C en un desecador (preferentemente con vaco) provisto de un material desecante como gel de silice o cloruro de calcio. Cuando se retire el desecador del congelador se debe esperar que tome temperatura ambiente antes de abrirlo para evitar que el agua de condensacin humedezca las drogas.
Pesada de los Antibiticos: Es importante conocer la potencia de cada frasco de antibitico ya que de acuerdo a ella se realizarn los clculos para la preparacin de la soluciones a utilizar. La actividad de una determinada droga puede variar entre los distintos productores y entre diferentes lotes del mismo productor. Frmulas:
(A) Frmula para determinar la cantidad de antimicrobiano en polvo: Pesada del ANT (mg) = Volumen de SE (mL) x Concentracin de SE (mg/mL) Potencia del ANT (mg/mg)
(B) Frmula para determinar el volmen de la solucin estndar: Volumen de SE (mL) = ANT: Antibitico SE: Solucin estndar.
Pesada de ANT (mg) x Potencia de ANT (mg/mg) Concentracin de SE (mg/mL)
Utilizar una balanza analtica bien calibrada, con una precisin igual o superior al dcimo de miligramo. Se debe evitar pesar cantidades muy pequeas de droga ya que estas acarrean alto error, por lo que es recomendable pesadas superiores a los 100 mg. Si al pesar la droga se obtiene un exceso de la misma, se debe aplicar la Frmula (B) para conocer el volumen exacto.
Preparacin de las Soluciones: Preparar soluciones estndares o madres de: - por lo menos 1000 mL - de una concentracin 10 veces mayor que la ms alta del rango establecido (por ej. para trabajar hasta una concentracin de 512 mg/mL se puede preparar una solucin madre de 5120 mg/mL). - Vancomicina, Teicoplanina, Gentamicina, Penicilina, Cefotaxima, Ceftriaxona y Meropenem son solubles en agua. Recomendaciones: - Conservar las alicuotas a 60C por 6 meses o ms, salvo otra recomendacin. Nunca conservarlos a una temperatura superior a 20C. - En algunos casos el lmite de solubilidad del antimicrobiano slo permite preparar soluciones de concentraciones bajas. - Se pueden utilizar soluciones no estriles, pero si se desea, se pueden filtrar a travs de membranas. Ade, se debe tener cuidado de no utilizar materiales que adsorban antibiticos. Ej.: papel, asbestos o filtros de vidrio sintetizado. - Al descongelar un vial, utilizarlo durante el da y descartar el sobrante. Nunca volver a congelar una solucin de antibitico.
Nmero de Concentraciones Probadas: Determinar de acuerdo a los puntos de corte que se enumeran en las tablas del Anexo F. El nmero de concentraciones debe ser elegido por quien realiza la prueba. Sin embargo se recomienda elegir el rango de concentraciones de manera tal que incluya el rango de la CIM de al menos una cepa patrn de control de calidad.
Materiales y Medios: Caldo Mueller Hinton Tubos de 13 x 100 estriles (con tapa de algodn o metal o plstico) Pipetas de 1 mL, 2 mL, y 5 mL o micropipetas con tips estriles. Placas con agar Mueller Hinton o agar sangre Asas de drigalski Solucin salina estril (9g/L ClNa)
Caldo Mueller Hinton: Preparar de acuerdo a las indicaciones del fabricante, y medir el pH del medio a temperatura ambiente (25C), el que debe estar entre 7,2 y 7,4.
61
Suplementos: Para determinar la CIM en Streptococcus se debe adicionar sangre lisada de caballo (2 5 % v/v).
Preparacin de la sangre lisada de caballo: En un tubo falcon, colocar 40 mL de sangre entera de caballo bien homogenizada. Congelar el tubo con la sangre en una congeladora de 70C (de no disponer de sta utilizar una congeladora de 20C). Retirar el tubo de la congeladora, e inmediatamente colocarlo en un bao de agua a 35C 38C hasta que la sangre se descongele. Tener cuidado de retirarlo inmediatamente se descongela. Repetir estos dos ltimos pasos tres veces si se utiliza congeladora de 70C, si se usa el mtodo alternativo repetir stos pasos cuatro a cinco veces. Centrifugar a 5000 RPM por 30 minutos. Separar el sobrenadante. Fraccionar en crioviales de 1 mL y almacenar en congeladora hasta su uso.
Estndar para la Preparacin del Inculo: El estndar es la turbidez 0,5 de la escala de Mc. Farland. Seguir las recomendaciones de la seccin 3.4.3 referente a su preparacin.
Inculo: Preparar de acuerdo a las indicaciones de la seccin 3.4.3. Una vez ajustado el inculo y dentro de los quince minutos de preparada la misma, diluir en caldo para lograr una dilucin 1/100 (inculo de trabajo = 1 x 106 UFC/mL) Proceder de la misma manera para las cepas que se utilizarn para el control del procedimiento.
Solucin de Antibitico de Trabajo: A partir de la solucin madre realizar diluciones en caldo Mueller Hinton (suplementado de acuerdo al microorganismo en estudio) hasta obtener el doble de la concentracin de antibitico que se desee obtener en el primer tubo de la CIM.
Procedimiento: Colocar 0,5 mL de Caldo Mueller Hinton (suplementado cuando es necesario) desde el tubo N 2 al N 12. Colocar 0,5 mL de solucin del antibitico de trabajo al tubo N1 y N2. Mezclar el tubo N2 y transferir 0,5 mL del tubo N2 al tubo N3 . Mezclar el tubo N3 y transferir 0,5 mL de este tubo al tubo N4. Continuar con el mismo procedimiento hasta el tubo N10. Descartar 0,5 mL de la dilucin del tubo N10. Colocar 0,5 mL del inculo desde el tubo N1 al N11.
62
Tabla E2. Resumen del procedimiento para realizar la microdilucin en Caldo
C.I. C.E.
TUBO N CALDO MUELLER HINTON (SUPLEMENTADO CUANDO ES NECESARIO) mL SOLUCION DE ANTIBITICO DE TRABAJO INCULO VOLUMEN FINAL mL
2 0.5
3 0.5
4 0.5
5 0.5
6 0.5
7 0.5
8 0.5
9 0.5
10 0.5
11 0.5
12 0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5 1.0
0.5 1.0
0.5 1.0
0.5 1.0
0.5 1.0
0.5 1.0
0.5 1.0
0.5 1.0
0.5 1.0
0.5 1.0
0.5 1.0 0.5
C.I= Control de inculo C.E: = Control de esterilidad Repetir el procedimiento para el microorganismo control. Incubacin: Seguir las recomendaciones del cuadro N 3
Lectura e Interpretacin de los Resultados: El punto final se define a simple vista, por la falta de turbidez del caldo, para ello comparar cada tubo con el tubo de control de crecimiento. La interpretacin se realiza de acuerdo a las tablas F-1, F-2 y F-3
Recuento del Inculo: Realizar diluciones 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 en suero fisiolgico a partir del tubo N 11 (Control de crecimiento = 5 x105 UFC ) Colocar 0,1 mL de cada una de estas diluciones en un placa de Agar Mueller Hinton o agar sangre (de acuerdo al microorganismo en estudio) partiendo de la ms diluda a la ms concentrada. Distribuir el inculo en la superficie de la placa e incubarlas 20 24 hrs, a 35 C. Si la cepa es dependiente de CO2 se incubar en la atmsfera adecuada. Realizar el recuento de colonias. Verificar que la concentracin del inculo final obtenido rutinariamente por el laboratorio se aproxime a 5 x 105 UFC/mL. Proceder de la misma manera para el microorganismo control.
63
Control de Calidad: Probar cada lote de tubos con la cepa de referencia apropiada. Realizar el ensayo de las cepas patrones cada da que se realice la prueba. El comportamiento del sistema de la prueba se debe vigilar utilizando los lmites de control de calidad aceptables para cada combinacin de antimicrobiano / microorganismo los cuales se muestran en la tabla F 4 Las cepas patrones de control de calidad se pueden utilizar para comprobar la precisin y la exactitud de las prueba de dilucin, a no ser que ocurra cambios significativos en la CIM que no puedan ser atribuidos a fallas metodolgicas. Obtener un nuevo cultivo a partir de la cepa congelada si aparecen resultados inexplicables en la CIM que sugieran un cambio en la sensibilidad de la cepa patrn. Descartar el lote procesado si la CIM obtenida para el microorganismo control no est dentro del rango esperado. Llevar registros de los nmeros de lote de cada uno de los reactivos y materiales empleados para la realizacin de las pruebas de sensibilidad.
Tabla E3. Resumen de las condiciones y caractersticas del mtodo de dilucin en caldo (macrodilucin) para los microorganismos y antimicrobianos sugeridos
MICROORGANISMO MEDIO INOCULO CONDICIONES DE INCUBACION 35C En aire atmosfrico 35C En aire24 h para atmosfrico TIEMPO DE INCUBACION 16 20 h. 24 h para vancomicina 16 20 h. ATCC 29212 vancomicina CEPAS CONTROL Staphylococcus aureus ATCC 29213 Enterococcus faecalis
Staphylococcus spp
Caldo Mueller Hinton
Suspensin directa de la colonia Mtodo de crecimiento o Suspensin directa de la colonia Suspensin directa de la colonia
Enterococcus spp
Caldo Mueller Hinton
Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus
Caldo Mueller Hinton con sangre lisada de caballo (2-5%)
35C 5% CO2
20 24 h
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
ANEXO F CONCENTRACIONES CRTICAS DE LOS ANTIBITICOS PARA SU CATEGORIZACIN SEGN LOS RESULTADOS DE LA DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN INHIBITORIA MNIMA
Tabla F1. Estndares interpresetativos (mg/mL) para Staphylococcus spp
ANTIMICROBIANO S GLICOPEPTIDOS ESTANDAR INTERPRETATIVO I R
Vancomicina
8-16
32
64
Tabla F2. Estndares interpretativos (mg/mL) para Enterococcus spp

ANTIMICROBIANO S GLICOPEPTIDOS Vancomicina Teicoplanina AMINOGLUCOSIDOS Gentamicina ESTANDAR INTERPRETATIVO I R 8 - 16 16 32 32 >500
4 8 500
Tabla F3. Estndares interpretativos (mg/mL) para Streptococcus pneumoniae

ANTIMICROBIANO S PENICILINAS Penicilina CEFALOSPORINAS Cefotaxima Ceftriaxona CARBAPENEM Meropenem GLICOPEPTIDOS Vancomicina ESTANDAR INTERPRETATIVO I R 0,12-1 1 1 0,5 2 2 2 1 -
0,06 0,5 0,5 0,25 1
Tabla F4. Lmites aceptables (mg/mL) de las concentraciones mnimas inhibitorias Lmites de control de calidaden pruebas de CIM
ANTIMICROBIANO Staphylococcus aureus ATCC 29213 1-4 1-8 0,03 - 0,12 0,25 - 2 0,25 - 1 0,5 - 2 0,12 - 1 Enterococcus faecalis ATCC 29212 2-8 1-4 0,06 - 0,25 1-4 4 - 16 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 0,03 - 0,12 0,03 - 0,12 0,06 - 0,25 0,25 - 1 0,12 - 0,5 -
Cefotaxima Ceftriaxona Meropenem Penicilina Teicoplanina Vancomicina Gentamicina
ANEXO G MODELO DE REGISTRO DE RESULTADOS El registro de los resultados del antibiograma debe tener por lo menos los siguientes datos: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Cdigo del laboratorio Nombre del paciente Edad Sexo Tipo de muestra Diagnstico del laboratorio Fecha de aislamiento Hospitalizado ( ) Ambulatorio ( ) Antibitico, concentracin del disco, lectura en mm, interpretacin.
65
ANEXO H CONSERVACION DE CEPAS BACTERIANAS REFERENCIALES (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis y Pseudomonas aeruginosa)
PERIODOS CORTOS Se recomienda que las cepas de control de calidad de trabajo se conserven en medio tripticasa soya agarificado 0,8%, pH + - 7,2. Medio y Conservacin: Preparar el medio de acuerdo a las instrucciones del fabricante adicionando el agar. Distribuir en tubos 13 x 100 con tapa rosca o en microtubos llenando 2/3 de la capacidad . Esterilizar durante 15 minutos a 121C. Dejar solidificar en posicin vertical. Sembrar a partir de cultivos jvenes puros, mediante 3 o 4 punciones hasta el fondo. Incubar a 35C 37C durante 18 a 24 horas. Cerrar o sellar con parafilm para evitar evaporacin. Conservar a 4 C 8 C temperatura. Reemplazar los cultivos de trabajo una vez al mes a partir de cultivos congelados o almacenados en conservacin prolongada. Antes de utilizar las cepas referenciales sembrar sobre una placa de agar para obtener colonias aisladas. NOTA: Para microorganismos exigentes o fastidiosos sembrar por estras en agar chocolate enriquecido y subcultivar semanalmente.
PERIODOS PROLONGADOS Pueden mantenerse liofilizados, en nitrgeno lquido o con crioprotectores. La crioconservacin es considerado el mtodo casi ideal y al alcance de los laboratorios. Los crioprotectores, mas comunes son leche descremada, glicerol, sacarosa, sangre de carnero desfibrinada o suero fetal bovino. Se describe la Preparacin y conservacin bacteriana mediante caldo glicerol: Preparar caldo tripticasa soya con glicerol al 10 20% v/v. Distribuir en microtubos llenando los 2/3 de su capacidad Esterilizar en autoclave a 116C durante 20 minutos para evitar caramelizacin Hacer una suspensin bacteriana directamente en el caldo glicerol a partir de un cultivo joven Congelar inmediatamente a 20 70C.
RECUPERACIN DE CULTIVOS CONSERVADOS Congelados: Descongelar a temperatura ambiente o en bao de agua a 36C 37C. Transferir una alcuota del criotubo a un medio apropiado como agar tripticasa soya.
66
Cultivos en agar: Con asa de siembra estril romper el agar y tomar una asada para sembrar en medio slido o caldo tripticase soya. Incubar a 35 37C durante 18 24 hrs, y antes de utilizarlos resalizar previamente otro subcultivo obteniendo colonias aisladas.
OBSERVACIONES Las cepas de control de calidad son tiles para ensayar la precisin y la exactitud de las pruebas de sensibilidad mientras no presenten un cambio significativo en los dimetros de las zonas de inhibicin que no puedan ser atribuidos a fallas metodolgicas. Si aparecen resultados inexplicables que sugieran un cambio en la sensibilidad propia de la bacteria, se debe obtener un nuevo cultivo a partir de las cepas almacenadas. Tambin deben realizarse las pruebas bioqumicas que sean necesarias Todas las etapas del proceso deben estar documentadas y mantener un registro detallado de todas las operaciones realizadas.
67

Manua-L-Prueba de Sensibilidad Antimicrobiana

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O N A C IO N

MINISTERIO DE SALUD DEL PER

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Serie de Normas Tcnicas N 30 Lima - 2002

MINISTERIO DE SALUD Ministro Dr. Fernando Carbone Campoverde

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jefe Dr. Luis Fernando Llanos Zavalaga

Cartula: Frontis del local central de Instituto Nacional de Salud

Esta publicacin se termin de imprimir en Febrero del 2002.

Instituto Nacional de Salud

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Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin del INS

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SECCIN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 2.1 Principales medidas de bioseguridad

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9.3.3 9.4 9.5 9.6 9.6.1 9.6.2 9.7

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13.5.1 13.5.2 13.5.3 13.6 13.6.1 13.6.2

SECCIN 14: REGISTROS

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1.3.4. 1.3.5. 1.4. 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. 1.4.4. 1.4.5 1.5.

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INOCULACIN Preparacin del inculo Puede realizarse de dos formas:

Figura 1. Direcciones en el sembrado del inculo sobre la superficie del agar

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MEDIO DE CULTIVO Agar Mueller Hinton

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4.3.2.3 4.3.2.4 4.3.2.5 4.3.2.6

Tetraciclina. Teicoplanina Nitrofurantona(1) Norfloxacina(1)

Disco utilizado exclusivamente en cepas provenientes de infecciones de las vas urinarias

4.3.3 4.3.3.1 4.3.3.2 4.3.3.3 4.4

LECTURA A las 16 18 h. A las 24 h para el disco de Oxacilina

INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS CRTICOS Antibiticos y dimetros crticos

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MEDIO DE CULTIVO Agar Mueller Hinton

INOCULO Mtodo del crecimiento o suspensin directa de la colonia.

Disco utilizado exclusivamente en cepas provenientes de infecciones de las vas urinarias

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5.3.3 5.3.3.1 5.3.3.2

Lectura A las 16 18 h. A las 24 h para el disco de Vancomicina

INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS CRTICOS Antibiticos y dimetros crticos

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MEDIO DE CULTIVO Agar Mueller Hinton.

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Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vas urinarias

INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS CRTICOS Antibiticos y dimetros crticos

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Tabla 4. Antibiticos y Dimetros Crticos para Pseudomonas aeruginosa

* Adaptado a partir de los dimetros crticos de la Cefoperazona segn el NCCLS 2001

MEDIO DE CULTIVO Agar Mueller Hinton

Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vas urinarias

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INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS CRTICOS Antibiticos y dimetros crticos

Tabla 5. Antibiticos y Dimetros Crticos para Acinetobacter spp

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7.7 7.7.1 7.7.2

MEDIO DE CULTIVO Agar Mueller Hinton

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