Curso Bsico de Biologa Molecular de Plantas

INDICE
1.- INTRODUCCIN: ADN Y GENES 1.1.- Definicin de gen 1.2.- El ADN 1.2.1.- Estructura bsica de la molcula de ADN 1.2.2.- Replicacin del ADN 1.3.- Partes de un gen 1.4.- Transcripcin, traduccin 1.4.1.- Transcripcin 1.4.2.- Regulacin de la expresin gnica 1.4.3.- Terminacin 1.4.4.- Procesamiento del mensajero 1.4.5.- Traduccin 1.4.6.- Modificaciones postraduccionales 1.5.- Por qu aislar genes? 2.- METODOLOGA BSICA 2.1.- Concepto de clonacin molecular 2.2.- Enzimas utilizadas en ingeniera gentica 2.2.1.- Enzimas de restriccin 2.2.2.- DNA Ligasas 2.2.3.- Otros enzimas 2.3.- Vectores 2.3.1.- Plsmidos 2.3.2.- Fagos 2.3.3.- Csmidos 2.3.4.- BACs/PACs 2.3.5.- YACs 2.3.6.- Otros vectores 2.4.- Electroforesis 2.4.1.- Concepto 2.4.2.- Gel de Agarosa 2.4.3.- Gel de Acrilamida 2.5.- Hibridacin 2.5.1.- Marcaje de molculas de cido nucleico 2.5.2.- Desnaturalizacin 2.5.3.- Hibridacin 2.5.4.- Hibriacin Southern 2.5.5.- Hibriacin Northern 2.5.6.- Northern reverso 2.5.7.- Hibriacin Western 2.5.8.- Hibridacin de colonias bacterianas o calvas 2.5.9.- Slots and dot blots 2.6.- Secuenciacin del ADN 3.- LIBRERAS DE DNA 3.1.-Concepto de librera 3.2.- Libreras genmicas 3.3.- Libreras de cDNAs 3.4.- Libreras de expresin 3.5.- Cribado diferencial 3.6.- Libreras de sustraccin 3.7.- Normalizacin de libreras de cDNA 4.- PCR 4.1.- Concepto de PCR 4.2.- Aplicaciones 4.2.1.- Aislamiento de genes 4.2.2.- Secuenciacin 4.2.3.- RT-PCR 4.2.4.- Real time Quantitative PCR

4.2.5.- PCR inversa 4.2.6.- Genome Walking 4.2.7.- RACE 4.2.8.- Differential Display 4.2.9.- PCR-select cDNA subtraction 5.- GENMICA FUNCIONAL 5.1.- Proyectos Genoma 5.2.- Proyectos de secuenciacin de ESTs 5.3.- Microchips de DNA 6.- GENTICA REVERSA 6.1.- Colecciones de mutantes 6.1.1.- Cribado de colecciones de mutantes 6.2.- Transposon tagging 6.2.1.- Concepto de elemento transponible 6.2.2.- Transposon tagging 6.2.3.- Enhancer y Gene traps 6.2.4.- Cribado de libreras de mutantes 6.3.- Targeting induced local lesions in genomes (TILLING)

1.- INTRODUCCIN: ADN Y GENES

1.1.- DEFINICIN DE GEN
El concepto de gen ha ido variando a lo largo del tiempo. La idea original del gen procede de los experimentos de Gregor Mendel, aunque l no los denomin genes, sino factores, y vendran a ser los responsables de la transmisin de los caracteres de padres a hijos. Fue hacia 1950 en que se aportaron pruebas definitivas sobre la naturaleza molecular del gen. Por un lado se descubri que los genes estn constituidos por ADN. Por otro lado, se descubri que ese ADN contena la informacin necesaria para la sntesis de una cadena determinada de protena. As pues, la definicin de gen pas a ser la cadena de ADN capaz de dirigir la sntesis de una protena. Posteriormente este concepto ha sido matizado. En primer lugar, se sabe que muchas protenas estn constituidas por ms de una cadena polipeptdica y que cada una de ellas est codificada por un gen diferente. Por ello la definicin pas a ser: la cadena de ADN capaz de dirigir la sntesis de un polipptido. A efectos de lo que nos interesa en este curso esta podra ser una buena definicin. Sin embargo, hoy se sabe que no es del todo correcta ya que determinados genes son capaces de codificar ms de un polipptido, y por otra parte, un mismo polipptido puede ser codificado por diferentes genes. Adems, existen algunos genes que no codifican protenas sino ARNs. Por ltimo, dentro de lo que se entiende por gen no nicamente se incluyen las regiones que codifican para un polipptido sino tambin aquellas que determinan en que tejidos, en que momentos, o en que cantidades se ha de producir el mismo. A pesar de ello nos quedaremos con la siguiente definicin: Fragmento de ADN que contiene toda la informacin necesaria para la sntesis de un polipptido.

1.2.- EL ADN 1.2.1.- ESTRUCTURA BSICA

Como se ha comentado el ADN es la molcula que contiene la informacin gentica y la sustancia de la cual estn hechos los genes. Por eso, para comprender el funcionamiento de los genes se ha de conocer al menos su estructura bsica. El cido desoxirribonucleico es un polinucletido, es decir, est formado por la unin de nucletidos. Existen 4 nucletidos diferentes: A, T, G y C. Cada nucletido, a su vez, et formado por una base nitrogenada, una pentosa (azcar) y un grupo ortofosfrico, a travs del cual se realizan las uniones entre nucletidos. La unin del grupo fosfato tiene lugar en las posiciones 5 o 3 de la pentosa, lo cual hace que las cadenas estn orientadas. El orden en que se sitan los nucletidos se denomina secuencia del ADN. Esta sera la estructura bsica del ADN, sin embargo, la mayor parte de las veces el ADN se encuentra formando una estructura ms compleja que consiste en dos cadenas como la anterior que se enlazan una con otra de manera complementaria, es decir, que solo se aparean las bases A con T, y C con G. Estas dos cadenas, se enrollan una sobre otra, formando la famosa doble hlice. Medidas del tamao de los fragmentos de ADN: nmero de pares de bases. pares de bases = pb mil pares de bases = kpb milln de pares de bases Mpb

1.2.2.- REPLICACIN DEL ADN

Esta estructura es importante por una particularidad, y es que cada una de las cadenas puede servir como molde para reproducir la otra, y esto es lo que se produce durante la replicacin. Cada vez que la clula se divide, todo el ADN es duplicado. Las dos cadenas se separan y cada una de ellas dirige la sntesis de la segunda. Esta reaccin tiene lugar por medio de un enzima llamada ADN polimerasa.

Por otro lado, otra particularidad del ADN es que si sus dos cadenas se separan, por ejemplo, por accin del calor, y luego se deja enfriar la solucin, las cadenas pueden reasociarse, reconociendo la secuencia una de la otra.

1.3.- PARTES DE UN GEN

Como se ha comentado antes los genes son segmentos de ADN capaces de dirigir la sntesis de protenas determinadas, y ello lo hacen a travs de un ARN intermediario. El siguiente diagrama muestra la forma en que la informacin gentica se transmite desde el ADN hasta la protena. Por lo tanto, estos segmentos de molculas de ADN que son los genes han de contener las seales o informacin necesaria para realizar estos procesos. Estos segmentos se pueden dividir en diferentes partes segn un criterio de funcionalidad. Bsicamente, un gen estara constituido por 3 partes: 1. 2. Promotor: que establece cundo y en qu cantidad se transcribir el gen. Regin codificante: el fragmento de ADN que determina la secuencia de aminocidos de la protena codificada. Terminador: que contiene las seales que determinan el trmino del proceso de transcripcin, evitando que contine hacia otros genes que se encuentran ms adelante.

3.

Todas estas seales son "ledas" y decodificadas por interacciones establecidas por protenas especficas. Adems, algunos genes contienen intrones. Los intrones son secuencias dentro de un gen que son eliminadas en el procesamiento del mensajero mediante un proceso denominado de splicing y que, por tanto, no estn presentes en el mRNA. El nmero, tamao y posicin de los intrones vara de unos genes a otros.

1.4.- TRANSCRIPCIN, TRADUCCIN 1.4.1.- TRANSCRIPCIN

Se entiende por transcripcin a la copia de la informacin de un gen desde el ADN de doble cadena a una molcula de ARN de cadena simple. Este proceso tiene lugar en el ncleo, y luego este ARN, denominado mRNA o ARN mensajero, es trasladado al citoplasma, donde se produce la sntesis de las protenas. El proceso de transcripcin consta de tres etapas: - Iniciacin: es el proceso ms complejo y ms importante. Implica la separacin de las dos cadenas de ADN y la unin de la ARN polimerasa, el enzima responsable de la sntesis del ARN. El inicio ha de realizarse en un lugar concreto, denominado promotor, y que viene determinado por la unin de ciertas protenas denominadas factores de transcripcin. - Elongacin: una vez unida la ARN polimerasa comienza a unir NTPs en orden complementario al de la cadena de ADN, y siempre de 5 a 3. - Terminacin: al final del gen existen unas seales que indican a la ARN polimerasa que debe soltarse y as finalizar la transcripcin. Por tanto, aunque la transcripcin la lleva a cabo la ARN polimerasa, sta debe asociarse a una serie de protenas que le indican donde y cuando empezar a copiar, donde acabar, y que permiten que el mRNA sea el adecuado. Estos factores de transcripcin son muy importantes en la regulacin de los genes. Algunos de estos factores nicamente actan en respuesta a ciertos estmulos, que pueden ser, por ejemplo, ambientales. Estos factores denominados inducibles, son los responsables de la regulacin de la actividad de los genes en respuesta a los estmulos, desarrollo, etc. Pueden actuar activando o reprimiendo la transcripcin. Promotor: parte del gen que contiene todas las secuencias necesarias para la unin de la ARN polimerasa y los factores de transcripcin.

Promotor basal: una secuencia que es capaz de iniciar la sntesis de ARN pero que no contiene ninguna seal de regulacin. Secuencias conservadas en los promotores bsales de plantas TATA box: Inicio TATA TCATCA -25 bp del inicio de transcripcin +1

1.4.2.- REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA

No todas las protenas se necesitan siempre, en todos los tejidos o en las mismas cantidades. Por tanto, los seres vivos han desarrollado sistemas para controlar la cantidad de cada protena que sintetiza la clula. Pero, Cmo lo hace la clula? El sistema ms habitual es regulando la cantidad de mRNA que se produce. La cantidad de RNA que produce un gen en un momento dado depende de la facilidad con que la RNA polimerasa puede unirse al promotor e iniciar la copia. Esta unin puede verse facilitada, o dificultada por la presencia de determinadas protenas unidas a localizaciones especficas del ADN en la zona del promotor. La presencia o capacidad de estas protenas a unirse al promotor pueden depender de factores como estmulos externos, hormonas, nutrientes, luz..., con lo cual se consigue regular la transcripcin de un gen. Una manera de estudiar estos factores es eliminando trozos del promotor y viendo como afecta a la transcripcin. De esta manera se pueden definir las regiones o cajas del promotor importantes en su regulacin.

1.4.3.- TERMINACIN
Secuencia terminadora: Aquella que contiene la informacin necesaria para que la RNA polimerasa termine la transcripcin. Secuencias conservadas en los terminadores de plantas Seal de poliadenilacin Sitio de poliadenilacin AATAAA CAATT(T/G) 10 a 30 bp del final.

El sitio de terminacin puede ser variable incluso dentro de un mismo gen, de manera que no todos los RNAs acaban exactamente en el mismo sitio, aunque la diferencia suele ser de unos pocos pares de bases.

1.4.4.- PROCESAMIENTO DEL MENSAJERO

El RNA que se produce tras la accin de la RNA polimerasa no es el mismo que posteriormente se traducir a protena, sino que sufre una serie de modificaciones posteriores. El RNA original, producto de la RNA polimerasa recibe el nombre de hnRNA (heterogeneous nuclear RNA) mientras que el RNA despus del procesamiento recibe el nombre de mRNA (messanger RNA). 1- 5 capping: adicin en el extremo 5 del RNA de un nucletido especial (metil-guanina) que protegeria al mRNA de la degradacin. 2- 3 poliadenilacin: adicin en el extremo 3 de una cola de adeninas. No ocurre en todos los mRNAs, pero si en la mayora. 3- Eliminacin de intrones (splicing): la realiza el splicisoma, un complejo formado por unas 70 protenas y numerosas RNAs. Los intrones poseen unas seales de secuencia que posibilitan que el splicisoma los reconozca y elimine. En general los genes que estn evolutivamente relacionados tienen una organizacin de intrones/exones semejante. Incluso, en especies cercanas, se observa relacin entre las secuencias de los intrones. Sin embargo, estas seales a veces no son reconocidas siempre, de manera que segn sea el splicing, un mismo gen puede codificar ms de un polipptido que pueden tener propiedades diferentes. A este fenmeno se le denomina splicing diferencial. Aunque no tan comn como en animales, el splicing diferencial tambin existe en plantas. Un ejemplo: la rubisco activasa de dicotiledneas.

1.4.5.- TRADUCCIN
El ribosoma se une al RNA mensajero. Los tRNAs reconocen la secuencia y unen el aminocido a la cadena de polipptido creciente. El ribosoma se mueve tres bases y se repite el proceso.

1.4.6.- MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES

La sntesis del polipptido no es siempre el final del proceso: La cadena de aminocidos ha de adoptar la conformacin adecuada En algunos casos el polipptido es cortado en subunidades En muchos casos ha de unirse a otras cadenas o a otras molculas. Algunos aminocidos pueden sufrir modificaciones, por ejemplo, fosforilacin o glicosilacin

1.5.- POR QU AISLAR GENES?

Desde el inicio de la agricultura el hombre a intentado mejorar las plantas que cultivaba. Hasta hace relativamente poco tiempo la Mejora Gentica se basaba en el encontrar nuevas combinaciones de alelos en una especie que dieran como resultado plantas con el fenotipo deseado. Las tcnicas de Biologa Molecular aplicadas al campo de la agricultura han revolucionado la Mejora Clsica por diversos motivos. Por un lado permiten crear nuevos alelos (mutagnesis) sin esperar a que estos se produzcan de manera natural. Pero por otra, permiten introducir en una planta aquellos genes que nos interesen incluso de otros organismos. Este mecanismo permite acortar significativamente el tiempo de muchas investigaciones que anteriormente requeran experimentos de larga duracin, pues dependan de la fertilizacin convencional de las plantas, y esperar que stas crecieran y formaran semillas en cuestin de meses. Algunas de las ventajas que se esperan de la Ingeniera Gentica de Plantas: - aumentar productividad y reducir costes - innovaciones y mejoras en los alimentos - prcticas agrcolas ms "ecolgicas". Pero adems la manipulacin gentica de plantas tendr un impacto en otros sectores productivos: - floricultura y jardinera - industria qumica - industria farmacutica Aunque no es la nica, la punta de lanza y parte ms espectacular de esta BT es la I.G. de plantas: la creacin de plantas transgnicas a las que hemos introducido establemente ADN forneo que puede ser no slo de origen vegetal, sino de animales o de microorganismos. Normalmente, para que un gen pueda funcionar en la planta, hay que hacer in vitro una "construccin gentica artificial": para ello se suele colocar delante de la parte codificadora que nos interesa una porcin de ADN que permite esa expresin (promotores, intensificadores de la transcripcin). Podemos incluso escoger nuestros promotores: algunos inducen la expresin en casi todos los tejidos de la planta, de forma continua (constitutiva); en cambio, otros logran que el transgn se exprese slo en determinados rganos o tejidos, o bajo el efecto inductor de alguna sustancia qumica. Pero en cualquier caso, la posibilidad de realizar ingeniera gentica en plantas depende, del descubrimiento y aislamiento de genes, o promotores, cuya introduccin en una planta pueda producir una ventaja en el cultivo.

2.- METODOLOGA BSICA

2.1.- CONCEPTO DE CLONACIN MOLECULAR
Clonar consiste en producir un elevado nmero de copias de una misma cosa, en nuestro caso, genes, o sea, pedazos de ADN. Por lo tanto, cuando hablamos de clonacin de genes estamos hablando de aislar genes y multiplicar el ADN que los codifica. ADN recombinante: Una molcula de ADN producida a partir de fragmentos que provienen de organismos diferentes o que en el organismo original se encuentran en diferente ordenacin. Dado que el ADN de todos los organismos vivientes tiene una naturaleza qumica idntica, no existen, en principio, limitaciones para recombinar el ADN de cualquier origen. La clonacin de genes requiere de seis condiciones: 12345Un organismo husped en donde se realice la multiplicacin (tambin se puede realizar in vitro: PCR) Un vector de DNA que se pueda multiplicar en el husped Una manera de unir el DNA de inters con el DNA vector Una manera de introducir la combinacin DNA-vector en el husped Una manera de seleccionar de entre todos los huspedes que contienen DNA-vector aquellos que tienen el DNA que nos interesa. 6- Un mtodo para poder aislar el DNA-vector en cantidades suficientes para su estudio

2.2.- ENZIMAS UTILIZADAS EN LA INGENIERA GENTICA

Las tcnicas de Ingeniera Gentica se basan en la capacidad del investigador para manipular las molculas de ADN. Para realizar estas manipulaciones el investigador utiliza enzimas que modifican de una u otra manera la molcula de ADN, o de ARN en algunos casos. Para ello se cuenta con un amplio repertorio. Los enzimas ms utilizados y claves son los enzimas de restriccin.

2.2.1- ENZIMAS DE RESTRICCIN

Son enzimas aislados a partir de bacterias que tienen la capacidad de cortar las molculas de ADN de doble cadena en lugares que presentan secuencias especficas. Cada enzima de restriccin reconoce una secuencia especfica de nucletidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN.
HaeIII 5GGCC 3 -> 5GG CC 3 corte de extremo romo

5.CCCAAGCTTGATAGCTTTCGGCCTAGCTGCAGCGATCGA.3 3.GGGTTCGAACTATCGAAAGCCGGATCGACGTCGCTAGCT.5 5.CCCAAGCTTGATAGCTTTCGG CCTAGCTGCAGCGATCGA.3 3.GGGTTCGAACTATCGAAAGCC GGATCGACGTCGCTAGCT.5 HindIII 5AAGCTT 3 -> 5A AGCTT 3 corte de extremo 3' cohesivo 5.CCCAAGCTTGATAGCTTTCGGCCTAGCTGCAGCGATCGA.3 3.GGGTTCGAACTATCGAAAGCCGGATCGACGTCGCTAGCT.5 5.CCCA AGCTTGATAGCTTTCGGCCTAGCTGCAGCGATCGA.3 3.GGGTTCGA ACTATCGAAAGCCGGATCGACGTCGCTAGCT.5

PstI 5CTGCAG 3 -> 5CTGCA G 3 corte de extremo 5' cohesivo 5.CCCAAGCTTGATAGCTTTCGGCCTAGCTGCAGCGATCGA.3 3.GGGTTCGAACTATCGAAAGCCGGATCGACGTCGCTAGCT.5 5.CCCAAGCTTGATAGCTTTCGGCCTAGCTGCA GCGATCGA.3 3.GGGTTCGAACTATCGAAAGCCGGATCG ACGTCGCTAGCT.5

Otras interesantes propiedades de las enzimas de restriccin son: En general, reconocen secuencias palindrmicas, es decir; secuencias que son iguales si se leen en una direccin, o en la direccin contraria. Dado que el enzima corta siempre en la misma secuencia diana, incluso las molculas de ADN ms complejas, en los mismos sitios, generando fragmentos del mismo tamao en cada digestin El tamao de estos fragmentos estara determinado por la distancia entre las dianas (pb) La frecuencia de corte de un enzima depende de la probabilidad d que s de la combinacin de nucletidos que reconoce como diana. As pues, cuanto ms larga sea la diana, menos probable es el corte.

De acuerdo con la manera en que el enzima corta, se distinguen tres tipos de enzimas de restriccin: Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a aparearse o hibridarse nuevamente. En realidad, cualquier extremo de ADN generado por un corte con EcoRI puede hibridarse o aparearse con otro extremo generado por la misma enzima.

2.2.1.- DNA LIGASA

Las DNA ligasas catalizan la formacin de un enlace fosfodiester entre el 5 de un fosfato y el 3 de un nucletido. Se usa para unir covalentemente cadenas de ADN. Por ejemplo, un fragmento dentro de otro. La DNA ligasa usada ms habitualmente es la T4 DNA ligasa, que requiere ATP como cofactor. La ligacin de molculas de ADN puede realizarse de mltiples maneras. Por ejemplo: Ligacin intermolecular: entre dos cadenas distintas de ADN Ligacin intramolecular: entre los dos extremos de la misma cadena de ADN, dando lugar a un crculo.

La ligacin en principio se producir o bien entre extremos romos o bien entre extremos de DNAs digeridos con el mismo enzima de restriccin y que, por tanto, pueden aparearse. Sin embargo, en ocasiones, tambin puede producirse entre molculas digeridos con enzimas diferentes si los extremos que generan son compatibles. Dos molculas digeridas con el mismo enzima pueden unirse para formar un circulo, aunque pueden adoptar dos configuraciones diferentes segn la orientacin en que se unan. Si esto mismo lo hacemos con moleculas digeridas con dos enzimas adecuados, podremos controlar la orientacin. En caso de no contar con enzimas adecuados para unir las molculas que nos interesan aun as contamos con algunas posibilidades. Por ejemplo, el empleo de molculas adaptadores. Esto es, pequeas molculas de ADN bicatenario que se unen a los extremos del ADN mediante ligasas y que tienen una diana de restriccin que nos interesa. Otra posibilidad es la de aadir al extremo del ADN una cola de mononucletidos en una de las molculas de ADN, y del mononucletido complementario en la otra. Esto se realiza mediante un enzima denominado polinucletido transferasa terminal.

2.2.3.- OTROS ENZIMAS

ENZIMA Transcriptasa reversa RNAsaH DNA polimerasa DNA ligasa Fosfatasa alcalina Polinucletido quinasa DNAsaI Nucleasa S1 Transferasa terminal RNA polimerasa Taq DNA polimerasa Exonucleasa III ACTIVIDAD Copia el RNA de cadena simple a DNA de cadena simple Degrada el RNA en hbridos DNA-RNA Sintetiza DNA complementario de un DNA de cadena simple Une molculas de DNA Elimina el grupo fosfato del extremo 5 del ADN Introduce fosfato en el extremo 5 del ADN Hidroliza uniones fosfato de DNA doble cadena Degrada DNA de cadena simple Aade nucletidos al extremo 3 del ADN Sintetiza RNA a partir de DNA doble cadena Sintetiza DNA complementario a otro y es termoestable Elimina nucletidos progresivamente por el extremo 3

2.3.- VECTORES
Vector de clonaje: un DNA de pequeo tamao capaz de autoreplicarse conteniendo un DNA forneo y de perpetuarse en clulas husped. Como se ha mencionado antes la clonacin de ADN depende de la disponibilidad de un vector que permita la amplificacin en una clula husped y la seleccin del fragmento que nos interesa. Tradicionalmente como huspedes se han usado o bien bacterias, o bien, en algunos casos, levadura, por su facilidad de manejo y capacidad de amplificacin. Las propiedades que se esperan de un buen vector de clonaje son: 1.- Debe de poder contener ADN extrao y aun as seguir reproducindose. 2.- Debe de permitir poder distinguir las bacterias o levaduras que contienen e vector con el fragmento que nos interesa de las que no. Con estas caractersticas se han desarrollado diversas clases de vectores. Los ms comnmente utilizados son: Plsmidos Bacteriofagos Csmidos YACs BACs Otros Tamao mximo de los insertos en los distintos tipos de vectores - Plsmidos 10 kb - Bacteriofagos 20 kb - Csmidos 47 kb - YACs 1000 kb - BACs 125 kb

2.3.1.- PLSMIDOS
Caractersticas - husped: bacterias, principalmente E.coli. - DNA circular extracromosomal - Tamao entre 1 y 200 kb - Pueden aadirse funciones de seleccin como resistencia a antibiticos o de clonaje, como mltiples dianas de insercin. - Alto nmero de copias por clula: hasta 200 copias. El fragmento que se desea clonar y el plsmido son digeridos con el mismo enzima y ligados. El DNA as producido se introduce en bacterias que no contienen plsmido mediante el proceso denominado de transformacin. Para ello se induce la formacin de poros en las paredes de las bacterias bien mediante un aumento en la temperatura (choque trmico) o bien mediante un choque elctrico (electroporacin). Como el

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plsmido contiene genes de seleccin para resistencia a antibiticos, solo las bacterias transformadas podrn crecer en un medio selectivo con ese antibitico. Finalmente, los plsmidos que contienen el inserto deseado (el DNA externo) son seleccionados mediante un segundo sistema de seleccin. Por ejemplo, la introduccin del inserto produce la ruptura de un gen que da coloracin a la bacteria. Este gen suele ser la beta-galactosidasa. Si el gen es activo, en presencia de una sustrato adecuado (X-gal) las colonias aparecen de color azul.

2.3.2.- BACTERIFAGO LAMBDA

Una de las limitaciones de los plsmidos como vectores es que no permiten introducir fragmentos de gran tamao debido a las limitaciones en el proceso de transformacin. Por ello se desarroll un segundo tipo de vector basado en el bacrerifago lambda. Un bacterifago (fago) es un virus que infecta bacterias. Los fagos introducen el DNA en la clula husped por si mismos, all se multiplica y produce nuevos virus encapsidados que a su vez son capaces de infectar nuevas clulas. La ventaja de los fagos como vectores es que se les puede aadir DNA externo y aun as son capaces de multiplicarse. Los fragmentos del DNA del fago se ligan in vitro al fragmento de DNA de nuestro inters. Este DNA hbrido se une a las protenas de la cpside del virus (tambin in vitro) y con ello se infecta las bacterias. Una ventaja respecto a los plsmidos es que puede contener fragmentos mayores de ADN. Su crecimiento se realiza sobre placas en las que se hace crecer simultneamente la bacreria en la densidad adecuada de manera que a partir de cada fago se genera lo que se conoce como calva, una zona de cultivo de bacterias que ha sido lisada por los fagos y que contendra fagos idnticos, es decir, con el mismo fragmento de ADN que le hemos introducido.

2.3.3.- CSMIDOS
Son una mezcla de plsmido y fago. Dentro de la bacteria se multiplican como plsmido y el proceso de ligacin del DNA es el mismo que para un plsmido, pero pueden contener mayores insertos por que se introducen en las bacterias por transduccin, como los fagos. As pues permiten insertar hasta 48 kb. Sin embargo, tienen algunos problemas como recombinaciones o falta de estabilidad en las bacterias.

2.3.4.- BAC/PACs
Los BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) se basan en el plsmido de E.coli denominado Factor F mientras que los PACs se basan en el bacterifago P1. La ventaja respecto a los anteriores es que permite clonar hasta 350 kb los BACs y hasta 150 los PACs. Esta gran capacidad ha hecho que se utilicen en los proyectos secuenciacin. El manejo es similar a los plsmidos ya que contienen similares genes de resistencia y seleccin. Una diferencia es que la transformacin debe realizarse por electroporacin. Otra diferencia es que el nmero de copias por clula es de 1 o 2, por lo que se requiere mayor numero de bacterias para el mismo nmero de molculas de plsmido.

2.3.5.- YACs
Contienen las seales necesarias para comportarse como un cromosoma en clulas de levadura. Pueden contener hasta 1000 kb de inserto. Contienen genes de seleccin. Se pueden replicar en bacteria como plsmidos cuando aun no tienen inserto.

2.3.6.- OTROS VECTORES

Retrovirus

Plsmido Ti
Plsmidos especializados para transformar Agrobacterium e introducir ADN en plantas.

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Baculovirus
Infectan clulas de insecto. Su genoma (128 kb) es de doble cadena y codifica entre otros para una protena, la polihedrina, que nicamente es necesaria para la diseminacin en la naturaleza. Los vectores se basan en la cotransfectacin de un pequeo plsmido conteniendo el gen de inters junto al genoma entero, que recombinan entre si, permitiendo que el gen introducido sustituya a la polihedrina. Se usan sobre todo para expresar protenas en clulas eucariotas.

Elemento transponible P
El elemento P es un transposn de Drosophila (elemento mvil) capaz de cambiar de localizacin dentro del genoma. El gen exgeno se introduce en el transposn y se microinyecta en clulas de Drosophila, integrndose en el genoma.

2.4.- ELECTROFORESIS 2.4.1.- CONCEPTO

La electroforesis es un mtodo de separacin de molculas que se basa en hacerlas pasar por un material (gel) sometido a un campo elctrico. Muchas de las molculas orgnicas, como las protenas o los cidos nucleicos, estn cargadas elctricamente. El DNA tiene carga negativa debido a los grupos fosfato. El gel sirve como soporte de la separacin y consiste en una sustancia polimerizada en forma de trama. Los ms usados son la agarosa y la poliacrilamida. En el mismo se realizan unos agujeros o pocillos en donde se colocarn las muestras. Cuando se somete al gel a un campo elctrico, el ADN tiende a desplazarse hacia el polo positivo, pero debe hacerlo a travs de la trama del gel. Las molculas pequeas lo hacen ms fcilmente que las grandes por lo que, por ejemplo, los fragmentos de ADN ms pequeos se desplazan ms rpido que los grandes. Esto permite separar los fragmentos de ADN por su tamao. Si introducimos en el gel fragmentos de tamao conocido podemos inferir el tamao de los de la muestra.

2.4.2.- GEL DE AGAROSA

La agarosa en polvo se introduce en una solucin tamponadora y se calienta hasta que se disuelve. Entonces se deja enfriar un poco, se aade bromuro de etidio, que tie el ADN, y se coloca en el molde. Cuando se enfra el gel se endurece y puede colocarse en la cubeta de electroforesis, que es el aparato que cuenta con unos electrodos conectados a una fuente elctrica. Las muestras de ADN se colocan en los pocillos. Se conecta la electricidad y se deja el tiempo necesario para la separacin. El DNA se visualiza en presencia de luz UV gracias al bromuro de etidio.

2.3.5.- GELES DE ACRILAMIDA

El principio es el mismo, la preparacin similar. La diferencia es que han de ser mas finos y que producen una mayor resolucin. Se pueden emplear tambin para protenas.

2.5.- HIBRIDACIN 2.5.1.- MARCAJE DE MOLCULAS DE CIDO NUCLEICO

Se basa en el uso de polimerasas que acten con dNTPs modificados de alguna manera detectable. Se pueden usar dNTPs radiactivos, conjugados a molculas detectables mediante anticuerpos o a molculas fluorescentes, etc.

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El marcaje radioactivo es uno de los que ms se han utilizado y ser el que use como ejemplo a continuacin. Los cidos nucleicos radioactivos pueden detectarse directamente en un contador de radioactividad o bien indirectamente sobre una placa fotogrfica (autorradiografa). Un cido nucleico puede hacerse radioactivo simplemente por la adicin de fosfato radioactivo (fsforo 32) durante su sntesis. As, si se aade fosfato radioactivo al medio de cultivo cuando est teniendo lugar la sntesis de DNA, el nuevo DNA ser radioactivo. 32P3- -------> 32P-nucletido -------> 32P-cido nucleico Alternativamente, se puede marcar radioactivamente el extremo 5' de una cadena de DNA usando ATP radioactivo marcado en el tercer fosfato. El enzima polinucletido quinasa quita especficamente el tercer fosfato del ATP y lo une al grupo hidroxilo 5' del DNA. 32P-P-P-adenosina + HO-desoxiribosa-DNA -------> ADP + 32P-O-desoxiribosa-DNA Esta tcnica es extremadamente til y rpida ya que permite el marcaje de molculas de DNA ya preformadas. Se han desarrollado nuevos mtodos de marcaje de cidos nucleicos que usan compuestos no radioactivos que se incorporan al DNA y pueden detectarse o bien porque dan un color determinado o incluso porque emiten luz (y por tanto pueden detectarse por autorradiografa). Algunos de estos mtodos casi igualan al radioactivo en cuanto a sensibilidad teniendo la ventaja aadida de que no generan desechos radioactivos.

2.5.2.- DESNATURALIZACIN
Las dos cadenas del DNA estn unidas por puentes de H que pueden romperse por accin del calor sin afectar los enlaces covalentes que unen a los nucletidos. Por lo tanto, las cadenas de un DNA bicatenario pueden separarse por calentamiento, proceso conocido como fusin. Se denomina Tm (melting temperature) a la temperatura a la que el 50% de las cadenas estn disociadas). Esta Tm, est en funcin del contenido en GC del DNA en cuestin ya que los pares de bases GC se unen por 3 puentes de H2, mientras que AT slo por dos. Cuanto mayor sea el contenido en GC mayor ser la temperatura de fusin. Si el DNA calentado se enfra lentamente, la doble cadena vuelve a formarse (el DNA se renaturaliza). Esto permite realizar hibridaciones con cadenas de DNA procedentes de fuentes distintas. Las cadenas del DNA tambin pueden separarse a temperatura ambiente cambiando las condiciones inicas del medio. Al no estar implicada la temperatura, el proceso se conoce como desnaturalizacin. Sin embargo, el resultado final es el mismo; si las condiciones inicas vuelven a lo normal se restablece de nuevo la doble hlice. De nuevo, la temperatura o la concentracin inica del medio condicionan la reaccin de renaturalizacin.

2.5.3.- HIBRIDACIN
La hibridacin es la construccin artificial de cidos nucleicos bicatenarios a partir de dos monocatenarios y por complementariedad de bases. Cuando una solucin de DNA que ha sido calentada se enfra lentamente se produce la rehibridacin dando lugar a la estructura inicial. Tal reasociacin ocurre slo si las secuencias de bases son complementarias. Por lo tanto, la hibridacin permite la formacin de complejos bicatenarios no naturales de DNA:DNA y DNA:RNA. Este es un mtodo muy verstil que permite estudiar el grado de relacin gentica entre dos cidos nucleicos. Tambin permite la deteccin de fragmentos de DNA que son complementarios a fragmentos monocatenarios de secuencia conocida (sondas). Por ejemplo, se puede utilizar una sonda radioactiva para saber si en una mezcla desconocida existe algn fragmento complementario a la sonda. Para ello se usan membranas de nitrato de celulosa. Primero se une al filtro el DNA monocatenario y es entonces cuando se aade la sonda. Cuando la sonda no se hibrida con el DNA problema es arrastrada en los lavados. La radioactividad que permanece unida al filtro se mide posteriormente. La hibridacin puede incluso realizarse despus de la electroforesis. Las molculas de cido nucleico se transfieren a las membranas bien por capilaridad o aplicando corriente elctrica y es entonces cuando se aade la sonda. La figura muestra el uso de sondas de cidos nucleicos para la bsqueda de secuencias complementarias en una mezcla compleja. Los fragmentos de DNA se separan por electroforesis y despus se transfieren a una membrana. La sonda, que es radioactiva, se unir al fragmento(s) con el que tenga complementariedad y se detectar por autorradiografa. Southern: Hibridacin de una sonda de DNA sobre DNA unido a una membrana. Northern: Hibridacin de una sonda de DNA sobre RNA unido a una membrana.

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Northern reverso: Hibridacin de una sonda de ARN marcado sobre sondas de DNA. Western: Hibridacin de un anticuerpo sobre protena unida a una membrana. Far Western: Hibridacin de una protena sobre otra protena unida a una membrana.

2.5.4.- HIBRIDACIN SOUTHERN

Una sonda de ADN marcado (o ARN) se hibrida sobre ADN separado sobre electroforesis e inmovilizado en una membrana. El DNA fijado a la membrana puede ser genmico o puede ser de un vector digerido. Lo primero podemos usarlo para, por ejemplo, saber el nmero de copias de una secuencia en el genoma. Lo segundo para realizar un mapa de restriccin de un plsmido. Como se ha comentado, la hibridacin y desnaturalizacin dependen de la temperatura y de la concentracin de sales, pero adems, depende de otro factor, de la homologa entre las cadenas, es decir, de cuantos nucletidos complementarios presenten. Cuantos ms, mas fuerte ser la unin y ms difcil de separar. Esto se puede aprovechar para controlar en una hibridacin southern el % de similitud de la sonda con el DNA que queremos detectar. Modificaremos la temperatura y concentracin salina de la hibridacin y de los lavados para hacer la hibridacin ms o menos restrictiva.

2.5.5.- HIBRIDACIN NORTHERN

El mtodo es similar al Southern solo que en lugar de ADN digerido se corre en el gel ARN. De esta manera lo que se detecta es si el gen en concreto se esta transcribiendo o no.

2.5.6.- NORTHERN REVERSO

En este caso lo que se fija al filtro es ADN pero no ADN genmico sino fragmentos de genes (sondas) y lo que se marca es ARN total que se copia a cDNA en presencia de nucletidos marcados (ver ms adelante RT-PCR).

2.5.7.- HIBRIDACIN WESTERN

En este caso se emplean geles de acrilamida en los que se corren protenas, que tambin se transfieren a una membrana. En este caso la hibridacin se realiza con anticuerpos.

2.5.8.- HIBRIDACIN DE COLONIAS BACTERIANAS O CALVAS DE FAGOS

Las bacterias o fagos se hacen crecer en una placa de petri, normalmente. Luego se transfieren a una membrana y las clulas o fagos se lisan, liberando el ADN, que luego se desnaturaliza. Tras esto se realiza la hibridacin.

2.5.9.- SLOT AND DOT BLOTS

El DNA o RNA no se separa por electroforesis antes de fijarlo a una membrana sino que una gota se deposita sobre la misma y luego se fija.

2.6.- SECUENCIACIN DEL ADN

Otra tcnica propia de la Ingeniera Gentica es la determinacin de la secuencia de nucletidos de un ADN, conocida como secuenciacin de dicho cido nucleico. El mtodo ms usado para la secuenciacin es el conocido como tcnica de terminacin de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado conocindose actualmente como la tcnica del didesoxi. Se denomina as por ser necesario los didesoxirribonucletidos, dNTPs que han perdido su grupo alcohol OH del carbono 3'. Como los nucletidos se unen por este grupo OH del carbono 3', hay que pensar que si nos encontramos con un didesoxinucletido ser imposible que se una otro nucletido y la cadena terminar aqu. Abreviadamente, ste sera el mtodo a seguir: Como la tcnica se basa en la sntesis de ADN, para hacer la reaccin de secuenciacin se necesita:

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Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar. Como "cebador" para iniciar la sntesis, se necesita un corto oligonucletido complementario del extremo de la cadena. desoxinucletidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP. didesoxinucletidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciacin.

Al aadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerizacin en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucletido. Se produce un conjunto de cadenas dobles cuyas longitudes dependen de la situacin del didesoxinucletido incorporado. En el caso expuesto en el dibujo, esta reaccin de secuenciacin se hace con un didesoxi de ADENINA, lo que significa que cuando se incorpore esta Adenina no podr continuarse la polimerizacin de nuevos nucletidos, nos queda por tanto un pequeo fragmento de ADN que termina en la ADENINA, lo que nos dice que en el ADN original, en ese lugar estar el nucletido complementario que lleva TIMINA. En el caso expuesto deducimos tres fragmentos con 5, 10 y 14 nucletidos (sin contar el cebador) en cuyos extremos tenemos ADENINA, nos permite interpretar que en el ADN original, en esas situaciones tendremos TIMINA. Deben prepararse cuatro reacciones de secuenciacin, cada una con un didesoxi distinto. Los fragmentos resultantes se separan por tamao mediante electroforesis, se autorradiografan, y la sucesin de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparndolas entre s, dan la secuencia del ADN. Este mtodo tiene la gran ventaja de poderse automatizar. El marcaje se realiza con fluorescencia y los geles se corren en aparatos que la detectan al mismo tiempo que se realiza la electroforesis.

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3.- LIBRERAS DE DNA

3.1.- CONCEPTO DE LIBRERA
Una librera de DNA es una coleccin de clones de vectores que contienen fragmentos de DNA diseada de tal manera que, mediante un determinado sistema de seleccin, se pueden llegar a separar los clones de inters. As pues, una librera de ADN podra ser una coleccin de fagos que contienen una muestra representativa de fragmentos de un genoma (librera genmica) o una coleccin de bacterias que contienen plsmidos en los que se ha clonado una muestra significativa de los genes que se transcriben en un determinado tejido. Por tanto, para tener una librera deberemos tener: Un sistema eficiente de clonaje de ADN, puesto que deberemos manejar un nmero considerable de clones. Un sistema de seleccin de los clones que nos interesan de entre toda la coleccin. Un sistema para la obtencin de una muestra representativa del ADN a estudiar. Segn cual sea el propsito de nuestro estudio existen diversos tipos de libreras: Libreras genmicas: se elaboran a partir de ADN genmico de una especie que se digiere hasta un tamao suficientemente pequeo para ser clonado en el vector de una manera mas o menos al azar. La deteccin se realiza mediante hibridacin de sondas. Libreras de cromosomas especficos: como las anteriores pero a partir de ADN de determinados cromosomas purificados. La deteccin se realiza mediante hibridacin de sondas. Libreras de cDNA: se realizan a partir de mRNAs de un tejido particular. La deteccin se realiza mediante hibridacin de sondas. Libreras de expresin: como el anterior pero el clonaje se realiza de tal manera que la bacteria es capaz de transcribir y traducir la protena codificada por el fragmento de ADN. La seleccin se realiza detectando la protena en s mediante anticuerpos, o bien alguna manifestacin de su actividad.

3.2.- LIBRERAS GENMICAS

Un problema tpico de la Biologa Molecular es que el investigador cuente con ADN de un gen en una determinada especie y desee aislar el mismo gen en otra especie. Una manera de hacerlo es mediante libreras genmicas. Las libreras genmicas requieren de un vector que permita el clonado de fragmentos relativamente grandes de ADN. Tradicionalmente se haban usado fagos, pero en la actualidad tambin se emplean BACs. Se asla DNA genmico de la especie de inters y se realiza una digestin con un enzima de restriccin adecuado de manera que genere fragmentos de tamao medio adecuado para el vector seleccionado. Muchas veces se utilizan digestiones parciales. Esto adems permite que los distintos clones puedan solaparse, permitiendo cubrir la totalidad del genoma. El DNA digerido se somete a electroforesis, se aslan los fragmentos del tamao adecuado, se ligan en el vector y se realiza su amplificacin. De esta manera se generan colecciones de colonias de bacterias o de calvas de fagos cada una conteniendo un fragmento determinado del genoma. Para seleccionar el que nos interesa, dichas calvas o colonias se transfieren a una membrana sobre la que se extrae y desnaturaliza el ADN, que se fija a la misma. Dicha membrana se utiliza para hibridarla con la sonda del gen conocido. Si una secuencia suficientemente similar se encuentra en algn lugar de la membrana se producir una hibridacin que podr ser detectada mediante autorradiografia, por ejemplo si se trata de sondas marcadas con radioactividad. Se denomina cribado (screening) al proceso de seleccin de un clon que nos interesa de todos los que forman una liberia.

3.3.- LIBRERAS DE cDNA

Uno de los problemas que tienen las libreras genmicas es que debido al gran tamao de los genomas es necesario un muy elevado nmero de clones para cubrirlas en su totalidad. Por otra parte, los genes contienen intrones que, muchas veces, pueden no interesarnos, y que complican el aislamiento de la regin codificante. Estos problemas podran resolverse si furamos capaces de clonar mRNAs. Seleccionaramos un tejido en que la

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expresin de nuestro gen fuera elevada y construiramos una librera con ellos. Este es el principio en que se basan las libreras de cDNA. La construccin de una librera de cDNA comienza con la extraccin de mRNA de un determinado tejido u rgano. Este RNA se copia a DNA de cadena simple mediante la accin de la Transcriptasa Reversa. EL hbrido DNA-RNA es tratado con RNAsaH, que degrada el RNA, y finalmente se realiza la sntesis de la segunda cadena de DNA. De esta manera se obtienen colecciones de fragmentos de ADN complementarios a los mRNAs de un tejido (cDNA). Estos fragmentos se introducen en un plsmido (lo ms usual) y se transforman bacterias. Se genera as una coleccin de clones que forman una librera que puede seleccionarse por hibridacin, como en el caso de las libreras genmicas, o por otros mtodos.

3.4.- LIBRERAS DE EXPRESIN

Dado que en el caso de los cDNA los fragmentos corresponden a DNAs codificantes, se han diseado estrategias en las que la seleccin no se realiza por hibridacin sino mediante la produccin de protenas codificadas por el plsmido. En estos casos los vectores se disean de tal manera que el cDNA posee una regin promotora procariota en 5 que dirige la sntesis de mRNA que, si la pauta de lectura lo permite, ser traducido a protena. As, en principio, las colonias de bacteria (levadura, clulas de insecto) produciran la protena codificada por cada cDNA. El cribado en estos casos puede realizarse mediante anticuerpos. Otra posibilidad es que el cribado se base en algn ensayo biolgico. En estos casos se habla de libreras de expresin.

3.5.- CRIBADO DIFERENCIAL

Sirve para comparar patrones de expresin en tejidos diferentes o en el mismo tejido en condiciones diferentes.

3.6.- LIBRERAS DE SUSTRACCIN

En ocasiones no nos interesar tener una librera completa de cDNAs sino que preferiremos que solo contenga ciertos cDNAs y no otros. Una librera de sustraccin es aquella que contiene cDNAs correspondientes a mRNAs presentes en un tejido pero no en otro. Por lo tanto, necesitamos un paso en el que se eliminen los mRNAs presentes en ambos tejidos. Se preparan libreras de cDNA de ambos tejidos. Se prepara un pool de DNA de cada librera y la del dador se digiere con un enzima que libere los insertos (EcoRI, por ejemplo) y la sustrada se digiere con AluI o RsaI, generando fragmentos cortos. Se mezclan ambas poniendo la segunda en un exceso de 50 veces. Se calienta y se dejan renaturalizar lentamente. Los fragmentos resultantes se clonan en un plsmido en la diana EcoRI.

3.7.- NORMALIZACIN DE LIBRERAS DE cDNA

Se calcula que una clula puede estar transcribiendo ms de 10.000 genes al mismo tiempo y que la abundancia de los mensajeros puede variar del orden de 1 a 200.000 copias de mRNA por clula. Por regla general, se supone que en un momento dado en una clula habrn unos 10 a 20 genes que se transcribenm mucho, unos cientos que se transcriben de manera moderada y unos miles que se transcriben poco o muy poco. En esta situacin, si quisieramos tener al menos un clon de cada gen, el nmero total de clones a analizar debera ser de cientos de miles. Por eso es interesante que las librerias sean normalizadas, es decir, que se haya reducido su redundancia. El mtodo ms usado para ello est basado en las propiedades de reasociacin de las molculas de ADN de doble cadena. Bsicamente, aquellas molculas ms abundantes hibridaran antes que las menos abundantes. Si una muestra de ADN de doble cadena es desnaturalizado (cDNAs por ejemplo) y se deja renaturalizar en las condiciones adecuadas limitantes, solo las molculas ms abundantes habrn podido encontrar pareja. Los cDNAs correspondientes a genes poco abundantes quedarn como cadenas simples. Si esta muestra la digerimos con una DNAsa que solo reconozca DNA de doble cadena, digeriremos los cDNAs de genes abundantes, reduciendo su representacin, y aumentando, por tanto, la de los genes poco expresados. Se inactiva la DNAsa y se realiza un nuevo ciclo de PCR para completar las dobles cadenas.

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4.- PCR
4.1.- CONCEPTO DE PCR
La PCR se basa en el uso de DNA polimerasas. Como ya se ha comentado este enzima es capaz de convertir una molcula de DNA de cadena doble en dos molculas idnticas de doble cadena tambin. Para ello necesita que el DNA se desnaturalice, unos oligonucletidos que acten como iniciadores y los nucletidos precursores. Si se coloca todo esto en un tubo en las condiciones adecuadas, la reaccin tiene lugar. Cul es entonces la innovacin de la PCR? 1.- El empleo de oligos especficos. El oligonucletido iniciador se une al DNA a copiar por apareamiento de bases. Si el oligo se disea con una secuencia especfica, la parte del DNA que copiar la polimerasa ser la que se encuentre despus de esa secuencia. Si se disean dos de estos oligos a ambos extremos de la secuencia que nos interesa, y que hibriden en las cadenas contrarias, la polimerasa amplificara especficamente la zona entre ambos lugares de hibridacin. 2.- Si lo anterior se repite cclicamente, lo que tendremos es una amplificacin espefcica y exponencial del fragmento de ADN situado entre ambos iniciadores. As pues, una reaccin tpica de PCR consistira en lo siguiente: Se mezclan en un tubo DNA, oligos, dNTPs y la polimerasa con la combinacin de sales adecuada, y se somete a los siguientes ciclos de temperatura: 1.- Desnaturalizacin: unos 94C. El DNA se desnaturaliza. 2.- Anillado: la temperatura se reduce a, por ejemplo 55C. Los oligos se unen al DNA en los lugares especficos. 3.- Extensin: tpicamente a 72C, que es la temperatura ptima de la Taq polimerasa,. Se produce la sntesis del ADN. Estos tres ciclos se repiten unas 30 veces. En cada ciclo una molcula de ADN se convierte en otras dos, nicamente en el fragmento entre los dos oligos. Gracias al gran poder de amplificacin, el uso de la PCR permite obtener cantidades manejables de DNA (tericamente tanto como queramos) a partir de, en caso extremo, una nica molcula de ADN inicial. Problema: la polimerasa ms utilizada hasta el desarrollo de la PCR era la DNA polimerasa I. Este enzima se inactiva a temperaturas altas, por lo que si se empleara para la PCR habra que adicionar enzima en cada ciclo, lo cual sera econmicamente inviable. El xito de la PCR se debe en parte al descubrimiento de determinadas polimerasas capaces de aguantar las altas temperaturas. La primera fue la Taq polimerasa, pero actualmente se conocen otras.

4.2.- APLICACIONES DE LA PCR 4.2.1.- AISLAMIENTO DE GENES

La PCR puede sustituir en algunos casos al cribado de libreras. El factor limitante es que precisa de secuencias conocidas para disear oligonucletidos. Si lo que queremos, por ejemplo, es ampliar un gen de una especie que ya se conoce en otra, podemos intentar disear unos oligos en las zonas ms conservadas del gen conocido, y utilizarlos en una PCR con el DNA de la especie nueva.

4.2.2.- SECUENCIACIN
Una de las razones ms comunes para el uso de la PCR es la formacin de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciacin. Es mucho ms sencillo y rpido que la clonacin en clulas. Por otro lado, la propia reaccin de secuenciacin puede realizarse mediante una modificacin de la reaccin de la PCR en la que se usa un nico oligo.

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4.2.3.- RT-PCR (reverse transcriptase PCR)

Es un mtodo que permite amplificar gran cantidad de un fragmento de ADN a partir de un mensajero o cualquier otro RNA. Se compone de dos ciclos: 1- Transcripcin reversa: la RT genera una cadena de DNA simple complementaria a los RNAs presentes en la muestra. 2.- PCR: el uso de iniciadores especficos que amplifican por PCR un fragmento a partir del DNA de cadena simple anterior. El RNA puede obtenerse por cualquiera de los mtodos conocidos. La RT tambin necesita, como las DNA polimerasas, de un oligo iniciador. Este puede ser especfico o inespecfico, como poliT o una mezcla ms o menos al azar.

4.2.4.- REAL TIME QUANTITATIVE PCR

Uno de los problemas de la RT-PCR respecto a, por ejemplo el Northern, es que no es cuantitativo, es decir, no refleja fielmente el grado de expresin de los genes, por lo que no permite comparar muestras. Existen mtodos para hacer la RT-PCR ms cuantitativa. Uno de ellos es la PCR competitiva, que consiste en aadir cantidades conocidas de sonda a la muestra o realizar una doble PCR con un gen de inters y otro de expresin constitutiva. Sin embargo, no siempre resulta fcil hacer estas comparaciones. Un mtodo ms preciso, pero tambin ms sofisticado es el de la Real Time Quantitative PCR. Este mtodo se basa en la deteccin de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de producto de PCR producido. El mtodo se basa en el uso de tres iniciadores. Dos de ellos correspondern a los normales de una reaccin de PCR. El tercero hibridara entre los dos anteriores y contiene dos nucletidos modificados. En 5 se le aade un fluorocromo (normalmente 6-carboxyfluoresceina 6-FAM) y en cualquier T del iniciador se le aade 6-carboxitetrametil-rodamina (TAMRA). El 6-FAM emite fluorescencia detectable por un sensor adecuado, pero cuando una molcula de TAMRA esta cerca dicha fluorescencia es inhibida. Por tanto, el iniciador no emite fluorescencia. Sin embargo, cuando la Taq polimerasa realiza la copia y llega al primer, su actividad exonucleasa lo degrada, separando el 6-FAM del inhibidor y produciendo fluorescencia, que resultar proporcional a la cantidad de producto generado. Dicha fluorescencia puede ser medida en cada ciclo en un aparato adecuado, y si se emplean los controles adecuados, esto permite comparar muestras.

4.2.5.- PCR INVERSA

Sirve para amplificar las regiones flanqueantes a una conocida. Se basa en el corte y ligacin para generar molculas circulares, que luego se amplifican por PCR normal.

4.2.6.- GENOME WALKING

Es un mtodo basado en la PCR que permite amplificar regiones de genoma contiguas a una de secuencia conocida. Se basa en la digestin al ADN genmico con un enzima de restriccin de extremos cohesivos y la posterior ligacin de un adaptador a los extremos de manera que la secuencia ese adaptador sirva de iniciador de una posterior PCR, junto con iniciadores especficos de la regin conocida.

4.2.7.- RACE PCR

Es un mtodo basado en la PCR que permite completar la secuencia de un cDNA.

4.2.8.- DIFFERENTIAL DISPLAY

Es un mtodo basado en la RT-PCR para detectar genes que se expresan especialmente ms o menos en un tejido respecto a otro.

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4.2.9.- PCR-SELECT cDNA SUBTRACTION Suppression subtractive hybridization (SSH)

Es un mtodo que permite seleccionar mRNAs que son ms abundantes en una muestra que en otra. Para ello se utiliza el RNA muestra y el RNA control. Se sintetizan cDNAs de ambos. En el caso de la muestra se realiza por duplicado y utilizando inciadores diferentes en cada caso. El control se sintetiza sin iniciadores o con unos distintos. Se mezclan cDNAs control y muestra, las dos rplicas por separado, poniendo el control en mucha mayor abundancia. Se desanaturalizan y se dejan reasociar. Podremos tener homodimeros, heterodimeros o cadenas simples. El segundo paso consiste en mezclar las dos hibridaciones y dejar que hibriden de nuevo. Las cadenas simples se reasociaran. Aquellas que tengan los dos inciadores diferentes, uno a cada extremo, solo podran provernir de esta hibridacin y son, bsicamente, los mRNAs que buscamos. Se les aaden adaptadores para completar las cadenas y se realiza una PCR. Los inciadores estan diseados de tal manera a que a una temperatura determinada de anillamiento los iniciadores se hibridan consigo mismos e impiden la accin de la PCR. De tal manera, solo los cDNAs mixtos se amplificarn exponencialmente, mientras que las molculas con un solo iniciadorlo haran linealmente. Finbalmente se clonan en plsmidos.

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5.- GENMICA FUNCIONAL

5.1.- PROYECTOS GENOMA
La secuenciacin de un genoma completo obviamente permite descubrir la secuencia de todos los genes. Sin embargo, el trabajo no es tan sencillo. Por una lado, a partir de la secuencia cruda hay que identificar los genes, cosa que no siempre es obvia. En segundo lugar, una vez identificados los genes hay que conocer como se regulan y para que sirven. Por tanto, si bien la obtencin del genoma completo es de grandsima ayuda, no lo es todo.

5.2.- PROYECTOS DE SECUENCIACIN DE ESTs

Un EST (Expressed Sequence Tag) no es ms que una secuencia parcial de un cDNA clonado. Por lo tanto, un proyecto de secuenciacin de ESTs consistir en la obtencin de un nmero elevado de secuencias parciales a partir de una coleccin de cDNAs clonados, o sea, a partir de una librera de cDNAs. Como a librera de cDNAs, los ESTs sern una representacin de los genes que se estn transcribiendo en un tejido, en un momento determinado en una especie concreta. Particularidades: Normalmente se secuencian una sola vez, por lo que no son secuencias 100 % libres de errores. Son redundantes, es decir, aquellos genes que ms se transcriben son los que ms secuencias presentan. (existen mtodos para reducir la redundancia).

Para que sirven? Saber que genes se transcriben en un determinado momento Saber si nuestro gen se transcribe en un tejido. Descubrir genes o confirmar posibles genes descubiertos en un proyecto genoma. Confirmar los lmites de un gen y sus intrones. Secuenciar genes (en especies donde no se tiene el genoma completo)

Particularidad: Hemos visto que las libreras de cDNA se realizan a partir de cDNA sintetizado usando poliT como iniciador de la transcriptasa reversa. Esto no siempre tiene que ser as. Por ejemplo, si nos interesa un gen en concreto podemos usar un iniciador especfico de ese gen. Tambin podemos usar iniciadores al azar, o ms o menos al azar. Esto quiere decir que no siempre los ESTs han de representar las secuencias de los extremos del RNA. Adems, la transcriptasa reversa puede no copiar completamente el mRNA con lo que las secuencias 5 no siempre corresponden al extremo del mensajero. Esto, que en otras circunstancias puede ser malo, en el caso de los ESTs no necesariamente ya que nos permite tener secuencias parciales a lo largo de todo el gen, con lo que se pueden solapar y obtener una secuencia mucho ms completa del mismo.

5.3.- MICROCHIPS DE DNA

La tcnica de microchips (o microarrays) de DNA es un mtodo que lo que pretende es identificar genes que se transcriben ms o menos en una determinada circunstancia respecto a otra. Por ejemplo, todos los genes de hoja de arroz que se inducen por calor. Por lo tanto, en sus objetivos no es diferente a, por ejemplo, un northern, un differential display o una librera de sustraccin. La diferencia radica en que en el caso de microchips el nmero de genes que se estudia en un solo experimento es muchsimo mayor (potencialmente, se pueden estudiar todos los genes). La tcnica de los microchips est basada en la existencia de bancos de ESTs. Si uno secuencia el nmero suficiente de cDNAs en un nmero suficiente de tejidos podra, en teora, aislar DNA de cada uno de los genes de un organismo, DNAs que podran usarse como sondas. Si uno pudiera inmovilizar estas miles de sondas sobre un filtro podra marcar mRNA mediante transcriptasa reversa y nucletidos marcados, e hibridar esas sondas, apareciendo cuales y cuanto se transcriben en ese tejido concreto. Esta es la base del microchip solo que: Las sondas no se fijan sobre una membrana sino sobre un vidrio Las cantidades de sonda utilizadas son mnimas para reducir el espacio Los mRNAs se marcan con fluorescencia Se realizan dos hibridaciones simultneas con RNAs marcados con distinta fluorescencia, esto permite comparar la expresin de los genes en dos condiciones diferentes.

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Los microordenamientos (microarrays) son soportes slidos sobre los que se han fijado pequeas cantidades de ADN cuya secuencia es especfica para un gen distinto de modo que cada punto en el microordenamiento corresponde a un gen determinado. La informacin gentica es copiada en el ncleo celular en forma de ARN mensajero (ARNm) y transferida luego a los ribosomas, partculas citoplsmicas en las que tiene lugar la sntesis de protenas. Para establecer qu genes se encienden (es decir inician o aceleran la sntesis de la protena que codifican) ante cierta respuesta biolgica o situacin metablica, los microordenamientos de ADN se hibridan (esto es, se aparean a travs de bases complementarias) en forma simultnea con dos colecciones de ARNm obtenidas del mismo organismo, una en ausencia y otra en presencia del estmulo. Estas dos poblaciones de ARNm estn unidas a dos sustancias fluorescentes distintas (fluorforos). El ARNm hibridado (cuya secuencia es complementaria a la secuencia de los genes) se visualiza bajo un microscopio por su emisin fluorescente. De acuerdo con las relaciones entre los dos tipos de emisin fluorescente, puede determinarse si un determinado ARNm se ha transcripto ms o menos o si el nivel de su transcripcin no se ha modificado. Ello permite establecer qu genes estn involucrados en cada situacin experimental. En la figura se muestra un microordenamiento conteniendo las secuencias de 11.500 genes que ha sido hibridado con poblaciones de ARNm de plantas de Arabidopsis thaliana obtenidas antes (fluorescencia verde) y despus (fluorescencia roja) del ataque del hongo Erysiphe cichoracearum. Las flechas sealan a los genes que se han expresado en respuesta al patgeno. Un punto rojo (flechas) significa expresin incrementada, un punto amarillo igual expresin, uno verde expresin disminuida y uno negro ausencia de expresin. La imagen muestra que unos setenta genes han variado su nivel de expresin luego del ataque del patgeno. Esta informacin ser usada luego para comprender los mecanismos de defensa involucrados. El anlisis se realiza mediante computadoras que identifican los genes candidatos y proveen toda la informacin disponible sobre los mismos. El microordenamiento ha sido impreso en vidrio cuyo tamao real es de 22 x 40mm. El inserto muestra una ampliacin de tres bloques del microordenamiento conteniendo 360 genes cada uno. Existen variaciones de este mtodo. Por ejemplo, en lugar de usar soportes de vidrio se pueden usar soportes de nylon e hibridarlos con sonds marcadas radioactivamente. La ventaja es el precio, pero la desventaja es que no permiten dobles marcajes y que los puntos no pueden ser tan pequeos, por lo que se precisa mayor espacio para estudiar el mismo nmero de genes. Otra variacin del mtodo consiste en que en lugar de fijar ADN en el vidrio, se utilizan oligos, es decir, pequeas cadenas de ADN, que se sintetizan en el mismo porta y cuya secuencia puede ser diseada a gusto del consumidor.

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6.- GENTICA REVERSA

6.1.- COLECCIONES DE MUTANTES
Hasta ahora los mtodos explicados de descubrimiento de genes se basan en primero encontrar el gen y luego demostrar su funcin. Una alternativa a este sistema consiste en lo contrario, primero ver una funcin y despus clonar el gen. Es lo que se conoce como gentica reversa. Existen varios tipos de gentica reversa. Por ejemplo, cuando las libreras de expresin se criban buscando actividad de protenas en realidad podra considerarse como tal. Sin embargo cuando hablamos de plantas normalmente entendemos por gentica reversa la generacin de gran nmero de mutantes de los que seleccionaremos aquellos cuyo fenotipo sea de nuestro inters. Una vez seleccionado, iremos a buscar el gen que produce la mutacin. Existen varias maneras de generar mutantes, por ejemplo, mediante radiaciones ionizantes, ultravioleta, EMS o insercin de transposones o T-DNA, etc. Los sistemas de mutagnesis qumica (EMS) o fsica (radiaciones) son ms sencillos, pero generan mutaciones puntuales, y la nica manera de encontrar el gen mutado es mediante mapeo y paseo cromosmico. Adems, dichas mutaciones no pueden ser revertidas. La insercin de transposones y T-DNA tienen la ventaja de que la propia secuencia del elemento puede ayudarnos a localizar el gen mutado. En el caso de los transposones, estos adems, en determinadas circunstancias, pueden escindirse y revertir la mutacin, lo cual es una prueba concluyente de la relacin mutacin / fenotipo. El uso de transposones para identificar genes se denomina transposn tagging, y el uso de elementos de insercin en general se denomina gene tagging.

6.1.1.- CRIBADO DE LIBRERAS DE MUTANTES

Una manera de recabar informacin sobre la funcin de un determinado gen es ver que pasa cuando se inactiva, es decir, mutarlo. No existe una manera sencilla de mutar un gen de una planta pero si que se han desarrollado mtodos que permiten seleccionar mutantes de genes determinados a partir de colecciones de lneas mutadas. Para ello primero se genera un nmero suficiente de lneas de insercin (con transposones o T-DNAs insertos), en principio, al azar por todo el genoma. A partir de aqu se pueden realizar dos estrategias: Cribado por PCR Se extrae DNA genmico de cada una de las lneas y se emplea para una reaccin de PCR en la que uno de los iniciadores es del gen que nos interesa y el segundo corresponde al transposon o T-DNA. Para reducir el nmero de reacciones se pueden hacer pools de DNAs. De esta manera nicamente aquellas plantas que tengan la insercin cerca del lugar de anillado del primer especfico generarn una banda. A partir de aqu se puede identificar de que planta original proviene la banda y generar mutantes de nuestro gen. Transposon insertion site sequencing En este caso tambin se extrae DNA de cada lnea, pero no se generan pools sino que se secuencia de cada lnea el fragmento de DNA junto al lugar de insercin. Con estas secuencias se genera un banco. Si nos interesa encontrar un mutante de nuestro gen solo tenemos que comparar la secuencia del mismo con el del banco. Si tal mutante existe, encontraremos una secuencia 100% (o casi) homloga a nuestro gen y podremos recuperar la planta de la cual proviene.

6.2.- TRANSPOSON TAGGING 6.2.1.- CONCEPTO DE ELEMENTO TRANSPONIBLE

Los elementos transponibles o transposones son fragmentos de ADN que tienen la capacidad de moverse de un lugar a otro del genoma. Si cuando se insertan lo hacen dentro de un gen, pueden producir mutaciones en el mismo. Los transposones codifican una protena denominada transposasa que es la responsable del salto. La transposasa reconoce los extremos de la secuencia del transposn (que son muy conservados), escinde el elemento y lo inserta en otro lugar del genoma. Los transposones se presentan en un nmero elevado de copias

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en los genomas, pero no todos estn en forma activa. Algunos pueden haber perdido la transposasa. Sin embargo, aun sin transposasa, si conservan los extremos, pueden saltar, si alguna otra copia es capaz de sintetizar transposasa.

6.2.2.- TRANSPOSON TAGGING

Se han clonado y secuenciado numerosos elementos transponibles. Dado que el nico requerimiento para el salto es que los extremos estn conservados, se puede sustituir el interior por cualquier secuencia o gen que nos interese. Por ejemplo, si queremos trabajar en maz podemos modificar un transposn de maz introducindole una secuencia que no est presente en su genoma. Este transposn modificado se introduce en el maz junto con una gen artificial que contiene la transposasa bajo el control de un promotor, de manera que la podamos activar a voluntad. Cuando transposasa y transposon modificado estn juntos, el transposn saltar a nuevos locus, algunos de los cuales pueden producir mutaciones. Una vez seleccionada la mutacin, podremos encontrar el gen responsable empleando como sonda la secuencia que no se encuentra en el maz, bien elaborando una librera y por cribado, bien por PCR inversa, por ejemplo. Una modificacin del transposn tagging es que en lugar de un transposn modificado se use un T-DNA que se introduzca en la planta mediante infeccin con Agrobacterium. Ambos sistemas tienen ventajas y desventajas. En general, la introduccin de T-DNAs en las plantas es ms sencillo y adems, se integran en mayor nmero de copias, con lo cual es mas probable que generen una mutacin. Esto, que por un lado es una ventaja, tambin puede ser una desventaja puesto que si hay ms copias, luego es mas complicado identificar cual de ellas es responsable de la mutacin. Pero por otro lado, los transposones tienen otras ventajas. Los transposones suelen insertarse como copias simples mientras que los TDNA a menudo generan reordenamientos o se integran en tandems. Adems, los transposones pueden escindirse mientras que los T-DNAs quedan permanentemente en el lugar donde se han insertado.

6.2.3- ENHANCER Y GENE TRAP

Ambas son modificaciones del sistema de transposon tagging mediante las cuales no se pretende detectar fenotipos mutantes sino que lo que se busca es detectar promotores, o elementos de un promotor que se activen en tejidos determinados o bajo determinadas circunstancias. Los transposones (o T-DNA) son modificados convenientemente para producir la actividad de un gen reportero en el caso de que el elemento se inserte dentro o cerca de un promotor. Al igual que el anterior, el elemento modificado se introduce en el genoma, se moviliza, y se generan colecciones de lneas las cuales son examinadas en este caso buscando actividad del gen reportero. Diferencias respecto al transposon tagging: Puede detectar genes que si se mutan son letales. Puede detectar genes de funcin redundante.

Tipos de construcciones empleadas en Transposon tagging

Elemento donador de transposasa No contiene ningn gen marcador, solo produce mutacin por su propia insercin. Enhancer trap reporter genes Contienen un promotor mnimo que solo se expresa en el caso de que el elemento se inserte tras elementos cis de un promotor. Promotor trap Solo contiene el gen reportero por lo que nicamente se activa cuando se inserta detrs de un promotor completo. Exon trap Semejante al anterior pero el gen reportero contiene aceptores de splicing al inicio, de manera que si se inserta dentro de un gen puede generar protenas de fusin con el gen reportero. Genes reporteros habituales en plantas son; -glucuronidase (GUS) Green fluorescent protein (GFP)

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Las construcciones llevan adems genes que permiten seleccionar aquellas lneas que contienen transposones. Por ejemplo, en el caso anterior, el gen de la neomicina fosfotransferasa (NPTII) que confiere resistencia a la kanamicina.

6.3.- TARGETING INDUCED LOCAL LESIONS IN GENOMES (TILLING)

Es un sistema para generar y aislar mutantes en genes determinados que se basa en el uso de la mutagnesis qumica. El sistema del TILLING funciona de la siguiente manera: 123456Se somete a una lnea a mutagnesis con EMS. Se regenera un nmero suficiente de lneas para cubrir el nmero de mutantes en todo el genoma que nos interese. Se extrae DNA genmico de cada lnea. Se disean iniciadores alrededor de la zona que nos interesa obtener mutantes (1 kb de distancia) Los DNAs se agrupan en pools de 8 a 12 y se realiza la PCR. Los fragmentos obtenidos se desnaturalizan al calor y se dejan renaturalizar de nuevo.. Pueden ocurrir dos cosas: a. Si no hay mutacin en ninguna lnea todas las molculas se reasociarn 100% b. Si hay alguna mutacin se producirn molculas hbridas en las que al menos un par de bases no quedarn apareados. Un anlisis por HPLC permite distinguir ambos casos y seleccionar las lneas que contienen mutaciones en nuestro gen. Se secuencia el producto de PCR y se determina la mutacin.

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El uso de la mutagnesis qumica tiene ventajas y desventajas respecto a los sistemas de insercin: Ventajas: No requiere el uso de plantas transgnicas Es ms sencillo. La dosis es ms regulable. Genera una coleccin de mutantes del mismo gen Genera mutaciones irreversibles Aplicable a cualquier gen o secuencia Aplicable a cualquier planta Permite la automatizacin

Desventajas: Genera mltiples mutaciones por lo que el proceso de asociar mutacin con fenotipo es ms complejo. Una mejora del mtodo consiste en el uso de la endonucleasa Cel I. Este enzima corta una de las cadenas de ADN cuando hay un desapareamiento. Si la PCR se realiza con un iniciador marcado esto nos permitira localizar el punto de la mutacin sin necesidad de secuenciar. Adems, como la mutagnesis por EMS produce casi siempre transiciones, es decir cambios C/G a T/A, conociendo la localizacin y la secuencia original, se puede deducir la secuencia mutada.

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