renocisrimn E>
Dns: una técnica
de cuantificacion
de azucares reductores
Utilizada en el Laboratorio de Catal
is Enzimatica del TESE
como ingenieros bioguimicos, irremediablemente
Iegamos a enfrentamos con el montaje de técni-
cas que nos permitan analizar las muestras re-
sultantes de los experimentos que realizamos, y poder
asi generar las conclusiones adecuadas a ese respecto,
Una de las técnicas analiticas que aprendemos destle
{que estamos estudiando, es la desarroliada por Miller
(1959), Esta técnica sirve para cuantificar los azécares
redutctores producidos durante una fermentacion o para
cuantificar los productos de una reaccién enzimatica,
Con el paso del tiempo y el vertiginaso desarrollo de ta
tecnologia, después de casi 50 afios, esta t6enica ha
suftido algunas modificaciones, sin embargo, en esen-
cia sigue siendo lo mismo, Cada laboratorio que la em-
plea, debe respetar la composicin del reactivo DNS,
aunque puede modificar las cantidades de reactivo y de
‘muestra que emplearé. Es importante recordar que siem-
pre que hagamos una modificacién, de-
bbemos comprobar que no se est afec-
tando la linealidad de! método. El preset
te trabajo describe detalladamente lat
nica utilizada por el Laboratorio de Cat
lisis Enzimética del TESE, para 1a
cuantificacién de aziicares reductores de
las muestras generadas durante el desa-
rrollo de los diversos proyectos de inves-
tigacién que se trabajan.
Preparacién del reactivo DNS
La composicién de este reactivo, en gil
s: Es importante recalear que, para po-
Profesora investigadora del Laboratorio
de CathlsisEneimatica del TESE.
Tecnoligice de Estudios Syperiores de Fcatepee
der disolver el dcido dini-trosalicilico, el hidréxido de
sodio deberd estar completamente disuelto.
Una vez preparado, el reactivo deberd almacenarse en
un recipiente color ambar, a temperatura ambiente, Este
reactivo dura aproximadamente un mes antes de mos-
trar precipitacion de los reactivos 0 vestigios de des~
composicién. Debido a lo anterior, se recomienda hacer
los caleulos adecuados para preparar solo la cantidad
requerida de reactivos y evitar el desperticio.
Elaboracién de la curva patron
Segiin la ley de Lambert y Beer, laabsorbancia es directa-
mente proporcional a la eoncentracién del material que
absorbe la luz, al que generalmente conocemos como
analito (Rubinson y Rubinson, 2000). Siempre que se
utiliza un método espectrofotométrico para cuantificar la
concentracién de analito presente en una muestra proble-Ca
ma, es necesario relacionar Ia concentracién de dicho
analito con Ia cantidad de luz que absorbe del haz que le
incide. Sabiendo que ésta es una relacién aproximada-
ayes
Hidréxido de sodio granular 10
Acido dinitrosalicitico 10
Sulfito de sodio anhidro 85.0
Fenol 02.0
mente lineal, lo mis recomendable es preparar una soli
ign estindar, con una concentracién conocida de analito
‘y hacer diversas diluciones de la misma, para poder obte-
her dicha relacién y expresaria mateméticamente con la
ayuda de la ecuacién de la recta, Y = mX +b, En este
caso, m ser la pendiente de esta recta, b la ordenada al
origen, X sera la concentracién de analito, y Y la
absorbancia observada para cada concentracién. La téeni-
ca de DNS cuantfica, como maximo, una concentra-
cién de azicar de un mg/ml. Por lo tanto, la solucién
estindar deberd tener esa concentracién.
A partir de esta solucién se deberan realizar las dilucio-
hes correspondientes para construir una curva patrén,
con la que se determinard la concentracién del analito
en la muestra problema, a partir de la ecuacién de la
recta antes meneionada, Las diluciones que servirdn para
la construecién de la curva deberdn realizarse por dupli-
cado, a fin de construir fa curva con los promedios de
las dos lecturas obtenidas por cada dilucién, Ademas,
deberd indicarse dentro de la grifiea la desviacién
esténdar de las lecturas, para poder asi valida la preci-
sidn en el trabajo del analista. Por tal razén, cada vez
que se prepare el reactivo DNS es necesario construit
luna curva patrén, con la que se cuantificard el analito de
las muestras tratadas con ese reactivo en especitico,
Es importante mencionar que, si se tiene la sospecha de
‘que la muestra problema posee una concentracién ma-
yor aun mg/ml, serd necesario realizar una dilucién de
a misma, previa a la determinacién, para asegurar que
las lecturas podran ser interpoladas en la curva patron,
Reaccion del azucar con el DNS
Todas las mucstras, tanto las que componen a la curva
patrén como las que constituyen el problema, deberdin
tratarse utilizando el procedimiento que se describe a
continuacién:
Paso I. Se deberé tener un ml total de muestra, Cuando
se requiera de una dilucién, se pondré una cantidad ade-
ccuada (menor a un ml) de la muestra que contiene el
azicar, y se completard a un ml uilizando agua destila-
da. De tal forma que, sise utilizan 0.5 ml de muestra, se
deber’ agregar 0.5 ml de agua, para completar a un ml.
Paso 2. Una vez completado el volumen, se agregarin
tres ml del reactivo DNS y se someterin a ebullicién
durante cinco minutos, Los tubos se podrin enfiar al
chorro del agua o bien podrén dejarse entriar por si so-
los hasta que alcancen la temperatura ambiente.
Paso 3. Se deberan agregar seis mi de agua, para cam-
pletar un volumen final de 10 mi, y se agitarén en el vértex.
Paso 4. Los tubos deberan leerse a $50 nm, calibrando
con el blanco, el cual contiene todos los reactivos, ex-
cepto el problema. Fs decir, contiene un ml de agua,
tres ml de DNS y seis ml de agua,
Se propone un ejemplo
En el Laboratorio de Catélisis Enzimatica se mont6 una
prictica en la que se requerfa conocer el eomportamiento
de una levadura durante una fermentacién aerobia, con
Fespecto a su crecimiento y consumo de sustrato. El azi-
car utiizado en el medio de cultiv fue glucosa, en una
coneentracién de dos gil. Se tomaron muesras a dife-
rentes tiempos y se analiz6 la cantidad de azicar presente
Lo primero que se elabor® fue la curva patron, para ello
se preparé una solucién de glucosa anhidra con una
concentracién de cuatro mg/ml, y por duplicado se hi-
cieron las diluciones indicadas en la tabla 1
A cada uno de estos tubos se les agregé tres ml del reactivo
DNS y se sometieron a ebullicién durante cinco minutos.
‘Cuando los tubos aleanzaron la temperatura ambiente, se
les agreg6 seis ml de agua y se leyeron en el espectro a
550 nm. La figura 1 nos muestra la relacién lineal que
existe entre la concentracién de la glucosa en las mues-
tras y la absorbancia obtenida. Como puede observarse,
la grffca es lineal en todo el rango probado, y la desvia-
cin estindar es pequeita en cada concentracién, lo que
nos indica un buen trabajo del analista
eee 00)
1 0208
Pace ater)
3 06 04
4 0 teem oD!
5 L000
Tabla 1. Preparaci6n de la curva pairén para
cuaniificacion de azticares utilizando el reactive DNS
Investigacion » Clerc «Tecnologia *Cutura
EEFigura 1. Curva patron de glucosa
Debido a la concentracién de glucosa en el medio de
cultivo, fue necesario hacer una dilucién 1:10 de las
uestras tomadas, antes de determinarles su conteni
do de aziicar. Para ello se tom6 un mi de la muestra y
se agregé 0.9 ml de agua, para completar un ml, Una
vez hecha la dilucién, a cada muestra se aadi6 el DNS
(tres ml). Los tubos se dejaron en ebullicién durante
cinco minutos, inmediatamente se dejaron enftiar para
agregarles seis ml de agua, completando asf el volumen
10 ml. Estos tubos se leyeron en el espectrofotometro
8550 nm, calibrando el equipo con un blanco, prepara-
do con todos los reactivos, excepto el problema,
La tabla 2 muestra las lecturas obtenidas después del
tratamiento con DNS.
0 OAL 385
2035503897
40323 0315
6 0298 0275
#0256 0262
W024 0256
2 OI 0163
24 a.402 0.10
26 Goll 001s
28 0013 0.017
Tabla 2. Lecturas de las muestras
de azitear de la cinética
Las lecturas obtenidas al analizar las muestras en el es-
pectro (Abs), se sustituyeron en la siguiente ecuacién:
X=¥-b = Abs+0.0545
m 1.1318
‘Con esta ecuacién, se tenia la cantidad de aziicar, en g/L
Considerando la dilucién, era necesario multiplicar por 10
todos los resultados, y asf se obtuvo la concentracién de
lucosa en cada tiempo de la fermentacién, La tabla 3
‘muestra la coneentracién por cada lectura, asi como los
promedios y la desviacién esténdar de los azéiares.
Teenoligico de Estudios Suporiarcs de Ecatopee
rorcaarien
‘Al graficar el promedio de las lecturas (Figura 2), ob-
‘servamos el consumo de sustrato de la levadura duran-
te la fermentacién.
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Tabla 3. Calculos de fa glucasa contenida en el medio de
cultivo a diferentes tiempos de la cinética
Figura 2. Cinética del consumo de sustrato
de Saccharomyces cerevisiae durante
tuna fermentacién aerobia
Agradecimientos
4 Jos alunos: Maria det Carmen Dominguez Reyes. Martha Blena
Excalona Domingues Noemi Negrete Valencuela Ernesto Rocha
Lines y Nancy Aurora Rosales Toledo, estudiantes del seto semesire.
de Ingentera Bioguinica, quienes participaron en el desarrollo det
ntbajo que se presents como ejemplo en este artical,
Bibliografia
Miller,G L. 1959,""Use of dnitrosalcylicreagent for
peer etene terre ne ae ea
Noee
ieee te
Analitioa Conteny