Tcnicas de estudio de las clulas 1.

Microscopa

Biologa II Enero 2009

Tcnicas de estudio de las clulas

1. Microscopa
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 ptica Flourescencia Contraste de Fases Confocal Microscopa electrnica (TEM y SEM)

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Qu es Microscopa?
La microscopa es la tcnica de producir imgenes visibles de estructuras o detalles demasiado pequeos para ser percibidos a simple vista. En este campo ha habido gran impulso por parte de la fsica.
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Tamao relativo de clulas

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1.1 Microscopa ptica

Un microscopio ptico es un microscopio basado en lentes pticas que nos permiten observar objetos de puequeo tamao. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de este tipo generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamao original. El lmite lo tienen en unas 2000 veces.

Elementos de un microscopio bsico: (1) ocular, (2) revlver, (3) objetivo, (4) mecanismo de enfoque, (5) tornillo de enfoque fino, (6) platina, (7) espejo, (8) condensador.

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Principio de funcionamiento
Las lentes de un microscopio ptico son el

condensador, el objetivo y el ocular. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparacin y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posicin que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular. En el ocular se realiza el aumento final.
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Aumento y resolucin
Es importante recordar que un microscopio, aparte

de tener la capacidad de dar AUMENTO al tamao de la imagen de la muestra, tambin tiene PODER RESOLUTIVO, esto es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor ser la definicin de un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver

pequeas estructuras.

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Microscopio ptico de campo oscuro

El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz

muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El objeto iluminado dipersa la luz y se hace as visible contra el fondo oscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin cerrada. Las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partculas se ven brillantes. Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminacin normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla. Tambin es bastante utilizado en la observacin de muestras metalogrficas para la observacin de detalles en superficies con alta reflectancia.
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1.2 Microscopa de Fluorescencia

El microscopio de fluorescencia es una variacin del microscopio ptico, dotado de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiacin electromagntica emitida por las molculas que han absorbido la excitacin primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Para dejar pasar slo la emisin secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos.
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Diagrama de Microscopio de Fluorescencia

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1.3 Microscopio de contraste de fases

Es un microscopio ptico modificado que permite contrastar

sustancias de diferente grosor o densidad. Mediante un condensador y un objetivo especial se controla la iluminacin de tal manera que vaya en diferentes rutas a travs de las distintas partes de una clula. El resultado es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad. Con este mtodo, el material denso aparece brillante, mientras que las partes de la clula que tienen una densidad cercana al agua (citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.
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Microscopio de contraste de fases

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1.4 Microscopio confocal

El microscopio confocal es en principio un

microscopio ptico que incluye como fuente de luz un lser y un sistema electrnico que ayuda a la captacin de imgenes. Debido a esto, el microscopio confocal consigue un aumento en la resolucin y obtener imgenes de secciones pticas extremadamentes finas, eliminando as la interferencia que produce la luz que llega de los diferentes campos pticos de todo el grosor de la muestra que se observa, consiguiendo as que el enfoque se realice sobre un nico plano (confocal). Las imgenes obtenidas son digitales.
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Microscopio confocal

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1.5 Microscopio electrnico

En el Microscopio Electrnico la luz se

sustituye por un haz de electrones que pasan por un tubo (con vaco para mejorar el paso de los electrones). Permite la observacin de las estructuras interiores de las clulas. Sirve para visualizar virus. Tiene una resolucin de 10 A (se pueden ver objetos muy pequeos, incluyendo algunas molculas).
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Microscopio electrnico
Un haz de electrones es lanzado por un can en el

que se establece una diferencia de potencial, entre el ctodo y el nodo. El chorro de electrones pasa a travs de la muestra a observar, que est colocada en una rejilla. Los electrones chocan con la muestra y se desvan, y estas desviaciones son recogidas por la pantalla. Observamos la imagen a travs de una pantalla que es excitada por los electrones que llegan a ella (mecanismo similar a la televisin). Las imgenes las recogemos mediante una placa fotogrfica que es impresionada directamente por los electrones.
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Microscopio electrnico: principio de funcionamiento

En un microscopio ptico, la potencia amplificadora

est limitada por la longitud de onda de la luz visible. El microscopio electrnico utiliza electrones para iluminar un objeto; los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz, y pueden mostrar estructuras mucho ms pequeas. La longitud de onda ms corta de la luz visible es de alrededor de 4.000 ngstroms (1 ngstrom es 0,0000000001 metros). La longitud de onda de los electrones que se utilizan en los microscopios electrnicos es de alrededor de 0,5 ngstroms.
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Microscopio electrnico: principio de funcionamiento

Es importante el vaco

dentro del can del microscopio electrnico, ya que Los electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, de forma que tiene que hacerse un vaco casi total en el interior de un microscopio de estas caractersticas.
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Microscopio electrnico
Existen dos tipos bsicos de

microscopio electrnico:

1. Microscopio electrnico de transmisin

(TEM) 2. Microscopio electronico de barrido (SEM)

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Microscopio electrnico de transmisin (TEM)

Principio de funcionamiento:
El microscopio electrnico de transmisin emite un haz de

electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrnico de transmisin debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ngstroms. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces. El primer microscopio electrnico de transmisin fue desarrollado entre 1931 y 1933 por Ernst Ruska y sus colaboradores. El primer microscopio electrnico de transmisin comercial lo construy la compaa Siemens en 1939.
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Microscopio electrnico de transmisin (TEM)

Microscopios Electrnicos de Transmisin en Chile (izq.) y Puerto Rico (der.).

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Microscopio electrnico de barrido (SEM)

El microscopio electrnico de barrido o SEM

(Scanning Electron Microscopy), es un microscopio que tiene una gran profundidad de campo, la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la muestra. Produce imgenes de alta resolucin, que significa que caractersticas espacialmente cercanas en la muestra pueden ser examinadas a una alta magnificacin. La preparacin de las muestras es relativamente fcil pues la mayora de SEMs slo requieren que estas sean conductoras.
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Microscopio electrnico de barrido (SEM)

En el microscopio electrnico de barrido la muestra

es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un can. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolucin est entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Inventado en 1981 por Ernst Ruska, Gerd Binnig y Heinrich Rohrer.
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Microscopio electrnico de barrido (SEM)

Un microscopio electrnico de barrido crea una imagen

ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar la muestra en capas, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto. Su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones, de forma parecida al barrido de un haz de electrones por la pantalla de una televisin. Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la aparicin de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrnico situado a los lados del espcimen.

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Microscopio electrnico de barrido (SEM)

Cada punto ledo de la muestra corresponde a un pxel en un

monitor de televisin. Cuanto mayor sea el nmero de electrones contados por el dispositivo, mayor ser el brillo del pxel en la pantalla. A medida que el haz de electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor. Los microscopios electrnicos de barrido pueden ampliar los objetos 100.000 veces o ms. Este tipo de microscopio es muy til porque produce imgenes tridimensionales realistas de la superficie del objeto.

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Microscopio electrnico de barrido (SEM)

Son ampliamente utilizados en la biologa celular. Aunque permite una menor capacidad de aumento que el microscopio

electrnico de transmisin, permite apreciar con mayor facilidad texturas y objetos en tres dimensiones que hayan sido pulverizados metlicamente antes de su observacin. Por esta razn solamente pueden ser observados organismos muertos, y no se puede ir ms all de la textura externa que se quiera ver. Los microscopios electrnicos slo pueden ofrecer imgenes en blanco y negro puesto que no utilizan la luz. Este instrumento permite la observacin y caracterizacin superficial de materiales inorgnicos y orgnicos, entregando informacin morfolgica del material analizado.
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Microscopio electrnico de barrido (SEM)

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