MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O CONTROLE DE INFECO RELACIONADA ASSISTNCIA SADE

Mdulo 7: Deteco e Identificao de Micobactrias de Importncia Mdica

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria | Anvisa

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MICROBIOLOGIA CLNICA PARA O CONTROLE DE INFECO RELACIONADA ASSISTNCIA SADE Mdulo 7: Deteco e Identificao de Micobactrias de Importncia Mdica

Copyright 2013 Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total dessa obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens dessa obra da rea tcnica. A Anvisa, igualmente, no se responsabiliza pelas idias contidas nessa publicao. 1 edio 2010 Elaborao, distribuio e informaes: AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA SIA Trecho 5, rea Especial 57 CEP: 71205-050 Braslia DF Tel.: (61) 3462-6000 Home page: www.anvisa.gov.br Diretoria Dirceu Brs Aparecido Barbano Diretor-Presidente Jaime Cesar de Moura Oliveira Jos Agenor lvares da Silva Adjuntos de Diretor Luiz Roberto Klassmann Luciana Shimizu Takara Neilton Araujo de Oliveira Doriane Patricia Ferraz de Souza Gerncia Geral de Tecnologia em Servios de Sade GGTES Diana Carmem Almeida Nunes de Oliveira Gerncia de Vigilncia e Monitoramento em Servios de Sade GVIMS Magda Machado de Miranda Costa Coordenao Tcnica: Ana Clara Ribeiro Bello dos Santos Anvisa Carlos Emlio Levy Universidade de Campinas-SP Redao: Gleize Villela Instituto Adolfo Lutz (IAL)-SP Lucilaine Ferrazoli Instituto Adolfo Lutz (IAL)-SP Reviso tcnica Anvisa: Andr Anderson Carvalho Fabiana Cristina de Sousa Heiko Thereza Santana Magda Machado de Miranda Suzie Marie Gomes Cooperao tcnica: Termo de Cooperao n 64 Organizao Pan-Americana da Sade Organizao Mundial da Sade Representao Brasil Joaquin Molina Representante Enrique Vazquez Coordenador da Unidade Tcnica de Doenas Transmissveis e NoTransmissveis e Anlise de Situao de Sade Rogrio da Silva Lima Consultor Nacional da Unidade Tcnica de Doenas Transmissveis e NoTransmissveis e Anlise de Situao de Sade Projeto Grfico e Diagramao: All Type Assessoria Editorial Ltda Capa: Camila Contarato Burns Anvisa

Ficha Catalogrfica Brasil. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade. Mdulo7: Deteco e Identificao de Micobactrias de Importncia Mdica/Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Braslia: Anvisa, 2013. 43p..: il.9 volumes ISBN 1. Infeco Relacionada Assistncia Sade Controle. 2. Infeco em Servios de Sade. 3. Microbiologia Clnica. 4. Vigilncia Sanitria em Servios de Sade. 5. Resistncia microbiana. I. Ttulo.

Sumrio
Apresentao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Captulo 1: Biossegurana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.1 Procedimentos em casos de acidentes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.2 Vigilncia em sade. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.3 Gerenciamento de resduos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Captulo 2: Coleta de Amostras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.1 Amostras respiratrias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.2 Urina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.3 Sangue. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.4 Medula ssea, lquor, lquido pleural. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.5 Bipsias ou amostras de tecido * . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.6 Secrees e bipsias provenientes de infeces decorrentes de procedimentos estticos e/ou cirrgicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 Captulo 3: Processamento de Amostras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 3.1 Exame microscpico e colorao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 3.2 Mtodos de colorao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 3.3 Controle e avaliao da qualidade da baciloscopia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3.4 Mtodos para tratamento das amostras para cultura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Captulo 4: Cultura para Isolamento de Micobactrias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 4.1 Meios slidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 4.2 Meios lquidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 4.3 Meios lquidos utilizados em mtodos automatizados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Captulo 5: Identificao de Micobactrias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 5.1 Separao das espcies do complexo M. tuberculosis das MNT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 5.2 Testes automatizados e moleculares para identificao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 Anexos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 ANEXO A. Indicadores para avaliao da qualidade da baciloscopia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 ANEXO B. Percentual de positividade da baciloscopia no laboratrio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 ANEXO C . ndice de contaminao das culturas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 Referncias Bibliogrficas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

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Apresentao
A resistncia microbiana um grave problema mundial, estando associada ao aumento do tempo de internao, dos custos do tratamento e das taxas de morbidade e mortalidade dos pacientes. O uso indiscriminado e incorreto dos antimicrobianos na comunidade e no ambiente hospitalar reconhecidamente um importante fator de risco para o aparecimento e a disseminao da resistncia microbiana. Nesse contexto, insere-se o Laboratrio de Microbiologia, que tem como objetivo no apenas apontar o responsvel por um determinado estado infeccioso, mas tambm indicar, atravs do monitoramento de populaes microbianas, qual o perfil dos micro-organismos que esto interagindo com o organismo humano, possibilitando a indicao de tratamentos mais adequados. Para o desempenho satisfatrio dessa funo, fundamental que os laboratrios de microbiologia possuam estrutura capaz de estabelecer informaes sobre a melhor amostra biolgica, reconhecer a microbiota e os contaminantes, identificar micro-organismos associados infeco ou com propsitos epidemiolgicos, obter resultados rpidos em casos de emergncia, realizar o transporte rpido das amostras e manter uma educao contnua em relao aos aspectos da infeco relacionada assistncia sade. Tendo em vista esses aspectos e considerando que a microbiologia um campo muito dinmico, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa, em cooperao com a Organizao Pan-Americana da Sade OPAS, prope a terceira reviso do Manual de Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade, buscando atualizar informaes nos temas considerados essenciais e contando com um seleto e conceituado corpo editorial. O manual composto por nove mdulos, a saber: Mdulo 1 Biossegurana e manuteno de equipamentos em laboratrio de microbiologia clnica; Mdulo 2 Controle externo da qualidade; Mdulo 3 Principais Sndromes Infecciosas; Mdulo 4 Procedimentos laboratoriais: da requisio do exame anlise microbiolgica e laudo final; Mdulo 5 Tecnologias em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos; Mdulo 6 Deteco e identificao de bactrias de importncia mdica; Mdulo 7 Deteco e identificao de micobactrias de importncia mdica; Mdulo 8 Deteco e identificao de fungos de importncia mdica e Mdulo 9 Infeces virais. A Anvisa e a OPAS esperam com essa publicao contribuir para que os laboratrios de microbiologia possam assimilar e alcanar novos nveis de complexidade laboratorial, atendendo s exigncias e caractersticas prprias de cada unidade hospitalar, alm de subsidiar a adoo de procedimentos bsicos padronizados nesses servios.

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Introduo
O gnero Mycobacterium constitudo por espcies do complexo M. tuberculosis, M. leprae e outras denominadas micobactrias no causadoras de tuberculose (MNT). At o momento, 127 espcies e 11 subespcies esto registradas na lista de nomes bacterianos aprovados ou vlidos. O complexo M. tuberculosis composto pelas espcies M. tuberculosis, principal agente da tuberculose (TB) humana, M. bovis, que causa doena em bovinos, no homem e em vrios outros mamferos, M. africanum, agente etiolgico da TB humana encontrado mais frequentemente na frica, e M. microti patognica para roedores. Recentemente, foram includas nesse complexo M. caprae e M. pinnipedii que causam infeco em caprinos, e em lees marinhos e no homem, respectivamente. O M. canettii, uma variante de M. tuberculosis, ainda no foi oficialmente reconhecida como uma espcie do complexo. Essas espcies so muito similares e apresentam 99,9% de identidade gentica, no entanto, apresentam diferenas fenotpicas, epidemiolgicas e de patogenicidade. A TB transmitida de pessoa a pessoa por aerossis produzidos durante a expectorao. Apresenta evoluo crnica e sua forma clnica caracterizada, principalmente, pelo comprometimento dos pulmes, podendo atingir outros rgos ou ocorrer de forma disseminada. A TB pulmonar a mais frequente e mais importante para a sade pblica, pois a forma que produz as partculas infectantes responsveis pela transmisso da doena. Por essa razo, o diagnstico precoce fundamental para interrupo da cadeia de transmisso da doena. A baciloscopia (exame direto para pesquisa de Bacilo lcool cido Resistente BAAR) o exame bsico para o diagnstico da TB, especialmente para a forma pulmonar. Por ser rpida e de fcil execuo, permite a pronta identificao dos pacientes bacilferos. De acordo com as normas do Programa Nacional de Controle da Tuberculose (PNCT), a baciloscopia deve ser realizada em 24 horas quando o paciente atendido em ambulatrios e em 4 horas nas urgncias e emergncias hospitalares. A cultura um mtodo mais sensvel e segundo as normas do PNCT deve ser realizada para: a) sintomticos respiratrios com suspeita de TB e baciloscopia repetidamente negativa; b) casos suspeitos de TB com amostras paucibacilares e/ou dificuldades de coleta da amostra (crianas, populaes indgenas); c) casos suspeitos de TB extrapulmonar; d) pacientes portadores do HIV; e) pacientes com indicao de retratamento aps falncia ao esquema bsico, TB multirresistente (TBMR) e recidiva da doena ou reincio de tratamento aps abandono; f ) casos suspeitos de infeces causadas por MNT; g) casos suspeitos que vivem em instituies fechadas; h) estudos epidemiolgicos como atividades de vigilncia, para determinar a prevalncia da resistncia.

As MNT so comumente encontradas no meio ambiente, em solo e fontes de gua. So classificadas de acordo com o tempo de crescimento em meio de cultura, como MNT de crescimento rpido (crescimento em menos de sete dias) e de crescimento lento (crescimento em sete dias ou mais). So tambm classificadas conforme sua capacidade em causar doena no homem como potencialmente patognicas e raramente patognicas. As espcies potencialmente patognicas podem causar uma variedade de doenas em humanos que diferem em severidade e importncia em sade pblica. Dentre as formas clnicas mais frequentes esto as infeces pulmonares, causadas por MNT de crescimento lento e rpido, e a doena disseminada em portadores do HIV, geralmente associada a MNT de crescimento lento. Recentemente muitos casos de infeces causadas por MNT em pacientes submetidos a procedimentos invasivos tm sido descritos. Geralmente esto envolvidas as espcies de crescimento rpido como M. fortuitum, M. abscessus e M. chelonae e os procedimentos variam desde cirurgias estticas, oftalmolgicas e cardacas, acupuntura, prticas de pedicuro, at o uso de medicamentos injetveis. O diagnstico de doena por MNT exige muita cautela, pois o seu isolamento a partir de espcimes clnicos no estreis pode significar colonizao transitria ou contaminao. Assim, a correlao clnico-laboratorial de fundamental importncia para o estabelecimento do diagnstico de doena por MNT e para determinao da estratgia teraputica. Por essa razo, os laboratrios precisam estar sempre atualizados. No captulo adiante citamos alguns dos procedimentos mais utilizados para o diagnstico das infeces por micobactrias em humanos.

Captulo 1: Biossegurana
Lucilaine Ferrazoli Gleize Villela

Os laboratrios que manipulam espcimes clnicos e/ou isolados de micobactrias devem ter normas de conduta bem estabelecidas, visando assegurar a validade e preciso nos resultados bem como a segurana de toda a equipe tcnica e da comunidade. Estudos tm demonstrado que tcnicos de laboratrio tm um risco at cinco vezes maior de adquirir a infeco, comparado com a populao geral. A principal via de infeco area, atravs de aerossis gerados nos procedimentos laboratoriais. Assim, as seguintes medidas devem ser adotadas: a) Para laboratrios que realizam apenas a baciloscopia, (laboratrio nvel I): Utilizar equipamentos de proteo individual (EPIs) como luvas, aventais descartveis e respiradores descartveis (tipo N95/PFF2). Fazer os esfregaos em cabine de segurana biolgica (CSB) classe A1 ou A2, ou na bancada forrada com papel absorvente, atrs de uma chama de bico de Bunsen. No momento da preparao dos esfregaos, o laboratrio deve estar com as portas fechadas e janelas semiabertas, para que no ocorram correntes de ar. Aps o trmino do trabalho, desprezar o papel e todo resduo em um balde para posterior autoclavao, descontaminar a bancada com hipoclorito de sdio a 2% e abrir as janelas para troca de ar do laboratrio. Outra opo tratar a amostra com mesma quantidade de hipoclorito de sdio a 5% e deixar 15 minutos (a fim de inviabilizar os eventuais bacilos presentes na amostra). Centrifugar a amostra e do sedimento preparar os esfregaos em lminas de vidro. Descartar de maneira apropriada os resduos biolgicos. Todo material utilizado no preparo e os recipientes do material clnico devem ser autoclavados antes de serem descartados no lixo branco. Todos os tcnicos devem ter treinamento em baciloscopia e biossegurana.

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As CSB devem ser certificadas por tcnico especializado pelo menos uma vez ao ano. b) Para laboratrios que realizam tambm a cultura (laboratrio nvel II) alm das medidas j citadas, o laboratrio deve: Processar todas as amostras em uma CSB classe II A2. Limitar a entrada de pessoas na rea reservada para a manipulao dos materiais. Treinar todos os profissionais nas tcnicas de cultura e identificao de M. tuberculosis. c) Para laboratrios que realizam todas as tcnicas descritas acima e, alm disso, testes de sensibilidade s drogas (Laboratrio nvel III), devem possuir: Uma rea com ante-sala e uma sala separada onde as amostras so processadas e os testes de sensibilidade so realizados. Um sistema de exausto prprio que crie uma presso negativa nas duas salas. Uma autoclave deve ser instalada dentro dessa rea para que todo material seja autoclavado antes de deixar esta rea. Treinamento especfico dos profissionais nas tcnicas de cultura, identificao e testes de sensibilidade as drogas.

1.1 Procedimentos em casos de acidentes

Para garantir a segurana no laboratrio preciso reconhecer que os acidentes podem ocorrer e formular um plano de ao para neutralizar seus eventuais efeitos prejudiciais, de maneira rpida e eficaz. Nenhum acidente deve ser considerado insignificante. Ao contrrio, sempre devem ser avaliados para estudar maneiras de evitar que eles ocorram. Os acidentes que ocorrem nos laboratrios de micobactrias podem ser divididos nos que geram um volume limitado de aerossis e os que provocam um grande volume de aerossis potencialmente infectados. Um volume limitado de aerossis pode ser produzido quando ocorre quebra de um tubo contendo meio de cultura slido ou no derramamento de uma amostra de escarro, que viscosa e de natureza mucoide. Um grande volume de aerossis potencialmente infecciosos pode ser produzido quando ocorre a quebra de tubos contendo cultura em meio lquido, suspenses bacterianas ou quebra de tubos durante a centrifugao. A seguir so sugeridos dois planos de ao que podem ser utilizados em laboratrios de micobactrias, para casos de acidentes.

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1.1.1

Plano de ao para um acidente que produza um volume limitado de aerossis a) Cobrir o derramamento imediatamente para evitar que continuem produzindo aerossis. Utilizar qualquer material disponvel, como toalhas de papel, jornal ou o prprio avental descartvel. b) Cobrir totalmente a rea com uma soluo de hipoclorito a 2%. Deixar agir por 30 min a 1 hora. c) Deixar o laboratrio e fechar as portas. Colocar um aviso na porta indicando o acidente. d) Aps 30 min a 1 hora, colocar EPIs (inclusive mscara) e entrar no laboratrio. Recolher todos os materiais envolvidos no acidente com uma pina ou p e coloc-los em um recipiente com tampa, para posterior autoclavao. e) Limpar o local do acidente com hipoclorito a 2%. Plano de ao para um acidente que produza um grande volume de aerossis a) Deixar o laboratrio imediatamente. Fechar a sala e se possvel as entradas e sadas de ventilao com sacos plsticos. Esperar duas horas. Colocar um aviso na porta do laboratrio. b) Aps duas horas, colocar equipamentos de proteo individual (inclusive mscara) e entrar no laboratrio. Cobrir o derramamento com soluo de hipoclorito de sdio a 2% e deixar agir durante duas horas. Deixar o laboratrio e fechar as portas. c) Recolher os tubos quebrados com o auxlio de uma pina ou p e coloc-los em um recipiente adequado para posterior autoclavao. d) Limpar o local do acidente com hipoclorito a 2%.

1.1.2

1.2 Vigilncia em sade

A vigilncia em sade dos funcionrios do laboratrio de TB deve ser realizada antes do funcionrio comear a trabalhar no laboratrio, em intervalos regulares e aps um incidente de risco biolgico. Os funcionrios devem ser instrudos sobre os sintomas de TB e devem ter acesso imediato a servio mdico gratuito no caso de apresentarem sintomas.

1.3 Gerenciamento de resduos

O laboratrio de micobactrias produz resduos classificados como resduos com a possvel presena de agentes biolgicos que, por suas caractersticas de concentra11

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o, podem apresentar risco de infeco (Grupo A) e resduos com substncias qumicas que podem apresentar risco sade pblica (Grupo B). O Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) define procedimentos para o gerenciamento de resduos de sade, desde a gerao at a disposio final (Dirio Oficial da Unio de 04/05/2005). Assim, cada laboratrio deve elaborar seu plano de gerenciamento de resduos compatvel com sua atividade. Por medida de segurana, todo material biolgico deve ser descontaminado em autoclave antes do descarte, mesmo que tenha sido desinfetado com hipoclorito a 2%.

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Captulo 2: Coleta de Amostras

Lucilaine Ferrazoli Gleize Villela

2.1 Amostras respiratrias

2.1.1 Escarro
TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO As amostras devem ser enviadas ao laboratrio o mais rpido possvel, transportadas sob refrigerao e acondicionadas de forma que no haja risco de derramamento. Manter as amostras em geladeira at terem sido examinadas por algum mtodo de colorao. Meios que podem ser usados para semeadura: Lowenstein-Jensen, MGIT, MB/BacT, Ogawa. AMOSTRAS REJEITADAS Amostras que no estiverem devidamente identificadas. TRATAMENTO NALC-NaOH* NaOH 4% cido oxlico 3% (indicado para materiais contaminados com P. aeruginosa).

COLETA Coletar em frasco descartvel estril, transparente, capacidade 35-50 mL, de boca larga, com tampa de rosca.

Identificar no corpo do frasco o nome do paciente e a data da coleta.

Orientar o paciente para coletar uma amostra proveniente da rvore brnquica. Essa amostra pode ser obtida aps esforo da tosse. Evitar a coleta de saliva. O diagnstico deve ser feito a partir de duas amostras de escarro. A primeira coletada no momento da consulta e a segunda no dia seguinte ao despertar. Durante o tratamento realizar um exame mensal.
* Mtodo do NALC-NaOH = N-acetil-L-cistena-hidrxido de sdio; ** Mtodo de Petroff

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2.1.2

Lavado brnquico (trqueo-brnquico, broncoalveolar)

ARMAZENAMENTO As amostras devem ser enviadas ao laboratrio o mais rpido possvel, acondicionadas de forma que no haja risco de derramamento. AMOSTRAS REJEITADAS Amostras que no estiverem devidamente identificadas. TRATAMENTO Colocar a amostra em tubo cnico de 50 mL estril com tampa de rosca. Centrifugar a 3.000 x g por 15 min. Tratar o sedimento com NaOH 4% ou NALC-NaOH* Meios que podem ser usados para semeadura: Lowenstein-Jensen, MGIT, MB/BacT.

COLETA Coletar 5 a 10 mL da amostra em tubo estril. A coleta de lavado brnquico induz a expectorao nos dias seguintes e por isso recomenda-se a coleta sucessiva desse material.

2.1.3

Lavado gstrico
TRANPORTE E ARMAZENAMENTO As amostras devem ser enviadas ao laboratrio o mais rpido possvel, acondicionadas de forma que no haja risco de derramamento. Manter as amostras em geladeira at serem processadas. Laboratrio deve processar as amostras em at 4 horas aps a coleta. TRATAMENTO Colocar a amostra em um tubo cnico de 50 mL estril com tampa de rosca. Centrifugar a 3.000 x g por 15 min. Tratar o sedimento com NaOH 4% ou NALC-NaOH*. Meios que podem ser usados para semeadura: Lowenstein-Jensen, MGIT, MB/BacT.

COLETA Injetar 10 a 15 mL de soluo fisiolgica e aps 30 min coletar 50 mL da amostra em tubo estril contendo carbonato de sdio, na proporo de 1mg/1mL de lavado gstrico. A coleta desse material feita em paciente hospitalizado. Deve ser feita logo que o paciente acorda e em jejum.

* NaLC-NaOH = N-acetil-L-cistena-hidrxido de sdio

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2.2 Urina
COLETA Coletar a primeira urina da manh, sem desprezar o primeiro jato, aps assepsia genital com gua e sabo. Um volume mnimo de 40 mL o suficiente para a cultura. TRANPORTE E ARMAZENAMENTO As amostras devem ser enviadas ao laboratrio o mais rpido possvel, acondicionadas de forma que no haja risco de derramamento. Processar a amostra o mais rpido possvel, mantendo-a refrigerada at o momento da descontaminao. AMOSTRAS REJEITADAS Urina coletada durante um perodo de 24 horas. O elevado nmero de bactrias contaminantes prejudica a descontaminao da amostra. TRATAMENTO Colocar a amostra em um tubo cnico de 50 mL estril com tampa de rosca. Centrifugar a 3.000 x g por 15 min. Tratar o sedimento com NaOH 4% ou NALC-NaOH*.

Coletar em frasco estril com tampa de rosca. recomendada a coleta de trs amostras em dias consecutivos.
* NaLC-NaOH = N-acetil-L-cistena-hidrxido de sdio

Meios que podem ser usados para semeadura: Lowenstein-Jensen, MGIT, MB/BacT.

2.3 Sangue
COLETA Seguir as orientaes de seu laboratrio para a assepsia antes da coleta das amostras de sangue para cultura. Coletar 5 mL de sangue utilizando uma seringa sem anticoagulante e inocular diretamente nos meios de cultura apropriados. TRANPORTE E ARMAZENAMENTO No refrigerar as amostras. Manter os frascos em temperatura ambiente at o momento da incubao. AMOSTRAS REJEITADAS Amostras colhidas com EDTA. TRATAMENTO As amostras devem ser inoculadas diretamente no meio de cultura, conforme especificaes dos fabricantes do meio utilizado. Meios para deteco de micobactrias em amostras de sangue: Lowenstein-Jensen bifsico (uma fase slida e com meio 7H9+ADC como fase lquida), Bactec Myco/Lytic (MB/BacT).

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2.4 Medula ssea, lquor, lquido pleural

COLETA Coletar em tubos estreis. Quanto maior o volume processado maior a possibilidade de se ter uma amostra positiva. ARMAZENAMENTO Manter a amostra na geladeira se no for processada dentro de 12 horas. Manter o material na geladeira aps o processamento, por cinco dias. Monitorar diariamente a cultura. Caso seja detectada qualquer contaminao, proceder a descontaminao da amostra armazenada com NALCNaOH ou NaOH 4%. TRATAMENTO Em geral essas amostras no tm bactrias contaminantes, podendo ser inoculadas diretamente nos meios de cultura. Quando houver mais que 3 mL da amostra, centrifugar e semear o sedimento. Meios que podem ser usados para semeadura das amostras com sangue: Lowenstein-Jensen, Midlebrook 7H9 + ADC, Bactec Myco Lytic, MB/BacT . As amostras sem sangue podem ser semeadas nos meios acima e no meio MGIT.

OBS. Fezes: No so mais utilizadas para o diagnstico da TB intestinal. Nesse caso est indicada a bipsia.

2.5 Bipsias ou amostras de tecido *

COLETA Coletar o material de modo assptico e colocar em tubo estril com um pouco de soluo salina estril. ARMAZENAMENTO Enviar a amostra ao laboratrio o mais rpido possvel, acondicionada de forma que no haja risco de derramamento. Processar a amostra o mais rpido possvel. AMOSTRAS REJEITADAS Amostras colocadas em formol. TRATAMENTO Macerar o material utilizando gral estril e um pouco de salina estril. Tratar o material macerado com NALC-NaOH ou NaOH 4%. Meios que podem ser usados para semeadura: Lowenstein-Jensen, Midlebrook 7H9 + ADC, MGIT, MB/Bact.

* Temperaturas diferentes devem ser usadas para incubar os meios inoculados com amostras de pele.

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2.6 Secrees e bipsias provenientes de infeces decorrentes de procedimentos estticos e/ou cirrgicos
COLETA Coletar material de modo assptico a partir da leso por aspirao de material purulento ou bipsia da rea infectada. No colher material com swab. Colocar o material em tubos estreis. Quando possvel, enviar mais de uma amostra para cultura, para aumentar as chances de isolamento da bactria. Enviar material tambm para: anatomo patolgico para pesquisa de BAAR e granuloma. cultura geral. cultura para fungos. ARMAZENAMENTO Enviar o material para o laboratrio o mais rpido possvel. Manter o material na geladeira aps o processamento, por 3-5 dias. Verificar diariamente se a cultura apresenta contaminao. Caso seja detectada, proceder a descontaminao com NALC ou NaOH 4%. TRATAMENTO Se a leso estiver fechada, a amostra em geral no tem bactrias contaminantes, podendo ser inoculada diretamente nos meios de cultura. Quando houver mais que 2 mL da amostra, centrifugar e semear o sedimento. Se a leso estiver aberta, proceder a descontaminao com NALC ou NaOH 4%. Placas de gar sangue semeadas para cultura geral devem ser mantidas seladas por at sete dias a temperatura ambiente, pois muitas MNT de crescimento rpido crescem nesse meio. Se houver crescimento, fazer um esfregao em lmina e corar pelo mtodo de Ziehl-Neelsen. Meios que podem ser usados para semeadura: Lowenstein-Jensen, Midlebrook 7H9+ADC, MGIT e MB/Bact.

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Captulo 3: Processamento de Amostras

Lucilaine Ferrazoli Gleize Villela

3.1 Exame microscpico e colorao

Para todas as amostras clnicas extrapulmonares deve ser feita a baciloscopia para pesquisa de BAAR (exceto sangue e medula ssea), sendo obrigatria a realizao da cultura. Para amostras de escarro obrigatria a baciloscopia, pois identifica com rapidez a maioria dos casos bacilferos. Entretanto, alguns cuidados devem ser tomados com o preparo do esfregao, colorao e leitura das lminas para garantir a qualidade do exame. 3.1.1 Preparo do esfregao para baciloscopia do escarro: O esfregao pode ser preparado por meio de distenso do escarro diretamente sobre a lmina (exame direto) ou por digesto com agentes mucolticos seguida por centrifugao.

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A) Distenso do escarro diretamente sobre a lmina

MATERIAIS E REAGENTES Papel toalha ou outro capaz de absorver respingos para forrar a bancada (delimitar a rea contaminada). Lminas novas, com bordas foscas, sem riscos e desengorduradas. As lminas devem ser lavadas com gua e detergente neutro. Aps vrios enxgues, coloc-las em lcool e sec-las antes do uso. Bandeja de inox forrada com papel absorvente (ser a rea de trabalho para preparar cada esfregao). Palitos de madeira. Recipiente com tampa para descarte dos palitos. PROCEDIMENTO Organizar as amostras em ordem crescente e as respectivas lminas em frente de cada pote. Colocar a amostra a ser processada na bandeja de inox. Quebrar no meio o palito e com as pontas farpadas retirar a partcula purulenta do escarro e distender na lmina at obter um esfregao homogneo, ocupando 2/3 da lmina, sem deixar espaos vazios. Deixar a lmina secar em temperatura ambiente, em superfcie forrada com papel (rea contaminada). Descartar o material usado de acordo com as normas de biossegurana. Guardar as amostras em geladeira at a liberao dos resultados (caso seja necessrio repetir a baciloscopia ou realizar a cultura). Fixar os esfregaos, passando trs vezes pela chama do bico de Bunsen. CUIDADOS Processar um nmero mximo de 12 amostras de cada vez. Trabalhar em CSB, ou com bico de Bunsen, mantendo a chama acesa at o final do trabalho. Esfregaos muitos finos ou muito grossos dificultam a leitura e podem levar a resultados falso-negativos. No aquecer a lmina durante a preparao do esfregao, para evitar a formao de aerossis. No usar ala metlica. Mesmo aps a fixao podem existir bacilos viveis no esfregao.

B) Digesto com agentes mucolticos seguida por centrifugao A tcnica aumenta o risco de formao de aerossis (torna a amostra mais liquefeita). Os procedimentos s podem ser realizados em CSB e a centrfuga deve ter rotores e adaptadores de tubos (caapas) com tampas de proteo contra a disperso de aerossis.
MATERIAIS E REAGENTES Tubos de centrfuga de polipropileno, com tampa e fundo cnico. Recipiente para descarte contendo hipoclorito a 2%. Lminas novas, com bordas foscas, sem riscos, e desengorduradas. Soluo de NaOH 4% estril. PROCEDIMENTO Transferir a amostra para o tubo de centrfuga, adicionar igual volume de NaOH a 4%, fechar bem o tubo e agitar em vortex. Deixar em temperatura ambiente por 15 min (fluidificao da amostra). Adicionar gua estril e purificada por sistema de filtrao, at completar 10 mL e agitar novamente. Centrifugar a 3.000 x g por 15 min. Desprezar o sobrenadante em recipiente prova de respingos e agitar em vortex para suspender o sedimento. Colocar 2 gotas do sedimento no centro da lmina, preparar um esfregao com a ponta da pipeta, com a forma de uma retngulo, com dimenses de 1x2 cm. CUIDADOS Utilizar gua ultrapura esterilizada, pois a gua destilada ou deionizada pode conter BAAR e levar a um resultado falso-positivo.

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Mdulo 7: Deteco e Identificao de Micobactrias de Importncia Mdica

3.2 Mtodos de colorao

3.2.1 Ziehl-Neelsen
CORANTES Fucsina 0,3%: Dissolver (por agitao) 3g de fucsina bsica em 100 mL de etanol 95%. Dissolver 50 g de fenol cristalizado em 1.000 mL de gua destilada (aquecer suavemente at que o fenol dissolva). Misturar os 100 mL da soluo de fucsina com 900 mL da soluo de fenol aquoso. Deixar repousar 24 h, filtrar e manter em frasco escuro. lcool-cido 3%: Adicionar 30 mL de HCl concentrado em 970 mL de etanol 95%. Azul de Metileno 0,3%: Dissolver 3 g de azul de metileno em 100 mL de gua destilada e completar o volume para 1.000 mL com gua destilada. Deixar repousar 24 h, filtrar e manter em frasco escuro. PROCEDIMENTO Cobrir todo esfregao com a Fucsina. Aquecer, sem deixar ferver, 3 vezes em um perodo de 5 min. Lavar com gua (jato fraco). Cobrir a lmina com lcool-cido. Deixar no mximo 1 min Lavar com gua (jato fraco). Cobrir o esfregao com azul de metileno (30 s). Lavar com gua (jato fraco). Deixar a lmina secar ao ar (se for usado papel de filtro para secar a lmina, desprezar em lixo apropriado e usar um papel para cada lmina). Ler em microscpio ptico comum em objetiva de imerso de 100x. RESULTADO Positivo: bacilos corados em vermelho (BAAR), outras bactrias e clulas se coram em azul. Negativo: ausncia de BAAR em 100 campos observados. Leitura da baciloscopia de escarro deve obedecer escala semi-quantitativa, conforme item 2.3. Leitura de baciloscopia de outras amostras deve ser informada apenas como positiva ou negativa.

3.2.2

Auramina indicado para ser utilizado como mtodo de triagem, uma vez que a leitura feita com objetiva de 40X. As lminas positivas devem ser recoradas pelo mtodo de Ziehl-Neelsen para confirmao do resultado e emisso do resultado em cruzes. *Um resultado negativo no exame direto do material clnico no exclui a possibilidade de infeco por M. tuberculosis. Em casos de forte suspeita de TB realizar a cultura.

CORANTES Auramina fenlica: Dissolver 0,1 g de auramina O em 10 mL de etanol 90-95%. Adicionar todo o volume em uma soluo de 3g de cristais de fenol em 87 mL de gua destilada estril (estocar a soluo em frasco escuro). lcool-cido: Adicionar 0,5 mL de HCl concentrado em 100 mL de lcool 70%. Permanganato de potssio: Dissolver 0,5g de permanganato de potssio em 100 mL de gua destilada.

PROCEDIMENTO Cobrir o esfregao com auramina e deixar por 20 min. Lavar com gua (jato fraco). Descorar com lcool-cido por 2 min. Lavar com gua (jato fraco). Cobrir o esfregao com permanganato de potssio 1 min e no mais que 2 min. Lavar com gua (jato fraco). Ler em microscpio de fluorescncia com objetiva de 40x.

RESULTADO Positivo: bacilos corados em amarelo alaranjado em fundo escuro. Negativo: apenas campos com fundo escuro. Sem necessidade de confirmao.

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3.2.3

Leitura das lminas Escala semi-quantitativa para informe do nmero de BAAR observados em esfregaos de escarro corados pelo mtodo de Ziehl-Neelsen
Nmero de Bacilos (Objetiva 100x) Resultado Negativo 1 a 9 bacilos + ++ +++

No foram encontrados BAAR em 100 campos observados Presena de 1 a 9 BAAR em 100 campos observados (relatar o nmero) Presena de menos de 1 BAAR por campo em 100 campos examinados Presena de 1 a 10 BAAR por campo em 50 campos examinados Presena de mais de 10 BAAR por campo em 20 campos examinados

Utilizar um formulrio quadriculado para anotar o nmero de bacilos encontrados em cada campo microscpico observado. As nocardias e rodococos podem corar-se por esse mtodo. No entanto, um tcnico com experincia notar que esses micro-organismos possuem morfologias diferentes. As nocardias geralmente se coram parcialmente e so filamentosas e os rodococos so cocos.

3.3 Controle e avaliao da qualidade da baciloscopia

A) Aspectos preventivos Os aspectos preventivos do controle de qualidade consistem de medidas adotadas desde a recepo das amostras at a emisso do laudo final, que incluem:

Organizao do local de trabalho, de maneira que facilite o trabalho, a locomoo das pessoas e a limpeza diria. Treinamento peridico dos profissionais, para que todos possam conhecer os procedimentos, eliminando erros decorrentes da falta de informaes. Uso de Procedimentos Operacionais Padro (POP). Protocolos que descrevem de forma clara e completa cada procedimento usado no laboratrio, como o objetivo de padronizar as aes, para que todos os tcnicos possam compreender e executar, da mesma maneira uma determinada tarefa. Cuidados com a identificao, conservao e transporte das amostras. Manuteno dos equipamentos, com instrues para utilizao adequada e conservao. Cuidados com inspeo, identificao, preparo e armazenamento de reagentes e corantes. Controle de estoque peridico, visando garantir a disponibilidade de todo o material de consumo necessrio e monitorar o prazo de validade dos reagentes e corantes.

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B) Aspectos operacionais Consistem na incluso de amostras com resultado conhecido na rotina (controle de qualidade interno), uso de indicadores para avaliao da qualidade (Anexo A) e superviso por laboratrio de referncia (controle de qualidade externo). Para o controle de qualidade interno, selecionar amostras positivas e negativas para BAAR, preparar os esfregaos e fixar. Conservar as lminas em caixas apropriadas, em lugar fresco. Identificar as caixas com data de preparo (validade de 3 meses) e smbolo de risco biolgico. Incluir uma lmina positiva e uma negativa na rotina de trabalho uma vez por semana.

3.4 Mtodos para tratamento das amostras para cultura

As amostras que apresentam flora microbiana associada devem ser tratadas para eliminar os micro-organismos contaminantes, que se desenvolvem mais rpido que as micobactrias e impedem seu crescimento. O tratamento feito com agentes qumicos aos quais as micobactrias so conhecidamente mais resistentes e que tambm reduzem a viscosidade do material. Espcimes provenientes de cavidades fechadas, tais como os lquidos orgnicos no necessitam ser descontaminados, desde que tenham sido colhidos assepticamente e colocados em recipiente estril.

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3.4.1

N-acetil-L-cisteina/NaOH 2% (NaLC-NaOH)
REAGENTES PROCEDIMENTO Preparar a quantidade necessria da soluo de NALC de acordo com quadro abaixo. Colocar 2-3 mL da amostra em um tubo cnico estril com tampa de rosca de 50 mL. Adicionar igual volume da soluo de NALC. Homogeneizar por inverso. Deixar 15 min na estufa. Completar at 50 mL com tampo fosfato Centrifugar a 3.000 x g por 15 min. Desprezar o sobrenadante em frasco contendo hipoclorito de sdio 2%, evitando ao mximo espirros do material. Limpar a borda do tubo com hipoclorito de sdio 2%. Ressuspender o sedimento com tampo fosfato,com um volume suficiente para inocular os meios que sero utilizados. Inocular 0,2 mL da amostra em meio slido e 0,5 mL em meio lquido. Preparar esfregaos em lminas (1 x 2 cm),deixar secar na CSB antes de fixar. Desprezar todo o material utilizado em lixo apropriado e descontaminar em autoclave. MATERIAIS

Soluo de NaOH 4% /Citrato de Sdio. NaOH 4% (40 g pastilhas de NaOH em 1.000 mL de gua destilada) Citrato de sdio 0,1M (26 g de citrato de sdio (anidro) em 1.000 mL de gua destilada). Soluo de NaOH/ citrato de sdio: volume 1/1. Aliquotar em frascos com tampa de rosca e autoclavar a 121C por 15 min. Tampo fosfato 0,067 M, pH 6,8: Soluo A Na2HPO4.......................................................9,47g gua destilada...........................................1.000 mL Soluo B KH2PO4..........................................................9,07g gua destilada...........................................1.000 mL Preparar cada uma das solues separadamente, em seguida mistur-las em volumes iguais, acertar o pH. Aliquotar em frascos com tampa de rosca e autoclavar a 121C por 15 min. Pode ser substitudo por gua estril.

Tubos de centrfuga com tampa de rosca e capacidade para 50 mL (estreis) Pipetas Pasteur descartveis estreis CSB classe II A2 Centrfuga

O NALC um potente agente mucoltico e favorece a utilizao de concentraes baixas do descontaminante sem prejudicar a recuperao de micobactrias. A desvantagem que a soluo deve ser preparada diariamente porque ela perde a atividade aps 24 horas. 3.4.2 Preparo da soluo para tratamento das amostras com N-acetil-Lcistena
NaOH 4% / citrato de sdio 12,5 mL / 12,5 mL 25 mL / 25 mL 50 mL/ 50 mL 100 mL/ 100 mL 250 mL/ 250 mL 500mL/ 500 mL 125 mg 250 mg 500 mg 1g 2,5g 5g NALC

Volume (mL) 25 mL 50 mL 100 mL 200 mL 500 mL 1.000 mL

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3.4.3

NaOH 4% (Petroff) Esta soluo tem atividade descontaminante e para ter atividade mucoltica deve ser usada em concentraes altas (4%). Nessa concentrao o NaOH txico para algumas micobactrias, o que torna o tempo de exposio do material a esta substncia crucial para se obter um bom resultado.
REAGENTES PROCEDIMENTO Transferir a amostra deixando escorrer pela parede dos tubos de centrfuga. Colocar o mesmo volume da soluo NaOH 4% (usar uma pipeta para cada amostra). Homogeneizar vigorosamente. Deixar 15 min temperatura de 37C. Adicionar o mesmo volume de gua destilada estril. Gotejar a soluo neutralizante at mudar a cor de rosa para amarelo mbar. Centrifugar a 3.000 X g por 15 minutos. Desprezar o sobrenadante em um recipiente a prova de respingos. Homogeneizar o sedimento . Inocular 0,2 mL da amostra em meio slido e 0,5 mL em meio lquido. Preparar os esfregaos (1 x 2 cm) em lmina Deixar secar bem em CSB antes de fixar na chama. Desprezar todo o material utilizado em lixo apropriado e descontaminar em autoclave antes de descartar no lixo branco.

NaOH 4% Dissolver 40 g de NaOH em um pouco de gua. Manter o frasco resfriado para evitar aquecimento. Completar o volume para 1.000 mL com gua destilada. Esterilizar a 121oC por 15 min. Estocar a temperatura ambiente. Indicador Vermelho de fenol (0,4%) Dissolver 0,4 g de vermelho de fenol em 50 mL de gua destilada. Adicionar NaOH 1 N at mudar para vermelho arroxeado, homogeneizando bem. No adicionar mais que 7 mL. Completar com gua destilada at o volume de 100 mL. Autoclavar a 121C por 15 min. gua destilada estril Soluo de HCl 1N A soluo de HCl pode ser preparada com o indicador vermelho fenol, eliminando uma etapa no processo de neutralizao. Soluo de HCl e vermelho fenol Adicionar 8,5 mL de HCl (37%) a 80 mL de gua destilada. Acrescentar 1,0 mL da soluo de vermelho fenol e completar o volume para 100 mL com gua destilada. Autoclavar a 121 C por 15 min.

MATERIAIS Tubos de centrfuga com tampa de rosca e capacidade para 50 mL (estreis) Pipetas Pasteur descartveis estreis Estufa a 37C e CSB classe II A2 Centrfuga

3.4.4

NaOH 4% (Swab) Este mtodo fornece resultados similares aos obtidos no mtodo de Petroff. Sua aplicao indicada para amostras de escarro. uma tcnica rpida e simples, e no requer o uso de centrfuga. Tambm permite que um laboratrio local, sem recursos de equipamentos, faa a semeadura no meio de Ogawa-Kudoh e envie ao laboratrio de referncia para incubao e leitura.

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REAGENTES Soluo 4% de NaOH estril, preparada como descrito no mtodo de Petroff.

PROCEDIMENTO Impregnar um swab estril com a poro mais purulenta do espcime, atravs de movimentos rotatrios. Transferir o swab impregnado para um tubo contendo 3 mL de NaOH 4%. Deixar em repouso por 2 min. Para descontaminao eficaz, a soluo de NaOH 4% deve cobrir o algodo do swab. Pressionar o swab contra a parede do tubo para remover o excesso de NaOH. Semear, com o prprio swab de maneira a distribuir o material sobre a superfcie de dois tubos contendo meio Ogawa-Kudoh. importante que o meio de cultura possua uma boa superfcie (tubos medindo 18 x 160 mm ou em frascos de 30 mL). Os esfregaos para colorao devem ser preparados como descrito no item baciloscopia direta. Desprezar todo o material utilizado em lixo apropriado, autoclavar antes de descartar. MATERIAIS

Tubos cnicos plsticos, com capacidade para 15 mL contendo 3 mL da soluo de NaOH 4%. Swab preparado com algodo e palito de madeira e esterilizado em autoclave.

3.4.5

cido Oxlico
REAGENTES PROCEDIMENTO Colocar 2 mL da amostra em um tubo cnico de 50 mL. Colocar o mesmo volume da soluo de cido oxlico 3%. Homogeneizar vigorosamente por 30 s. Deixar a temperatura ambiente por 15 min, agitando o tubo ocasionalmente. Adicionar gua destilada estril at a marca de 50 mL do frasco. Centrifugar por 15 a 20 min a 3.000 xg e desprezar o sobrenadante. Adicionar ao sedimento 1-2 gotas de vermelho de fenol. Neutralizar o sedimento com NaOH 4% at obter uma cor rosa claro. Inocular 0,2 mL da amostra no meio apropriado. Preparar esfregaos (1 X 2 cm) em lmina. Desprezar todo o material utilizado em lixo apropriado, autoclavar antes de descartar. MATERIAIS

cido Oxlico 3% Dissolver 30 g de cido oxlico em um pouco da gua destilada e completar para 1.000 mL. Esterilizar a 121oC por 15 min. Estocar a temperatura ambiente. Indicador Vermelho de fenol Dissolver 8 mg de vermelho de fenol em 20 mL de NaOH 4% e completar o volume para 100 mL com gua destilada. Soluo de NaOH 4% Preparada como descrito no mtodo de Petroff. gua destilada estril

Tubos cnicos com tampa de rosca e capacidade para 50 mL (descartveis e estreis). CSB Classe II A2 Centrfuga

o mtodo de escolha para processar amostras com suspeita de contaminao com Pseudomonas aeruginosa, como escarro de pacientes com fibrose cstica.

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Captulo 4: Cultura para Isolamento de Micobactrias

Lucilaine Ferrazoli Gleize Villela

4.1 Meios slidos

Lowenstein-Jensen (LJ)
a) Composio: Fosfato monopotssico anidro (KH2PO4) . . . . . . 4,0 g Sulfato de magnsio (MgSO47H2O) . . . . . . . . . . . 0,4 g Citrato de magnsio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 g Glicerol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 mL gua destilada q.s.p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.000 mL Ovos frescos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.600 mL Soluo aquosa de verde malaquita a 2% . . . 50 mL b) Preparo: Dissolver os sais e o glicerol na gua e esterilizar em autoclave a 121oC por 15 min. Lavar os ovos com gua e sabo, enxaguar, deixar em lcool 70% por 30 min. e secar com gaze estril. Quebrar os ovos assepticamente em recipiente estril contendo prolas de vidro para homogeneizar. Filtrar em gaze estril e medir o volume. Adicionar a soluo de sais e de verde malaquita e homogeneizar. Distribuir 7 mL em tubos com tampa de rosca. Coagular os meios na posio horizontal inclinada, por 50 min a 85oC. c) Inoculao: 0,2 mL do material clnico tratado, em dois tubos contendo meio de LJ. d) Incubao: Em estufa 37oC. O material de pele deve ser incubado a 30 e a 37C. Manter os tubos na posio horizontal com as tampas um pouco desrosqueadas at que o inculo esteja seco. Depois colocar na vertical e apertar as tampas. e) Leituras: Examinar as culturas duas vezes nas duas primeiras semanas e uma vez nas semanas seguintes at completar 8 semanas. Anotar o nmero e a pigmentao das colnias. Observar a presena de contaminantes (fungos e outras bactrias) e presena de mais de um tipo de colnias de micobactrias. Se houver crescimento, fazer um esfregao em lmina de uma colnia, utilizando uma gota de gua estril. Deixar secar, fixar e corar como descrito no item baciloscopia. Observar e anotar: presena de BAAR, a formao de corda e a presena de contaminantes. f) Resultado: Cultura negativa: ausncia de crescimento de colnias. Cultura positiva para BAAR: quando for confirmado BAAR no esfregao em lmina. Cultura contaminada: crescimento de outras bactrias que no micobactrias. Formao de corda: As espcies do complexo M. tuberculosis apresentam a formao de corda, ou grumos aglomerados lineares. Geralmente os bacilos apresentam-se em paliada adquirindo um aspecto de corda. Outras vezes apresentam-se como grumos compactos assemelhando-se a um borro de corantes. A formao de corda mais evidente na cultura em meio lquido.
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Ogawa-Kudoh
a) Composio: Fosfato monopotssico anidro (KH2PO4) . . . . . . 2,0 g Citrato de magnsio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g Glutamato de sdio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 g Glicerol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 mL gua destilada q.s.p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 mL Ovos frescos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 mL Soluo aquosa de verde malaquita a 2% . . . . . 4 mL b) Preparo: Dissolver os sais e o glicerol na gua e ajustar o pH para 5,3 (usar NaOH 1N ou HCl 1N). Esterilizar em autoclave a 121C por 15 min. Lavar os ovos com gua e sabo, enxaguar, deixar em lcool a 70% por 30 min. e secar com gaze estril. Quebrar os ovos assepticamente em recipiente estril contendo prolas de vidro para homogeneizar. Filtrar em gaze estril e medir o volume. Adicionar soluo de sais e de verde malaquita e homogeneizar. O pH final deve ser 6,4. Distribuir 7 mL em tubos com tampa de rosca. Coagular os meios na posio horizontal inclinada, por 50 min a 85C. c) Inoculao: Espalhar o material com o swab sobre a superfcie do meio. d) Incubao: A 37C em estufa por at oito semanas. e) Leituras: Examinar as culturas duas vezes nas duas primeiras semanas e uma vez nas semanas seguintes at completar 8 semanas. Anotar o nmero e a pigmentao das colnias. Observar a presena de contaminantes (fungos e outras bactrias) e presena de mais de um tipo de colnias de micobactrias. Se houver crescimento, fazer um esfregao em lmina de uma colnia, utilizando uma gota de gua estril. Deixar secar, fixar e corar como descrito no item baciloscopia. Observar e anotar: presena de BAAR, a formao de corda e a presena de contaminantes. f) Resultado: Cultura negativa: ausncia de crescimento. Cultura positiva para BAAR: quando for confirmado BAAR no esfregao em lmina. Cultura contaminada: crescimento de outros micro-organismos que no micobactrias. Formao de corda: as espcies do complexo M. tuberculosis apresentam a formao de corda, ou grumos aglomerados lineares. Geralmente os bacilos apresentam-se em paliada adquirindo um aspecto de corda. Outras vezes apresentam-se como grumos compactos assemelhando-se a um borro de corantes. A formao de corda mais evidente na cultura em meio lquido.

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Mdulo 7: Deteco e Identificao de Micobactrias de Importncia Mdica

4.2 Meios lquidos

Middlebrook 7H9 (adquirido comercialmente)
a) Composio Base: sais, vitaminas, cofatores, glicerol. Enriquecimento ADC, tambm adquirido comercialmente. b) Preparo: Seguir as orientaes do fabricante para preparo da base. Adicionar a proporo de 20 mL de ADC para cada 180 mL do meio base. c) Inoculao: Semear 0,5 a 1,0 mL do sedimento tratado. d) Incubao: Incubar em estufa a 37C. Se forem inoculados fragmentos de pele no meio incubar um tubo a 37C e outro a 30C. e) Leituras: Examinar os tubos duas vezes durante as duas primeiras semanas e uma vez nas semanas seguintes at completar oito semanas. Observar a turvao no meio. Se houver crescimento, fazer um esfregao em lmina, utilizando uma gota da cultura. Deixar secar em cabine de segurana, fixar e corar como descrito no item baciloscopia. Observar e anotar: presena de BAAR, a formao de corda e a presena de contaminantes. f) Resultado: Cultura negativa: ausncia de crescimento. Cultura positiva para BAAR: quando for confirmado BAAR no esfregao em lmina. Cultura contaminada: crescimento de outros micro-organismos que no micobactrias. Formao de corda: as espcies do complexo M. tuberculosis apresentam a formao de corda, ou grumos aglomerados lineares. Geralmente os bacilos apresentam-se em paliada adquirindo um aspecto de corda. Outras vezes apresentam-se como grumos compactos assemelhando-se a um borro de corantes. A formao de corda mais evidente na cultura em meio lquido.

4.3 Meios lquidos utilizados em mtodos automatizados

a) Composio MB/BACT: Middlebrook 7H9 b) Inoculao 0,5 mL do material clnico tratado. Uma mistura de antibiticos deve ser adicionada previamente. 0,5 mL do material tratado, adicionar 0,8 mL de OADC previamente (acompanha o kit) e PANTA (soluo de antibiticos). 5 mL de sangue c) Incubao 37oC no equipamento automatizado MB BacT/Alert por 42 dias d) Leituras Leitura automtica e constante pelo aparelho.

MGIT: Middlebrook 7H9

Estufa a 37oC ou no equipamento BACTEC MGIT960, durante 42 dias

Quando os tubos so incubados no equipamento, a leitura realizada automaticamente e os tubos positivos so indicados no visor e na parte frontal da gaveta do equipamento. Leitura automtica e constante pelo aparelho. * Estes frascos so apenas para processamento de amostras de sangue.

BACTEC MYCO LYTIC: Middlebrook 7H9

37oC no equipamento Bactec 9420 durante 42 dias

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Confirmao da presena de BAAR em culturas positivas de qualquer sistema automatizado: Em caso de crescimento microbiano, fazer um esfregao da cultura em lmina, de acordo com as recomendaes do fabricante, secar em CSB, fixar e corar como descrito no item baciloscopia. Observar e anotar: presena de BAAR, a formao de corda e a presena de contaminantes. Resultado

Cultura negativa: ausncia de crescimento Cultura positiva para BAAR: quando for confirmado BAAR no esfregao em lmina. Cultura contaminada: crescimento de quaisquer outros micro-organismos que no micobactrias. Formao de corda: As espcies do complexo M. tuberculosis apresentam a formao de corda, ou grumos aglomerados lineares. Geralmente os bacilos apresentam-se em paliada adquirindo um aspecto de corda. Outras vezes apresentam-se como grumos compactos assemelhando-se a um borro de corantes. A formao de corda mais evidente na cultura em meio lquido.

Controle de qualidade

Controle positivo: apresenta crescimento abundante no meio. Mycobacterium tuberculosis H37Ra ATCC25177 ou Mycobacterium kansasii ATCC12478 O controle de qualidade deve ser realizado de acordo com as especificaes do fabricante.

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Mdulo 7: Deteco e Identificao de Micobactrias de Importncia Mdica

4.3.1

Sugesto de meios de cultura, temperatura de incubao e mtodo de processamento de diferentes amostras para isolamento de micobactrias
Inoculao direta x x Tratamento da amostra Meio para isolamento LJ x x OgawaKudoh Outros Bactec Myco/F Lytic, MB/BacT 7H9. 25 a 30C 37C x x x x x x x x x x x

Amostra Sangue Medula ssea

Lquidos asspticos Lquor Amostras respiratrias Lavado gstrico Secrees e bipsias Secrees e bipsias cutneas Urina

x x x x x x x

x x x x x x x x

Lytic, MB/BacT, 7H9. MGIT, MB/BacT, 7H9. MGIT, MB/BacT, Ogawa. Kudoh, MGIT, MB/ BacT. MGIT, MB/BacT. MGIT, MB/BacT. MGIT, MB/BacT, suplementado com hemina. MGIT, MB/BacT.

Linfonodo

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Captulo 5: Identificao de Micobactrias

Lucilaine Ferrazoli Gleize Villela

Os testes de identificao de micobactrias devero ser realizados em CSB, classe II, A2. O tcnico dever utilizar equipamentos de proteo individual (EPIs), como mscara (N95), luvas e avental. Os laboratrios que fazem cultura para micobactrias devem realizar pelo menos a separao das espcies do complexo M. tuberculosis das MNT, do contrrio devero reportar o resultado das culturas positivas como Mycobacterium sp. A identificao das MNT pode ser feita por mtodos fenotpicos, moleculares ou pela combinao de ambos. Entretanto, devido ao aumento no nmero de espcies descritas, recomenda-se que os isolados de MNT sejam encaminhados a um Laboratrio de Referncia da regio de abrangncia do laboratrio para identificao.

5.1 Separao das espcies do complexo M. tuberculosis das MNT

A separao das espcies do complexo M. tuberculosis das MNT pode ser feita por quatro testes fenotpicos: a) Anlise microscpica da cultura b) Anlise macroscpica da cultura c) Inibio de crescimento em meio de LJ contendo cido p-nitrobenzico (PNB) d) Teste da niacina

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A) Anlise microscpica da cultura A anlise microscpica consiste na confeco de um esfregao em lmina a partir de uma colnia, corado pelo mtodo de Ziehl-Neelsen. Permite avaliar a pureza da cultura, confirmar presena de BAAR e a formao de corda. De modo geral, as micobactrias apresentam-se na forma de bacilos curvos ou retos. As espcies do complexo M. tuberculosis apresentam um arranjo caracterstico dos bacilos em cadeias lineares paralelas (ou cordes de bacilos) denominado corda. A formao de corda mais evidente em meio lquido, mas tambm pode ser observada em esfregaos obtidos de cultura em meio slido. A maioria das MNT no forma corda, apresentando aspecto microscpico de bacilos isolados, com exceo de algumas espcies como M. kansasii, M. fortuitum e M. chelonae. B) Anlise macroscpica da cultura Esta avaliao feita na cultura original em meio slido. As colnias de micobactrias cultivadas em meio slido apresentam diferentes morfologias e pigmentao. A morfologia das colnias pode ser lisa, rugosa, opaca ou transparente. A pigmentao , tambm, uma caracterstica importante utilizada na classificao e pode variar de laranja a amarelo intenso.
a) Materiais Lupa b) Procedimento Observar a cultura de preferncia com uma lupa manual em um ambiente iluminado e anotar as caractersticas da colnia. Observar e anotar o aspecto da colnia: lisa, rugosa, aspecto de couve-flor. Observar e anotar a pigmentao da colnia: acromgena (creme), pigmentada (laranja, amarela, salmo). c) Resultado Colnia de M. tuberculosis: colnia rugosa com aspecto de couve-flor, acromgena, geralmente de cor creme. Colnia de MNT: pigmentada ou acromgena, lisa ou rugosa.

C) Teste da inibio do crescimento em PNB (cido p-nitrobenzico) Separa as espcies do complexo M. tuberculosis que so inibidas das demais micobactrias que crescem neste meio.

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a)Reagentes Meio LJ contendo 500 g/mL de cido p-nitrobenzico Soluo estoque de PNB (25 mg/mL) Dissolver 2,5 g de PNB em 15 mL de soluo NaOH 1N. Completar com gua destilada estril at 80 mL. Acrescentar uma ou duas gotas de soluo de fenolftalena 0,1% (soluo em etanol). Acrescentar, gota a gota, cerca de 3 mL de uma soluo de HCl 1 N, at ficar incolor. Se houver precipitao, devido ao excesso de cido; acrescentar mais um pouco de NaOH. Completar com gua destilada estril at 100 mL. Distribuir 5 mL em criotubos estreis e manter a -200C. Validade: trs meses. Meio de LJ contendo 500 g/mL de PNB Adicionar 4 mL da soluo estoque de PNB 25 mg/mL em 200 mL do meio de LJ antes da coagulao. Distribuir 3 mL de meio em tubos 12 x 120 mm. Coagular o meio, colocando os tubos inclinados, a 85C por 45 min. Incubar a 36C + 1C por 24 h para a prova de esterilidade. Validade: 3 meses. b) Materiais Ala descartvel estril Estufa 37oC Pipeta Pasteur descartvel estril Frascos de 3-5mL com tampa de rosca contendo 1,0 mL de gua destilada e prolas de vidro estreis.

C) Procedimento Transferir uma alada (no muito cheia) do crescimento bacteriano para o frasco com gua destilada e prolas de vidro e homogeneizar. Deixar em repouso por 10 a 15 min. Inocular 0,2 mL da suspenso com a pipeta Pasteur no tubo de LJ contendo PNB e no tubo LJ controle. Incubar a 37oC. d) Resultado: Positivo: crescimento Negativo: sem crescimento e) Controle de qualidade: Positivo: MNT Negativo: complexo M. tuberculosis

D) Teste de produo de niacina Todas as micobactrias produzem niacina (precursor das coenzimas NAD e NADP), mas algumas espcies tm um bloqueio na via metablica do NAD que faz com que a niacina seja acumulada e excretada no meio de cultura.
a) Reagentes: Fitas para o teste da niacina, disponveis comercialmente. b) Materiais e equipamentos: Ala descartvel estril Estufa 37oc Pipeta pasteur descartvel estril Tubo de rosca 12x120 mm estril gua destilada estril c) Procedimento: Seguir as instrues fornecidas pelo fabricante. d) Resultado: Positivo: cor amarela no lquido Negativo: no ocorre mudana de cor e) Controle de Qualidade: Positivo: M. tuberculosis Negativo: complexo M. avium

5.1.1
Pigmentao

Separao do complexo M. tuberculosis das MNT

complexo M. tuberculosis ausente + + MNT presente/ausente + +/-

Caractersticas

Formao de corda Crescimento em LJ-PNB Produo de niacina

-/+ = predominantemente negativo; PNB = cido -nitrobenzico.

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5.2 Testes automatizados e moleculares para identificao

5.2.1 Identificao por sondas de cidos nucleicos As sondas de DNA utilizam uma fita simples de DNA marcada com um ster de acridina complementar ao rRNA do micro-organismo alvo. Aps a lise das clulas da micobactria, o rRNA liberado e a sonda marcada se combina com esse rRNA formando um complexo sonda + rRNA. Uma soluo hidroltica utilizada para inativar o ster no ligado ao rRNA. O complexo formado detectado por quimioluminescncia com um luminmetro. A quantidade de luz produzida proporcional a quantidade de complexos sonda + rRNA presentes na amostra. As sondas disponveis comercialmente identificam o complexo M. tuberculosis, complexo M. avium, M.kansasii, M.gordonae e M.intracellulare (GenProbe Inc. San Diego, CA).
Identificao por sondas de cidos nucleicos a) Materiais e Equipamentos Luminmetro Sonicador de banho maria Banho seco 95oC Seringa de tuberculina Pipetas automticas de 100l e 300l Banho 60C b) Procedimento 1. Se for utilizado crescimento de micobactrias em meio lquido. Utilizar a cultura quando o crescimento atingir a escala 1 ou superior de McFarland. Adicionar 100 l do reagente 1 e 100l do reagente 2 em um tubo de lise. Ligar todos os banhos para que possam atingir a temperatura adequada antes de comear o teste. Retirar 1 mL do crescimento bacteriano e colocar no tubo de lise. Agitar o tubo vigorosamente por 5 min. Sonicar por 15 min. temperatura ambiente. Colocar o tubo no banho a 95C por 15 min. Deixar o tubo esfriar a temperatura ambiente. Retirar 100 l do lisado e transferir para um tubo com a sonda. Incubar 15 min a 60C. Pipetar 300 l do reagente 3 (que vem no kit) no tubo. Tampar e misturar no vortex. Colocar no banho a 60C * por 5 min. Retirar do banho, deixar chegar a temperatura ambiente e colocar no luminmetro para fazer a leitura. * A temperatura do banho de 60C crucial para ocorrer o anelamento da sonda com o rRNA da amostra. 2. Se for utilizado crescimento de micobactrias em meio slido: Colocar 100l do reagente 1 e 100l do reagente 2 no tubo de lise Inocular uma alada cheia do crescimento no tubo de lise. Proceder como descrito acima no item 1 3. Se for utilizado crescimento de micobactrias em meio lquido: Somente fazer o teste quando o caldo apresentar uma boa turvao. Colocar 100 l do reagente 1 e 100 l do reagente 2 no tubo de lise Colocar 1 mL da amostra no tubo de lise Proceder como descrito acima no item 1. Nota: O passo mais importante no processo a lise das clulas. Aps colocar a amostra no tubo de lise, agitar no vortex vigorosamente por aproximadamente 5 min para que o processo seja adequado. c) Resultado Positivo: > 30,000 RLU (Relative Light Units) Negativo: < 30,000 RLU A sonda para o complexo M. tuberculosis no identifica as diferentes espcies de micobactrias pertencentes ao complexo.

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5.2.2

Identificao por mtodos de amplificao do DNA Vrios so os mtodos para amplificao do DNA de micobactrias que existem no mercado. No entanto, apenas alguns possuem a aprovao do FDA (Food and Drugs Administration, EUA) para serem utilizados em amostras pulmonares com baciloscopia positiva; a exemplo do Amplicor e Cobas-Amplicor (Roche Molecular Systems Brancburg, NJ) e AMTD e EMTD nova gerao do AMTD (Gen Probe Inc., San Diego, CA). Este ltimo aprovado para uso em amostras com baciloscopia negativa. Esses testes foram aprovados apenas para uso rotineiro na suspeita clnica de TB pulmonar em pacientes adultos, no infectados pelo HIV e sem tratamento prvio nos 10 meses que antecedem o evento atual. O CDC (Center for Disease Control, EUA) recomenda a seguinte interpretao para esses testes: a) Baciloscopia positiva e PCR positiva, confirmao do caso de TB. b) Baciloscopia positiva e PCR negativa, avaliao de inibidores da reao de PCR na amostra analisada. Se no forem encontrados inibidores, suspeitar de infeco por uma MNT. c) Baciloscopia negativa e PCR positiva analisar nova amostra, caso a nova amostra seja positiva, o caso confirmado. d) Baciloscopia negativa e PCR negativa, analisar nova amostra. importante ressaltar que esses testes so caros e no se aplicam para monitoramento do tratamento, nem substituem a cultura. O procedimento tcnico para a realizao desses mtodos deve seguir rigorosamente as instrues do fabricante.

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5.2.3

Resumo dos mtodos:

PCR (Amplicor, Roche Diag. Systems) AMTD (Gen Probe) um sistema semi-automtico de amplificao de RNA que utiliza uma nica temperatura de amplificao e duas enzimas, uma que converte o rRNA em DNA e outra que transcreve o DNA em RNA. Kit AMTD pipetas automticas sonicador banho 42C banho seco 95C banho 60C luminmetro Tratar a amostra pelo mtodo de NALCNaOH. Utilizando os reagentes do kit: extrair o DNA das micobactrias; purificar e concentrar o DNA extrado; amplificar o DNA purificado e concentrado; detectar o produto amplificado com sondas especficas marcadas com um ster de acridina. Fazer a leitura no luminmetro.

Princpio

um sistema semi-automtico de amplificao do DNA por uma srie de incubaes sucessivas em diferentes temperaturas usando uma enzima estvel a temperatura e dependente de DNA (Taq polimerase). kit Amplicor termociclador pipetas automticas

Materiais e Equipamentos

Procedimento

Tratar a amostra pelo mtodo de NALCNaOH. Utilizando os reagentes do kit: extrair o DNA das micobactrias; purificar e concentrar o DNA extrado; amplificar o DNA purificado e concentrado; detectar o produto amplificado com sondas especficas, marcadas com digoxigenina e biotina no formato de uma reao imunoenzimtica colorimtrica.

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Anexos ANEXO A. Indicadores para avaliao da qualidade da baciloscopia

Indicador 1. Percentual de baciloscopias liberadas aps 24 horas da recepo da amostra, no perodo em avaliao
Uso: avaliar a resposta do laboratrio em relao realizao da baciloscopia e liberao de resultados em tempo ideal (mximo 24 h) Perodo de avaliao: semestral Fonte de dados: livro de Registro de Baciloscopia para Diagnstico e Controle da TB Parmetro de avaliao e interpretao: percentual deve ser a 15% (adequado) Mtodo de clculo: N de resultados liberados aps 24h da recepo das amostras em determinado perodo No total de baciloscopias liberadas no mesmo perodo x 100

Indicador 2. Percentual de amostras para diagnstico com aspecto de saliva, no perodo em avaliao
Uso: avaliar a qualidade das amostras recebidas para diagnstico e necessidade de treinamento/ reciclagem do tcnico que orienta o paciente para a coleta Perodo de avaliao: semestral Fonte de dados: livro de registro de baciloscopia Parmetro de avaliao/interpretao: percentual deve ser a 15% (adequado) Mtodo de clculo: N amostras de escarro recebidas com aspecto de saliva em determinado perodo N total de amostras de escarro recebidas no mesmo perodo x 100

Indicador 3. Percentual de lminas com esfregao inadequado, no perodo de avaliao

Uso: avaliar a necessidade de treinamento/reciclagem do tcnico que prepara os esfregaos Perodo de avaliao: trimestral ou estabelecido pelo laboratrio. Fonte de dados: observao macroscpica do esfregao pela equipe tcnica do laboratrio ou relatrio do CQE* realizado pelo laboratrio de referncia. Parmetro de avaliao/interpretao: percentual deve ser a 10% (adequado) Mtodo de clculo: N de esfregaos considerados inadequados em determinado perodo N total de esfregaos realizados no mesmo perodo
*CQE= Controle de Qualidade Externo 39

x 100

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Indicador 4. Percentual de lminas com colorao inadequada, no perodo em avaliao

Uso: avaliar a necessidade de treinamento do tcnico que realiza a colorao dos esfregaos Perodo de avaliao: determinado pelo laboratrio ou sempre que chegar o relatrio do CQE. Fonte de dados: observao macroscpica do esfregao pela equipe tcnica do laboratrio ou relatrio do CQE* realizado pelo laboratrio de referncia. Parmetro de avaliao/interpretao: percentual deve ser a 10% (adequado) Mtodo de clculo: N de lminas com colorao inadequada em determinado perodo N total de lminas realizadas no mesmo perodo
*CQE= Controle de Qualidade Externo

x 100

Indicador 5. Percentual de lminas para diagnstico submetidas ao CQE com discordncia qualitativa na leitura, no perodo em avaliao.
Uso: avaliar a confiabilidade dos resultados da baciloscopia e necessidade de treinamento do tcnico responsvel. Perodo de avaliao: sempre que chegar o relatrio do CQE*. Fonte de dados: relatrio do CQE realizado pelo laboratrio de referncia. Parmetro de avaliao/interpretao: um percentual de lminas acima de 1,0% com resultado falso positivo leva a diagnstico errado e ao uso inadequado de medicamentos; um percentual de lminas acima de 0,5% com resultado falso negativo acarreta a no identificao das fontes de infeco. Mtodo de clculo: Lminas com resultado falso positivo: N total de lminas submetidas ao CQE com resultado falso positivo no perodo Total de lminas positivas submetidas ao CQE no mesmo perodo Lminas com resultado falso negativo: N total de lminas submetidas ao CQE com resultado falso negativo no perodo Total de lminas negativas submetidas ao CQE no mesmo perodo x 100

x 100

*CQE= Controle de Qualidade Externo

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ANEXO B. Percentual de positividade da baciloscopia no laboratrio

Indicador 1. Percentual de positividade da baciloscopia
Fonte: livro do laboratrio Perodo de avaliao: mensal Mtodo de clculo: N de baciloscopias positivas de diagnstico no perodo N total de baciloscopias de diagnstico examinadas

x 100

ANEXO C . ndice de contaminao das culturas

Indicador 1. Percentual de contaminao das culturas
Perodo de avaliao: ms Parmetro de avaliao: 3-5% adequado. ndice menor indica que o tratamento para descontaminao est sendo muito drstico. Mtodo de clculo: N de culturas contaminadas no perodo x 100 N total de culturas no perodo

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Referncias Bibliogrficas
BRASIL. Resoluo CONAMA n. 358 de 29 de abril de 2005. Dispe sobre o tratamento e a disposio final dos resduos dos servios de sade e d outras providncias. Dirio Oficial da Unio, Poder Executivo, Braslia, n. 84, p 63-5, de 04 de maio de 2005, Seo 1. COLLINS, C.H.; GRANGE, J.M.; YATEs, M.D. Tuberculosis Bacteriology: Organization and Practice. Butter Worth-Heinemann, Oxford, 2nd edition. 1997. CVE/SES-SP. Orientaes para investigao clnica e tratamento de infeces por Mycobacterium spp. em procedimentos estticos. Disponvel em (http://www.cve.saude. sp.gov.br/htm/ih/ih_saude.html). Acesso em 19 de abril de 2013. EUZBY, J.P. List of bacterial names with standing in nomenclature. Disponvel em: (http:// www.bacterio.cict.fr/m/mycobacterium.html). Acesso em 19 de abril de 2013. HALL, L.; ROBERTS, G.D. Non-molecular identification of nontuberculous micobactria in the clinical microbiology laboratory: whats the real deal? Clinical Microbiology Newsletter, 28:7380, 2006. KENT, P.T. ; KUBICA G.P. Public Health Mycobacteriology. A guide for the Level III Laboratory. Centers for Disease Control, Atlanta, 1985. KONEMAN, E.W.; ALLEN, A.D.; JANDA, W.M.; SCHRECKENBERGER, P.C.; WINN JR., W.C. Mycobacteria. In: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. Lippincott, Philadelphia, 5a ed, 1997. MONTEIRO, P.H.T.; MARTINS, M.C.; UEKI, S.Y.M.; GIAMPAGLIA, C.M.S.; TELLES, M.A.S. Cord formation and colony morphology for the presumptive identification of Mycobacterium tuberculosis complex. Brazilian Journal of Microbiology, 34:171-174, 2003. BRASIL. Ministrio da Sade. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. 3a ed. Edio comemorativa. Rio de Janeiro. 2005. MS/SVS/DVE-Manual Nacional de Vigilncia Laboratorial da Tuberculose e outras Micobactrias. 1 edio. Braslia, 2008. BRASIL. Ministrio da Sade. Tuberculose-Diagnstico Laboratorial Baciloscopia. Srie TELELAB, Braslia, 2001. WAGNER D, YOUNG LS. Nontuberculous mycobacterial infections: a clinical review. Infection, 32: 257-70, 2004. WHO. Laboratory Services in Tuberculosis Control: Part I Organization and Management. Geneva, 1998.

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Figuras

Formao de corda em esfregao de cultura de M. tuberculosis corado pela tcnica de Ziehl-Neelsen.

Aspecto microscpico de MNT em esfregao de cultura corado pela tcnica de Ziehl-Neelsen.

Aspecto macroscpico de colnias de Mycobacterium tuberculosis

Aspecto macroscpico de colnia de MNT

Cultura de micobactrias em meio Lowenstein-Jensen. A) Mycobacterium tuberculosis; B e C) MNT

Teste da niacina. A) teste positivo; B) teste negativo.

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