FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFA DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA, BIOLOGA MOLECULAR Y FARMACOLOGA SECCION BIOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR PRCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA

2010 II PRCTICA # 7 TTULO: INHIBICIN ENZIMTICA 1. INTRODUCCIN

Inhibicin Enzimtica La actividad enzimtica puede ser disminuida o bloqueada por la accin de ciertas molculas o inclusive tomos a las cuales se les conoce con el nombre de inhibidores enzimticos. Mediante el uso de los inhibidores enzimticos se ha obtenido informacin muy valiosa sobre la conformacin del centro activo de algunas enzimas. Las distintas formas de interaccin se traducen en varios tipos de inhibicin perfectamente diferenciables experimentalmente. Los dos tipos ms comunes de inhibicin son la competitiva y la no competitiva. La primera es cuando el inhibidor compite con el substrato por la unin con el centro activo de la enzima. Este tipo de inhibicin puede reducirse si se aumenta la concentracin de substrato. Un ejemplo clsico lo constituye la inhibicin del malonato sobre la enzima succinato deshidrogenasa que cataliza la eliminacin de dos tomos de hidrgeno de los tomos de carbono metilnico del succinato. En el segunda tipo de inhibicin, el inhibidor interacta con la enzima ya sea cerca del centro activo o distante modificando el centro activo pero sin modificarla irreversiblemente. Un ejemplo son los gases nerviosos, como el fluorofosfato de di isopropilo (DFP) que forma un complejo con la enzima acetilcolinesterasa. Los animales envenenados con este gas quedan paralizados, debido a la imposibilidad de transmitir adecuadamente los impulsos nerviosos. Otro ejemplo de sustancias que inhiben a las enzimas son los metales como el plomo, mercurio y arsnico inhiben enzimas que tienen en su centro activo grupos que presentan grupos -SH libres. Los inhibidores enzimticos ha sido muy tiles en las estrategias desarrolladas para comprender los mecanismos de accin txica y farmacolgica de algunos compuestos Inhibidor: Efector que hace disminuir la actividad enzimtica, a travs de interacciones con el centro activo u otros centros especficos (alostricos). Esta definicin excluye todos aquellos agentes que inactivan a la enzima a travs de desnaturalizacin de la molcula enzimtica, de esta forma, habr dos tipos de inhibidores: Isostricos: ejercen su accin sobre el centro activo Alostricos: ejercen su accin sobre otra parte de la molcula, causando un cambio conformacional con repercusin negativa en la actividad enzimtica. Tipos de inhibicin Inhibicin competitiva En la inhibicin competitiva, el inhibidor se une a la enzima libre e impide que el substrato se una al sitio activo. En otras palabras, el inhibidor y el substrato se excluyen mutuamente debido a la competencia que se establece entre ellos. El inhibidor competitivo es un anlogo no metabolizable, un derivado del substrato u otro substrato para la enzima, o un producto de la reaccin.
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Inhibicin no competitiva En la inhibicin no competitiva, la unin del inhibidor a la enzima no influye en la unin del substrato. Tanto el substrato como el inhibidor se unen de manera reversible a sus sitios respectivos y a la vez distintos de la enzima, de manera independiente y al azar. Esto quiere decir que el inhibidor puede unirse tanto a la enzima libre como al complejo enzimasubstrato y el substrato tanto a la enzima libre como al complejo enzima-inhibidor. El complejo enzima-substrato-inhibidor es cataliticamente inactivo, presumiblemente porque la unin del inhibidor altera la conformacin del centro activo de manera tal que la catlisis no puede producirse. Fosfatasa Alcalina Las enzimas de tipo fosfatasa hidrolizan el enlace ster fosfato, formando un alcohol y un derivado fosfatado. Cuando el agua es el aceptor del fosfato, se forma fsforo inorgnico (Figura 1).
OH l ROP =O l OH OH l HOP =O l OH

H2O

FA

ROH

ster fosfrico

agua

derivado fosfatado

alcohol

Fig. 1. Reaccin qumica de una fosfatasa. La enzima fosfatasa alcalina es una metaloenzima no especfica que acta sobre los steres fosfricos liberando fsforo inorgnico a pH alcalino, en presencia de iones zinc y magnesio. Sus niveles sricos se incrementan en las enfermedades hepticas, seas o en infecciones gstricas. La fosfatasa alcalina se encuentra en el hgado, rin, hueso e intestino y es un indicador muy sensible de colestasis (secrecin de bilis deficiente) y dao heptico en los animales Para determinar la actividad de la enzima fosfatasa alcalina se utilizar como sustrato el pnitrofenilfosfato (p-NFF, peso molecular = 371,1), siendo el producto liberado por hidrlisis enzimtica el p-nitrofenol que presenta una coloracin caracterstica con un Coeficiente de extincin molar = 18 300 M-1 cm-1 a 405nm (Figura 2). La presencia de p-nitrofenol se puede determinar espectrofotomtricamente a esta longitud de onda en solucin alcalina. El p-NNF no absorbe luz a esta longitud de onda, de manera que el desarrollo de la reaccin (formacin de producto) puede ser seguido fcilmente midiendo el cambio de absorbancia.

O2N
p-nitrofenilfosfato
(incoloro)

OPO 3H2 + H2O

Fosfatasa Alcalina

O 2N
p-nitrofenol
(amarillo)

OH + H3PO4

Fig. 2. Reaccin del p-nitrofenil fosfato catalizada por la fosfatasa alcalina. 2. OBJETIVOS
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FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFA DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA, BIOLOGA MOLECULAR Y FARMACOLOGA SECCION BIOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR PRCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA 2010 II 2.1. OBJETIVO GENERAL Estudiar la accin de inhibidores en la cintica de la enzima 2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS Determinar las constantes catalticas Km y Vmx de un enzima en presencia y ausencia de un inhibidor. 3. PROCEDIMIENTO Materiales Tampn (Buffer) Tris-HCl 0.5M, MgCl2 5mM, pH9 Solucin de p-NPP, 1mg/mL tamponada L-Phe 50mM NaH2PO4 25mM Fosfatasa alcalina intestinal en solucin tamponada (buffer) NaOH 3N Tubos de vidrio Micro pipetas Puntas para micro pipeta Espectrofotmetro de luz visible, cubetas Cronmetro

Mtodo Rotular 16 tubos y colocar los reactivos de acuerdo a las siguientes tablas: *Agregar la enzima y el NaOH 3N cuando corresponda en intervalos de 30 segundos entre un tubo y otro tubo Sin Inhibidor

Tubo Blanco 1 2 3 4 5 6 Tampon (l) 990 950 930 910 830 750 670 p-NPP (l) 0 40 60 80 160 240 320 Enzima (l) 10 10 10 10 10 10 10 Incubar a temperatura ambiente por 3 minutos Detener la reaccin con: NaOH 3N (l) 160 160 160 160 160 160 160

7 590 400 10

160

Con Inhibidor
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Tubo Blanco 1 2 3 4 5 Buffer (l) 950 910 890 870 790 710 p-NPP (l) 0 40 60 80 160 240 NaH2PO4 (l) 40 40 40 40 40 40 Enzima (l) 10 10 10 10 10 10 Incubar a temperatura ambiente por 3 minutos Detener la reaccin con: NaOH 3N (l) 160 160 160 160 160 160 Leer la absorbancia de los tubos versus el blanco a 405nm ANALISIS DE LOS DATOS 1) Graficar en papel milimetrado segn los resultados obtenidos:

6 630 320 40 10

7 550 400 40 10

160

160

a) Velocidad inicial vs Concentracin de Sustrato (Vo vs [S]) para la fosfatasa alcalina sin inhibidor y con inhibidor. b) Graficar el grfico de Lineweaver-Burk (1/Vo vs 1/[S]) y determinar el Km y Vmx de la Fosfatasa Alcalina sin inhibidor y con inhibidor. 2) Qu tipo de inhibicin ocasiona la adicin de NaH2PO4 en la fosfatasa alcalina. Fundamente su respuesta. 3) Con los datos que se presentan a continuacin determine la naturaleza del inhibidor A (competitivo, no competitivo, acompetitivo o mixto) y calcule el Km y la Vmax de la enzima con y sin inhibidor. Utilice las graficas de Lineweaver-Burk (1/Vo vs 1/[S]). [S] mM 0,20 0,25 0,50 1,00 2,00 4,00 5,00 Velocidad (mmoles/min) Sin Inhibidor Inhibidor A 16,67 5,56 20,00 6,67 33,33 11,11 50,00 16,67 66,67 22,22 80,00 26,67 83,33 27,77

4. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Mathews CK & van Holde KE. (2000) Bioqumica. 2da Ed. McGraw-Hill Interamericana, Madrid. Nelson DL & Cox MM. (2005) Lehninger Principios de bioqumica. 4ta Ed. Ediciones Omega. Barcelona. Segel IH. (1968) Biochemical Calculations How to Solve Mathematical Problems in General Biochemistry. 2nd Ed. John Wiley & Sons. New York.