MINISTRIO DA SADE

Jos Serra
Ministro de Estado da Sade

Joo Yunes
Secretrio de Polticas de Sade

Pedro Chequer
Coordenador Nacional de DST e Aids

Hlio Moraes de Souza

Coordenador Nacional de Sangue e Hemoderivados

Miriam Franchini e Hlio Moraes de Souza

Coordenadores do projeto TELELAB - Srie Sangue

Autores:
Alejandro Luquetti Eliana Furtado Moreira Maria de Ftima Sampaio Gadelha Yara de Miranda Gomes Maria Lcia Ricciotti Ribinik (pedagogia) Maristela Arantes Marteleto (pedagogia)

Colaboradores:
Luiz Alberto Peregrino Ferreira Maria Luiza Bazzo Hlio Moraes
Doena de Chagas Triagem e diagnstico sorolgico em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblico. Braslia: Ministrio da Sade, Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. 1998. 76. p. : il (Srie TELELAB) 1. Doena de Chagas Triagem e diagnstico sorolgico em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica I. Coordenao Nacional de Doena Sexualidade Transmissveis e Aids (Brasil) II. Srie TELELAB

Apresentao
Coordenao Nacional de DST e Aids e a Coordenao de Sangue e Hemoderivados do Ministrio da Sade, em nome do compromisso com a melhoria do atendimento populao, unem seus esforos a fim de promover o aperfeioamento dos profissionais dos laboratrios de sade pblica e das unidades hemoterpicas. Nessa perspectiva, os cursos do Sistema de Educao a Distncia TELELAB, organizados numa abordagem favorvel ao repensar da prtica profissional, oferecem aos profissionais da sade uma oportunidade de adquirir conhecimentos embasados em critrios tcnico-cientficos de qualidade para assegurar o padro de excelncia desejvel no atendimento aos usurios dos servios de sade. Queremos deixar registrado nosso agradecimento a todos os que contriburam na produo dos vdeos e dos manuais que compem os cursos. Esses especialistas de reas to diversas aproveitaram as diferenas para realizar um trabalho harmnico e integrado, o que refora a nossa idia de que em equipe e em parceria que se constri um sistema nico de sade com qualidade. Aos alunos do TELELAB nossas boas vindas e votos de sucesso! Pedro Chequer
Coordenador Nacional de DST e Aids

Hlio Moraes de Souza

Coordenador Nacional de Sangue e Hemoderivados

DOENA DE CHAGAS

Seja bem-vindo(a)!
Voc agora faz parte do TELELAB, um Sistema de Educao a Distncia do Ministrio da Sade. Esto sua disposio os seguintes cursos:
Cursos TELELAB
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 Tcnicas para Coleta de Secrees Tcnicas para Coleta de Sangue Tcnica de Colorao de Gram Cultura, Isolamento e Identificao de "Neisseria gonorrhoeae" Diagnstico Laboratorial da Chlamydia Diagnstico Sorolgico da Sfilis Diagnstico Sorolgico do HIV: Testes de Triagem Diagnstico Sorolgico do HIV: Testes Confirmatrios Coleta de Sangue de Doadores Preparao de Hemocomponentes Doena de Chagas Triagem e Diagnstico Sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica HTLV- I/II Triagem e Diagnstico Sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica Hepatites Virais Triagem e Diagnstico Sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica Controle de Qualidade de Testes Sorolgicos em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica Equipamentos - Utilizao e Monitoramento em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica Biossegurana em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

Pr-requisitos
Curso 01 Curso 01 e Curso 03 Curso 01 Curso 02 Curso 02 Curso 02 e Curso 07 Curso 09 Curso 02 Curso 02 Curso 02 Curso 06 ou 07 ou 11 ou 12 ou 13 Um dos cursos anteriores Um dos cursos anteriores

12 13 14 15 16 -

Observaes: 1. Voc se inscreve em um curso por vez, escolhido de acordo com seu interesse e/ou necessidade do servio, respeitando os pr-requisitos identificados. 2. O curso Controle de Qualidade de Testes Sorolgicos complemento essencial para todos os cursos de diagnstico sorolgico. Ele deve ser feito imediatamente aps a concluso do primeiro desses cursos (06 ou 07 ou 11 ou 12 ou 13). 3. Os cursos de Equipamentos (15) e de Biossegurana (16) so complementos essenciais para todos os outros cursos e devem ser feitos aps o primeiro curso concludo por voc.

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Como funciona
Os cursos do TELELAB esto programados de modo a no interferir na sua rotina de trabalho e voc tem 1 ms para concluir cada curso que fizer. Em cada um deles, voc: Pr-teste Vdeo Manual faz um pr-teste e, depois, assiste a um vdeo quantas vezes quiser, no lugar combinado com a coordenao local do TELELAB; estuda o manual correspondente, no tempo, horrio e lugar de sua preferncia; faz um ps-teste para avaliao de sua aprendizagem depois de acertar no mnimo 80% dos psteste, recebe um certificado Para esclarecimentos de dvidas e sempre que precisar, comunique-se diretamente com:

Ps-teste

Certificado

TELELAB - CN-DST/AIDS - MS Fax gratuito: 0800-61-2436

Ao final do curso "Doena de Chagas - Triagem e Diagnstico Sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica", voc ser capaz de: T identificar os procedimentos e as tcnicas recomendadas pelo Ministrio da Sade para triagem sorolgica de doadores de sangue e para o diagnstico sorolgico da doena de Chagas; T executar os testes para deteco da infeco pelo T. Cruzi, obedecendo a critrios tcnicos e de controle de qualidade.

GUARDE ESTE MANUAL. ELE SEU. USE-O!

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Sumrio
INTRODUO A DOENA DE CHAGAS E MTODOS PARA DETECO DA INFECO PELO T.CRUZI Introduo o agente causador da doena de Chagas formas de contaminao pelo T. cruzi testes utilizados para o diagnstico laboratorial da infeco pelo T. cruzi testes parasitolgicos testes sorolgicos testes sorolgicos para deteco da infeco pelo T. cruzi TESTE DE HEMAGLUTINAO INDIRETA HAI a reao de HAI leitura da reao e critrios para definio de amostra reagente, no reagente e indeterminada teste qualitativo e quantitativo diluies determinao de ttulo de uma amostra no teste de HAI materiais para realizao do HAI qualitativo e quantitativo procedimentos para realizao do teste de HAI qualitativo e quantitativo garantia de qualidade nos resultados do HAI TESTE DE IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA IFI a reao de IFI leitura da reao e critrios para definio de amostra reagente, no reagente e indeterminada diluies da amostra para realizao de IFI qualitativo e quantitativo determinao do ttulo de amostra no teste de IFI necessidade de titulao do conjugado materiais para realizao do IFI qualitativo e quantitativo armazenagem dos reagentes do IFI realizao da titulao do conjugado interpretao dos resultados para determinao do ttulo ideal do conjugado realizao do teste de IFI garantia de qualidade dos resultados do IFI 7 9 11 12 12 12 12 13 15 17 18 19 20 21 22 24 25 27 28 28 30 31 32 32 33 36 38 40

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TESTE DE ELISA em que se baseia o ELISA variaes nos componentes do ELISA tipo de ELISA utilizado no diagnsticoo da infeco pelo T. cruzi seqncia do ELISA indireto definio de amostra reagente, no reagente e indeterminada no ELISA equipamentos e materiais para realizao do ELISA procedimentos para executar o ELISA medidas para garantir a qualidade dos resultados ELISA TRIAGEM SOROLGICA DE DOADORES DE SANGUE EM UNIDADES E HEMOTERPICAS E DIAGNSTICO SOROLGICO EM LABORATRIOS DE SADE PBLICA registro de amostras em unidades hemoterpicas quantidade, acondicionamento e conservao das alquotas em unidades hemoterpicas triagem sorolgica de doadores de sangue para a doena de Chagas fluxograma para diagnstico sorolgico da doena de Chagas FRMULAS preparo de tampo fosfato (PBS) pH 7.2 soluo de azul de Evans: soluo estoque (0,1%) preparo da soluo PBS-AE a 0,01% preparo da glicerina tamponada ANEXOS Anexo 1 Protocolo do Teste HAI Anexo 2 Protocolo do Teste IFI Anexo 3 Protocolo de ELISA BIBLIOGRAFIA

41 43 43 44 44 45 46 46 48 49 51 52 53 58 61 63 64 65 65 67 69 70 71 73

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Introduo
A doena de Chagas, descrita em 1909, uma parasitose causada pelo protozorio Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Esse parasita transmitido ao homem por um inseto conhecido popularmente pelos nomes de barbeiro, chupo, procot e outros. O sanitarista brasileiro Carlos Justiniano Chagas descreveu sozinho, fato indito na histria da medicina, o ciclo completo da doena. Ele identificou o parasita, o transmissor, o reservatrio animal dos parasitas e as manifestaes clnicas da doena que levou o seu nome. Chagas denominou o parasita de T. cruzi, em homenagem a Oswaldo Cruz. A doena freqente na Amrica Central e na Amrica do Sul. No Brasil, a ocorrncia dessa enfermidade, que acomete cerca de trs milhes de brasileiros, particularmente elevada em alguns estados como Minas Gerais, Gois, Rio Grande do Sul, Bahia e Piau. Alm da transmisso pelo barbeiro, a infeco pelo T. cruzi transmitida tambm por via sangnea. O primeiro teste utilizado para a deteco da infeco pelo T. cruzi foi a reao de Fixao de Complemento, desenvolvida por Guerreiro e Machado, em 1913. Hoje, esse teste apresenta apenas valor histrico, dada a existncia de testes sorolgicos mais simples e mais precisos. A utilizao rotineira dos testes sorolgicos em unidades hemoterpicas tem contribudo, de forma decisiva, para a reduo do nmero de casos ps-transfusionais da infeco pelo T. cruzi. Neste manual esto apresentados os testes recomendados, tanto em unidades hemoterpicas, para a triagem sorolgica de doadores de sangue, quanto em laboratrios de sade pblica, para o diagnstico sorolgico da infeco pelo T. cruzi, atendendo a critrios tcnicos, de controle de qualidade e de biossegurana.

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A doena de Chagas e os mtodos de diagnstico

Qual o agente causador da doena de Chagas?
Como voc j sabe, o Trypanosoma cruzi o parasita causador da doena de Chagas. Esse parasita transmitido aos mamferos (homens e animais) por insetos hematfagos como o Triatoma infestans, popularmente chamado barbeiro. Inseto hematfago - inseto que se alimenta de sangue. Em condies naturais, o barbeiro ingere formas sanguneas do T. cruzi ao se alimentar em um hospedeiro infectado. Essas formas sangneas diferenciam-se e multiplicam-se no trato digestivo do inseto, dando origem aos tripomastigotas metacclicos que so eliminados nas fezes do barbeiro. Como o inseto tem o hbito de defecar no momento da picada, as fezes contendo os parasitas infectam os seres humanos atravs de leses na pele, pelo orifcio da picada ou pelas mucosas. Na Figura 1, voc pode ver o barbeiro e uma forma sangnea do T. cruzi.

Figura 1 - Triatoma infestans e forma sangnea do T. cruzi

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Quais as principais formas de contaminao pelo T. cruzi por via sangnea?

O T. cruzi transmitido por via sangnea, principalmente: T nas transfuses com sangue contaminado, T de me para filho (transmisso vertical); T na infeco acidental em laboratrio; T nos transplantes de rgos e tecidos.

Quais os testes utilizados para o diagnstico laboratorial da infeco pelo T. cruzi?

Para o diagnstico laboratorial da infeco pelo T. cruzi so utilizados os seguintes testes: T parasitolgicos diretos (exame a fresco do sangue, tcnicas de concentrao do parasita, etc.) Esses testes so indicados na fase aguda da doena, quando a parasitemia elevada; T sorolgicos, so testes imunolgicos que detectam no soro, antgenos ou anticorpos em vrios tipos de infeco. Esses testes so utilizados para deteco da infeco pelo T. cruzi na fase crnica da doena. Antgeno - Ag - qualquer substncia que o organismo identifica como estranha e que induz a produo de protenas especficas (anticorpos) pelo sistema imune. Anticorpo - Ac - tambm chamado imunoglobulina (lg), uma protena produzida pelo sistema imune em resposta a um determinado antgeno. O anticorpo se liga de maneira especfica ao antgeno. A ligao especfica entre o antgeno e o anticorpo constitui a base dos testes sorolgicos. No caso da doena de Chagas, esses testes baseiam-se na identificao de anticorpos anti-T. cruzi da classe IgG, predominantes na fase crnica da doena.

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H laboratrios que, alm dos testes sorolgicos, utilizam, na fase crnica, reaes de amplificao dos cidos nucleicos do parasita. Amplificao de cido nucleico - seqncia de reaes que promove o aumento de cpias de uma molcula de DNA ou RNA. Essas reaes so utilizadas em laboratrios de pesquisa, mas ainda no esto disponveis para a rede de laboratrios. Por isso, a partir daqui, sero enfocados os testes sorolgicos que so rotineiramente empregados na deteco da infeco pelo T. cruzi.

Quais os testes sorolgicos mais utilizados para a deteco da infeco pelo T. cruzi?
Devido sua elevada sensibilidade e especificidade, os testes sorolgicos mais utilizados para a deteco da infeco pelo T. cruzi so: 1. Hemaglutinao Indireta (HAI); 2. Imunofluorescncia Indireta (IFI); 3. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). A sensibilidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado positivo quando o indivduo est verdadeiramente infectado. A especificidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado negativo quando o indivduo no est infectado.

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Em que se baseia a reao de HAI?

A reao de HAI se baseia na aglutinao de hemcias sensibilizadas com antgeno T. cruzi, em presena de soro contendo anticorpos contra esse parasita. Veja na Figura 2.

ETAPA 1

ETAPA 2

ETAPA 3

Figura 2 - Representao esquemtica de uma reao de hemaglutinao indireta (HAI).

Observe que: T na etapa 1, adiciona-se a amostra, que, sendo reagente, contm anticorpos anti-T. cruzi. O suporte, em geral, uma placa de microtitulao; placa de microtitulao - produzida, geralmente, em poliestireno transparente com 96 cavidades ou em tiras (strips) de 8 ou 12 cavidades, com fundo em V ou em U.
T T

na etapa 2, adiciona-se hemcias sensibilizadas com antgeno de T. cruzi; na etapa 3, a reao antgeno-anticorpo visualizada pela aglutinao das hemcias.

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Como feita a leitura da reao e quais os critrios para se considerar uma amostra reagente, no reagente ou indeterminada no teste de HAI?
A leitura feita, a olho nu, com a placa de microtitulao colocada contra a luz ou em um espelho prprio. Veja, no Quadro 1, os critrios para a leitura.
Quadro 1 Critrios para definir amostra reagente, no reagente ou indeterminada no teste de HAI amostra reagente hemcias distribudas de maneira homognea, em forma de tapete ou manto, ocupando rea maior do que 50% do fundo da placa. amostra no reagente amostra indeterminada hemcia acumulada em formas de boto no fundo do poo. qualquer padro diferente dos anteriores.

Confira esses critrios na Figura 3:

Figura 3 -

Visualizao de amostra reagente, no reagente e indeterminada na reao de HAI

O teste HAI pode ser qualitativo ou quantitativo.

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Quando se utiliza o teste de HAI qualitativo e o HAI quantitativo ou para titulao?

T

O teste de HAI qualitativo utilizado para definir se uma amostra reagente ou no reagente. A amostra de soro para a realizao da HAI qualitativa diluda uma nica vez; O teste de HAI quantitativo, ou para titulao, utilizado para confirmar os resultados das amostras reagentes ou indeterminadas no HAI qualitativo e para definir o ttulo das amostras reagentes. Para a titulao feita a diluio seriada das amostras de soro.

Como so feitas as diluies da amostra para o teste de HAI qualitativo e quantitativo?

O fabricante do conjunto diagnstico fornece o diluente especfico e define a diluio inicial da amostra para o teste qualitativo. As diluies da amostra para o teste quantitativo so preparadas, em geral, na razo 2 a partir da diluio do teste qualitativo. Acompanhe um exemplo: Uma amostra foi reagente no HAI qualitativo na diluio nica de 1/20 de acordo com as orientaes do fabricante. Para o teste HAI quantitativo foram feitas cinco diluies da amostra a partir da diluio 1/20 como apresentado na Figura 4.

Figura 4 - Exemplo de diluio seriada da amostra para o teste de HAI quantitativo

Ateno: preciso homogeneizar cada diluio antes de fazer a seguinte.

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Depois de diluir, preciso determinar o ttulo da amostra.

Como determinado o ttulo de uma amostra no teste de HAI?

Para determinar o ttulo voc testa cada uma das diluies da amostra em um poo da placa de microtitulao. O ttulo corresponde ltima diluio em que a amostra ainda foi reagente, desde que a diluio seguinte tenha um resultado negativo ou indeterminado. Continuando o exemplo do item anterior, veja, na Figura 5, o resultado obtido com cada uma das diluies da amostra:

Figura 5 - Representao das reaes de cada uma das diluies da amostra no HAI

Observe que o ttulo foi de 160, porque a diluio 1/160 foi a ltima onde a amostra ainda foi reagente.

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Quais os materiais necessrios para realizar o teste de HAI qualitativo ou quantitativo?

No Quadro 2 esto os materiais geralmente fornecidos pelo fabricante e os materiais necessrios mas no fornecidos.
Quadro 2 - Materiais utilizados para execuo do teste de HAI MATERIAIS GERALMENTE FORNECIDOS PELO FABRICANTE 9 placas de microtitulao com fundo em V ou e U 9 diluente para os soros ou plasmas 9 soro-controle negativo 9 soro-controle positivo 9 hemcias sensibilizadas com antgeno T.cruzi 9 2 mecarptoetanol (2-ME) Ateno: o 2-ME recomendado por alguns fabricantes e includo no conjunto diagnstico. Essa substncia quando misturada ao soro elimina a reatividade inespecfica diminuindo a possibilidade de se obter resultados falso-positivos e indeterminados. MATERIAIS NO FORNECIDOS PELO FABRICANTE 9 pipetas manuais de volume ajustvel (de 5 a 50l, de 50 a 200l e de 200 a 1.000l) 9 ponteiras descartveis para as pipetas de volume ajustvel 9 pipetas graduadas de 1ml, 5ml e 10 ml e pra de borracha 9 soro-controle positivo (CP) e negativo (CN) produzido em seu prprio laboratrio 9 fita adesiva transparente para selar a placa 9 espelho para leitura de placas de microtitulao (opcional) 9 agitador de placas (opcional) 9 protocolo de trabalho (vide bloco "Anexos") 9 equipamentos de proteo individual: luvas, mscaras, avental ou jaleco 9 recipiente de paredes rgidas, boca larga e tampa contendo hipoclorito de sdio a 2%

Siga as orientaes do fabricante para conservar e armazenar os reagentes.

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Como realizar um teste de HAI qualitativo e quantitativo ou para titulao?

O teste de HAI, qualitativo ou quantitativo (titulao), deve ser realizado de acordo com as orientaes do fabricante. No entanto, alguns procedimentos gerais devem ser observados: 1. confira o conjunto diagnstico (componentes, materiais, diluente e reagentes) verificando se ele est sob condies adequadas de conservao e dentro do prazo de validade; Ateno: homogeneze as hemcias sensibilizadas com o antgeno verificando se esto sem grumos. Se voc observar a presena de grumos significa que houve autoaglutinao das hemcias o que torna o antgeno imprprio para uso. 2. leia todas as instrues do conjunto diagnstico antes de iniciar o teste; 3. providencie os outros materiais, no fornecidos pelo fabricante, necessrios para a realizao dos testes; Separe uma ponteira descartvel para cada amostra e para cada tipo de reagente a ser pipetado. No reutilize ponteiras. 4. utilize exatamente os volumes indicados para o preparo de todas as solues. No faa qualquer alterao com o intuito de economizar reagentes; 5. deixe as amostras e os reagentes que sero utilizados atingirem a temperatura ambiente, antes de iniciar a reao; A temperatura ambiente em laboratrios deve estar entre 20C e 26C. 6. inclua soros-controle positivo e negativo fornecidos pelo fabricante e produzidos em seu laboratrio; 7. faa um protocolo de trabalho, relacionando os controles, as amostras e as diluies correspondentes. Veja um exemplo de protocolo de HAI no Anexo 1 deste manual; 8. faa a diluio das amostras: a) para o HAI qualitativo a amostra deve ser diluda em tubo, de acordo com a recomendao do fabricante, e depois pipetada na placa de microtitulao; b) para o HAI quantitativo a diluio seriada da amostra deve ser feita na razo 2, e a partir da diluio do HAI qualitativo. Faa cada uma das diluies diretamente em um poo da placa de microtitulao, de acordo com as instrues do fabricante;

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Lembre-se: homogeneze o contedo de cada diluio da amostra antes de fazer a diluio seguinte. Utilize uma ponteira para cada diluio.
Ateno: se o conjunto diagnstico utilizar 2-ME, antes das diluies, as amostras devero ser preparadas do seguinte modo: T dilua o 2-ME 1/100 em salina. Por exemplo: 10 l de 2-ME + 990 l de soluo 0,85% NaCI (cloreto de sdio isotnico, ou seja, "soro fisiolgico"); T dilua cada amostra (soro puro) com 2-ME j diludo. Faa essa diluio em volumes iguais, por exemplo: para diluir 0,1 ml de soro utilize 0,1 ml de 2-ME j diludo; T incube por 30 minutos a 37C. fundamental que o tempo de incubao seja exatamente 30 minutos.

9. homogeneize suavemente o antgeno e pipete em cada poo da placa de microtitulao o volume indicado pelo fabricante; 10. cubra a placa com fita adesiva transparente de modo que fique totalmente vedada; 11. agite, suavemente, a placa de microtitulao, de preferncia com o agitador de placa, para homogeneizar todos os componentes; 12. incube a placa temperatura ambiente, em local sem vibraes, pelo tempo recomendado pelo fabricante; 13. faa a leitura da reao verificando se os resultados obtidos para os controles esto de acordo com os critrios definidos pelo fabricante. Se os resultados dos controles no estiverem de acordo, inicie novamente o teste. S considere os resultados das amostras quando os resultados dos controles estiverem de acordo com os critrios; 14. registre os resultados no protocolo; 15. despreze as amostras e os resduos do conjunto diagnstico utilizado, conforme as orientaes do curso TELELAB - "Biossegurana em Unidades Hemoterpicas e em Laboratrios de Sade Pblica".
T T

Jamais inicie a execuo dos testes antes de arrumar sua bancada de trabalho com todos os materiais e equipamentos necessrios. Utilize sempre equipamentos de proteo individual e manipule as amostras como material potencialmente infectante.

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Que medidas devem ser levadas em considerao para que voc possa garantir a qualidade dos resultados do teste de HAI?
1. Leia atentamente todas as instrues do fabricante antes de iniciar qualquer reao; 2. providencie todo o material necessrio execuo do teste e que no est contido no conjunto diagnstico; 3. no misture controles, placas de microtitulao, hemcias sensibilizadas com antgeno e diluentes de diferentes lotes e/ou fabricantes; 4. homogeneize as hemcias observando se no houve aglutinao espontnea, antes de iniciar a reao; Lembre-se: as hemcias autoaglutinadas formam grumos que as tornam imprprias para uso; 5. verifique se os reagentes apresentam turvao, precipitao ou alterao de cor, o que os torna imprprios para uso; No use reagentes com prazo de validade vencido; 6. execute as diluies da amostra em diluente especfico fornecido no conjunto diagnstico e de acordo com as orientaes do fabricante; Lembre-se que fundamental homogeneizar cada diluio antes de fazer a seguinte e trocar a ponteira; 7. incube a placa de microtitulao em local sem vibraes.

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Em que se baseia a reao de Imunofluorescncia indireta (IFI)?

A reao de IFI baseia-se na interao do prprio T. cruzi (formas epimastigotas) com os anticorpos contra esse parasita presentes no soro. Veja na Figura 6.

Figura 6 - Representao esquemtica da reao de IFI positiva

Observe que: T na etapa 1, o prprio parasita T. cruzi fixado numa lmina de vidro com regies demarcadas; T na etapa 2, adicionada a amostra diluda que, sendo reagente, contm anticorpos especficos que se ligam ao antgeno T. cruzi; T na etapa 3, adiciona-se o conjugado composto de uma antiimunoglobulina humana ligada ao isotiocianato de fluorescena, que servir como revelador da reao antgeno e anticorpo; T na etapa 4, a interao antgeno/anticorpo evidenciada por meio da fluorescncia do parasita. Assim como o HAI, o teste de IFI tambm pode ser qualitativo ou quantitativo: x IFI qualitativo: define se a amostra reagente, no reagente ou indeterminada, x IFI quantitativo: confirma os resultados das amostras reagentes e indeterminadas no IFI qualitativo e define o ttulo das amostras reagentes.

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Como feita a leitura da reao e quais os critrios para se considerar uma amostra reagente, no reagente ou indeterminada no teste de IFI?
Para leitura da reao, necessrio que voc utilize microscpio de fluorescncia. A interpretao dos resultados deve obedecer aos critrios descritos no Quadro 3
Quadro 3 Interpretao de uma reao de IFI para diagnstico da infeco pelo T. Presena de fluorescncia uniforme em toda a membrana dos tripanossomas Ausncia total de fluorescncia nos tripanossomas que se apresentam, geralmente, com colorao vermelho tijolo Qualquer padro diferente dos descritos anteriormente. Geralmente, os tripanossomas apresentam fluorescncia inespecfica, ou seja, em vrias partes cruzi Amostra reagente Amostra no reagente Amostra indeterminada

O teste de IFI pode ser qualitativo ou quantitativo.

Como so feitas as diluies da amostra para realizar o teste de IFI qualitativo e quantitativo?
As diluies da amostra so feitas com PBS (Phosphate-BufferedSaline), ou seja, soluo salina tamponada com fosfatos, tambm chamada tampo fosfato.
Veja orientaes para preparar o PBS no bloco "Frmulas" deste manual.

Para o teste de IFI, as diluies so realizadas de acordo com as orientaes definidas pela prtica dos laboratrios de referncia, ou seja: T para o teste de IFI qualitativo recomenda-se a diluio 1/20, na triagem sorolgica de doadores em unidades hemoterpicas, enquanto que para o diagnstico nos laboratrios de sade pblica essa diluio deve ser de 1/40; T para o teste de IFI quantitativo recomenda-se a execuo de pelo menos 5 diluies na razo 2 a partir da diluio do teste qualitativo.

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Na Figura 7, voc pode conferir a seqncia de diluies da amostra para IFI quando for necessria a titulao na triagem sorolgica de doadores de sangue.

Figura 7 - Representao da seqncia de diluies da amostra no teste IFI quantitativo para triagem sorolgica de doadores de sangue

Agora, veja na Figura 8, a seqncia de diluies da amostra no IFI quantitativo para diagnstico sorolgico.

Figura 8 -

Representao da seqncia de diluies no teste IFI quantitativo para diagnstico sorolgico

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A opo dos laboratrios de referncia pela diluio inicial da amostra em 1/40 para diagnstico sorolgico foi feita aps estudos epidemiolgicos. Esses estudos demonstraram que soros de indivduos verdadeiramente chagsicos apresentam reatividade em diluio igual ou maior do que 1/40. Os mesmos dados epidemiolgicos indicaram que, na populao no-chagsica, a presena de anticorpos naturais responsvel por um grande nmero de resultados falso-positivos, quando esses soros so testados em diluies menores do que 1/20. Visando a proteo dos receptores de sangue e hemocomponentes, foi estabelecida a diluio inicial da amostra em 1/20, para evitar a ocorrncia de resultados falso-negativos na triagem sorolgica de doadores de sangue.

Como determinado o ttulo de uma amostra no teste de IFI?

Para determinar o ttulo, cada uma das diluies da amostra colocada em contato com o antgeno, em uma demarcao da lmina de IFI. O ttulo como voc j sabe, corresponde ltima diluio em que a amostra ainda foi reagente, desde que a diluio seguinte tenha um resultado negativo ou indeterminado.

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Na reao de IFI o conjugado tambm precisa ser titulado.

Por que necessrio titular o conjugado na reao de IFI?

O ttulo do conjugado varia em funo das condies de trabalho e do operador. Alm disso, existem variaes tanto na qualidade dos reagentes de cada lote quanto na capacidade de resoluo dos diferentes microscpios de fluorescncia. Portanto, mesmo que o fabricante indique o ttulo, a titulao deve ser feita: T a cada novo lote de conjugado ou de antgeno; T sempre que o controle positivo acusar perda de intensidade de fluorescncia. Veja, no prximo item, quais os materiais necessrios para titular o conjugado e testar as amostras por IFI.

Quais os materiais necessrios para realizar o teste de IFI?

Para o teste de IFI, o antgeno e os reagentes so adquiridos separadamente ou juntos em um conjunto diagnstico. No Quadro 4, na pgina seguinte, esto relacionados os materiais necessrios para execuo do teste de IFI.

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Quadro 4: materiais necessrios para execuo do teste de IFI REAGENTES 9 Antgeno de T cruzi (fixado na lmina, liofilizado ou em suspenso) Ateno: os antgenos liofilizados e em suspenso devem ser preparados e fixados nas lminas seguindo rigorosamente as instrues do fabricante. 9 Tampo fosfato PBS (phosphate buffer saline) pH 7,2 vide bloco "Frmulas" 9 Azul de Evans (AE) (vide bloco "Frmulas") 9 Conjugado anti-imunoglobulina humana (total ou IgG) conjugada ao isotiocianato de fluorescena 9 Glicerina tamponada pH (9,0 0,5) vide bloco "Frmulas" 9 Soros-controle (positivo e negativo) controle de qualidade interno da reao, conforme orientaes do curso TELELAB "Controle de Qualidade de Testes Sorolgicos em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica" EQUIPAMENTOS E MATERIAIS DE LABORATRIO 9 Relgio despertador (timer) 9 Lminas demarcadas para IFI 9 Microscpio de fluorescncia 9 Pipetas manuais de volume ajustvel (5 l a 50 l, 50I a 200 l, 200 l a 1.000 l) 9 Ponteiras descartveis para as pipetas manuais 9 Balana semi-analtica e acessrios de pesagem 9 Agitador tipo Kline (opcional) 9 Estufa com temperatura regulvel a 37C 9 Cmara mida 9 Cubas para lavagem de lminas (cuba de Koplin) 9 Lamnulas 24 x 50 mm 9 Provetas de 1.000 ml 9 Bquer de 2.000 ml 9 Recipientes de paredes rgidas, boca larga e tampa contendo hipoclorito de sdio a 2% 9 Luvas descartveis, culos, mscaras ou protetor facial e jaleco 9 Protocolo de trabalho (vide bloco "Anexos")

Como armazenar os reagentes do teste de IFI?

As lminas j contendo o antgeno fixado devem ser armazenadas a - 20C. Aqueles laboratrios que utilizam antgeno liofilizado ou em suspenso devem conserv-los entre 2C e 8C, antes de fazer a fixao na lmina. A anti-imunoglobulina humana (total ou IgG), glicerina tamponada e azul de Evans, devem ser mantidos tambm entre 2C e 8C.

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Veja no curso TELELAB - "Controle de Qualidade de Testes Sorolgicos em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica", como armazenar e conservar os soros-controle. Agora que voc j conhece os materiais e a forma de armazen-los, veja no prximo item como titular o conjugado.

Como realizar a titulao do conjugado?

A titulao do conjugado deve ser feita do seguinte modo: 1. leia atentamente todas as instrues do fabricante; 2. deixe o soro-controle negativo, o positivo e os demais reagentes atingirem a temperatura ambiente. Utilize um soro positivo com ttulo entre 80 e 320; 3. deixe uma lmina com o antgeno j fixado atingir a temperatura ambiente; Evite atrito na parte superior da lmina para no remover o antgeno fixado 4. coloque a lmina em estufa a 37C at sua completa secagem. Cuidado: a lmina no pode ficar na estufa alm de 10 minutos, que o tempo mximo necessrio para essa secagem; 5. faa a identificao da lmina e prepare um protocolo de trabalho, indicando as posies do soro controle positivo (CP), do negativo (CN) e do PBS. Veja na Figura 9.

Figura 9 -Representao de uma lmina para titulao do conjugado

Ateno: a demarcao contendo PBS um controle para verificar se o conjugado reage inespecificamente com os parasitas. Se houver fluorescncia no PBS o procedimento precisa ser realizado novamente.

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6. faa e homogeneze a diluio do soro CN a 1/20 (190 l de PBS + 10 l do CN); 7. faa a diluio com PBS do CP, de acordo com o ttulo do soro que voc estiver utilizando (1/80, 1/160 ou 1/320); 8. pipete nas demarcaes correspondentes da lmina: 10 l do PBS, 10 l do CN j diludo e 10 l do CP j diludo; Lembre-se: providencie uma ponteira descartvel para cada tipo de controle e reagente a ser pipetado. No reutilize ponteiras. 9. coloque a lmina em cmara mida e incube em estufa a 37C por 30 minutos; 10. faa a lavagem da lmina, aps a incubao, do seguinte modo: a) mergulhe-a, rapidamente, em um recipiente contendo PBS pH 7,2; b) coloque a lmina na cuba e adicione PBS pH 7,2 at cobr-la completamente; c) coloque a cuba em agitao durante 5 minutos. Caso voc no tenha um agitador tipo Kline, faa sucessivas e cuidadosas agitaes manuais pelo mesmo espao de tempo; d) repita os passos b e c mais 2 vezes, trocando o PBS a cada vez; e) lave rapidamente a lmina em gua destilada; f) coloque-a em estufa a 37C at a completa secagem. Lembre-se: a lmina no pode ficar na estufa alm de 10 minutos. Enquanto aguarda a agitao e a secagem da lmina, voc pode executar os passos 11 e 12. 11. prepare a soluo PBS e Azul de Evans (AE) a 0,01%, para diluir o conjugado, seguindo as orientaes do bloco "Frmulas" deste manual; 12. faa as diluies do conjugado como apresentado na Figura 10.

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Figura 10 - Diluies recomendadas para titular o conjugado

Ateno: fundamental homogeneizar cada tubo antes de fazer a diluio seguinte e trocar a ponteira. 13. pipete 10 l de cada diluio do conjugado nas demarcaes correspondentes da lmina. Confira na Figura 11.

Figura 11 -

Lmina com o PBS e soro positivo e negativo j diludos para a titulao do conjugado

14. faa a incubao e a lavagem da lmina seguindo os mesmos procedimentos descritos nos passos 9 e 10; 15. prepare a lmina para leitura aplicando 2 a 3 gotas de glicerina tamponada pH 9,0 ( 0,5) sobre a mesma; 16. cubra a lmina com uma lamnula 24 x 50 mm evitando a formao de bolhas. Mantenha a lmina ao abrigo da luz e em local seco at a leitura; 17. faa a leitura da reao da lmina em microscpio de fluorescncia, utilizando objetiva de 40 vezes; 18. registre os resultados no protocolo.

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Como interpretar os resultados para determinar o ttulo ideal do conjugado?

Considera-se como ttulo ideal do conjugado a maior diluio que apresentar: T fluorescncia uniforme em toda a membrana do parasita no soro controle positivo; T ausncia de fluorescncia no controle negativo e no PBS. Para compreender melhor, veja, no Quadro 5, os resultados obtidos, para cada diluio do conjugado.
Quadro 5 - Exemplo 1 - resultados obtidos na titulao do conjugado Diluio do Conjugado 1/50 CP Fluorescncia uniforme em toda a membrana do parasita RESULTADOS CN fluorescncia descontnua na membrana do parasita 1/100 1/200 Fluorescncia uniforme em toda a membrana do parasita fluorescncia inespecfica ou fraca em vrias partes do parasita 1/400 ausncia de fluorescncia ausncia de florescncia ausncia de florescncia ausncia de fluorescncia ausncia de florescncia ausncia de florescncia ausncia de florescncia PBS ausncia de fluorescncia

Como voc pode ver, no exemplo, o ttulo ideal do conjugado foi encontrado na diluio 1/100, que a maior diluio onde foi observada fluorescncia uniforme na membrana do parasita no controle positivo, sem fluorescncia no controle negativo e no PBS. Veja, agora, no Quadro 6 um outro exemplo.

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Quadro 6 - Exemplo 2 - resultados obtidos na titulao do conjugado Diluio do Conjugado 1/50 CP fluorescncia uniforme em toda a membrana do parasita RESULTADOS CN fluorescncia descontnua na membrana do parasita 1/100 fluorescncia uniforme em toda a membrana do parasita fluorescncia descontnua na membrana do parasita 1/200 1/400 fluorescncia uniforme em toda a membrana do parasita fluorescncia uniforme em toda a membrana do parasita ausncia de fluorescncia ausncia de florescncia ausncia de florescncia ausncia de florescncia ausncia de fluorescncia PBS ausncia de fluorescncia

Observe que, no exemplo 2, no foi encontrado o ttulo ideal e, neste caso, voc deve repetir os procedimentos de titulao com mais duas diluies do conjugado (1/800 e 1/1600). preciso repetir os procedimentos at que o ttulo ideal do conjugado seja encontrado para que voc possa testar as amostras. Lembre-se que voc deve titular o conjugado: T a cada novo lote do conjugado ou de antgeno; T sempre que o controle positivo acusar perda de intensidade de fluorescncia.

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Como realizar o teste de IFI qualitativo e quantitativo (titulao)?

1. Leia as instrues do fabricante de cada reagente antes de iniciar o teste; 2. deixe os soros-controle e as amostras atingirem a temperatura ambiente. Inclua o controle de qualidade interno, conforme orientaes do curso TELELAB "Controle de Qualidade de Testes Sorolgicos em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica"; 3. deixe o conjugado, a glicerina tamponada e o azul de Evans atingirem a temperatura ambiente; 4. faa o protocolo de trabalho. Voc encontra um exemplo desse protocolo no Anexo 2 deste manual; 5. retire do congelador o nmero de lminas correspondente quantidade de amostras a serem testadas e deixe-as descongelar at atingirem a temperatura ambiente; Ateno: as lminas j devem estar com o antgeno fixado. 6. coloque essas lminas em estufa a 37C at a sua completa secagem (no mximo 10 minutos); 7. faa em PBS a diluio das amostras: a) para o teste de IFI qualitativo: T faa a diluio a 1/20 nas unidades hemoterpicas; T faa a diluio a 1/40 nos laboratrios de sade pblica. b) para o teste de IFI quantitativo (titulao), as diluies da amostra devem ser feitas na razo 2 a partir da diluio do IFI qualitativo, seguindo as orientaes j apresentadas; Lembre-se: homogeneze o contedo de cada diluio da amostra antes de fazer a diluio seguinte. 8. pipete, em cada demarcao da lmina, 10l das diluies dos soros controles (CP e CN) e das amostras, de acordo com o seu protocolo de trabalho; 9. coloque as lminas em cmara mida e incube-as em estufa a 37C durante 30 minutos; 10. faa a lavagem das lminas, aps a incubao, seguindo os mesmos procedimentos descritos na titulao do conjugado;

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11. dilua o conjugado de acordo com a titulao j realizada, enquanto aguarda o tempo de incubao das amostras. Calcule o volume do conjugado a ser diludo de acordo com o nmero de amostras a serem testadas. Em geral, 150 Pl so suficientes para testar cada lmina;
T T

Prepare somente o volume de PBS-AE a 0,01% necessrio para diluir o conjugado. Jamais utilize o conjugado diludo de um dia para outro.

12. pipete 10 Pl do conjugado diludo em cada demarcao da lmina; 13. faa a incubao e a lavagem das lminas seguindo os mesmos procedimentos j descritos nos passos 9 e 10; 14. prepare as lminas para leitura aplicando 2 a 3 gotas de glicerina tamponada pH 9,0 ( 0,5) sobre cada lmina; 15. cubra cada lmina com uma lamnula de 24 x 50 mm, evitando a formao de bolhas. Mantenha as lminas ao abrigo da luz e em local seco at a leitura; 16. faa a leitura da reao em microscpio de fluorescncia, utilizando objetiva de 40 vezes. Inicie a leitura pela demarcao que corresponde ao controle positivo; em seguida, leia a demarcao que corresponde ao controle negativo; e, finalmente, leia as demarcaes correspondentes s amostras; Ateno: os controles devem apresentar padro reagente (CP) e no reagente (CN). Caso contrrio, descarte a lmina e repita o teste a partir do primeiro passo, procurando identificar e corrigir as causas dos resultados inadequados. S considere os resultados das amostras quando os resultados dos controles estiverem de acordo com os critrios do fabricante. 17. registre os resultados no protocolo; 18. despreze as amostras, a sobra do conjugado e os resduos dos reagentes utilizados, conforme as orientaes do curso TELELAB - "Biossegurana em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica". Jamais inicie a execuo dos testes antes de arrumar sua bancada de trabalho com todos os materiais e equipamentos necessrios.

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Que medidas devem ser levadas em considerao para que voc possa garantir a qualidade dos resultados do IFI?
1. Leia atentamente todas as instrues do fabricante antes de iniciar qualquer reao; 2. providencie todo o material necessrio execuo do teste; 3. homogeneize cada diluio antes de fazer a seguinte e troque a ponteira, 4. verifique se os reagentes apresentam turvao, precipitao ou alterao de cor, o que os torna imprprios para uso. No use reagentes com prazo de validade vencido; 5. faa a titulao do conjugado a cada novo lote do conjugado e do antgeno e sempre que o controle positivo acusar perda de reatividade; 6. no utilize o conjugado diludo de um dia para o outro; 7. verifique as condies de funcionamento do microscpio.

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Em que se baseia o ELISA?

O ELISA um teste imunoenzimtico que se baseia na interao antgeno-anticorpo evidenciada pela ao de uma enzima e o substrato apropriado, e revelada por um cromgeno. Cromgeno - substncia que revela a ao de uma enzima sobre o substrato por meio de mudana de cor. So componentes do ELISA: fase slida, antgeno, enzima, substrato, cromgeno e soluo de bloqueio da reao. Fase slida: material capaz de adsorver o antgeno ou o anticorpo que ser empregado no teste.

Quais as variaes encontradas nos componentes do ELISA para o diagnstico da infeco pelo T. cruzi?
Confira, no Quadro 7, as variaes encontradas nos componentes do ELISA para o diagnstico da doena de Chagas.
Quadro 7 -Variaes encontradas nos componentes do ELISA COMPONENTES ELISA Fase Slida x placas de microtitulao - produzidas, geralmente, em poliestireno transparente com 96 cavidades ou em tiras (strips) de 8 ou 12 cavidades, com fundo chato ou arredondado x prolas - pequenas esferas de poliestireno Antgeno x fraes isoladas do parasita T. Cruzi, preparadas para produzir a possibilidade de reao cruzada Enzima Substrato Cromgenos Soluo de bloqueio x x x x x x x fosfatase alcalina ou peroxidase perxido de hidrognio ( H2O2) ortofenilenodiamina (OPD) ou tetrametil benzidina (TMB). H2SO4 ou HCL

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Qual o tipo de ELISA utilizado no diagnstico da infeco pelo T. cruzi?

Para deteco de anticorpos anti-T. cruzi utiliza-se o ELISA indireto.

Qual a seqncia de um ELISA indireto?

A Figura 12 apresenta a seqncia de um ELISA indireto para uma amostra reagente:

Figura 12 - Seqncia esquemtica de um ELISA indireto para uma amostra reagente

Observe que: T na etapa 1, os antgenos esto adsorvidos fase slida; T na etapa 2, adicionada a amostra que, sendo reagente, contm anticorpos especficos que se ligam fase slida; T na etapa 3, com a adio de um conjugado, composto de uma enzima ligada a um anti-anticorpo (anti-imunoglobulina), ocorre a interao conjugado e anticorpo da amostra; T na etapa 4, adicionam-se o substrato e o cromgeno;

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na etapa 5, a ao da enzima no substrato revelada pelo cromgeno, que sofre um processo de oxidao dando origem a um produto com cor na amostra reagente. A cor varia de acordo com o tipo de cromgeno utilizado. Nesta etapa, adicionada uma soluo de bloqueio para interromper o processo de oxidao. Se esse processo no for interrompido haver aparecimento de cor em todas as amostras levando a resultados falso-positivos. Ateno: se no houver anticorpo especfico na amostra, ou seja, se ela for no reagente, a reao no acontecer e conseqentemente no haver desenvolvimento de cor. A cor resultante da ao da enzima deve ser lida em espectrofotmetro.
T

Como definir se um resultado de ELISA reagente, no reagente ou indeterminado?

No ELISA o resultado de uma reao definido pela leitura da absorbncia ou densidade tica (DO) em espectrofotmetro, utilizando um filtro com comprimento de onda indicado pelo fabricante do conjunto diagnstico. Usualmente, cada conjunto tem sua forma de calcular o ponto de corte (cut-offCO), acima ou abaixo do qual as amostras so consideradas reagentes, no reagentes ou indeterminadas. As amostras indeterminadas so aquelas cujos valores de DO esto includos na zona cinza (borderline). A zona cinza compreende a faixa de valores em torno do cut-off, dentro da qual no se pode ter certeza do resultado.

Como definir a zona cinza no ELISA?

Em geral, o fabricante do conjunto diagnstico indica como definir a zona cinza. Quando no existir a orientao do fabricante, recomenda-se que sejam consideradas indeterminadas as amostras com valores de DO includas no intervalo de 10% a 20% abaixo ou acima do valor do cut-off. Acompanhe um exemplo do clculo do intervalo de 10% para definio da zona cinza:
ELISA com CO = 0,20 10% do CO = 0,20 / 10 = 0,02 Limite inferior da zona cinza = CO - 10% = 0,20 - 0,02 = 0,18 Limite superior da zona cinza = CO + 10% = 0,20 + 0,02 = 0,22

Neste exemplo, so consideradas indeterminadas as amostras com DO de 0,18 a 0,22.

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Quais os materiais utilizados para execuo do ELISA?

No Quadro 8 esto os materiais geralmente fornecidos pelo fabricante e os materiais no fornecidos.
Quadro 8 -Materiais utilizados para execuo do ELISA
MATERIAIS GERALMENTE FORNECIDOS PELO FABRICANTE 9 placa de microtitulao ou prolas sensibilizadas com antgeno T. cruzi 9 selos ou tampas de cobertura 9 soro-controle negativo 9 soro-controle positivo 9 solues-tampo para a diluio das amostras e do conjugado 9 soluo-tampo para a lavagem 9 conjugado 9 substrato e cromgeno 9 soluo-tampo para diluir o substrato 9 soluo de bloqueio de reao MATERIAIS NO FORNECIDOS PELO FABRICANTE 9 relgio (timer) 9 pipetas manuais de volume ajustvel (de 5 a 50 l, de 50 a 200 l e de 200 a 1.000 l) mono e multicanal 9 ponteiras para pipetas manuais de volume ajustvel 9 pipetas graduadas de 5 ml e 10 ml 9 pra de borracha ou outro auxiliar de pipetagem 9 barquetes (reservatrios) ara a utilizao de pipetas multicanal 9 bquer de 1.000 ml 9 provetas de 100 ml, 500 ml e 1.000 ml 9 frasco com tampa de 1.000 ml 9 basto de vidro 9 equipamentos de proteo individual: luvas, mscaras, avental ou jaleco 9 recipiente de paredes rgidas, boca larga e tampa contendo hipoclorito de sdio a 2% 9 protocolo de trabalho (vide bloco "Anexos")

Siga as orientaes do fabricante, para conservar e armazenar os reagentes. Alm dos materiais constantes do Quadro 8, o laboratrio deve estar equipado com banho-marfa com termostato para regulagem de temperatura; estufa com termostato regulvel; sistema de lavagem e de leitura compatveis com os mtodos empregados e com as especificaes dos conjuntos diagnsticos disponveis. Antes de iniciar um procedimento, verifique se os equipamentos esto em condies adequadas de uso. No curso TELELAB - "Equipamentos Utilizao e Monitoramento em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica" voc encontra as orientaes necessrias.

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Quais os procedimentos para executar o ELISA ?

Os procedimentos variam de acordo com o fabricante do conjunto diagnstico. Alguns procedimentos gerais, no entanto, devem ser observados: 1. confira o conjunto diagnstico, verificando todos os seus componentes, se eles esto sob condies adequadas de conservao e dentro do prazo de validade; 2. leia todas as instrues do conjunto diagnstico antes de iniciar a reao; 3. providencie os outros materiais, no fornecidos pelo fabricante, necessrios para a realizao dos testes; Ateno: providencie uma ponteira descartvel para cada amostra e para cada tipo de reagente a ser pipetado. No reutilize ponteiras. 4. utilize exatamente os volumes indicados para preparar as solues, no faa qualquer alterao com o intuito de economizar reagentes; 5. deixe as amostras e os reagentes que sero utilizados atingirem a temperatura ambiente, antes de iniciar a reao; A temperatura ambiente em laboratrios deve estar entre 20C e 26C. 6. homogeneize as amostras; 7. inclua, alm dos controles fornecidos pelo fabricante, o controle de qualidade interno da reao, conforme orientaes do curso TELELAB "Controle de Qualidade de Testes Sorolgicos em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica"; 8. faa um protocolo de trabalho, relacionando os controles eas amostras. Veja um exemplo de um protocolo de ELISA no Anexo 3 deste manual; 9. siga rigorosamente os tempos de incubao e os ciclos de lavagem indicados pelo fabricante, tendo o cuidado de evitar a contaminao cruzada das amostras; 10. faa a leitura da absorbncia em espectrofotmetro, utilizando o filtro recomendado pelo fabricante; Siga as orientaes do fabricante do conjunto diagnstico para o clculo do cut-off. 11. verifique se os resultados obtidos para os controles esto de acordo com os critrios definidos pelo fabricante. Caso contrrio, faa novamente o teste procurando identificar e corrigir as causas dos resultados inadequados. S considere os resultados das amostras quando os resultados dos controles estiverem de acordo com os critrios do fabricante; 12. registre os resultados no protocolo;

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13. despreze as amostras e os resduos do conjunto diagnstico utilizado, conforme as orientaes do curso TELELAB - "Biossegurana em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica".
T

Jamais inicie a execuo dos testes antes de arrumar sua bancada de trabalho com todos os materiais e equipamentos necessrios. Utilize sempre equipamentos de proteo individual e manipule as amostras como material potencialmente infectante.

Que medidas devem ser levadas em considerao para que voc possa garantir a qualidade dos resultados do ELISA?
T

T T T T T T

Verifique se os reagentes apresentam turvao, precipitao ou alterao de cor, o que os torna imprprios para uso. No use reagentes com prazo de validade vencido; no misture controles, conjugados, prolas ou placas de diferentes lotes e/ou fabricantes; armazene os conjuntos diagnsticos de acordo com as recomendaes do fabricante; no exponha o substrato luz durante o armazenamento ou incubao da reao, evitando assim a fotodecomposio do mesmo; no coloque o substrato em contato com substncias oxidantes ou metais, para evitar sua degradao, evidenciada pela alterao de cor; faa a limpeza e a manuteno peridica dos equipamentos de lavagem, evitando dessa maneira o acmulo de sais e outros compostos qumicos; verifique se o filtro usado para a leitura da absorbncia aquele indicado pelo fabricante.

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Infeco pelo T. cruzi

Triagem sorolgica de doadores de sangue em unidades hemoterpicas
Que tipo de amostra deve ser utilizada?
O soro a amostra mais indicada para deteco de anticorpos anti-T cruzi. Veja informaes sobre a preparao das amostras no manual "Coleta de Sangue" do TELELAB. As amostras no podem estar turvas, lipmicas ou hemolisadas. Em qualquer desses casos elas devem ser descartadas e novas amostras devem ser solicitadas. Ateno: a experincia de alguns pesquisadores tem demonstrado que quando se utiliza plasma nos testes sorolgicos, ele deve ser centrifugado para separar e retirar a fibrina. A testagem do plasma contendo fibrina pode levar a resultados tanto falso-positivos quanto falso-negativos.

Como registrar a entrada das amostras para a triagem sorolgica de doadores de sangue?
O registro pode ser feito por sistema manual ou informatizado. De qualquer modo, importante que voc:
T

copie, do rtulo da amostra, e registre na planilha de resultados os dados de identificao do doador e a data da coleta.

Os dados devem sempre ser conferidos por duas pessoas. Erros de identificao podem:
T T

expor o receptor a riscos de contaminao; levar rejeio de um doador apto.

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Em quantas alquotas devem ser distribudas as amostras, antes dos testes para a triagem sorolgica de doadores de sangue?
Antes da testagem, as amostras de soro devem, obrigatoriamente, ser distribudas em, no mnimo, duas alquotas: T uma para os testes de rotina; e T outra para a contraprova. Recomenda-se que a alquota da contraprova tenha um volume de aproximadamente 1 ml. A alquota da contraprova deve ficar armazenada obrigatoriamente a - 20 C e estar disponvel por seis meses para a Vigilncia Sanitria. A distribuio em um nmero maior de alquotas e o volume das mesmas fica a critrio de cada servio.

Como acondicionar e conservar as alquotas, antes de fazer os testes para a triagem sorolgica de doadores de sangue ?
Distribua as alquotas para os testes de rotina, em tubos ou frascos com tampa e previamente identificados com os dados correspondentes; Ateno: as alquotas das amostras podem ser conservadas em geladeira, entre 2 C e 8 C por 72 horas no mximo. Depois desse perodo, elas precisam ser congeladas a 20 C. T distribua em frascos prprios para congelamento a alquota da contraprova e demais alquotas a serem congeladas; T acondicione esses frascos em caixas de papelo ou plstico rgido identificadas com informaes que facilitem a localizao dessas alquotas.
T

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Como feita a triagem sorolgica de doadores de sangue para a doena de Chagas?

Nas unidades hemoterpicas, a triagem sorolgica de doadores de sangue obrigatria e visa a proteo do receptor e no o diagnstico da doena de Chagas. Veja, na Figura 13, o fluxograma recomendado para a realizao dessa triagem.

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Figura 13 -

Fluxograma de triagem sorolgica de doadores de sangue para a infeco pelo T. cruzi

Para a compreenso deste fluxograma, importante observar que: nos testes 1 e 2: T a amostra deve ser testada simultaneamente em dois testes (1 e 2) de princpios metodolgicos diferentes, escolhidos de acordo com as condies do servio: ELISA e HAI, ELISA e IFI ou HAI e IFI. O HAI e o IFI devem ser executados de modo qualitativo. Recomenda-se o ELISA como uma das escolhas, sempre que possvel;

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q a amostra reagente nos dois testes tem seu resultado definido como

"amostra reagente" para a infeco pelo T. cruzi; q a amostra no reagente nos dois testes tem seu resultado definido como "amostra negativa" para a infeco pelo T cruzi, q a amostra indeterminada ou com resultados discordantes deve ser retestada com a repetio dos Testes 1 e 2, sendo que: para o ELISA deve ser feita repetio em duplicata e com o mesmo conjunto diagnstico; para o HAI deve ser feita a titulao (teste quantitativo) com o mesmo conjunto diagnstico utilizado na HAI qualitativa; para o IFI deve ser feita a titulao (teste quantitativo) com os mesmos reagentes utilizados na IFI qualitativa. na retestagem: q a amostra reagente nos dois testes tem seu resultado definido como "amostra reagente" para a infeco pelo T. cruzi; q a amostra no reagente nos dois testes tem seu resultado definido como "amostra negativa" para a infeco pelo T. cruzi, q a amostra indeterminada ou com resultados discordantes definida como "amostra indeterminada" para a infeco pelo T. cruzi; q a definio do resultado de cada amostra testada de acordo com este fluxograma deve obedecer aos critrios apresentados no Quadro 9.
Quadro 9 Critrios para definio do resultado final da triagem sorolgica de doadores de sangue para a doena de Chagas
Resultados do Teste 1 e Teste 2 (-/-) (+/+) ( + / - ) ou ( - / + ) ou ( + / I ) ou ( l / + ) ou ( l / - ) ou ( - / l ) ou ( l / l ) Resultados da retestagem em duplicata Resultado da triagem negativa reagente negativa reagente indeterminada

(-/-) ( + / +) ( + / - ) ou ( - / + ) ou ( + / l ) ou ( l / + ) ou ( l / - ) ou ( - / l ) ou ( l / l )

( - ) no reagentes; ( + ) reagentes; ( I ) indeterminada

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Ateno: a liberao dos hemocomponentes s pode ser feita quando todos os testes sorolgicos obrigatrios apresentarem resultados negativos, conforme normas vigentes do Ministrio da Sade.

Quais os procedimentos com os doadores que apresentarem resultados reagentes ou indeterminados?

Os doadores com resultados reagentes ou indeterminados para a infeco pelo T. cruzi devem ser encaminhados aos servios mdicos para diagnstico. As unidades hemoterpicas devem notificar os casos reagentes para a infeco pelo T. cruzi junto vigilncia epidemiolgica local.

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Diagnstico sorolgico em laboratrios de sade pblica

Como registrar a entrada das amostras em laboratrios de sade pblica?
O registro pode ser feito por sistema manual ou informatizado. De qualquer modo, importante que voc: 1) verifique se a identificao no rtulo da amostra a mesma da solicitao do(s) teste(s); 2) copie da solicitao e registre numa planilha de resultados os seguintes itens bsicos: T nmero de registro da amostra; T nome; T procedncia da amostra (unidade que solicitou); T data da coleta; T sexo; T idade. Ateno: os dados devem sempre ser conferidos por duas pessoas. Erros de identificao podem levar troca de resultados.

Infeco pelo T. cruzi

preciso distribuir em alquotas as amostras para anlises nos laboratrios de sade pblica?
Nos laboratrios de sade pblica no existe a obrigatoriedade da alquota para contraprova. No entanto, recomenda-se que a amostra seja distribuda no mnimo em duas alquotas: T uma para realizar os testes solicitados; T outra para atender necessidades relacionadas, por exemplo, execuo de testes complementares. Para acondicionar e armazenar as amostras utilize os mesmos procedimentos j apresentados para as amostras da triagem sorolgica.

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Como feito o diagnstico sorolgico da infeco pelo T. cruzi em laboratrios de sade pblica ?
Veja, na Figura 14, o fluxograma para o diagnstico sorolgico da infeco pelo T. cruzi em laboratrios de sade pblica.

Figura 14 Fluxograma para diagnstico sorolgico da infeco pelo T cruzi

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Para a compreenso do fluxograma do diagnstico sorolgico da infeco pelo T. cruzi, importante observar que: no Teste 1 e 2: q a amostra deve ser testada em dois testes (1 e 2) de princpios metodolgicos diferentes escolhidos de acordo com a disponibilidade do servio: ELISA e HAI, ELISA e IFI ou HAI e IFI. Recomenda-se o ELISA como uma das escolhas, sempre que possvel; q a amostra no reagente nos dois testes tem seu resultado definido como "amostra negativa " para a infeco pelo T. cruzi; q a amostra reagente, indeterminada ou com resultados discordantes deve ser retestada atravs da repetio dos Testes 1 e 2, sendo que: para o ELISA deve ser feita repetio em duplicata e com o mesmo conjunto diagnstico; para o HAI deve ser feita a titulao (teste quantitativo) com o mesmo conjunto diagnstico utilizado na HAI qualitativa; para o IFI deve ser feita a titulao (teste quantitativo) com os mesmos reagentes utilizados na IFI qualitativa. na retestagem: q a amostra no reagente nos dois testes tem seu resultado definido como "amostra negativa " para a infeco pelo T. cruzi; Ateno: Em caso de amostras reagentes na testagem inicial (Teste 1 e Teste 2) e no reagentes na retestagem no libere nenhum dos resultados obtidos com as outras amostras testadas no mesmo protocolo. Isto porque possvel que tenha havido erro de transcrio no protocolo ou troca de amostras. Se o protocolo estiver correto, faa novamente o teste de todas as amostras seguindo o fluxograma. q a amostra reagente nos dois testes tem seu resultado definido como "amostra positiva" para a infeco pelo T. cruzi; q a amostra indeterminada ou com resultados discordantes deve ser encaminhada a um laboratrio de referncia. Veja na prxima pgina.

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Para encaminhar amostras indeterminadas ou com resultados discordantes na retestagem, faa contato com o seguinte laboratrio: Laboratrio de Referncia Nacional para Diagnstico Sorolgico da Doena de Chagas - Laboratrio de Sorologia Instituto Octvio Magalhes - Fundao Ezequiel Dias Rua Conde Pereira Carneiro, 80 Gameleira CEP 30510-010 Belo Horizonte Fax: (031) 371-9474 Ateno: no manual "Coleta de Sangue" do TELELAB voc encontra orientaes sobre o acondicionamento das amostras para transporte. O laboratrio de sade pblica deve notificar os casos positivos para a infeco pelo T. cruzi vigilncia epidemiolgica local.

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Tampo fosfato (PBS pH 7,2)

materiais necessrios: 9 balana semi-analtica; 9 papel de pesagem; 9 bquer de 1.000 ml; 9 1 esptula; 9 1 basto de vidro (ou agitador magntico e barra magntica); 9 pHmetro (medidor de pH). frmula:
COMPONENTES Cloreto de sdio (NaCl) P.A. - (MM 58) Fosfato de sdio dibsico anidro (Na2HPO4) P. A. (MM Fosfato de sdio monobsico anidro (NaH2PO4) P.A. gua destilada (q.s.p.) (MM 18) QUANTIDADE 8,77 g 1,02 g 0,34 g 1.000 ml

P. A. = Para Anlise; MM = massa molecular, tambm conhecida como peso molecular; q.s.p. = quantidade suficiente para

preparo:
T

T T T

pese cada sal separadamente e transfira para o bquer. Veja instrues para pesagem no curso TELELAB "Equipamentos - Utilizao e Monitoramento em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica" adicione gua destilada em quantidade suficiente para (q.s.p.) completar o volume de 1.000 ml; misture tudo at a completa dissoluo dos sais. Utilize o agitador magntico ou um basto; verifique, com auxlio do pHmetro, se o pH da soluo encontra-se na seguinte faixa: pH 7,2 0,2. Caso no esteja, prepare nova soluo.
Ateno: para preparar o PBS com sais hidratados, as quantidades devem ser recalculadas em funo das molculas de gua presentes. Verifique sempre no rtulo dos produtos a composio e a massa molecular dos sais.

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clculo do peso de sais hidratados: Para a correo do peso de qualquer sal hidratado, preciso fazer uma regra de trs. Veja um exemplo: T se para utilizar Na 2 HPO 4 (sal anidro) com MM 142 preciso pesar 1,02 g T para utilizar Na 2 HPO 4 . 12H 2 O (sal hidratado) com MM 359, quanto preciso pesar? T MM 142 est para 1,02 g, assim como MM 359 est para x g

x = 359 x 1,02 142 x =2,57 g Neste exemplo, onde o fosfato de sdio dibsico hidratado contm 12 molculas de gua, deve-se, portanto, pesar 2,57 g para preparar o PBS pH 7,2. Lembre-se: antes de pesar qualquer sal, verifique sempre na embalagem sua composio a sua massa molecular.

Soluo de Azul de Evans a 0,1 % (estoque)

Azul de Evans............................. 100 mg PBS q.s.p .................................... 100 ml Conservar em geladeira.

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S o l u o P B S - A E a 0 , 0 1 %
1. Coloque em um tubo 100 l da soluo de Azul de Evans a 0,1% e 900 l de PBS pH 7,2. Voc vai obter um volume final de 1 ml PBS/AE que, em geral, suficiente para as diluies necessrias do conjugado; 2. homogeneize suavemente a soluo para evitar a formao de bolhas. Prepare a soluo PBS-AE a 0,01% imediatamente antes da diluio do conjugado. Lembre-se que todo corante degradado pela ao da luz.

Glicerina tamponada
A) soluo de carbonato de sdio a 0,5 M Carbonato de sdio anidro (CO 3Na 2) ............................. 5,3 g H 2O destilada ................................................................ 100 ml soluo de bicarbonato de sdio a 0,5 M Bicarbonato de sdio ((CO3 HNa) ............................... 4,2 g H2O destilada ................................................................. 100 ml soluo tampo carbonato-bicarbonato (0,5 M) pH 9.5 Coloque em um recipiente de vidro 10 ml da soluo A + 13 ml da soluo B. Homogeneizar e medir o pH.

B)

C)

Frmula da glicerina tamponada Glicerina P.A ...................................................................9 partes Soluo C ................................................................. 1 parte Ateno: descarte as solues ao primeiro sinal de contaminao.

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ANEXO 1 EXEMPLO DE PROTOCOLO DE HAI PARA DOENA DE CHAGAS

TESTE DE HEMAGLUTINAO INDIRETA (HAI) Protocolo n ______________________________________ Data: __/__/__ Fabricante: __________ Lote: ____________ Validade: __/__/__ Tcnico responsvel:____________________________________________________

Identificao das amostras e resultados da leitura 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Identificao Resultado Identificao B Resultado Identificao C Resultado Identificao D Resultado Identificao E Resultado Identificao F Resultado Identificao G Resultado Identificao H Resultado Observaes: ___________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ A

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ANEXO 2 EXEMPLO DE PROTOCOLO DE TESTE DE IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA (IFI) PARA DOENA DE CHAGAS
IFI n:__________________________ Data: _/ _ / _ Antigeno:________ Lote: ________ Validade: _/ _ / _ Conjugado:______ Lote: ________ Validade: _/ _ / _ Diluio:______ Tcnico responsvel: _____________________________________________ Resultados Identificao

Observaes: _________________________________________________________ _______________________________________________________________________

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ANEXO 3 EXEMPLO DE PROTOCOLO DE ELISA PARA DOENA DE CHAGAS

Protocolo n: __________________________________ Data: __ /__ /__ Fabricante: ___________ Lote: _________________ Validade: __ /__/__ Tcnico responsvel: ____________________________________________

1 A B C D E F G H

10

11

12

Observaes: Ponto de Corte (cut-off): _______________________________

_________________________________________________________ _________________________________________________________

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CAMARGO, M.E. & TAKEDA, G.K.F. Diagnstico de laboratrio. In: Trypanosoma cruzi e Doena de Chagas. Brener, Z. & Andrade, Z. (organizadores), Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1979, pp 175-198. FERREIRA, A. W. & AVILA, S. L.M. Sorologia: Importncia e parmetros. In: Diagnstico Laboratorial das Principais Doenas Infecciosas e Autoimunes. Ferreira, A.V. & vila, S.L.M. (organizadores), Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1996, pp. 1-6. GOMES, Y. M. Diagnstico etiolgico. In: Doena de Chagas. Malta, J.A. (organizador). Editora Sarvier, So Paulo, 1996, pp. 119-132. GOMES, Y. M. PCR and sero-diagnosis of chronic Chagas' disease: biotechnological advances. Appl. Biochem. Biotechnol. 66:107-119, 1997. GUIMARES, M. C. S. Exames de laboratrio: sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 18 117-120, 1985. LUQUETTI, A. O. & CASTRO A. M. Diagnstico sorolgico da doena de Chagas. In: Clnica e Teraputica da Doena de Chagas. Dias, J. C. P. & Coura, J. R. (organizadores). Editora FIOCRUZ, Rio de Janeiro, 1997, pp. 99-113. LUQUETTI, A. O. Use of Trypanosoma cruzi defined proteins for diagnosis multicentre trial serological and technical aspects. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 85 : 497-505, 1990. LUQUETTI, A. O. Megaesfago e anticorpos anti-Trypanosoma cruzi. Rev Goiana Med. 331-16, 1987. MINISTRIO DA SADE. Portaria 1.376. Normas tcnicas para coleta, processamento e transfuso de sangue, componentes e derivados. Braslia, novembro de 1993. MONCAYO, A. & LUQUETTI, A. O. Multicentre double blind study for evaluation of Trypanosoma cruzi defined antigens as diagnostic reagents. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 85 : 489-495, 1990. ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUD. Manual de Procedimientos de Control de Calidad para los Laboratorios de Serologia de los Bancos de Sangre. CURA, E. & WENDEL, S. (organizadores) ed. OPS, Washington, 1994, pp 61. SEZ-ALQUZAR, A. et al. Estudo multicntrico: avaliao do desempenho de conjuntos diagnsticos de hemaglutinao indireta, disponveis no Brasil, para o diagnstico sorolgico da infeco pelo Trypanosoma cruzi. Rev. Pat. Trop., 26 : 343-374, 1997. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Control of Chagas' disease. Report of a WHO Expert Committee, Geneva, 1991, pp. 38-43.

Agradecimentos: Fundao Hemocentro de Braslia Fundao Ezequiel Dias - MG Fundao Hemocentro de Pernambuco - HEMOPE Centro de Pesquisas Aggeu Magalhes/FIOCRUZ Universidade Federal de Gois Agradecimento Especial: Beatriz Mac Dowell Soares, Jos Antnio de Faria Vilaa e aos servidores da Fundao Hemocentro de Braslia, pelo apoio incondicional para a execuo deste projeto. Projeto grfico, arte-final e impresso: