TES-TES IMUNOLOGIS DI LABORATORIUM Dikompilasi oleh: Tonang Dwi Ardyanto

Uji lab. imunologis : 1. Reagen antigen ditambahkan pada antibodi yang terikat pada gel, lempengan (plate) atau manik-manik. 2. Reagen antibodi ditambahkan pada antigen yang terikat. 3. Antigen dan antibodi bebas dicampurkan. 4. Menilai fungsi sel kekebalan in vitro

pada prinsipnya meniru secara in vitro reaksi imunologis yang terjadi dalam tubuh.

Reaksi Coombs & Gell

Reaksi

tipe I : Ab terikat, Ag bebas Reaksi tipe II : Ab bebas, Ag terikat Reaksi tipe III : Ab bebas, Ag bebas Reaksi tipe IV : Hipersensitivitas Uji fungsi limfosit

Reaksi Coombs & Gell uji : I : Ag ( ) bebas vs Ab (Y) terikat pd sel lab. : Ab (Y) diikatkan pd masa padat II : Ab (Y) bebas vs Ag ( ) terikat lab. : Ag diikatkan pd masa padat III : Ab (Y) bebas vs Ag ( ) bebas lab.: Ab ( Y) dlm larutan direaksikan dg Ag ( ) dlm larutan

Reaksi tipe I : Ab terikat, Ag bebas (asma, syok anafil.)

Reaksi tipe II : Ab bebas, Ag terikat (reaksi transfusi)

IMMUNO AGGLUTINASI
Metoda pemeriksaan interaksi Ag-Ab, Ab spesifik interaksi dg. Ag yang melekat pada permukaan partikel/sel. Ukuran partikel: 200-250 nm. Reaksi: Berlangsung cepat (menit/jam). Sensitivitas analitik > tinggi dp. Reaksi presipitasi. Mekanisme: Tahap 1; Aggregasi partikel/sel oleh Ab membentuk kisi-kisi lebar makroskopis gumpalan halus. Tahap 2; pembentukan sedimen antara gumpalan halus membentuk gumpalan > besar. Ig M mempunyai 10 binding site agglutinasi > kuat dp. Ig G.

Syarat reaksi imunoagglutinasi: Ag melekat pada partikel/sel. Ag-Ab ada dalam proporsi optimal. Perlu media elektrolit, dipengaruhi; suhu, daya ionik, pH. Jenis Agglutinasi: I 1. Agglutinasi Langsung 2. Agglutinasi tak langsung

Ag yang larut diadsorbsikan pada carier (lateks, bentonit, eritrosit). Pemeriksaan carier lateks; Rheumatoid faktor, CRP, anti TG Ab., Aso, Cryptococcal Ag, histoplasmosis, Trichinosis

 Pemeriksaan carier eritrosit: a. Active haemagglutination. Direk A.H. : tes golongan darah. Indirek A.H.: Coombs tes ; direk indirek b. Passive haemagglutination. Direk: TPHA anti HBs, RPHA HBs Ag, Rubella PHA. Indirek: Deteksi non agglutinating Ab ( anti serum terhadap IgG). 3. Agglutinasi Inhibisi. HI Virus dengue. HCG . II. Agglutinasi bakteri: - tabung - Slide. III. Agglutinasi degan zarah kaku: Lateks, bentonite, colloidon.

Agglutinasi langsung.
Reaksi Widal. Agglutinasi Ab. O Ag. Ohne Hauch Ag O/H atau Agglutinasi Salmonella tifi Ab. S. tifi

Reaksi Golongan Darah.

Agglutinogen A

Agglutinin

Agglutinasi

Protein A Ag. ? Stapilokokus Ab. Spesifik

Agglutinasi

Agglutinasi tak langsung

Mendeteksi Ag.:

Eritrosit angsa

Ag. Terlarut ?

Agglutinasi

Contoh: RPHA HBs Ag (Reverse Passive Haemagglutination)

Mendeteksi Ab.

Agglutinasi tak langsung

Ag. Terlarut

Eri kambing

Eri terlapisi Ag

Ab. ?

Agglutinasi Contoh: PHA (TPHA)-anti HBs

INDIREK HA Direk Coombs tes.

Inkomplit Ab. Eritrosit

Coomb' s

Agglutinasi

Indirek Coombs tes.

E
Coombs Inkomplit Ab serum Agglutinasi

CRP (C Reactive Protein) L Ab pd Latek Ag protein CRP serum pend.

Agglutinasi

Kelebihan CRP dibandingkan LED: _ Infeksi akut: CRP +, LED , Infeksi sembuh: CRP , LED masih .

ASTO (ASO)
Ag : Streptococcus Hemolyticus
Kadar Normal: <125 S.Todd (dewasa). <200 S.Todd (anak).

Indikasi Pemeriksaan: Demam Rematik Akut. Glomerulo nepritis Akut (GNA). Bila peningkatan titer 2X Infeksi sedang berlangsung. Pemeriksaan dilakukan 2X fase Akut dan konvalescen.

Agglutinasi Inhibisi Haemagglutination Inhibisi (HI) tes DHF.

Virus + Eri Angsa Agglutinasi. Virus + Eri Angsa + Serum pend. DHF tidak agglutinasi. Virus + Eri Angsa + Serum orang Normal Agglutinasi. Preparasi serum penderita; 2-5 ml darah ambil serum simpan 0oC pada fase akut & konvalesen. Serum diekstraksi dengan kaolin. Perbandingan serum: saline: kaolin= 1 : 4 : 5. Inkubasi 20, kocok putar 2.500 ppm selama 30. Ag viral: Den 1. Den 2. Den 3

Reaksi tipe II, komplemen terlibat

Reaksi tipe III : Ab bebas, Ag bebas), terbentuk kompleks Ag-Ab (GNA, PJR)

Reaksi tipe IV : tipe selular (peny. granuloma, uji tuberkulin)

Pembacaan hasil

langsung (mata telanjang):

presipitasi aglutinasi

dengan alat :
nefelometri scanning

dengan bahan radioaktif dengan pewarnaan dengan fluoresensi

Meningkatkan reaksi Ag-Ab

menggunakan media yang tepat :

Larutan gel massa padat : plate, butir manik-manik

mengatur suhu optimum menggunakan medan listrik mengatur suhu optimum menambahkan bahan tertentu

Antibodi diikatkan pada lempengan (meniru reaksi tipe I)

Gb 1 dan 2 : Ab dilekatkan pada massa solid, Gb 1 : Ag berlabel ditambahkan, kemudian Ag uji ditambahkan, Gb 2 : Ag uji ditambahkan, kemudian Ab berlabel ditambahkan Pengukuran : dilakukan pd Ag berlabel yg terdesak oleh Ag uji (Gb1) atau pada Ab berlabel yang terikat (Gb 2).

Antibodi diikatkan pada gel (meniru reaksi tipe II )

Pada gel yg mengandung Ab dibuat sederet sumuran. Ag dimasukkan ke dlm sumuran. Ag akan berdifusi ke sekelilingnya dan bereaksi dg Ab dlm gel. Luas lingkaran presipitin berkorelasi dg konsentrasi Ag, dibandingkan dg. Grafik standar

Elektroforesis
Gb atas : Ab mau-pun Ag bebas dlm gel, Ab bergerak ke arah kutub neg., Ag bergerak ke arah kutub pos., keduanya bertemu terbentuk presipitin. Gb bawah : Ab terikat pada gel, Ag bebas begerak ke arah kutub positif shg terjadi presipitat berbentuk spt roket

Antigen diikatkan pada massa padat

(meniru reaksi tipe II)

Antigen bebas, antibodi bebas

(meniru reaksi tipe III)

Ag maupun Ab dimasukkan ke dalam sumuran yang dibuat pada media gel. Akan terjadi difusi Ag maupun Ab. Pd Gb a. terjadi satu sedangkan pada b. dua pita precipitin pada pertemuan Ag dan Ab.

Gb 1 : garis presipitin menunjukkan bahwa Ag di sumuran kiri dan Ag kanan keduanya mempunyai epitop yg identik. Gb 2 : Ag dlm sumuran kiri tidak identik dg Ag di sumuran kanan, terlihat dari adanya presipitin yang bersilangan. Gb 3 : Taji pada presipitin kanan menunjukkan bahwa Ag di sumuran kiri dan kanan adalah identik parsial.

Pada campuran Ag yang telah diberi label radioaktif ditambahkan Ab spesifik. Kompleks AgAb diendapkan. Endapan dipisahkan dari Ag yang bebas, lalu dielektroforesis. Dibaca dengan scanner radioaktivitas

Gb 1. Pd tabung kanan maupun kiri terdapat Ag. Tbg kanan : terjadi reaksi Ag dg serum uji yang sesuai komplek Ag-Ab Gb 2. Setelah penambahan komplemen : pd tabung kiri komplemen yg ditambahkan tetap bebas. Gb 3. Komplemen bebas di tabung kiri melisis sel indikator

Gb 1. Komplemen diikatkan pada fase padat. Gb 2. Kompleks Ag-Ab terikat pada komplemen Gb 3. Pembacaan dg anti-IgG yg telah dilabel radioaktif

Antigen mikroorganisme (banyak Ag) dielektroforesis pada gel shg terpisah satu sama lain. Hasil elektroforesis dipindahkan ke lempeng nitroselulose (blotting), ditambahkan Ab, dicuci, dst dibaca dengan pelabelan radioaktif atau dg pewarnaan

Adanya lisis membuktikan terjadi reaksi AgAb dg keterlibatan komplemen. Tidak ada lisis berarti reaksi Ag vs Ab tidak berpengaruh pada sel indikator. Gb bawah tabel bukti adanya macam2 kompl.

ELISA
Uses an enzyme system to show the specific combination of antigen antibody An enzyme labeled or linked to a specific antigen A substrate A color reader Double antibody technique to detect and assay antigen Indirect technique to Assay and antibody

Indirect ELISA

Ab detection
Immobilize Ag Incubate with sample Add labeled anti-Ig Amount of labeled Ab bound is proportional to amount of Ab in the sample
Ab in Patients sample

Labeled Anti-Ig

Immobilized

Ag
Solid Phase

Quantitative

Double Antibody ELISA

Ag

detection
Ag in Patients sample Immobilized

Immobilize Ab Incubate with sample Add labeled antibody Amount of labeled Ab bound is proportional to the amount of Ag in the sample
Quantitative

Labeled Ab

Ag

Solid Phase

Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay (ELISA)

Indirect ELISA

Sandwich ELISA

1.

Indirect ELISA

The steps of the general, "indirect," ELISA for determining serum antibody concentrations are:
1. Apply a sample of known antigen of known concentration to a surface, often the well of a microtiter plate. The antigen is fixed to the surface to render it immobile. Simple adsorption of the protein to the plastic surface is usually sufficient. These samples of known antigen concentrations will constitute a standard curve used to calculate antigen concentrations of unknown samples. Note that the antigen itself may be an antibody. The plate wells or other surface are then coated with serum samples of unknown antigen concentration, diluted into the same buffer used for the antigen standards. Since antigen immobilization in this step is due to non-specific adsorption, it is important for the total protein concentration to be similar to that of the antigen standards. A concentrated solution of non-interacting protein, such as Bovine Serum Albumin (BSA) or casein, is added to all plate wells. This step is known as blocking, because the serum proteins block non-specific adsorption of other proteins to the plate.

2.

3.

4.

5. 6.

7. 8. 9.

The plate is washed, and a detection antibody specific to the antigen of interest is applied to all plate wells. This antibody will only bind to immobilized antigen on the well surface, not to other serum proteins or the blocking proteins. The plate is washed to remove any unbound detection antibody. After this wash, only the antibody-antigen complexes remain attached to the well. Secondary antibodies, which will bind to any remaining detection antibodies, are added to the wells. These secondary antibodies are conjugated to the substratespecific enzyme. This step may be skipped if the detection antibody is conjugated to an enzyme. Wash the plate, so that excess unbound enzymeantibody conjugates are removed. Apply a substrate which is converted by the enzyme to elicit a chromogenic or fluorogenic or electrochemical signal. View/quantify the result using a spectrophotometer, spectrofluorometer, or other optical/electrochemical device.

To detect antibody (indirect ELISA):

2. Sandwich ELISA
A

sandwich ELISA:

Plate is coated with a capture antibody sample is added, and any antigen present binds to capture antibody detecting antibody is added, and binds to antigen enzyme-linked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.

A less-common variant of this technique, called "sandwich" ELISA, is used to detect sample antigen. The steps are as follows:
1.

2.
3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Prepare a surface to which a known quantity of capture antibody is bound. Block any non specific binding sites on the surface. Apply the antigen-containing sample to the plate. Wash the plate, so that unbound antigen is removed. Apply primary antibodies that bind specfically to the antigen. Apply enzyme-linked secondary antibodies which are specific to the primary antibodies. Wash the plate, so that the unbound antibody-enzyme conjugates are removed. Apply a chemical which is converted by the enzyme into a color or fluorescent or electrochemical signal. Measure the absorbance or fluorescence or electrochemical signal (e.g., current) of the plate wells to determine the presence and quantity of antigen.

To detect antigen (sandwich ELISA):

3. Competitive ELISA

1.

Unlabeled antibody is incubated in the presence of its antigen. 2. These bound antibody/antigen complexes are then added to an antigen coated well. 3. The plate is washed, so that unbound antibody is removed. (The more antigen in the sample, the less antibody will be able to bind to the antigen in the well, hence "competition.") 4. The secondary antibody, specific to the primary antibody is added. This second antibody is coupled to the enzyme. 5. A substrate is added, and remaining enzymes elicit a chromogenic or fluorescent signal. For competitive ELISA, the higher the original antigen concentration, the weaker the eventual signal.

A third use of ELISA is through competitive binding. The steps for this ELISA are somewhat different than the first two examples:

Competitive ELISA for antigen

Method
Determine amount of Ab needed to bind to a known amount of labeled Ag Use predetermined amounts of labeled Ag and Ab and add a sample containing unlabeled Ag as a competitor

Prior to Test
+

Labeled Ag Test
+

Labeled Patients Ag sample

Competitive ELISA for Ag

Method cont.
Determine amount of labeled Ag bound to Ab
NH4SO4 anti-Ig Immobilize

Test
+ + +

the Ab

Solid Phase

Labeled Ag

Patients sample

Solid Phase

Concentration determined from a standard curve using known amounts of unlabeled Ag

Quantitative

Most sensitive test

Kuantitasi limfosit

Tujuan : menghitung AFC Prinsip : Ab menyebabkan lisis eritrosit tersensitisasi. Gb atas: Ig spesifik (thd Ag tertentu) yg diproduksi sel uji melisis eritrosit tersensitisasi, setelah penambahan anti-Ig. Gb tengah : IgM yang spesifik (thd Ag tertentu) langsung melisis eritrosit yg punya Ag tersebut Gb bawah : Ig (tak hanya yg spesifik) berikatan dg eritrosit tersentisitisasi dg anti-Ig,dan selanjutnya mampu mengikat komplemen lisis

Ig yang diproduksi sel limpa mengeluarkan antibodi yg kemudian berikatan dg eritrosit tersensitisasi. Selanjutnya komplemen yg ditambahkan akan menyebabkan lisis eritrosit yang telah mengikat Ab di permukaannya, teradi plaque ( )

Ag reagen (kiri)/Ab reagen anti-sitokin (kanan) dilekatkan pd plate Limfosit B uji (kiri) mengeluarkan Ab spesifik, reaksi Ab vs Ag Limf T uji (kanan) mengeluarkan sitokin, sitokin yg sesuai bereaksi dg Ab antisitokin ditambah Ab antisitokin yg mengikat enzim Selanjutnya dg teknik Enzym immunoassay dpt dihitung jml sel ( )

Cara memisahkan limfosit dari populasi sel lain : dalam Ficoll Isopaque eritrosit, granulosit dan trombosit akan mengendap di bawah bila disentrifuse, limfosit di atas Ficoll.

Gb kiri : limfosit mempunyai reseptor utk eritrosit domba; pencampuran kedua sel itu akan menghasilkan roset (eritrosit mengelilingi limfosit) Gb tengah:sel yg mempunyai reseptor Fc dapat mengikat Ab; bila dicamur dg eritrosit yg telah tersensitisasi, maka Ab di permukaan eritrosit akan berikatan silang dengan sel tadi shg terbentuk roset. Sel-sel telah membentuk roset selanjutnya dpt dipisahkan dg cara sedimentasi lewat Ficoll gradients

Uji fungsi limfosit

Uji kemampuan limfosit : Populasi limfosit yg telah terpisahkan dibiak dlm medium dan dipacu dg Ag kmdn ditambahkan Tritiated thymidine Limfosit dipanen dan ditaruh pd glassfiber filter disc, lalu dibaca dg skintilasi Nilai tinggi berarti limf telah mengalam transformasi (merespon Ag)

Uji kemampuan toksisitas limfosit Sel target dilabel dg Cr radioaktif Sel target berlabel di biak bersama Limfosit (sel efektor) selama 4-16 jam. Terjadi pembunuhan sel target, Cr radioaktif bebas dalam supernatan. Supernatan dipisah, Cr radioaktif dalam supernatan diukur.

Produksi Ab monoklonal:
Sel limpa difusikan dg sel mieloma, lalu dibiak pada medium HAT dlm banyak sumuran. Sel fusi tetap hidup,sel lain mati. Beberapa dari sel fusi menghasilkan Ab. Ab di supernatan diidentifikasi. Sel di sumuran yg mengandung Ab yang diinginkan kemudian dibiak Ab monoklonal.

IL-2

Sel kelenjar limfe tikus yg telah disensitisasi diinkubasikan bersama Ag ( ) sel feeder dan syngeneic aktivasi sel T. Sel T teraktivasi dibiak bersama IL-2 sel T yg diperoleh diuji spesifisitasnya utk memperoleh galur yg diinginkan.