ESCUELA POLITCNICA DEL EJRCITO ESPE DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERA EN BIOTECNOLOGA MICROBIOLOGA I

NOMBRE: Hctor Pulla NIVEL: Cuarto PARALELO: A 1. Tema: Recuento bacteriano 2. Objetivos: Entender el concepto de Unidad Formadora de Colonia (UFC). Calcular el nmero de UFC/ml de una muestra problema a partir del recuento de colonias. 3. INTRODUCCIN: Recuento en placa o colonia se define como la determinacin numrica de la capacidad de una clula viable de formar colonias en un medio slido conveniente. (Madigan, 2006) Existen muchas formas de determinar la cantidad numrica de clulas microbianas, entre ellas tenemos: recuento directo, recuento por siembra en extensin, recuento por siembra de vertido y por medio de un filtro de membrana. (Prescott, 2004) El recuento directo (Cmara de recuento de Petroff-Hauser) consiste en el uso de un portaobjetos concreto con una graduacin en superficie, con una previa fijacin de la muestra, se usa el microscopio de contraste de fases u fluorescencia, en donde, el nmero de microorganismos se puede calcular a partir de una muestra con la disolucin efectuada a la muestra y con el volumen de la cmara. (Prescott, 2004). Este mtodo presenta varias dificultades, por ejemplo, sirve observar en el microscopio solo para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 cls./ml), adems en bacterias con movimiento hay que realizar una solucin de alcohol y agua para causar su inmovilizacin. (Universidad de Granada, 2005) El mtodo de recuento por extensin se basa en un especfico volumen (0.1ml) de un cultivo se extiende sobre la superficie de un agar slidos por medio del uso de una asa estril, luego se incuba y finalmente se numera a las colonias formadas. El volumen no debe sobrepasa r de 0.1ml porque el agar absorbe lquido sin exceso, ya que su abundancia puede facilitar la extensin y mezcla de las colonias, dificultando as el conteo por este mtodo. Como se puede notar el recuento consiste en contar las clulas que pueden crecer y multiplicar, en donde, el numero de bacterias viables en la muestra se calcula mediante la formacin de de colonias y la disolucin de la muestra. En el mtodo del vertido en placa se pipetea un volumen entre 0.1-01.0ml conocidos en una palca estril vaca y luego se le

introduce agar fundido y se mezcla con delicadamente toda la solucin formada, esperando que se solidifique. Es importante recalcar que por este mtodo se puede introducir volmenes de inoculo mayores que del mtodo de recuento por extensin, adems el microorganismos debe ser capaz de resistir la temperatura fundido de 45C. (Madigan, et al., 2006) Se puede asegurar que cada colonia provenga de una sola clula individual por lo que se expresa los resultados en unidades formadoras de colonias (UFC), para prevenir la incertidumbre el valor de UFC debe estar comprendido entre 30-300. (Prescott, 2004) En los mtodos realizados en el laboratorio de la Espe de recuento por extensin y profundidad presentan la mayora de sus cultivos suficientes colonias formadas entre 30300ml, por lo que el UFC calculado es semejante o igual las disoluciones de cada mtodo de recuento realizado. 4. HIPTESIS: El numero de bacterias se obtiene en base al la cantidad de solucin que se tome de una muestra de jugo. 5. MATERIALES Y MTODOS: (Extrada del Manual de laboratorio de microbiologa de Vieira y Koch). Materiales: 4 tubos con 9ml de solucin salina estril. Pipetas estriles. Varillas de vidrio acodadas Alcohol Cajas Petri con agar nutritivo preparado Cajas Petri MKL preparado. Jugo de fruta. (muestra problema) Asas de vidrio Caldo nutritivo estriles. Procedimiento inicial: 1. Se tomo 1ml de la muestra problema y se transfiri al primero de los tubos con 9ml de solucin salina estril. (disolucin de concentracin 10-1). 2. Se Homogeniz totalmente la primera dilucin y se prosigui de la misma forma hasta la dilucin a la 10-4. Ejercicio1 (Mtodo de recuento por extensin): 1. Se transfiri con una pipeta estril 0,1ml de cada dilucin de la muestra a las cajas Petri con agar nutritivo. Se extendi al inoculo de forma homognea por toda la

superficie de la placa, para lo cual utilizamos la vailla de vidrio acodada, previamente esterilizada. 2. Se incub las placas en posicin vertida a 37C durante 24 horas. 3. Despus de un periodo de incubacin se examin las placas. Las colonias aparecieron sobre la superficie del agar. Cada colonia se los represent como los representantes de una UFC. 4. Se calcul con estos datos el nmero inicial de UFC/ml de muestras: UFC/ml=nmero de colonias*factor de dilucin/ml sembrados en la placa. Ejercicio2 (Mtodo de recuento por profundidad): 1. Se prepar el agar nutritivo, se mantuvo esterilizado y se lo mantuvo a 40-50C para su uso. 2. Se marc 3 cajas Petri estriles con los datos de la bacteria y la disolucin correspondiente. 3. Se transfiri con una pipeta estril 0,1ml de cada disolucin de la muestra a las cajas Petri estriles y vacas. 4. Se verti aproximadamente 20ml del agar, se tap la caja Petri y se rot gentilmente para mezclar el agar con el inoculo. 5. Despus de que el medio se ha enfriando totalmente, se lo incub por 24horas a 37C. 6. Luego se examin las Placas, en donde, las colonias aparecen sobre y a debajo de la superficie del agar. 7. Se verific las cajas Petri entre 30-300 colonias, se cont independientemente de cada tamao y se calculo con esos el nmero inicial de UFC/ml de las muestras. 6. RESULTADOS: A continuacin se muestran los resultados realizados en los mtodos de recuento por extensin y en los mtodos de recuento por profundidad:

Cuadro 1: Resultados de unidades formadoras de colonias en cada mtodo de recuento. Se calcul UFC por medio de la siguiente frmula:

UFC/ml= grupo 1 2 3 4 5 AN 8x105 3x104 13x103 7x103 5x103 CC 7x103 1x104 9x102 1x104 7x103 MKL NA NA NA NA NA muestra Jugo de pia Agua de charco Jugo de pia Jugo de pia Jugo de pia

Las grficas de cada recuento son:

40000 35000 30000 25000 UFC/ml 20000 15000 10000 5000 0 -5000 0 1 2 3 Concentracin de agar 4 Series2 Series3 Series1

Imagen1. Mtodo de recuento por extensin en chromocut.

5000 4000 UFC/ml 3000 2000 1000 0 Series2 Series3 Series1

Extensin-Concentracin de agar

Imagen2. Mtodo de recuento por profundidad en Agar nutritivo.

6000 5000 4000 UFC/ml 3000 2000 1000 0 Caja sin agar Series1 Series3 Series2

Imagen2. Mtodo de recuento por profundidad en Agar nutritivo. 6. DISCUSIN: En bastantes investigaciones de microbiologa se requiere conocer la cantidad precisa de microorganismos que existe en una muestra. Normalmente las muestras de inters poseen gran cantidad de microorganismos por lo que es necesario diluirlas para dar lugar a la aplicacin de mtodos de recuento, en donde, se realiza el recuento por siembra en placas y con medio adecuado, cuyo objetivo es conocer el nmero de microorganismos viables de la muestra, ese mtodo llamado tambin por extensin se basa en la determinacin de clulas viables por medio del conteo del numero de colonias (UFC). Es importante aclarar que la viabilidad microbiana es la capacidad de un microorganismos de formar su descendencia por medio su capacidad de divisin (generalmente por fusin binaria o gemacin) (Gamazo, et al., 2005). Se supone que cada disolucin presenta debe presentar el mismo valor de UFC ya que se en cada disolucin la concentracin microbiana es menor, pero su factor inverso de disolucin es cada vez menor, comprobndose no as en los resultados, en donde, se puede notar claramente que la disolucin ms concentrada presenta mayor UFC, siendo mayoritario en el agar nutritivo por el mtodo de recuento en profundidad, pero en sus posteriores diluciones la cantidad de UFC baja notablemente, siendo mayoritario en la disoluciones (10-2 y 10-3) la cantidad de UFC en el mtodo de recuento por extensin. Dicha desigualdad numrica de UFC, puede ser causado por: medicin de volumen no presisa en cada disolucin, las cajas Petri no estuvieron completamente estriles a igual que la vailla de vidrio acodada y/o pipetas, adems puede ser causado tambin por sobrepasar el volumen de 0.1 ml de la muestra, ms adelante se aclara el motivo del mismo. (Vieira y Koch, 2008). Y lo ms probable (por las causas anteriores) es que no todos los cultivos posean un nmero de colonias entre 30-300, por lo tanto hay gran nivel de incertidumbre en el clculo de UFC, por lo tanto no se puede asegurar los resultados obtenidos, por las causas indicadas

anteriormente. (Prescott, 2004). Es importante recalcar que el agar nutritivo presenta mayor cantidad de UFC, que el agar Mc Conkey Lactosa, uno de las causas puede ser debido a que el agar Mc Conkey Lactosa es diferencial y selectivo, cuyo uso es favorecido para el cultivo y aislamiento de microorganismos Gram negativos como fermentadores y no fermentadores de glucosa, e inhibe a las Gram positivas. Otra de las causas puede ser que el agar nutritivo es un agar para una gran cantidad de microorganismos, es decir no es diferencial no selectivo. (MCD laboratorios, 2010). Por lo tanto en la muestra del juego, puedo haberse encontrado bacterias Gram positivas y Gram negativos, en la que las se vieron ms favorecidas en el agar nutritivo que en el agar Mc Conkey. Como se dijo introductoriamente, los mtodos de recuento por extensin, solo se debe introducir un volumen de 0.1ml en el medio de cultivo estril (mtodo por extensin), ya un volumen mayor a 0.1ml porque el agar absorbe lquido sin exceso, ya que su abundancia puede favorecer a la sobre extensin y a la mezcla de las colonias, dificultando as el conteo por este mtodo; en cambio el mtodo por profundidad requiere un de inoculo comprendido entre 0.1-1 ml y adicionalmente los microorganismos deben ser capaz de resistir la temperatura fundida de 45C del agar. (Madigan, et al., 2006). Para realizar los respectivos 7. CONCLUSIONES: No se puedo asegurar los valores obtenidos de UFC, ya que el nivel de incertidumbre es alto, una de las causas ms probables es que los medios de cultivo no presentaron un nmero de colonias entre el rango de 30-300 y esto puede ser causado a su vez por el impreciso pipeteo, impreciso medicin de volumen en cada disolucin. Se pudo aprender a aislar y calcular el nmero de clulas viables, en donde, es necesario e importante calcular bien los volmenes de cada disolucin, utilizar materiales completamente estriles, y todos los requerimientos de la prctica, ya que sin un uso debido de los instrumentos ni un trabajo adecuado, no hay como asegurar resultados, como en este caso. 8. BIBLIOGRAFA: Universidad de Granada. 2005. Ciclo celular y crecimiento. Granada- Espaa (en lnea: http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm, consultado el 14 de junio de 2010) MCD. LAB. S/A. Medios de cultivos preparados en placa. Mxico. (En lnea: http://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%20NUTRITIVO.pdf , consultado el 13 de junio del 2010) Gamazo, C., Lpez-Goi, I., Daz, R. 2005. Manual prctico de Microbiologa. 3a edicin. Masson. Travessera de Grcia. Barcelona (Espaa). Madigan, M., Martinku, J., Parker, J. 2006. Brock. Biologa de los Microorganismos. 10m edicin. Pearson, Prentice Hall. Madrid, Espaa.

 Prescott, L. M., Harley, J. P., y Klein, D. A. 2004. Microbiologa. 5 edicin. McGraw-Hill Interamericana. Madrid Espaa. Koch, A., Vieira, N. 2008. Manual de laboratorio de Microbiologa I. Pg. 34, 35, 36. Sangolqui-Ecuador.