Miniaturizacin en Quimioluminiscencia: Una interesante alternativa para la determinacin analtica de frmacos y compuestos de inters biomdico

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Willy R.G. BAEYENS y Ana M. GARCA CAMPAA

1Universidad

de Gante, Facultad de Ciencias Farmacuticas, Dept. Anlisis Farmacuticas, Harelbekestraat 72, B-9000 Gante, Blgica 2Universidad de Granada, Facultad de Ciencias, Dept. Qumica Analtica, Avda. Fuentenueva s/n, E-18071 Granada, Espaa 1. Introduccin El uso analtico de la quimioluminiscencia (QL) est experimentando un creciente inters, ya que representa una alternativa simple, barata y sensible para cuantificar una gran variedad de compuestos. Desde hace unos treinta aos, el fenmeno de la luminiscencia originalmente una curiosidad del laboratorio fsico-, se ha convertido en una rama de la espectrometra aplicada, dentro de la qumica analtica. Debido a la nueva instrumentacin y, especialmente a la incorporacin de tcnicas modernas, algunas nuevas y otras tomadas de otras disciplinas, la QL y la bioluminiscencia (BL) se aplican de forma rutinaria en el anlisis tanto cuali- como cuantitativo [i]. Aunque el fenmeno de la QL se conoce desde 300 aos a.C., el desarrollo de aplicaciones analticas es relativamente reciente. Debido a su alta sensibilidad y selectividad, los mtodos basados en detecciones QL suponen una herramienta analtica de gran utilidad. La primera aplicacin de la QL como tcnica analtica la llev a cabo Erdey en 1957, que estudi el uso de varias sustancias, como luminol, lofina y lucigenina, como indicadores volumtricos. Las investigaciones sobre el potencial analtico de la QL para anlisis de rutina datan de los aos 70, en el caso de reacciones en fase gaseosa, y de la dcada de los 80 para reacciones en fase lquida. Desde entonces, los mtodos quimioluminiscentes han sido ms ampliamente utilizados, fundamentalmente en anlisis bioqumico y ambiental, y el nmero de publicaciones y comunicaciones sobre el tema ha ido incrementando de forma exponencial desde la celebracin del primer Simposium Internacional sobre Bioluminiscencia y Quimioluminiscencia, celebrado en Bruselas en 1978. De hecho, en el desarrollo de mtodos QL pueden diferenciarse dos periodos: una primera etapa (19281940) caracterizada por la bsqueda de nuevos compuestos o sistemas quimioluminiscentes, por medio de modificaciones qumicas de estructuras bien conocidas, y, desde la 2 Guerra Mundial hasta el presente, un avance en la instrumentacin, junto con el desarrollo de conceptos tericos de los, a veces, complejos principios de la QL. Las grandes aplicaciones analticas de la QL como mtodo de deteccin en inyeccin en flujo y cromatografa lquida (CL), junto con el gran potencial del inmunoensayo [ii ], hacen de esta tcnica un campo de investigacin muy interesante en una amplia variedad de disciplinas, que incluyen tcnicas de separacin en anlisis qumico, biolgico, farmacutico, biomdico y alimentario, control de calidad, etc [iii ]. Las tendencias ms actuales en qumica analtica implican la aplicacin de la QL como sistema de deteccin, combinada con tcnicas de anlisis por inyeccin en flujo y tcnicas

separativas, proporcionando una selectividad y sensibilidad analticas excelentes y permitiendo la resolucin y cuantificacin de varios analitos en mezclas relativamente complejas. Hasta la dcada de los noventa, la deteccin por QL no haba sido acoplada a electroforesis capilar (EC), pero en estos ltimos aos, se han publicado importantes desarrollos por parte de algunas compaas y grupos de investigacin, por lo que se esperan futuras contribuciones sobre el tema [iv ]. Combinadas con separaciones por cromatografa lquida de alta resolucin (CLAR) , se han empleado varias reacciones quimioluminiscentes, entre otras con peroxioxalato, luciferasa, lucigenina y luminol, siendo la ms comn la reaccin con peroxioxalato en deteccin postcolumna acoplada a cromatografa lquida, tanto convencional como empleando microcolumnas. Asimismo, se han empleado sistemas de flujo continuo con deteccin basada en QL, para la determinacin de varios frmacos y analitos de inters biolgico. 2. Fundamentos de la QL La QL se define como la emisin de radiacin electromagntica (normalmente en la regin del visible o del infrarrojo cercano) producida por una reaccin qumica. Cuando esta emisin proviene de organismos vivos o sistemas derivados de ellos, se denomina bioluminiscencia. Ambos fenmenos son procesos luminiscentes que se han identificado tradicionalmente mediante un prefijo que identifica la fuente de energa responsable del inicio de la emisin de radiacin electromagntica (ver Tabla 1). Tabla 1. Clasificacin de los fenmenos luminiscentes Producidos por irradiacin A) Fotoluminiscencia: El estado excitado se produce por la absorcin de radiacin ultravioleta, visible o de infrarrojo prximo
- Fluorescencia: Emisin de vida corta a partir de un estado singlete electrnicamente excitado

- Fosforescencia: Emisin de vida larga a partir de un estado triplete electrnicamente excitado B) Catodoluminiscencia: Emisin producida por irradiacin de partculas C) Anodoluminiscencia: Emisin producida por irradiacin de partculas D) Radioluminiscencia: Emisin producida por irradiacin de partculas o rayos X Producidos por calentamiento A) Candoluminiscencia: Emisin por slidos incandescentes B) Termoluminiscencia: Emisin por slidos y cristales en caliente C) Piroluminiscencia: Emisin por tomos metlicos en llama Producidos por reordenamientos estructurales en slidos A) Triboluminiscencia: Emisin por cristales friccionados o triturados B) Cristaloluminiscencia: Emisin por cristalizacin

C) Lioluminiscencia: Emisin por cristales disueltos Producidos por fenmenos elctricos A) Electroluminiscencia: Emisin por descargas elctricas B) Galvanoluminiscencia: Emisin durante la electrolisis C) Sonoluminiscencia: Emisin por exposicin a ondas ultrasnicas en solucin D) Piezoluminiscencia: Emisin por separacin de cargas por friccin en la superficie de cristales Producidos por reacciones qumicas A) Bioluminiscencia: Emisin por organismos vivos o sistemas biolgicos B) Quimioluminiscencia: Emisin por una reaccin qumica - Electroquimioluminiscencia: Emisin que se produce en solucin, a partir de un estado electrnicamente excitado producido en una reaccin de transferencia de alta energa de un electrn - Quimioluminiscencia Electrogenerada: Emisin producida en la superficie de un electrodo

Como la intensidad de emisin es funcin de la concentracin de las especies qumicas implicadas en la reaccin QL, las medidas de la intensidad de emisin pueden emplearse con fines analticos. Una ventaja de las tcnicas QL es que permiten emplear una instrumentacin bsica bastante sencilla, ya que el sistema ptico no requiere fuente externa de excitacin. La QL se describe a menudo como una tcnica de campo oscuro: la ausencia de niveles altos de luz de fondo, que s ocurren en espectrofotometra y fluorimetra, reduce el ruido y permite mejorar los lmites de deteccin. La instrumentacin para medidas de QL vara desde sistemas muy simples hasta instrumentacin ms compleja, pudindose usar un fluormetro simplemente con la fuente de excitacin apagada. No obstante deben considerarse algunas limitaciones en el anlisis por QL, como la dependencia de la emisin quimioluminiscente de varios factores ambientales que deben ser controlados, la falta de selectividad, ya que un reactivo quimioluminiscente no se limita a un nico analito, y finalmente, como ocurre en otros sistemas de deteccin en flujo, la emisin quimioluminiscente no es constante sino que vara con el tiempo (el flash de luz est compuesto de una seal que se produce tras la mezcla de los reactivos, alcanza un mximo y despus cae hasta la lnea de base), y este perfil de emisin frente al tiempo puede variar ampliamente en diferentes sistemas quimioluminiscentes, por lo que hay que extremar el cuidado para detectar la seal en sistemas en flujo, midiendo en periodos de tiempo bien definidos. 2.1. Mecanismos de las reacciones QL En general, una reaccin QL puede generarse mediante dos mecanismos bsicos (Figura

1). En una reaccin directa, dos reactivos, normalmente un substrato y un oxidante en presencia de algunos cofactores, reaccionan para formar un producto o intermedio de la reaccin, algunas veces en presencia de un catalizador. Despus, parte del producto o intermedio pasa a un estado electrnicamente excitado, que puede a continuacin relajarse hasta el estado fundamental con emisin de un fotn. El substrato es el precursor QL, que se convierte en la molcula excitada electrnicamente, responsable de la emisin de luz, o bien acta para transferir la energa en la QL indirecta. El catalizador, enzima o ion metlico, reduce la energa de activacin y proporciona el ambiente adecuado para la produccin de una alta eficiencia QL durante el proceso. Los cofactores son necesarios en ocasiones para convertir uno o ms de los substratos en una forma capaz de reaccionar e interaccionar con el catalizador, o para proporcionar un grupo saliente eficaz cuando se requiere un marcado para producir el emisor excitado. Por el contrario, la QL indirecta o sensibilizada se basa en un proceso de transferencia de energa de la especie excitada a un fluorforo. En el caso de molculas que no pueden emitir directamente QL, este proceso permite transferir su exceso de energa a un fluorforo que a su vez es excitado, volviendo a su estado fundamental con la emisin de un fotn. Todas estas etapas dan lugar a una gran variedad de aplicaciones prcticas de la QL en la fase slida, lquida y gaseosa.

2.2. Requisitos de la emisin QL Para que una reaccin qumica emita luz, debe reunir algunos requisitos bsicos: a) la reaccin debe ser exotrmica y producir la suficiente energa para formar el estado electrnicamente excitado. En este sentido, para que ocurra una reaccin quimioluminiscente, los requisitos energticos pueden establecerse en trminos de G (Kcal.mol-1):

donde ex es la longitud de onda lmite (nanmetros) para la excitacin de las especies luminiscentes. Como la mayora de las reacciones quimioluminiscentes producen fotones en el rango comprendido entre 400 (violeta) - 750 (rojo) nm, la formacin del estado electrnicamente excitado y la generacin de QL en la regin del visible requiere alrededor de 40-70 Kcal.mol-1. Esta condicin exotrmica se asocia a las reacciones redox que emplean oxgeno, perxido de hidrgeno u oxidantes de potenciales similares. b) El camino de reaccin debe ser favorable a canalizar la energa hacia la formacin de un estado electrnicamente excitado. En el caso de que la energa qumica se disipe en forma de calor, mediante vibraciones o rotaciones moleculares, la reaccin no ser quimioluminiscente. c) la emisin de un fotn debe ser un proceso de desactivacin del producto excitado favorable en relacin a otros procesos no radiantes que pueden aparecer en pequea proporcin, como disociacin molecular, reacciones qumicas con otras especies, transferencia de energa intra- o intermolecular, isomerizacin o atenuacin fsica. En el caso de QL sensibilizada, tanto la eficacia y energa de transferencia de las especies excitadas al fluorforo como la eficacia de la fluorescencia de este ltimo deben ser considerables. En todos los procesos luminiscentes, la intensidad de la emisin producida depende de la eficacia al generar molculas en el estado excitado, lo cual viene representado por la eficiencia cuntica (rendimiento cuntico) y la velocidad de la reaccin. En el caso de reacciones quimioluminiscentes, la intensidad puede expresarse como:

donde I

rendimiento cuntico y (- dA/dt) la proporcin en la que el precursor quimioluminiscente, A, es consumido. Los valores altos de rendimiento cuntico se asocian normalmente con reacciones de BL, mientras que en la mayora de las reacciones quimioluminscentes empleadas para fines analticos, vara entre 0.001-0.1, e incluso sistemas bastante ineficaces, con rendimientos cunticos inferiores, pueden emplearse en anlisis basados en la ausencia casi absoluta de emisin de fondo. Tal es el caso de reacciones quimioluminiscentes ultradbiles, en las que puede ser inferior a 0.001 (a menudo 10-3QL QL

QL

es la intensidad de emisin quimioluminiscente (fotones/segundo),

QL

es el

10-8 y algunas veces 10-9-10-15). La QL ultradbil se produce a partir de reacciones de oxidacin en clulas vivas y las seales emitidas son a menudo 103-106 veces menos intensas que las de organismos luminosos, siendo invisibles a simple vista. Este tipo de QL incluye un grupo de reacciones quimioluminiscentes que, al menos en clulas vivas, implica cierto nmero de intermediarios oxigenados y que juega un papel importante en ciertos tipos de activacin celular, en los sistemas de defensa del cuerpo y en enfermedades coronarias. Se han detectado en gran variedad de rganos intactos, clulas aisladas y tejidos homogneos de vertebrados, invertebrados y plantas, y en varias reacciones in vitro. La QL ultradbil se asocia a algunas importantes funciones celulares, como la respiracin mitocondrial, fotosntesis, divisin celular o fagocitosis, entre otras [v ]. 2.3. Factores que influyen en la emisin QL Las medidas de QL estn fuertemente influenciadas por aquellos factores experimentales que afectan al rendimiento cuntico y a la velocidad de reaccin, como son: - La estructura qumica del precursor quimioluminiscente, no solamente la parte que contiene al grupo excitado electrnicamente, sino tambin las cadenas laterales. - La naturaleza y concentracin de otras sustancias que afectan el proceso de QL y que favorecen otros procesos competitivos no radiantes. - El catalizador seleccionado. - La presencia de iones metlicos, especialmente metales de transicin implicados en el proceso de oxidacin. - La temperatura - pH y fuerza inica - La hidrofobicidad del disolvente y la composicin de la disolucin (por ejemplo, la QL del luminol oxidado en dimetilsulfxido (DMSO) es 0.05 comparado con 0.01 en agua, siendo los colores azul-violeta (425 nm) y verde-azulado (480-502 nm), respectivamente) - La presencia de aceptores de la energa transferida

2.4. Caractersticas de la QL como tcnica analtica Como la velocidad de la reaccin es funcin de las concentraciones de reactivos, la QL es una tcnica adecuada para el anlisis cuantitativo. La utilidad de los sistemas quimioluminiscentes en qumica analtica se basa en algunas caractersticas especiales, que se comentan a continuacin. a) La tcnica comprende simultneamente caractersticas cinticas y luminiscentes, por lo que proporciona una alta sensibilidad y un amplio rango dinmico. Si QL es lo suficientemente alta, se pueden alcanzar lmites de deteccin excelentes, en el rango de los femtomoles. Como ejemplo, en la fase gaseosa, los lmites de deteccin habituales son de 10 pmol de NO empleando ozono, y 0.1 pmol para compuestos sulfurados empleando una llama de hidrgeno seguida de ozono; en la fase lquida, puede detectarse hasta 1 fmol de fluorforo empleando el sistema quimioluminiscente con peroxioxalato, y 0.1 fmol de peroxidasa usando luminol. En comparacin con otras tcnicas espectromtricas, la QL es aproximadamente 105 veces ms sensible que la

espectrometra de absorcin y al menos 103 veces ms sensible que la fluorimetra. b) Comparada con los procesos de fotoluminiscencia, no se requiere fuente de excitacin externa, lo que ofrece algunas ventajas, como la ausencia de dispersin y seales fotoluminiscentes de fondo, la desaparicin de problemas relacionados con la inestabilidad de la fuente externa, reduccin de interferencias debidas a procesos de excitacin no selectivos, y una instrumentacin ms simple. c) La selectividad y la linealidad son ms dependientes de la reaccin y de las condiciones de reaccin escogidas. Como ocurre con los procesos fotoluminiscentes, la absorcin o emisin de radiacin por el analito, producto o cofactores, pueden causar prdida de linealidad o interferencias espectrales. d) La tcnica es verstil para la determinacin de una amplia variedad de especies que pueden participar en el proceso quimioluminiscente, como: substratos o precursores quimioluminiscentes responsables del estado excitado; el reactivo necesario para la reaccin (normalmente un oxidante); algunas especies que afectan la velocidad o la eficacia de la reaccin: activadores, como catalizadores (enzimas o iones metlicos), o inhibidores, como reductores que disminuyen la emisin quimioluminiscente; fluorforos en el caso de QL sensibilizada; algunas especies que no estn directamente implicadas en la reaccin QL pero que pueden reaccionar con otros reactivos en reacciones acopladas para generar un producto que es un reactivo en la reaccin QL; especies que pueden formar derivados con algn precursor quimioluminiscente o fluorforo, determinndose mediante QL directa o sensibilizada. e) Dependiendo de la naturaleza del analito y de la reaccin QL, el incremento o disminucin de la intensidad de QL estar directamente relacionada con la concentracin de analito. f) Las reacciones quimioluminiscentes pueden acoplarse fcilmente como mtodo de deteccin en cromatografa, EC o inmunoensayo, proporcionando informacin cualitativa o cuantitativa sobre una gran variedad de especies en las fases gaseosa y lquida. Como regla emprica, es probable que un compuesto exhiba QL cuando l o su producto derivado muestren propiedades fluorescentes. Es posible que la oxidacin de tal especie produzca QL, aunque hay muchas excepciones a esta regla general. 3. Principales reacciones CL en fase lquida 3.1. Acilhidracidas El ejemplo ms conocido en reacciones directas es la oxidacin del luminol (5-amino-2,3dihidro-1,4-ftalazinediona) en medio alcalino, para producir el in 3-aminoftalato excitado (Figura 2). Pueden utilizarse varios oxidantes, tales como el permanganato, hipoclorito o yodo, aunque el ms usado es el perxido de hidrgeno. La reaccin es catalizada por iones metlicos (Fe(II), Cu(II), Co(II), entre otros), ferricianuro o algunos metalocomplejos (hemina, hemoglobina y peroxidasas). Esta reaccin ha sido aplicada en la determinacin de iones metlicos que actan como catalizador, enzimas (peroxidasas, compuestos hemticos, etc), ciertos oxidantes, inhibidores o sustancias que son fcilmente oxidables y que son determinadas indirectamente por la disminucin de emisin quimioluminiscente. Tambin el luminol se ha usado ampliamente en investigaciones criminales para detectar cantidades trazas de sangre, que no son visibles a simple vista, tales como restos de sangre

seca incluso con varios aos de antigedad, en ropas lavadas, superficies intencionadamente limpiadas, superficies oscuras, etc. [vi ]. De hecho, la aplicacin de un spray con luminol sobre la superficie a investigar puede producir una luminiscencia capaz de detectar hematina a dilucin de 1:108. Igualmente frmacos cuya presencia inhibe o exalta la emisin del luminol han sido cuantificados mediante esta metodologa. En el primer caso destaca la determinacin de paracetamol [vii ] y oximetazolina [viii ] en preparados farmacuticos y en el segundo caso, la determinacin de cido clavulnico y sulbactam [ix ] o de tiopronina [x ].

3.2. Imidazoles La lofina (2,4,5-trifenilimidazol) es el precursor quimioluminiscente ms representativo de estos compuestos. Cuando la lofina es oxidada, en medio bsico, por perxido-hipoclorito o perxido- hexacianoferrato (III) y O a hidroperxido, a partir del cual se forman diaroilarilamidinas en estado excitado a travs de una estructura de dioxetano, que es la responsable de la emisin de la luz (Figura 3) [xi ]. Utilizando este sistema se han llevado a cabo determinaciones de Co(II), Cr(III), Cu(II), Fe(CN) 3-, MnO -, ClO-, entre otros. Recientemente, se ha encontrado que el cloruro de hidroxilamonio aumenta la emisin quimioluminiscente del sistema lofina-Co(II)-H O , permitiendo una determinacin muy sensible de Co(II) [xii ].
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3.3. steres de acridinio La lucigenina (nitrato de 10,10-dimetil-9.9-biacridinio) es uno de los compuestos quimioluminiscentes ms eficientes, que emite una intensa luz verde cuando se oxida en medio bsico [xiii ]. Otros derivados del acridinio producen emisin quimioluminiscente al ser oxidados por perxido de hidrgeno en disolucin acuosa alcalina. El producto final de la reaccin es la N-metilacridona, que acta como intermediario activo en el mecanismo propuesto por Rauhut y col.[xiv , xv ] (Figura 4). Debido a que este producto es insoluble en agua, la adicin de pequeas cantidades de un surfactante, tal como dodecilsulfato sdico puede utilizar para evitar la precipitacin [xvi ]. La aplicacin de esta reaccin ha permitido la determinacin de varios iones, oxidantes o reductores como el cido ascrbico [xvii ].

3.4.Tris(2,2-bipiridina) rutenio (III) Otro sistema quimioluminiscente frecuentemente usado es el del complejo Ru(bpy) estado excitado [Ru(bpy)
2+]* 3

produce una emisin naranja a 610 nm. El estado excitado

3

2+,

cuyo

puede conseguirse por diversas reacciones que implican la transferencia de un electrn y regeneracin de la especie Ru(bpy) 2+ : * Por reaccin de Ru(bpy) Ru(bpy)
3+ 3

+ Ru(bpy)

*Por reaccin de Ru(bpy) + con ciertos oxidantes Ru(bpy) + + ox [Ru(bpy) *Por reaccin de Ru(bpy) Ru(bpy)
3+ 3 3 3+ 3 3

[Ru(bpy)
2+]* 3

3+ 3

y Ru(bpy)

2+]* 3

+ 3

+ ox-

con ciertos reductores

3 3+

+ red Ru(bpy)

+ red+

Para estas reacciones la intensidad de QL es linealmente proporcional a la concentracin de cualquiera de los reactivos, lo que permite su determinacin ajustando adecuadamente la concentracin de los restantes reactivos que intervienen en ella. Los disolventes que se utilizan en las determinaciones quimioluminiscentes basadas en estas reacciones suelen ser acetonitrilo-agua, metanol-agua y acetona-agua [xviii ]. Recientemente, se ha investigado un complejo similar, Ru(phen) 2+ (phen= 1,10 fenantrolina), que genera una mayor emisin durante la oxidacin de Ru(phen)
3

establecimiento de un mtodo quimioluminiscente para el anlisis de cidos nucleicos, con un gran aumento de la emisin de QL [xix ]. 3.5. Peroxioxalatos En QL indirecta, uno de los sistemas no biolgicos ms frecuentemente utilizados se basa

2+

por Ce(IV) en medio cido sulfrico, permitiendo el

en la reaccin quimioluminiscente de los peroxioxalatos (PO-CL), que supone la oxidacin por perxido de hidrgeno de un ster aril oxalato en presencia de un fluorforo. La reaccin parece que sigue un mecanismo denominado luminiscencia de intercambio electrnico iniciada qumicamente (CIEEL, chemically initiated electron exchange luminescence mechanism) a travs de un intermediario de alta energa, la 1,2dioxietanodiona, que forma un complejo de carga con el fluorforo, donando un electrn al intermediario [xx]. Este electrn es transferido al fluorforo, que alcanza un estado excitado y al regresar al estado fundamental, produce una emisin caracterstica propia de la naturaleza del fluorforo (Figura 5). El bis-(2,4,6-triclorofenil) oxalato y el bis-(2,4dinitrofenil) oxalato son los ms corrientemente usados. La principal desventaja de este sistema reside en la insolubilidad de estos compuestos en agua y su inestabilidad por hidrlisis, por lo que se requiere el uso de disolventes orgnicos, tales como, acetonitrilo, dioxano, terbutanol y acetato de etilo. Recientemente este problema se ha solventado mediante el uso de medios micelares, siendo posible su aplicacin en sistemas en flujo para el anlisis de protenas [xxi,xxii]. Esta reaccin se aplica a la determinacin de un gran nmero de compuestos como perxido de hidrgeno, sustancias altamente fluorescentes (ej. hidrocarburos aromticos policclicos) o compuestos que no siendo fluorescente pueden convertirse en fluorescentes, por reaccin qumica con cloruro de dansilo (aminocidos, esteroides, aminas alifticas, cidos carboxlicos, etc.) o con fluorescamina (catecolaminas) [xxiii].

3.6. Reacciones bioluminiscentes Los sistemas bioluminiscentes ms utilizados desde el punto de vista analtico, son los basados en la reaccin luciferina-luciferasa y los sistemas derivados de la lucirnaga Photinus pyralis y ciertas bacterias marinas (Vibrio harvey y Photobacterium fischeri). Las luciferasas se estabilizan por protenas como la albmina. En el primer sistema, la enzima hidrofbica luciferasa cataliza la oxidacin por el aire de la luciferina en presencia de ATP,

que se consume como sustrato para emitir luz a 562 nm [xxiv ]. Es necesaria la presencia de Mg(II) para que la luciferasa muestre su actividad. Un detallado esquema se muestra en la Figura 6. Considerando la estequiometra de la reaccin, por cada molcula de ATP consumida se emite aproximadamente un fotn. Esta propiedad, junto con la alta especificidad de la enzima por el nucletido, hacen que esta reaccin sea un sistema analtico ideal para detectar la presencia de ATP, su produccin o consumo, que depende de la actividad enzimtica y para cuantificar substratos relacionados con el metabolismo del ATP. La deteccin de ATP es una alternativa para detectar la contaminacin por microorganismos, residuos en alimentos o restos de contacto humano en superficies. Este sistema se emplea en el mbito de la gestin y garanta de la calidad para aumentar la higiene de los alimentos [xxv ] y en otros campos, tales como en control de calidad ambiental [xxvi ], en el seguimiento de plantas de lodos y aguas residuales [xxvii ], en la industria farmacutica y de cosmticos [xxviii, xxix ], en la calidad y vitalidad de la biomasa implicada en procesos de fermentacin [xxx ], en la contaminacin bacteriana de reas estriles o en el deterioro de obras artsticas por microorganismos[xxxi ]. Se han comercializados varios kits de reactivos, para usarlos directamente en el sistema adecuado mediante instrumentos porttiles con este fin [xxxii ].

3.7. Oxidaciones directas En los ltimos aos, se han desarrollado nuevas reacciones quimioluminiscentes por reaccin del analito en cuestin con oxidantes fuertes, tales como MnO - ( en medio cido y alcalino), ClO-, Ce(IV), H O , IO -, Br , N-bromosuccinimida, y con reductores, en
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diferentes condiciones qumicas [xxxiii ]. Normalmente, si se conoce que la oxidacin de la molcula da un producto fluorescente, o si el analito en si mismo, tiene una estructura que permita la emisin fluorescente, hay posibilidad de que la oxidacin del mismo produzca emisin de QL. Algunas de las aplicaciones de estos ltimos sistemas han sido la

determinacin quimioluminiscente de morfina [xxxiv ], hidrocloruro de buprenorfina [xxxv ] y la benzodiazepina loprazolam [xxxvi ], sulfonamidas [xxxvii ], mediante anlisis por inyeccin en flujo (FIA). En estos casos, la muestra conteniendo el frmaco se inyectaba en el canal por donde circula una disolucin de cido fosfrico que posteriormente se mezclaba con el oxidante, proporcionando un procedimiento sumamente simple, econmico y efectivo. Desde entonces, un gran nmero de este tipo de reacciones han sido publicadas, principalmente en el anlisis de frmacos [xxxviii ]. Para aumentar la emisin de QL se han aadido a estos sistemas sensibilizadores, medios micelares o catalizadores. Como ejemplos podemos citar la determinacin de penicilamina [xxxix ], tiopronina [xl ], cefadroxil [xli ] en presencia de sulfato de quinina; cido flico [xlii ], captopril [xliii ], hidroclorotiazida [xliv ], fenotiazinas [xlv ] o furosemida [xlvi ] usando rodaminas 6G o B e hidracina en presencia de diclorofluorescena [xlvii ]. El sulfato de quinina y la rodamina 6G se han utilizado conjuntamente para la determinacin de tiopronina [xlviii ]. Tambin, en presencia de un surfactante catinico, bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) se ha determinado tetraciclina con una alta sensibilidad [xlix ]. Todas estas reacciones han sido aplicadas principalmente a mtodos por inyeccin en flujo con deteccin quimioluminiscente. 4. Instrumentacin bsica La medida de la luz emitida por una reaccin qumica o bioqumica est relacionada con la concentracin de las especies participantes: la produccin total de luz est directamente relacionada con la cantidad de luz emitida y, consecuentemente, es proporcional a la concentracin de la especie concreta. Por esta razn, la medida de luz emitida es un indicador de la cantidad de analito presente y al instrumento bsico que es capaz de realizar estas medidas se le llama luminmetro. Una de las ventajas ms importantes de la QL como tcnica analtica es la simplicidad de la instrumentacin, que incluye como componentes principales: una clula de reaccin, un compartimento cerrado a la luz, un dispositivo de inyeccin y mezcla de reactivos y/o de muestra, un detector de luz y un sistema de adquisicin y procesador de seal. En el compartimento cerrado se coloca la clula de reaccin (un tubo de ensayo, un microplato, una clula de flujo, etc.) con objeto de que toda la luminiscencia sea captada por el detector. Este compartimento debe estar sellado a luz ambiental para evitar posibles interferencias y se debe colocar tan cerca como sea posible del detector para conseguir una mxima eficiencia ptica. Espejos, lentes y otros dispositivos adicionales se pueden utilizar para aumentar el ngulo de deteccin y conseguir una alta eficiencia ptica, al objeto de obtener una relacin seal-ruido ptima; as, se obtiene un instrumento rpido y preciso. La funcin del compartimento es mantener la mezcla de reactivo y muestra, a una temperatura adecuada y en completa oscuridad a fin de aislar el detector de la luz externa. Normalmente no es necesario el uso de monocromadores porque la intensidad de QL que surge de una de las especies no se ve apenas afectada en su distribucin espectral, por la presencia de otras especies. En las tcnicas de QL, una vez mezclados los reactivos y la muestra comienza la reaccin quimioluminiscente y la intensidad de la emisin que se est produciendo, disminuye una vez que los reactantes se han agotado. Esto supone que el carcter de la emisin quimioluminiscente es transitorio, y que la escala de tiempo depende de la reaccin en cuestin, que va de un corto flash a una emisin continua. Este hecho es crucial para la seleccin del sistema ms conveniente para la incorporacin de los reactivos.

5. Futuras perspectivas Hoy en da, el inters analtico de la QL est aumentando considerablemente debido a las ventajas ya comentadas, como bajos lmites de deteccin, rangos dinmicos amplios, alta sensibilidad y la gran versatilidad de los mtodos QL. Recientemente, las investigaciones se estn centrando especialmente en el desarrollo de productos quimioluminiscentes para aplicaciones de diagnstico clnico; as, la QL es hoy en da un posible sustituto del marcado isotpico, remplazando as el uso de radioistopos [l ]. La QL se aplica tambin en el control de calidad de productos crnicos y residuos, existiendo igualmente aplicaciones en la medida del ozono ambiental. Siguiendo la tendencia general en anlisis qumico, la mejora en los mtodos de deteccin est dirigida actualmente a la miniaturizacin y, por lo tanto, a reducir el gasto de disolventes orgnicos en mtodos de separacin, empleando ms sistemas acuosos y volmenes de muestra menores con concentraciones inferiores. Como las tcnicas quimioluminiscentes pueden proporcionar mejoras en estas situaciones, la instrumentacin para medidas quimioluminiscentes y el desarrollo de acoplamientos con interfaces selectivas fsicas o qumicas que permitan medidas selectivas estn tambin dirigidos a conseguir este fin, de modo que puedan eliminarse las desventajas de las tcnicas basadas en medidas directas de QL (como falta de selectividad o dependencia de factores fsicoqumicos). As, se estn publicando progresivamente avances especficos en cromatografa, EC, inmunoensayo y en el uso de reactores enzimticos. Desde este punto de vista, los sistemas miniaturizados (microchip) son muy atractivos, ya que puede resolver el problema de los lmites de deteccin poco satisfactorios caractersticos de estos sistemas [li]. Asimismo, el problema del gasto de disolvente est potenciando gradualmente el uso de sistemas analticos de separacin miniaturizados, tales como la cromatografa lquida capilar y de columnas de pequeo dimetro (narrow-bore) frente a la CLAR, cromatografa en capa fina de alta resolucin miniaturizada, y recientemente EC. Debido a que la QL puede resolver las limitaciones en la deteccin en estos casos, resulta previsible el desarrollo de este acoplamiento en la prxima dcada. Como ejemplo, puede mencionarse un sistema descrito recientemente, basado en deteccin quimioluminiscente de enzimas y que emplea la tcnica denominada microensayo a travs de electroforesis (EMMA, electrophoretically mediated microassay), que permite la deteccin de enzimas a niveles de zeptomoles, tanto en capilares abiertos como en canales realizados en microchips, detectndose la oxidasa y catalasa a niveles de 9000 molculas y empleando una instrumentacin relativamente econmica. Sin ninguna duda, cuando se compara con otros mtodos de deteccin convencionales y sensibles (fluorescentes o electroqumicos), la deteccin QL es una tcnica en pleno desarrollo y sus avances se dirigen hacia el desarrollo de nuevos detectores ms simples que los ya existentes y que ofrezcan la posibilidad de determinar varias clases de analitos a niveles traza. BIBLIOGRAFA i Garca-Campaa, A.M., Baeyens, W.R.G., Chemiluminescence in Analytical Chemistry. New York: Marcel Dekker, 2001. ii Baeyens, W.R.G., Garca-Campaa, A.M., Analusis 2000; 28: 686-698.

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