Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular

Universidad Ricardo Palma

Biologa Celular y Molecular Gua de Prcticas

Lima Per

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UNIVERSIDAD RICARDO PALMA

FAMURP

Dr. Elio Ivn Rodrguez Chvez

Rector

Dr. Manuel Huamn Guerrero

Decano de la Facultad de Medicina Humana

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Instrucciones Generales
El estudiante ingresar al laboratorio vistiendo el mandil blanco manga larga (largo). Y a la hora indicada en la Gua de Matricula. Esta prohibido Fumar, Comer y Beber dentro del laboratorio. Todo material biolgico ser manipulado con guantes y segn lo requiera la prctica se utilizara mascarilla. Est prohibido pipetear con la boca las soluciones qumicas. Los alumnos participarn activamente durante el desarrollo de cada prctica como parte de su evaluacin. Antes de iniciar la practica correspondiente el alumno rendir un test para verificar que posea los conocimientos bsicos introductorios y conozca: Conceptos tericos bsicos para esa practica Los objetivos de cada prctica. El material y equipo de laboratorio necesario para la realizacin de dicha prctica.

Material de uso permanente (obligatorio)

El material obligatorio y de uso permanente para cada practica constar de lo siguiente: Material indicado en la gua de prctica. Laminas porta objetos: una caja por mesa de trabajo. Laminas cubreobjetos: una caja por mesa de trabajo. Guantes descartables: dos pares por alumno. Mandil blanco largo (manga larga). Gua de prctica y colores.

Presentacin de resultados
Los resultados sern presentados al finalizar la prctica en el formato respectivo. Toda la gua de prctica ser presentada al finalizar el semestre acadmico.

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CRONOGRAMA DE PRACTICAS 2013 I

SEMANA 18/03 al 22/03 25/03 al 29/03 01/04 al 05/04 08/04 al 12/04 15/04 al 19/04 22/04 al 26/04 29/04 al 03/05 06/05 al 10/05 13/05 al 17/05 20/05 al 24/05 27/05 al 31/05 03/06 al 07/06 10/06 al 14/06 17/06 al 21/06 24/06 al 28/06 01/07 al 05/07

TITULO DE LA PRACTICA Reconocimiento de materiales y equipos de laboratorio Microscopa Niveles de organizacin de los seres vivos Medicin de poblaciones celulares Interaccin de sistemas autopoyeticos eucariotas multicelulares y procariotes. Organizacin celular: Clulas Procariotas y Eucariotas Receptores de Membrana: Antgenos sanguneos EXAMEN PRACIAL Permeabilidad de la Membrana Celular Identificacin de Citoesqueleto y Organelas celulares Cromatina Sexual: Cuerpo de Barr Identificacin del Ncleo Interfsico Divisin Celular Extraccin de ADN y Tcnicas en Biologa Celular y Molecular Gametognesis EXAMEN FINAL

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PRACTICA N 8
PERMEABILIDAD DE MEMBRANA CELULAR I) INTRODUCCIN: La bicapa lipdica de las membranas celulares es permeable a molculas pequeas no polares como el oxigeno y el dixido de carbono y a molculas polares muy pequeas como las molculas del agua. La bicapa lipdica es sumamente impermeable a la mayora de las molculas hidrosolubles de gran tamao y a todos los iones. La transferencia de nutrientes, metabolitos e iones a travs de la membrana plasmtica y las membranas internas de las clulas depende de protenas de transporte de membrana. Las membranas celulares contienen una diversidad de protenas de transporte y cada una de ellas es responsable de la transferencia de un tipo particular de soluto a travs de la membrana. Existen dos clases de protenas de transporte de membrana, a saber, protenas transportadoras y protenas de canal.

Son las protenas de transporte especficas (protenas transportadoras carriers y las protenas de canal) las responsables del trnsito selectivo de las molculas pequeas a travs de la membrana permitiendo a la clula controlar la composicin del citoplasma. El agua se mueve con facilidad a travs de una membrana semipermeable de una regin con menor concentracin de solutos a una regin con mayor concentracin de solutos. Este proceso se denomina osmosis. Las membranas semipermeables permiten pasar el agua, molculas pequeas y los iones hidratados. No obstante bloquean el pasaje de las enzimas y protenas sintetizadas dentro de la clula. La diferencia en las concentraciones de soluto dentro y fuera de una clula da origen a la presin osmtica y el agua ingresa en la solucin ms concentrada en el interior de la clula, transportando nutrientes moleculares pequeos con ella. La osmosis es de gran significado prctico, en los pacientes que se deshidratan por enfermedades a menudo requieren de agua y nutrientes por va intravenosa, esta solucin debe tener la misma concentracin global de soluto que la sangre del paciente: debe ser isotnica. Si se usara agua pura, el interior de los eritrocitos tendra mayor concentracin de soluto (menor concentracin 5

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de agua) y entrara el agua a la clula. Esta solucin se denomina hipotnica, ocasionara que la membrana de los eritrocitos sobrepasen el lmite de turgencia y exploten (experimentarn lisis). La situacin opuesta, la hipertonicidad, ocurre cuando la solucin intravenosa est ms concentrada que el contenido del eritrocito. En este caso la clula perdera agua y se encogera (crenacin) El tiempo de Hemlisis: Se usa para medir la velocidad de penetracin de sustancias en los eritrocitos. Se expresa por la aparicin brusca de una solucin roja transparente, en lugar de la suspensin turbina de los glbulos rojos. En la prctica, se colocaran glbulos rojos en soluciones hipertnicas como etilenglicol. Al principio el agua abandona la clula y aparece crenacin; pero con el tiempo van entrando las molculas de etilenglicol. Estas aumentan la cantidad de molculas osmticamente activas en las clulas y se absorbe una cantidad correspondiente de agua. La membrana plasmtica slo puede extenderse hasta cierto punto sin que se modifiquen sus propiedades, si sobrepasamos este lmite, los eritrocitos se hemolizan, es decir, empiezan a hincharse rebasando el lmite de turgencia de manera que la estructura molecular de la membrana queda alterada permitiendo la salida al espacio extracelular de la hemoglobina. Como la clula vaci todo su contenido se le llama "eritrocito fantasma", casi todo lo que se conoce sobre transporte de membrana se ha hecho utilizando el modelo del "eritrocito fantasma".

Reaccin hiposmtica de la membrana plasmtica: Cuando una clula se expone a condiciones hiposmticas, el agua ingresa al interior en un intento de llegar al equilibrio osmtico. El espermatozoide humano, necesita de ciertos cambios morfofisiolgicos para poder adquirir capacidad frtil. Estos cambios se inician cuando el espermatozoide ha reacomodado sus protenas de membrana que le confieren integridad a la membrana espermtica. La integridad de la membrana espermtica es importante para el metabolismo de los espermatozoides y adems sirve para propiciar la interaccin espermatozoide-ovocito. Cuando el espermatozoide es expuesto a condiciones hiposmticas, el influjo de agua aumentar el volumen, que se expresar en una hinchazn de la membrana espermtica. Esta hinchazn se aprecia, generalmente, en el extremo de la cola del espermatozoide que es la zona ms sensible al shock hiposmtico. Esta reaccin de la membrana celular, es un signo de que el transporte del agua a travs de la membrana est ocurriendo normalmente, lo cual es un indicador de la integridad de la membrana y de su actividad fisiolgica normal. En pruebas de infertilidad masculina, se considera una muestra como normal cuando el porcentaje de colas de espermatozoide hinchadas es mayor del 60%. II) OBJETIVOS Medir el tiempo de penetracin de diversas sustancias observando la hemlisis de glbulos rojos humanos. Evaluar la madurez de la membrana espermtica, mediante el test de reaccin hiposmtica.

Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular III) MATERIALES El laboratorio proporciona: 1. Incubadora 2. Microscopio compuesto de campo claro 3. Serie de alcoholes 4. Medio hiposmtico NaCl 0.065 M 5. Agua destilada 6. Cloruro de Sodio 0.9 % 7. Jeringa 8. Algodn. 9. Alcohol 10. Pipetas 11. Propipetas 12. Pipetas pasteur 13. Tubos de ensayo 14. Gradillas 15. Papel parafilm 16. Papel lente.

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Los alumnos deben traer: Por grupo de practica: 1. Muestra de Semen humano: la muestra deber ser tomada el da de la prctica, deber ser recolectada en un frasco estril (frasco para orina de venta en farmacias). Por mesa de trabajo: 01 Muestra de sangre humana Material Indispensable u Obligatorio 02 Instrumentos para medir tiempo de hemlisis. (mesa que no presenta el instrumento antes de iniciar la practica ser retirada del laboratorio. El instrumento para medir el tiempo de hemolisis: se construye de la siguiente manera: * En un pedazo de cartulina, se corta una ventana rectangular de 2.5 cm. x 5cm. * Se extiende una hebra de hilo negro de manera que atraviese la ventana por el centro del eje mayor. * Se cubre la ventana con el papel cebolla.

Cartulina Papel cebolla Hilo negro

Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular IV) PROCEDIMIENTO:

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Medicin relativa de la velocidad de penetracin de una serie de alcoholes en eritrocitos humanos. Se usar la siguiente serie de alcoholes: metanol, etanol, etileno-glicol, n-propanol y glicerol. Como controles se usar: agua y una solucin de NaCl 0.9% . La velocidad relativa de penetracin de cada alcohol, se medir en funcin al "tiempo requerido para la hemlisis", definido como el tiempo total desde la adicin de la sangre hasta que el hilo negro del aparato de hemlisis se hace visible. * * Coloque el aparato detrs del tubo de ensayo y se coloca a contra luz de forma que, la ventana quede completamente iluminada. Realizar este procedimiento con cada uno de los tubos (uno por uno), hasta poder observar con claridad el hilo negro a travs del tubo de ensayo.

Trabaje en pareja y pruebe una solucin cada vez, procediendo de la siguiente manera: 1. Colocar 3 ml de cada solucin en un tubo de ensayo (utilizar un total de 7 tubos) 2. Adicione 2 gotas de sangre en el tubo, coloque papel parafilm y homogenice despacio (no agitar) inmediatamente lleve el tubo al aparato de hemlisis y tomar el tiempo. Repetir para cada solucin. y registre en la tabla el tiempo requerido para hemlisis 3. Repita el procedimiento para cada una de las otras sustancias y anote los tiempos Respuesta de la membrana plasmtica el espermatozoide ante un shock hiposmtico. 1. 2. 3. Coloque en un tubo de cultivo: 1 gota de semen o de suspensin espermtica en 9 gotas de una solucin hiposmtica. Se incuba a 36 C por 45 minutos. Despus del tiempo de incubacin, se coloca una gota pequea en un portaobjetos, se cubre con una laminilla y se observa a 40X.

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Representacin esquemtica de un espermatozoide sin respuesta (A) y con respuesta hiposmtica (B). V) CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4.Explique porque las diversas sustancias tiene velocidades relativas diferentes de ingreso a la clula. Averige si la glucosa ingresa ms rpido o tarda mucho ms que el etileno glicol. Por qu la reaccin hiposmtica es una prueba importante en la evaluacin de la calidad del semen humano. Que efectos en el organismo produce el exceso de Metanol y Etanol.

VI) REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Jeyendran RS, Van der Ven HH, Prez-Prez M, Grabo BG, & Zaneveld IJD. 1984: Development of an assay to asses the funtional integrity of thehuman spem membrane and its relationship to other semen characteristics. J. Reprod. Fet. 70: 219-228. Bruce Alberts, Dennis Bray 2006. Introduccin a la Biologa Celular. 2da Edicin. Editorial Medica Panamericana.

Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular Hoja de Resultados SUSTANCIAS AGUA DESTILADA NaCl 0.9 % METANOL 0.8 M ETANOL 0.8 M ETILENO GLICOL 0.8M n-PROPANOL 0.8 M GLICEROL 0.8 M TIEMPO (seg.) HEMOLISIS

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OBSERVACIONES

Muestra: . Solucin: Estructuras:

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PRACTICA N 9
IDENTIFICACION DE CITOESQUELETO Y ORGANELAS CELULARES I) Identificacin de citoesqueleto: El citoesqueleto de las clulas eucariticas est formado por filamentos de actina, filamentos intermedios y microtbulos. Estas estructuras definen la forma de las clulas. Funciones del citoesqueleto: Estabilidad y forma celular. Movimiento celular. Divisin celular. Movimiento de orgnulos internos Microtbulos: los microtbulos forman husos mitticos, rayos astrales de clulas en divisin, elementos longitudinales de los axones y de los flagelos. La tubulina es la principal protena. Ciertas drogas interfieren en la polarizacin y despolarizacin, alcaloides como la colchicina, vinca (esta ltima se utiliza como drogas antimitticas en el tratamiento antitumoral. Microfilamentos: la actina es la protena ms abundante en las clulas de los mamferos. Los filamentos de actina son esenciales para posibilitar los movimientos celulares, para determinar la dinmica de la forma celular, para la adhesividad entre las clulas o entre clulas y matrices, y en mltiples niveles para la organizacin de la superficie celular. Filamentos intermedios: le dan a la celula un soporte puramente mecanico. Son estructuras fuertes, estables, insolubles, resistentes a los cambios de temperatura y dispuestas en densas redes tridimendionales en el citoplasma que se relacionan y forman parte de la uniones intercelulares. El movimiento intracelular, como por ejemplo: ciclosis realizado en las plantas, depende del ordenamiento de los filamentos de que a manera de rieles de un tren permiten que circulen organelas como los cloroplastos. Las estructuras especializadas por los microtbulos, son los centrolos, los cilios y los flagelos y el huso mittico. Los flagelos y cilios son estructuras piliformes ancladas por uno de sus extremos y capaces de ejecutar diversos movimientos con su extremo libre. Gracias a sus movimientos coordinados, desempean un importante papel en la locomocin. Los cilios pueden ser encontrados en tejido epitelial y los flagelos en los espermatozoides. Dentro de los protozoarios tenemos el Paramecium, Balantidum, que presentan cilios y los tripanosomas, la Euglena, etc. que poseen flagelos. II) Identificacin de organelas: Las clulas eucariticas se caracterizan por tener un subsistema o nivel de organizacin de organelas, en estos orgnulos tienen lugar actividades celulares especficas; las organelas se caracterizan por presentar una membrana que separa el compartimiento interno de la organela del entorno citoplasmtico. La enorme superficie de membranas internas proporciona a las clulas no solamente un soporte para la localizacin ordenada de multiples sistemas enzimticos diferentes, sino que les provee de subcompartimentos funcionales cerrados que constituyen los diferentes organoides

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membranosos especializados, cada uno de ellos con estructura, dotacin enzimtica y propiedades funcionales que lo caracterizan. Numerosos compartimentos rodeados de membrana son responsables de funciones celulares vitales, entre las cuales se encuentran la separacin y asociacin de sistemas enzimticos, la digestin intracelular de sustancias, la distribucin de cada una de las miles de protenas diferentes de la clula hacia sus destinos finales. El mayor sistema de membranas corresponde al retculo endosplasmtico (RE), de donde se originan la mayora de las organelas celulares, como el aparato de Golgi y los lisosomas. Algunas vesculas provenientes del RE o del Aparato de Golgi, forman orgnulos limitados por membranas llamados lisosomas, que contienen hidrolasas cidas (enzimas que degradan polmeros en sus unidades monomricas). Los lisosomas varan en cuanto a su tamao y forma y en una clula pueden encontrarse en grandes cantidades. Los lisosomas intervienen en la digestin celular unindose a las vesculas endocticas o fagocticas constituyendo lisosomas secundarios o fagolisosomas. Las clulas eucariticas poseen organelas que traducen la energa y reciben el nombre de mitocondrias y cloroplastos. Estas organelas se caracterizan por tener doble membrana que separa su compartimiento interno o matriz del medio citoplasmtico. En la membrana interna de ambas organelas se encuentra una serie de protenas que define en conjunto la llamada cadena transportadora de electrones, as como presentan una estructura denominada complejo F1, F0, a travs del cual y por quimiosmosis se va a formar el ATP. Tanto los lisosomas como las mitocondrias no pueden ser observados directamente al microscopio ptico, es necesario para ello, utilizar colorantes en concentraciones muy diluidas, de tal manera que no presenten toxicidad a las clulas. Actualmente existen muchas evidencias de que el rojo neutro en concentraciones no txicas es tomado por la clula y se concentra en el sistema lisosomal. Las mitocondrias pueden ser observadas en clulas vivas mediante coloracin con una solucin de verde de Janus muy diluida con la cual toman un color azul - verdoso. Esta coloracin se debe al sistema citocromo - oxidasa, esta es una hemoprotena con amplia distribucin en muchos tejidos, constituye el componente terminal de la cadena de acarreadores respiratorios presente en la mitocondria, por tanto, es el componente responsable de la reaccin por la cual los electrones resultantes de la oxidacin de las molculas del sustrato, catalizada por las deshidrogenasa, se transfiere al aceptor final, oxigeno. En cambio en el citoplasma el colorante es reducido a su leucobase. La presencia de pigmentos fotosntticos en el cloroplasto, hace posible observarlos sin necesidad de utilizar colorantes. II) OBJETIVOS Al finalizar la prctica el alumno ser capaz de: Identificar los movimientos dependientes de microflamentos y de microtubulos. Describir el movimiento de cilios y flagelos Explicar las funciones de cilios y flagelos. Reconocer lisosomas y mitocondrias e preparaciones frescas. Utilizar los colorantes adecuados para cada organela. III) MATERIAL Por grupo de practica: 1. Muestra de semen: (ver procedimiento de la practica 8) 12

Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular 2. Hojas de Elodea (planta acutica)

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Por mesa de trabajo: 1. Material indispensable 2. Agua estancada en frasco oscuro (recolectaela con 4 das de anticipacin y aadirle pocas hojuelas de avena). 3. Hisopos (3 unid.) El laboratorio proporcionara: 1. Suero fisiolgico (en goteros) 2. Solucin de cristal de violeta 3. Solucin de rojo neutro (1/20000) 4. Solucin de verde de Janus (1/10000) 5. Pipetas pasteur 6. Pipetas rotuladas 7. Tubos de ensayo 8. Gradilla 9. Papel lente. 10. Incubadora III) PROCEDIMIENTO CITOESQUELETO: a) 1. 2. 3. 4.Observacin de cilios en Paramecium. Coloque una gota de Agua estancada sobre un porta objeto y cubran una laminilla. Observe con el objetivo de menor aumento. Ajuste el diafragma para incrementar el contraste. Observe el movimiento de los cilios en el Paramecium.

b) 1. 2. 3. 4. 5.

Observacin de flagelos Diluya el semen humano con suero fisiolgico, mezclando una gota de semen y tres de suero. Coloque una gota de la dilucin anterior en el portaobjeto y cubra con una laminilla. Observe al microscopio a 10 y 40 la forma y el movimiento de los espermatozoides. Regule la entrada de luz, para mejorar el contraste. Despus de observar esta preparacin coloque una gota del colorante cristal violeta en el tubo de ensayo donde se realiz la dilucin. 13

Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular 6.

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Tome una muestra con la pipeta pasteur y colquelo en un portaobjeto cubra con la laminilla y observe nuevamente.

c) 1. 2. 3.-

Observacin de cloroplastos y movimiento de ciclosis Coloque una hoja del Elodea sobre el cubreobjeto, aadas una gota de agua y cbralo con una laminilla. Observe al microscopio a 10 y 40 . Describa la forma como se mueven los cloroplastos

Observacin de Cloroplastos
Elodea sp.

ORGANELAS: a) Observacin de lisosomas en protozoarios 1. Revisar la muestra de agua estancada para determinar la presencia de Paramecium. 2. Si se observa Paramecium en la muestra se proceder a incubar 1 ml. de la muestra de agua estancada con 1 ml de la solucin rojo neutro a 37 C por 15 minutos. 3. Coloque una gota de la incubacin en el portaobjeto, coloque la laminilla y observe a 10 y 40.

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Observacin de Lisosomas

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b) 1. 2. 3. 4. 5.

Observacin de mitocondrias en epitelio bucal Obtenga una muestra de clulas de epitelio bucal mediante un raspado suave utilizando un hisopo largo. Realice el frotis extendiendo la muestra sobre una lmina portaobjetos, deje secar a medio ambiente. Agregar unas gotas de colorante verde de Janus hasta cubrir la muestra por 10 minutos. lavar con agua corriente y deje secar al medio ambiente. Observe a 10 x y 40x.

V .- Cuestionario: 1.- Cules son los componentes del citoesqueleto? 2. Qu funcin tiene el flagelo en el movimiento de los espermatozoides? 3. De ejemplos de clulas humanas que presentan cilios y flagelos. En que tipo de tejidos se localizan y cual es la funcin que tienen este tipo de clulas? 4. Que funcin cumple los filamentos de actina en el tejido muscular? 5. En que parte de la mitocondria se localiza la citocromo oxidasa? 6. Describa la funcin que realizan los lisosomas. 7. Escriba la importancia de la mitocondria. 8.- Por que reacciona la mitocondria con el verde de Janus? 9.- Si hiciramos una tincin posterior para fosfatasa acida, veramos que los grnulos son lisosomas . Porque? VI) REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Smith C.A. y Wood E.J., 1997: Biologa Celular Ed. Addison - Wesley Iberoamericana Fred H.E, 1990: Biologa. Edit. Mc Graw Hill. Smith C.A. y Wood E.J., 1997: Biologa Celular Ed. Addison - Wesley Iberoamericana . Cooper G. 2002. La Clula. Ed. Marban Libros.

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Hoja de Resultados CITOESQUELETO: parte b. Muestra: ....................... Clula que observa: . Colorante: ... Estructuras: ...

ORGANELAS parte a: Muestra: . Micoorganismo: ... Organela: .. Colorante: .

ORGANELAS parte b: Muestra: . Clula que observa .. Colorante: .. Reaccin que evidencia la presencia de mitocondrias: ....

.. VB Dra. Chambers

Fecha: .

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PRACTICA N 10
CROMATINA SEXUAL Introduccin: Murray Llewellyn Barr (Junio 20, 1908 Mayo 4, 1995) un Mdico Canadiense y un investigador en Medicina, descubri en 1948 una importante estructura celular a la que se denomin Cuerpo de Barr. Corpsculos o cuerpos de Barr: es una masa condensada de cromatina sexual ubicada en el ncleo de las clulas somticas de las hembras debido a un cromosoma X inactivo. El fenmeno de inactivacin del cromosoma X es un ejemplo del papel de la heterocromatina en la expresin gnica. En muchos animales, incluyendo los humanos, las hembras tienen dos cromosomas X y los machos tiene un cromosoma X y un cromosoma Y. El cromosoma X posee miles de genes que no estn presentes en el pequeo cromosoma Y, de este modo las hembras tienen el doble de genes localizados en el cromosoma X que los machos. A pesar de estas diferencias, las clulas de las hembras y de los machos tienen una misma cantidad de protena codificadas por los genes del cromosoma X. Esto es debido a un mecanismo de compensacin de dosis en el que uno de los cromosomas X de las clulas de las hembras se inactiva en etapas tempranas de desarrollo, transformndose en heterocromatina. Las clulas que se reproducen mitticamente de esas clulas embrionarias tienen el mismo cromosoma inactivado. Esta heterocromatica, se puede observar como una masa plano convexo, con un tamao de 0.7 * 1.2 micras. El corpsculo de Barr solamente se encuentra en las clulas de la mujer y nunca en las del hombre, en condiciones normales. Segn la hiptesis de Lyon (propuesto por Mary Lyon en 1966), uno de los dos cromosomas X en cada clula somtica femenina es genticamente inactivo. A esta observacin sigui el desarrollo de una tcnica sencilla que permita detectar cuerpos de Barr en clulas de mucosa oral.

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Como resultado de su aplicacin se reconoci que las clulas femeninas eran croma tina positiva mientras que las masculinas eran cromatina negativa, pero que existan excepciones: Las pacientes con sndrome de Turner no tienen cuerpos de Barr. Esta una enfermedad gentica y, a su vez, una enfermedad rara caracterizada por una alteracin en el cromosoma X o ausencia del segundo cromosoma X en algunas o en todas las clulas de su cuerpo, expresndose en la falta de desarrollo de los caracteres sexuales primarios y secundarios. Esto confiere a las mujeres que padecen el sndrome de Turner un aspecto infantil e infertilidad de por vida. Su incidencia es de alrededor de 1/2.500 nias. Los pacientes con sndrome de Klinefelter o sndrome 47XXY si presentan cuerpos de Barr, es una condicin que se presenta en los hombres como resultado de la presencia de un cromosoma X extra y cuyo sntoma ms comn es la infertilidad. Estos hallazgos tambin demostraron que en presencia de un cromosoma Y, independientemente del nmero de cromosomas X, el embrin humano se desarrolla como macho, mientras que en ausencia del Y se desarrolla como hembra. Objetivos: Al trmino de la prctica el alumno sabr verificar el sexo en forma gentica de un individuo, mediante la deteccin de los cuerpos de Barr en clulas epiteliales de la cavidad bucal.

Materiales: La mesa de trabajo deber traer: 04 Bajalenguas Material obligatorio (por alumno) El laboratorio brindar: Acetorceina Microscopios Aceite de inmersin

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Procedimiento: Cada alumno proceder de la siguiente manera: 1. Por separado el hombre y la mujer se enjuagan la boca con agua varias veces. 2. Se obtienen clulas epiteliales del interior de la mucosa oral, raspando suavemente la parte interna de la mejilla con un bajalenguas. 3. Descartar esta primera muestra. 4. Tomar la segunda muestra la cual se va a colocar en un portaobjetos limpio y seco, haciendo un frotis o extendido sobre el mismo portaobjetos, deja secar la muestra al medio ambiente por unos minutos. 6. Una vez seca la muestra, se le agrega una gota de acetorceina. Cubre con el cubreobjetos y espera aproximadamente 10 minutos. 7. Observar con el objetivo de 40, localizando las clulas epiteliales y posteriormente con el objetivo de 100, procura que se coloque una gota de aceite de inmersin sobre el cubreobjetos, entre la preparacin y el objetivo de 100. 8. Localiza los ncleos de las clulas y observa cuidadosamente. Los cuerpos de Barr son corpsculos pequeos que se localizan muy prximos a la cara interna de la membrana nuclear. 10. Dibuja los resultados obtenidos de las muestras comparativas de hombre y mujer. Cuestionario: 1.- Que otros Sndromes hay relacionados al cromosoma X? explique cada uno de ellos. 2.- En que otras clulas podemos encontrar Corpsculos de Barr. 3.- Que es la heterocromatina?

Hoja de resultados Muestra: . Colorante: Estructura que seala el puntero: ..

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PRACTICA N 11
NCLEO INTERFASICO I) INTRODUCCIN:

El ncleo es el compartimiento de las clulas eucariticas donde se encuentran las molculas biolgicas portadoras de la informacin gentica: ADN y ARN, asociadas con protenas. El ADN asociado a protenas determina la asociacin supramolecular conocida como CROMATINA. Cuando el ARN se asocia con protenas forma el NUCLOLO, que tambin esta integrado por el ADN nucleolar. Esta delimitado por la envoltura nuclear, compuesta por dos membranas concntricas: una interna, que se halla sostenida por la lamina nuclear y otra externa que se continua con la membrana del retculo endoplasmatico. La envoltura nuclear contiene poros, los cuales son un conjunto de protenas que forman una estructura llamada complejo poror, a travs de los cuales se realiza el intercambio de sustancias ncleo-citoplasma. Los motivos por los cuales las molculas de ADN han sido confinadas en un compartimento aislndolas de los componentes citoplasmticos serian: 1. Proteger al ADN de posibles colisiones generadas durante los desplazamientos de las protenas motoras asociadas a los microtubulos y a los filamentos de actina, esenciales para transportar a los elementos citoplasmticos. 2. Poder completar el procesamiento de los ARNm antes que se inicie la sntesis proteica, ya que esta debe producirse a partir de ARNm plenamente formados. Durante su ciclo vital, el ncleo sufre cambios morfofisiolgicos muy importantes que permiten mantener la estabilidad celular (ncleo interfsico) por un lado y tambin originar otras clulas (ncleo en divisin). La forma del ncleo interfsico determina la forma de la clula, las clulas cbicas tiene un ncleo redondo, las clulas alargadas tiene un ncleo ovalado, las clulas aplanadas tiene un ncleo plano. Sin embargo existen una variedad de formas de ncleo en clulas altamente especializadas. Utilizando como ejemplos los glbulos blancos del tejido sanguneo y mediante la coloracin con Wright o Giemsa, Ud, podr reconocer los diferentes ncleos que caracterizan a cada glbulo blanco. Un glbulo blanco algunos presentan granulaciones en el citoplasma y un ncleo a veces lobulado estos son de forma variable, debido a su migracin en todos los tejidos entran y salen de los capilares por los movimientos amiboideos y ante grmenes o sus toxinas presentan un quimiotaxismo positivo, es decir, son atrados hacia ellos por las sustancias que difunden en el medio. Este fenmeno es conocido con el nombre de fagocitosis, o sea la propiedad de absorber y digerir a los grmenes. Los leucocitos polimorfonucleares presentan ncleo lobulado y citoplasma granuloso, tenemos: Neutrfilos: ncleo lobulado y su citoplasma se tie con colorantes neutros. Son fagocitos y se forman en la mdula sea. Eosinfilos: Grnulos del citoplasma mas grandes y se tienen con colorantes cidos. Basfilos: presentan grnulos que se tien con colorantes bsicos.

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II) OBJETIVOS: * Reconocer las diferentes formas de ncleos y su ubicacin en las clulas sanguneas. * Diferenciar los tipos de ncleos en diferentes tejidos. Aplicar tcnicas para su coloracin e identificacin. III) MATERIAL El alumno deber traer: 1. Material indispensable. El laboratorio contar con: 1. Microscopio compuesto de campo claro 2. Colorante WRIGHT 3. Agua destilada 4. Lancetas 5. Algodn 6. Alcohol 7. Aceite de inmersin 8. Papel lente 9. Lminas patrn. IV) PROCEDIMIENTO 1. 2. Con ayuda de una lanceta desechable, realice una puncin del pulpejo del dedo anular de la mano izquierda, previa desinfeccin con algodn y alcohol. Tome una gota de sangre y haga un frotis fino sobre el portaobjeto como indica el siguiente dibujo:

3. 4. 5. 6. 6. 9. 10.

Colocar el frotis extendido ya seco, sobre una base plana en posicin totalmente horizontal. Agregar el colorante Wright hasta cubrir la lmina portaobjetos, inmediatamente agregar sobre el colorante 5 gotas de agua destilada y homogenizar soplando suavemente de arriba hacia abajo hasta que se forme una capa plateada. Dejar reposar la mezcla por 10 minutos. Lave con agua corriente y dejar secar al medio ambiente, si es posible con la lamina en forma vertical. Observe al microscopio con el objetivo de 10x, luego agregar una gota de aceite De inmersin utilice el objetivo de 100x para la observacin de las clulas y ncleos. Diferencie las diferentes formas de ncleo en los neutrofilos, basofilos, eosinofilos, monocitos y linfocitos. Dibuje cada forma de ncleo. 21

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V) CUESTIONARIO 1.2.3.4.Explique la relacin existente entre estructura y funcin nuclear. Determina cual son los valores normales en la formula leucocitaria en porcentaje. Explique con un ejemplo, lo que ocurre al incrementarse o disminuir el porcentaje de los diferentes leucocitos en la formula leucocitaria. Que es la anemia?

VI) REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Berkaloff, A,., Boruguet, J., Lacroix, J.C. 1980. Biologa y Fisiologa Celular. Vol II Ed. Omega S.A. Barcelona 256 Bregman, A. A. 1983. Laboratory Investigations in Cell Biology. Ed. John Wiley & Sons. New York, 253 pag.

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Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular Hoja de Resultados

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Muestra: Sangre Colorante: Wrigth Tcnica utilizada para obtener la muestra: Puncin de la yema del dedo Clula que observa:

Glbulo Rojo y Plaquetas

Basfilos

Neutrfilos

Eosinfilos

Linfocitos

Monocitos

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PRACTICA N 12
CICLO CELULAR I) INTRODUCCIN: Las clulas nuevas solo se originan de otras clulas vivas. Este proceso se llama Divisin Celular. Un tipo de divisin celular es la mitosis que conduce a la produccin de clulas con caractersticas genticas idnticas a las de su antecesora, mientras que en la meiosis se producen clulas con la mitad del contenido gentico de la clula madre. El ciclo celular constituye el proceso bsico de la gnesis de nuevas clulas, y se extiende desde su formacin de una clula, por divisin de la clula madre, hasta su propia divisin en dos clulas hijas. Esta unidad de tiempo represente EL CICLO DE VIDA DE UNA CLULA EN PROLIFERACION y constituye una unidad de repeticin en todo proceso de reproduccin o proliferacin celular. El ciclo celular puede dividirse en dos fases principales: La fase M y la Interfase. La Fase M: es el periodo en el que el contenido de la clula se divide, esta fase incluye: El proceso de mitosis, durante el cual los cromosomas duplicados se separan en dos ncleos. La citocinesis, en la que toda la clula se divide en dos clulas hijas. La interfase: es el periodo entre las divisiones celulares, es un intervalo donde la clula crece, y efecta diversas actividades metablicas. Durante la interfase ocurren muchos preparativos para la mitosis prxima, incluye la replicacin del ADN celular. La interfase cuenta con 03 fases: Fase G1 (gap1) que corresponde al intervalo entre la mitosis y el comienzo de la replicacin del ADN. Durante esta fase la clula es metablicamente activa y est creciendo, pero no se replica su ADN Fase S (sntesis): durante la que se produce la replicacin del ADN. Fase G2: aqu prosigue el crecimiento de la clula y en la que se sintetizan protenas en preparacin para la mitosis. A diferencia de la rpida proliferacin en las clulas embrionarias, algunas clulas del animal adulto cesan por completo su divisin y muchas otras clulas solo se dividen ocasionalmente, cuando es necesario reemplazar la perdida de las clulas debido a la lesin o a la muerte celular. Entre este ltimo tipo de clulas se incluyen a los fibroblastos de la piel, as como a las clulas de muchos rganos internos, como el hgado, el rin y el pulmn. Estas clulas salen de G1 para entrar en un estado de reposo del ciclo denominado G0, en el que permanecen activas metablicamente pero no proliferan a no ser que sean requeridas para ello mediante las seales extracelulares apropiadas. El final de la mitosis da como resultado a dos clulas e incluye la divisin nuclear o cariocinesis y la divisin del citoplasma o citocinesis. Para el estudio del ciclo de divisin celular, se utilizan los ndices del ciclo mittico, interfsico y de fases.

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Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular CICLO CELULAR

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Indice Mittico: est dado por el porcentaje de clulas proliferativas que se encuentran en mitosis. En el caso de las clulas meristemticas de la raz de la cebolla, el criterio para identificarlas de aquellas que han iniciado los primeros estadios de diferenciacin es considerar como meristemticas a las que tienen ncleo con un dimetro superior a la tercera parte del eje mayor de la clula. Indice Interfsico. Es el porcentaje de clulas proliferativas en interfase. Se calcule restando de 100, el ndice mittico. Indice de Fases. Es el porcentaje de clulas mitticas en cada una de sus fases.

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Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular DESCRIPCION DE LA MITOSIS

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Profase: el comienzo de la profase queda determinado por la aparicin de los cromosomas condensados, cada uno de los cuales est constituido por dos cromtidas hermanas. Estas cromtidas se mantiene unidas a travs del centrmero, que es una secuencia de ADN a la que se unen protenas dando lugar al cinetocoro, este es el lugar de anclaje de los microtbulos del huso. AL final de la profase ocurre la rotura de la envoltura nuclear lo que posibilita la interaccin entre el huso y los cromosomas. La fosforilacin de las molculas de la lamina por la cinasa mittica Cdk promueve el desensamblaje de la lamina nuclear que constituye la capa interna de la envoltura nuclear.

Prometafase: Los cromosomas se mueven al ecuador del huso. Metafase: Se caracteriza por la organizacin del huso mittico. Los microtbulos de los polos opuestos del huso se acaban uniendo a los dos cinetocoros de las cromtidas hermanas y el equilibrio de fuerzas que acta sobre los cromosomas hace que estos queden alineados en la placa metafsica en la mitad del huso. Este huso est constituido por microtbulos cinetocricos, que se unen a los cromosomas y por microtbulos polares, que se superponen unos con otros en el centro de la clula. Adems los pequeos microtbulos astrales irradian desde los centrosomas hacia la periferia celular.

Anafase: el paso de la metafase a la anafase se debe a la protelisis de protenas reguladoras mediada por la ubiquitinas, la cual se dispara por la activacin de una ubiquitina ligasa denominada complejo promotor de la anafase. El movimiento de los cromosomas hacia el polo se acompaa de un acortamiento evidente en los microtbulos cromosmicos. Este mecanismo de separacin recibe el nombre de DISYUNCION.

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Telofase: Los cromosomas empiezan a desarrollarse, los nuclolos estn en fase de reorganizacin y la envoltura nuclear se forma paulatinamente alrededor de los cromosomas. Simultneamente se produce la citocinesis (divisin del citoplasma).

En esta prctica se estudiar el ciclo de divisin celular en las clulas meristemticas de la raz de Allium cepa "cebolla". Este sistema es muy adecuado porque la poblacin celular est en equilibrio dinmico y los cromosomas son relativamente grandes, con nmero diploide 2n = 16.

Observacin a 10 de las diferentes fases de la mitosis. Coloracin con hematoxilina eosina. II) OBJETIVOS Al trmino de la prctica los estudiantes sern capaces de: Reconocer las fases de la mitosis. Reconocer las caractersticas del ncleo interfsico en las clulas meristemticas de cebolla. Hallar los ndices interfsico, de fases y mittico en el modelo estudiado

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Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular III) MATERIALES Que debe traer la mesa de trabajo:

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1. Races de bulbo de cebolla. (La cebolla se remojara previamente por 02 das en un recipiente con agua. 2. Material obligatorio. 3. Lpiz con cabeza de borrador. 4. Papel toalla. Que proporciona el laboratorio: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Orceina actica - clorhdrica Mechero de alcohol Placas Petri. Mascarillas. Papel filtro. Microscopio compuesto de campo claro. Fsforos. Papel lente. Lminas patrn.

IV) PROCEDIMIENTOS 1. Desarrollo De Las Races 1.1 Coloque bulbos de cebolla en vasos pequeos con agua, de tal manera que la parte inferior toque el agua, como lo indica el grafico, unas 72 horas antes de la prctica. El agua debe removerse cada 24 horas.

Palitos de madera Agua

1.2. 1.3. 2.

Cubra el frasco con una cartulina negra, con la finalidad de dar oscuridad a las races. Las races que se desarrollan se usarn en la prctica. Preparacin De Las Lminas Para Observar Las Diferentes Fases De La Mitosis. 1. Corte unos 2 mm. de la parte apical de la raz, unas 4 o 5 raicillas y colquelas en una placa petri que contenga Orceina actica. 2. Caliente cuidadosamente el petri en la llama de un mechero hasta 60 C aproximadamente, momento que coincide con la emisin de vapores blancos (la 28

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temperatura puede controlarse pasando el material de vidrio por el dorso de la mano. No debe de permitirse la ebullicin del colorante).

Raicillas con orcena

3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Deje enfriar y repita esta operacin tres veces. Despus del ltimo calentamiento deje enfriar y reposar durante 10 minutos. Coloque una raicilla en una lmina porta objeto y aada una gota de Orceina fra. Cubra la muestra con una laminilla. Coloque un trozo de papel filtro sobre la laminilla y con el borrador de un lpiz golpee el material describiendo crculos concntricos para permitir la extensin del tejido meristemtico. Este aplastamiento se denomina "squash". Observe la preparacin a menor y mayor aumento (40). Identifique y haga esquemas de clulas meristematicas en interfase con sus prominentes nuclolos, clulas en profase, metafase, anafase.

V) CUESTIONARIO 1. Qu es una poblacin celular en equilibrio dinmico? 2. Por qu los cromosomas no son visibles durante la interfase? 3. En qu etapa de la mitosis los cromosomas se observan con mayor facilidad? Porqu?. 4. Del ndice mittico, qu fase observo en mayor frecuencia? Hay alguna relacin con el tiempo de duracin de cada fase y con la hora del da? 5. Cules son las caractersticas de los ncleos interfsicos? VI) REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Smith CA. y Wood EJ. 1997: Biologa Celular Ed. Addison Wesley Iberoamericana. Karp, Gerald 2009: Biologa cellular y molecular. Ed. Mc Graw Hill

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Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular Hoja de Resultados Muestra: Tejido meristemtico de Allium cepa Colorante: Orcena Actica. Fases que observa:

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Interfase

Profase

Metafase

Anafase

Telofase

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Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular Hoja de Resultados

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Muestra: Corte Histologico de Tejido meristemtico de Allium cepa Colorante: Hematoxilina - Eosina Fases que observa:

Interfase

Profase

Metafase

Anafase

Telofase

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PRACTICA No. 13
EXTRACCION DE DNA

I) INTRODUCCION Tcnicas en Biologa Celular y Molecular Se denomina as a todas las tcnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la Ingeniera gentica), amplificar una regin en una enorme cantidad de molculas (clonacin de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una determinada regin con enzimas de restriccin para ver si por una mutacin se gana o se pierde un sitio de restriccin (anlisis de mutaciones por RFLP o Restriction fragment lengt polymorphism), que significa: diferencias en los tamaos de los fragmentos de restriccin debido a polimorfismos en el ADN entre otras. Todas estas tcnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnstico de enfermedades hereditarias, bsqueda de alelos ms o menos frecuentes asociados a una caracterstica que nos interesa seleccionar, diagnstico de contaminacin bacteriana en alimentos (deteccin de Escherichi coli 0157, cepas diferentes de Salmonellas, Mycobacterium sp) diagnstico viral o de infeccin viral (HIV, Hepatitis C, PIF, otros), seleccin de marcadores moleculares para asistir en el mejoramiento gentico de una especie, test de paternidad, diagnstico de identidad forense, etc. La primera tcnica que todas las dems necesitan es la extraccin del ADN, y para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las protenas del medio, detergentes para eliminar las membranas plasmticas y luego ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN protenas y restos celulares. Los cidos nucleicos son macromolculas de suma importancia biolgica. Todos los organismos vivos contienen cidos nucleicos en forma de acido desoxiribonucleico (ADN) y acido ribonucleico (ARN). Algunos virus solo contienen ADN, mientras otros solo poseen ARN. Los cromosomas se componen de ADN y protenas relacionadas, que en conjunto se conocen como cromatina. El empaquetamiento ordenado del ADN eucariota depende de las histonas, un importante grupo de pequeas protenas que poseen un inusual contenido alto de los aminocidos bsicos arginina y lisina. Las histonas se dividen en cinco clases: H1, H2A, H2B, H3, H4. Kornberg postulo que el ADN y las protenas histnicas se organizan en subunidades repetidas denominadas nucleosomas. Ahora se sabe que cada nucleosoma contiene una partcula nuclear de nucleosoma que consiste en 146 pares de bases de ADN superenrrollado envuelto por lo menos dos veces alrededor de un complejo en forma de disco de ocho molculas de histona. El ADN constituye el depsito fundamental de la informacin gentica. Esta informacin es copiada o transcripta en las molculas de ARN, cuyas secuencias de nucletidos contienen el cdigo para las secuencias especficas de aminocidos. Entonces se produce la sntesis de protenas, en un proceso llamado de traduccin del ARN. Esta serie de fenmenos ha recibido el nombre de dogma central de la Biologa Molecular, que puede resumirse de la siguiente manera: 32

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En las clulas superiores el ADN se halla principalmente en el ncleo integrando los cromosomas. Una pequea cantidad se halla en el citoplasma, dentro de las mitocondrias y los cloroplastos. El ARN se localiza tanto en el ncleo donde se forma, como en el citoplasma, donde tiene lugar la sntesis proteica. Toda la vida celular actual almacena su informacin en cdigo de tripletes en molculas de DNA lineales o circulares. Se debe tomar en cuenta la estructura as como la secuencia de nucletidos o de aminocidos y la composicin del producto del gen para evaluar las homologas y la magnitud y el significado de la divergencia evolutiva en los genes y sus productos. La organizacin y secuencia del genoma es capaz de cambiar, ya sea con lentitud en el curso de la evolucin o con rapidez a consecuencia de una trasposicin. Los genes eucariotas que codifican protenas casi siempre son miembros de una familia de multigenes, cuyos elementos evidencian datos de una evolucin originada en un gen ancestral comn. Se cree que el primer paso en este proceso es la duplicacin de un gen, la mayor parte de las veces quiz por el fenmeno de entrecruzamiento desigual. Una vez ocurrida la duplicacin, sera de esperar que la sustitucin de nucletidos modifique a varios miembros en diferentes formas y produzca una familia de secuencias repetidas con estructura similar pero no idntica. II) OBJETIVOS - Examinar un extracto crudo de DNA en clulas hepticas - Interpretar el origen del sistema de Informacin: RNA DNA III) MATERIALES Que debe traer el alumno: 1. Hgado de pollo o res 2.- Material obligatorio 33

Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular Que proporciona el laboratorio. 1. 4 tubos de ensayo en sus gradillas 2. 10 ml de alcohol de 95% helado. 3. Pipetas Pasteur 4. Mortero de porcelana 5. Propipetas 6. Centrfuga 5 600 RPM 7. Microscopio

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IV) PROCEDIMIENTO 1. Cortar Aprox. 10 gr. De hgado en trozos pequeos en una placa petri. 2. Colocar el hgado cortado en trocitos en un mortero y agregarle 10 ml de solucin de lauril sulfato de sodio al 5%. Esta mezcla se debe homogenizar por aprox.1 hora (NO BATIR), al trmino del cual es llevado a centrifugar por 5 minutos a 5300 RPM. 3. Extrae el sobrenadante producto del centrifugado con una pipeta pasteur y colocarlo en un tubo de ensayo. 3. Agrega poco a poco, 3 ml de alcohol al 95% que haya estado refrigerado. Si el procedimiento se realiz como es debido, se habr formado una capa de alcohol encima de la capa de extracto.

IV) CUESTIONARIO 1. Que indica esto con respecto a la estructura de la molcula de ADN? 2. Con que finalidad se le agrega lauryl Sulfato de Sodio? Explique 3. A qu se debe que en este tipo de experimentos los resultados sean casi siempre mezclas en lugar de sustancias puras? 4. Por que nicamente 20 aminocidos estn incluidos en el cdigo gentico cuando muchos otros no estn? 5. Si 30% de las bases de una cadena sencilla de ADN es T, entonces 30% de las bases de las cadenas es A. Cierto o Falso? Por qu? Referencias bibliogrficas: Karp, Gerald. 2008. Biologa Celular y Molecular. Ed. Mc Graw Hill.

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PRACTICA N 14
GAMETOGENESIS I) INTRODUCCIN Una de las caractersticas notables de los sistemas vivientes es la reproduccin, es decir la capacidad de originar nuevos individuos de su misma especie. Todo los los sistemas vivientes , utilizan el mecanismo reproductivo para perpetuar su especie . Se distinguen dos formas generales de reproduccin: Asexual y Sexual Los sistemas vivientes multicelulares, en su nivel de organizacin celular, han desarrollado procesos por los cuales las clulas somticas o germinales originan descendientes a partir de una clula materna. La mitosis, es el proceso reproductivo mediante el cual una clula somtica da origen a dos clulas hijas con caractersticas idnticas a las que la origino. Este proceso a nivel de individuo recibe el nombre de Reproduccin Asexual. La meiosis, otro proceso reproductivo celular origina clulas germinales a partir de una clula somtica. Este mecanismo consiste en que una clula (2n) da lugar a clulas (n) mediante la reduccin del nmero de cromosomas a la mitad, producindose a su vez una recombinacin gnica. En el nivel de organizacin de individuo se denomina Reproduccin Sexual. Gameto gnesis Procesos espacio-temporales multifacticos que ocurren en las gnadas o estructuras reproductivas de los organismos que se reproducen sexualmente , para dar origen a las clulas reproductivas llamadas gametos En los animales y en los humanos, se pueden identificar los siguientes procesos: GONIAS: Mitosis CITOS: Meiosis GAMETOS: Cito diferenciacin.

Cada uno de estos procesos ocurre en etapas diferentes del ciclo biolgico de los organismos vivos. Los procesos gameto gnicos en los mamferos y en la especie humana, se inician y terminan en tiempos diferentes en las hembras y machos.

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ESPERMATOGENESIS La espermatogenesis, proceso que se inicia con la pubertad, es la secuencia de eventos celulares a travs de los cuales las clulas troncales espermatogoniales se transforman en espermatozoides. Tres categoras de clulas estn involucradas en este proceso: Espermatogonias ( mitosis) Espermatocitos (meiosis) Espermatidas (espermiogenesis)

Citologa de las clulas germinales: Espermatogonias y mitosis: Clulas troncales situadas en la periferie de los tubulos seminferos entre las clulas de Sertoli. Producto de las divisiones mitticas puede distinguirse diferentes tipos de espermatogonias: tipo con ncleo muy tenido (Ad), con ncleo difuso (Ap) y tipo B. En el ser humano las clulas palidas de tipo Ason las que representan la reserva no cclica y las oscuras son mitticamente activas. Espermatocitos y meiosis: Espermatocitos primarios se originan de las espermatogonias tipo B. Clulas redondas , grandes con ncleos esfricos y algunos nucleolos que inician la meiosis (profase I : leptoteno, zigoteno, paquiteno, diploteno, diacinesis ). 36

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Espermatidas y espermiogenesis : La metamorfosis de espermatides a espermatozoides constituye el proceso de cito diferenciacin denominado espermiogenesis . Incluye reorganizacin nuclear (histonas por protaminas), formacin del acrosoma, ensamblaje de las estructuras del flagelo y reorganizacin citoplasmtica cuya fase final es la liberacin de los espermatozoides en el lumen de los tubulos seminferos.

FUNCION OVARICA El ovario es la estructura que en los mamferos y en las mujeres , almacena y desarrollan los ovocitos formados durante la vida embrio-fetal o en los primeros momentos del nacimiento. Algunas etapas de las funciones ovricas: 1. Crecimiento folicular y a tresia de los folculos pequeos. 2. Crecimiento de los folculos ovulatorios y su regulacin. 3. Ruptura folicular en el momento de la evolucin. 4. Formacin del cuerpo luteo y las funciones del mismo. Foliculogenesis La foliculogenesis debe medirse desde la formacin de esta unidad estructural y funcional ovrica denominada folculo, hasta el momento que este es ovulado o se transforma en un folculo atresico . Este proceso es continuo. Etapas del desarrollo folicular : Folculo primordial Folculo Primario Folculo Secundario o Antral Folculo Maduro o de Graaf Folculo Primordial

Los folculos primordiales, son los folculos de reserva que estn almacenados en el ovario, los cuales van a ser usados durante la vida de la hembra o de la mujer. Se localizan en la periferie de la corteza del ovario y contienen un ovocito primario. Este esta en la fase inactiva de dictioteno 37

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de la meiosis I. Alrededor del ovocito primario esta una sola capa de clulas epiteliales foliculares planas tambin conocidas como clulas de granulosa, rodeadas por una membrana basal.

Folculo Primario: En la Pubertad la secrecin de la hormona estimulante del folculo (FSH) por la hipfisis estimula la el desarrollo de un pequeo nmero de los folculos primordiales. Se puede observar un incremento de tamao del ovocito, asociado con el aumento de tamao de las clulas de granulosa que lo rodean, convirtindose en clulas cubicas, en esta fase se denomina Folculo Primario Unilaminar. Las clulas de estroma que rodean al folculo se diferencian en la teca Si continua la secrecin de la FSH las clulas de granulosa se dividen recubriendo al ovocito en crecimiento con mltiples capas, aqu se puede observar con mayor claridad la zona pelcida. Este Folculo se conoce con el nombre de Folculo Primario Multilaminar.

Zona pelcida: Cubierta celular de naturaleza glicoproteica que es sintetizada por el ovocito en crecimiento. Bloquea la polispermia. Especfica para cada especie. 38

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Foliculo Secundario : La capa interna de las clulas estromales (la teca interna) aumenta de tamao al desarrollar las clulas un abundante retculo endoplasmtico liso y mitocondrias con crestas tubulares (caracterstica de las clulas productoras de hormonas esteroides); estas clulas comienzan a segregar estrgeno. La capa externa de clulas estromales (la teca externa) se mantiene pequea y compacta y no posee actividad secretora conocida. Aqu aparece una laguna llena de lquido viscoso y rico en acido hialurnico, entre las clulas, este espacio se denomina antro. Folculo Maduro o de Graaf: la hormona luteinizante se encarga de la maduracin final del folculo. El ovocito se sita a un lado separado del lquido folicular por una capa de clulas de granulosa denominada cmulo ooforo. La ovulacin es precedida por una acumulacin importante de liquido folicular, que exuda la teca interna, por separacin del oocito primario y sus clulas de granulosa, provenientes del cumulus oophorus, y la terminacin de la meiosis I. Por rotura del folculo maduro el oocito secundario producido, sobresale en superficie ovrica aun recubierto de clulas de granulosa que constituyen la llamada corona radiada, el oocito maduro penetra en el extremo proximal de la trompa vecina y la clula comienza su segunda divisin de maduracin que llega hasta la metafase II, pero solo se completa si es fecundado el vulo. Antes de la ovulacin el folculo contiene: 0.3 x 106 clulas de granulosa en rata 3.5 x 106 clulas de granulosa en oveja .50 x 106 clulas de granulosa en la mujer.

Atresia Folicular: La atresia es el destino de la mayora de los folculos. No existen criterios objetivos para detectarlos en las etapas de folculos primordiales e intermedios. En humanos, ovejas y rata se pueden detectar folculos atrsicos: 1. En folculos < 1mm de dimetro se caracterizan por una regresin del ovocito, retraccin de las clulas de la granulosa e hipertrofia de las clulas de la teca. 39

Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular 2. 3.

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En folculos grandes, la atresia puede visualizarse por la presencia de vesculas picnticas, el nmero de las cuales determina el estado de atresia. En los preantrales la atresia se visualiza por la invasin de la cavidad folicular por fibroblastos.

Cambios relacionados con la edad: decrece el nmero de folculos en todos sus tamaos. Esto es visible en humanos decrecen a partir de los 38 aos. En muchos mamferos el nmero de folculos en la reserva no son marcadamente afectados por la edad. Cintica del crecimiento folicular: El ndice mittico de las clulas de la granulosa se utiliza para establecer el rango de crecimiento folicular. II) OBJETIVOS: Al trmino de la prctica los estudiantes sern capaces de: Reconocer formas de espermatogonias, espermatocitos y espermtides. Reconocer las diferentes formas de folculos, desde el primordial hasta el folculo de Graaf o maduro. III) MATERIALES Que debe traer el alumno: 1. Material Obligatorio. Que proporciona el laboratorio: 1. 2. Microscopio compuesto de campo claro. Lminas preparadas de cortes de testculos y ovario.

IV) PROCEDIMIENTOS Espermatognesis 1. Observe con diferentes aumentos el corte de testculo humano teido con HE. 2. Distinga y dibuje como se disponen los distintos tipos celulares (espermatogonias, espermatocitos, espermtides, espermatozoide) desde la base el tbulo seminfero a la luz del mismo. Foliculognesis 1. Observe con diferentes aumentos el corte de ovario teido con HE y distinga el hilo, la mdula y la corteza. La ovognesis tiene lugar en la corteza ovrica. 40

Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular 2. 3. 4.

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Usando diferentes aumentos reconozca y dibuje: folculo primordiales y folculos en crecimiento: primarios, secundarios, o folculos antral y de Graff. En el folculo de Graff identifique el ovocito. Identifique folculos atrsicos.

V) CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. 5. 6.7.Qu diferencia existe entre una poblacin de espermatogonias y una de espermatocitos? Cmo se diferencian las espermtides? En que etapa de la meiosis se encuentran: las espermatogonias, los espermatocitos primarios, las espermtides y los espermatozoide?. Qu diferencia encuentra entre un folculo primordial y un folculo secundario? En que fase de la meiosis est el ovocito dentro del folculo de Graff? Qu es el cuerpo lteo y qu funcin cumple? Por qu los folculos ovricos no reaccionan a la hormona folculo estimulanteen la menopausia?

VI) REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Smith CA. & Wood Ej. 1997: Biologa Celular. Ed. Addison Wesley Iberoamericana. Stevens A., & Lowe J. 1997: Human Histology. 2da. Edicin. Mosby. London, Bogot, Mxico.

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Gua de Practicas de Biologa Celular y Molecular Hoja de resultados Muestra: Corte de ovario Colorante: Hematoxilina - Eosina Etapas que observa y caractersticas:

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Folculo Primordial

Folculo Primario laminar

Foliculo Primario Multilaminar

Folculo Secundario o Antral

Folculo Maduro

Folculo Atrsico

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Hoja de Resultados Muestra: Corte de Testiculo Colorante: Hematoxilina - Eosina Etapas que observa y caractersticas:

Tbulo Seminfero

Espermatogonia

Espermatocito Primario

Espermatocito Secundario

Espermatide

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