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calibração de micropipetas

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38QUALIDADEEM SAÚDE
M E T R O L O G I A
Micropipetas
As micropipetas são instrumentos volumétricos utiliza-dos para a medição de um determinado volume de líquidoquando são necessários valores na ordem dos micro-litros. São instrumentos de medição muito importantesem áreas como a química, biologia, saúde, farmácia egenética, que trabalham com o doseamento volumétricoem pequena escala. Existem dois tipos de micropipetas:as micropipetas de deslocamento positivo utilizadas paralíquidos específicos e as de deslocamento de ar, sendoestas últimas as mais utilizadas em laboratórios.O princípio da operação de pipetagem é simples: oenchimento das micropipetas é realizado através dumêmbolo accionado manualmente que aspira o líquidode calibração. Aquantidade de ar entre o êmbolo e apipeta determina o volume pretendido. O mesmo êmbolotambém provoca o escoamento do líquido por impulsãodo ar.
Calibração
Acalibração de micropipetas consiste na determinaçãodo volume escoado de uma micropipeta através dométodo gravimétrico, utilizando água como líquido decalibração, à temperatura de referência de 20ºC, utili-zando fórmulas adequadas, e que permite obter o errovolumétrico associado à micropipeta.O procedimento experimental é baseado na norma ISO8655
(1)
e consiste em efectuar cinco enchimentos suces-sivos de forma a que a micropipeta atinja o equilíbrio dehumidade. Muda-se de seguida a ponta e faz-se um novoenchimento. Determina-se o peso do recipiente com 3mmde água e pipeta-se o volume pretendido. Pesa-se orecipiente com água e, por diferença, determina-se ovalor do volume da micropipeta. Repete-se os ensaios10 vezes sem limpar o recipiente. Em cada mediçãodeve-se registar o valor da massa. O valor médio dos 10ensaios corresponde à massa escoada da micropipeta.Para se determinar qual o volume correspondente àmassa escoada da micropipeta utiliza-se a seguintefórmula descrita na ISO 4787
(2)
:Nesta equação temos:
20
 –volume, à temperatura de 20ºC, em
µ
l;
A medição de volume é um passo crítico em qualquerlaboratório analítico, especialmente quando se trabalhaem ensaios muito sensíveis onde existem poucasquantidades de amostra a analisar e onde um pequenoe rro de pipetagem pode causar um erro bastantesignificativo no resultado. Para se conseguir identificare corrigir erros provenientes do manuseamento dequidos é essencial a calibração dos instru m e n t o svolumétricos nas mesmas condições em que sãoutilizados no laboratório.
IMPORTÂNCIA DA
CALIBRAÇÃO DE MICROPIPETAS
NOS ENSAIOS ANALÍTICOSIMPORTÂNCIA DA
CALIBRAÇÃO DE MICROPIPETAS
NOS ENSAIOS ANALÍTICOS
Elsa Batista
Laboratório de Volume Instituto Português da Qualidade
 
N.11 -JULHO/SETEMBRO2004 39
M E T R O L O G I A
que descreve como a grandeza
20
é influenciada pelas variaçõesde cada um dos componentes da fórmula utilizada.Assim, a fórmula de cálculo da incerteza padrão é a seguinte:Aincerteza padrão é de seguida multiplicada por um factor deconversão
(normalmente é 2 para um número de graus deliberdade superior a 50) para se obter a incerteza padrão expandidaque corresponde a um intervalo de confiança de 95%.
(6)
Assim, o resultado final da calibração irá ser representado por:
20
= Volume ± Incerteza
Variação do erro
Asoma do módulo do erro obtido (diferença entre o volume nominale o volume convencionalmente verdadeiro) com o módulo daincerteza deverá ser igual ou inferior à tolerância do instrumentoindicada na norma ISO 8655, de forma a que o instrumento possaser utilizado nos ensaios a que se destina.
Testes de desempenho
O erro volumétrico obtido na calibração da micropipeta pode seralterado indevidamente (invalidando todo o processo de calibração)devido a vários factores de manuseamento deficiente do material,tais como um mau funcionamento do êmbolo causado pela fadigada mola da micropipeta ou erros associados ao tipo de ponta, entreoutros. Assim sendo, foram efectuados dois tipos de ensaios de desem-penho a uma micropipeta de 1000
µ
l para se avaliar a sua respostaem condições específicas e como isto pode influenciar o volumeescoado: o ensaio das pontas e o ensaio de fadiga. No primeirocaso a micropipeta foi calibrada sempre com a mesma ponta cincovezes. No caso da fadiga foram realizadas 100 medições conse-cutivas, 10 testes com 15 minutos de intervalo e cinco testes com24 horas de intervalo. Cada teste possui 10 medições.Os resultados obtidos
( 7 )
estão indicados nas figuras da páginaseguinte. Como se pode observar pelas figuras, no ensaio de fadiga amicropipeta necessita de algum tempo para recuperar depois deser utilizada continuamente. O volume vai diminuindo ao longo das100 medições (figura 1) possivelmente devido a um problema mecâ-
 I 
 L
 –resultado da pesagem com o recipiente cheio comágua, em mg;
 I 
 E 
 – resultado da pesagem com o recipiente vazio, emmg;
ρ
 – massa volúmica da água, à temperatura de cali-bração
, em mg/ 
µ
l;
ρ
 A
 – massa volúmica do ar, em mg/ 
µ
l (para temperaturasmuito próximas de 20ºC e à pressão atmosféricanormal pode ser usado o valor médio de 0,0012mg / 
µ
l);
ρ
 B
 –massa volúmica de referência das massas dabalança (para massas conformes com a OIML33,normalmente utilizados, este valor é de 8,0 mg/ 
µ
l);
γ 
 –coeficiente de expansão cúbica do material de queé constituída a micropipeta, em ºC
 – 1
;
 –temperatura da água usada na calibração, em ºC.Atemperatura do líquido de calibração é um elementoessencial para o cálculo do volume, uma vez que a suavariação implica a obtenção de diferentes valores dedensidade. Assim, é de extrema importância que o líquidode calibração se encontre à temperatura de trabalhodo laboratório para que os valores obtidos na calibra-ção possam ser utilizados no decorrer de ensaioslaboratoriais. Atemperatura de referência deverá ser de(20 ± 0.5)ºC. O líquido de calibração deverá ser águadestilada com uma condutividade inferior a 5
µ
S / cm
(3)
.
Cálculo da incerteza
Aincerteza de medição é o parâmetro associado aoresultado de uma medição, que caracteriza a dispersãodos valores que podem ser razoavelmente atribuídosà mesuranda
(4)
. Para calcularmos a incerteza do volumeescoado temos de ter em conta os factores que vãoinfluenciar essa medição ou seja os componentes deincerteza. O cálculo da incerteza na calibração de micropipetas ésemelhante ao descrito no trabalho de E. Batista
.
.,Metrologia 2000
(5)
. Neste caso específico as componen-tes da incerteza vão ser as seguintes:a incerteza da pesagem (
u
m
)a incerteza da massa volúmica da água (
u
ρ
),dos pesos da balança (
u
ρ
 B
) e do ar (
u
ρ
 A
)a incerteza da temperatura (
u
)a incerteza da evaporação (
u
eva p
)a incerteza do coeficiente de expansão cúbicado material (
u
γ 
)Para se obter a incerteza padrão multiplica-se cadacomponente pelo respectivo coeficiente de sensibilidade,

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