UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA ESCUELA DE QUIMICA FACULTAD DE CIENCIAS INSTRUMENTAL ANALITICO

GUIA DE CROMATOGRAFA

Caracas 2008

Tabla de Contenido
DEFINICIONES IMPORTANTES........................................................................................ 3 Cromatografa..................................................................................................................... 3 Clasificacin de los Mtodos Cromatograficos:................................................................. 3 Cromatograma: ................................................................................................................... 3 Tiempo de Retencin.......................................................................................................... 4 Tiempo Muerto ................................................................................................................... 4 ECUACIONES BASICAS EN CROMATOGRAFA........................................................... 4 Constante de Distribucin .................................................................................................. 4 Factor de Capacidad ........................................................................................................... 4 Factor de Selectividad ........................................................................................................ 5 Eficiencia de una Columna................................................................................................. 5 Resolucin de una Columna ............................................................................................... 7 APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA................................................................... 8 Anlisis Cualitativo ............................................................................................................ 8 Anlisis Cuantitativo .......................................................................................................... 8 Calibracin absoluta ....................................................................................................... 9 Mtodo del estndar interno ........................................................................................... 9 Normalizacin de rea .................................................................................................. 10 BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA.................................................................................. 11

DEFINICIONES IMPORTANTES
Cromatografa La cromatografa es un mtodo de separacin de diferentes componentes de una muestra, este mtodo logra la separacin de los mismos a travs del paso de una muestra por una fase estacionaria con la ayuda de la fase mvil, cada componente de la muestra tiene propiedades particulares que permitir su interaccin en forma diferente entre la fase estacionaria y mvil, de esta forma cada componente se retrasa en forma particular y si el caudal, las caracterstica de la fase estacionaria y mvil y la longitud de la columna son las adecuadas se lograra la separacin completa de todos los componentes de la muestra. El objetivo principal de un estudio cromatografa es lograr la separacin de todos los componentes en una muestra, para ello es necesario jugar con una serie de factores cromatograficos, es por ello que es necesario conocer como estn relacionados los diferentes factores experimentales con las ecuaciones cromatograficas. Clasificacin de los Mtodos Cromatograficos: Segn como se coloque en contacto la fase mvil y estacionaria: cromatografa en columna y cromatografa plana Segn el tipo de fase mvil utilizada: Cromatografa gaseosa y cromatografa Liquida y cromatografa de fluidos sper crticos Cromatograma: Es la representacin grafica de la seal en funcin del tiempo una vez que la muestra es inyectada a un sistema cromatografico. Para obtener este cromatograma a la salida de la columna se coloca un sistema de deteccin y registro, que permite responder a una propiedad de la solucin que contiene el analito o del propio analito en funcin del tiempo, figura 1.

Figura 1.- Cromatgrama de dos componentes

Tiempo de Retencin
El tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra para que el pico del analito alcance el detector se denomina tiempo de retencin y se le da el smbolo tR. (ver figura 1)

Tiempo Muerto
Es el tiempo tM para que la especie no retenida alcance el detector (ver figura 1)

ECUACIONES BASICAS EN CROMATOGRAFA

Constante de Distribucin
Los equilibrios de distribucin implicados en cromatografa se describen por ecuaciones simples que suponen la transferencia de un analito entre las fases estacionaria y mvil. As para una especie A

Amvil Aestacionaria
La constante de este equilibrio K se denomina, constante de distribucin y se define como: C K = S ec. 1 CM donde CS es la concentracin molar de analito en la fase estacionaria y CM es la concentracin molar de analito en la fase mvil.

Factor de Capacidad
Es un parmetro (k) que se utiliza para describir las velocidades de migracin de los analitos en las columnas y se interpreta considerando que mientras mayor sea el valor de este factor menor es la velocidad de migracin de los solutos en la columna. Para una especie A, el factor de capacidad k A se define como: K AVS ec. 2 k A = VM

donde KA es la constante de distribucin, VS es el volumen de la fase estacionaria y VM es el volumen de la fase mvil. Tambin puede ser descrito en trminos experimentales los cuales pueden ser tomados de un cromatograma: ec. 3 tM donde (tR)A es el tiempo de retencin del componente A y tM es el tiempo muerto obtenido para una especie no retenida.
k A =

(t R ) A t M

Factor de Selectividad
El factor de capacidad de una columna, como su nombre lo indica, es un trmino que define que tan selectiva es una columna para separar dos picos. Es de hacer notar, que la columna puede ser selectiva a una separacin, que se identifica por un valor alto de este factor, pero si no se considera la mejora de los parmetros que pueden afectar el ancho de un pico, aun as no se lograra la separacin de los mismos. Entonces el factor de selectividad de una columna para dos especies A y B se define como: k = B ec. 4 k A es el factor de capacidad del compuesto B, que es el mas retenido y k donde k B A es el factor de capacidad del compuesto A, que es el menos retenido. Con esta definicin siempre es mayor que la unidad. En trminos tomados a partir de un cromatograma se puede calcular como sigue:

(t R )B t M (t R ) A t M

ec. 5

Eficiencia de una Columna.

Como se dijo anterior mente, si no se toma en cuenta los factores que afectan el ancho de un pico para la separacin cromatografa no se podra lograr una buena separacin aun cuando se tenga un factor de selectividad alto para estos picos en una columna particular. Es decir que mientras mayor es la capacidad de la columna de producir picos mas estrechos mayor es su eficiente. La anchura de una banda aumenta a medida que se mueve a travs de la columna, debido a que cuanto ms tiempo transcurre mayor es la dispersin que puede tener lugar. Por ello la anchura de la zona est relacionada directamente con el tiempo de residencia en la columna, e inversamente con la velocidad a la que fluye la fase mvil.

Se utilizan dos trminos afines con frecuencia como medida cuantitativa de la eficacia de una columna cromatogrfica: (1) la altura equivalente de plato terico o H y (2) el nmero de platos tericos N. Los dos estn relacionados por la ecuacin: L N= ec. 6 H donde L es la longitud (normalmente en centmetros) del relleno de la columna. La eficacia de la columna cromatogrfica aumenta cuando mayor es el nmero de platos, y cuando menor es la altura de plato. La evaluacin experimental de H y N se puede realizar a partir de las siguientes ecuaciones: LW 2 H= ec. 7 2 16t R donde L es la longitud de la columna, W es el ancho del pico a considerar y tR es su tiempo de retencin. 2 tR N = 16 ec. 8 W Para tener una mejor idea de cmo afectan las diferencias variables cromatogrficas el ancho de un pico, que a se vez, se traduce en la modificacin de la eficacia de una columna Van Deemter present la siguiente ecuacin: H = A + B / u + Cu ec. 9 En esta ecuacin se evalan varios trminos que pueden contribuir al ensanchamiento de una banda los cuales se pueden interpretar como sigue: El termino A, igual a 2d p y atribuido a la difusin en remolino, representa el efecto de

trayecto mltiple de la fase mvil a travs de una columna empacada. Incorpora la densidad del empaque y el promedio del dimetro de partcula, dP Para las columnas capilares sin relleno este trmino es cero. La difusin longitudinal (B/u), es una causa del ensanchamiento de banda por las que los analitos difunden desde la zona ms concentrada del centro de la banda hacia las regiones ms diluidas por delante y por detrs del centro de la banda, es decir, en el mismo sentido y en el sentido opuesto a la direccin del flujo. El termino B, 2DM , expresa la tortuosidad de los canales en la columna empacada y el coeficiente de difusin molecular del soluto en la fase movil.
2 2 El termino C esta dado por 8 / k / (1 + k ) 2d f / DE . Refleja la resistencia a la 2

)[

](

trasferencia de masa entre la fase mvil y la estacionaria, y dentro de la propia fase estacionaria, en donde k es el factor de capacidad, df es el espesor de la pelcula de la fase estacionaria y DE es el coeficiente de difusin del soluto en la fase estacionaria. La figura ilustra representaciones grficas, determinada experimentalmente, de AEPT (H) en funcin de la velocidad promedio, , para cromatografa de gases, cromatografa de fluidos supercriticos y la cromatografa liquida. Como se puede observar, hay una diferencia significativa entre la cromatografa de gases y la cromatografa lquida, tanto en el valor de H como en el intervalo ptimo de . Las separaciones de GC se hacen a menudo cerca del punto optimo de H versus . Sin embargo, las velocidades de flujo a las que se

alcanza el valor ptimo en LC son tan bajas que las separaciones de LC se hacen normalmente a un valor algo por encima del punto ptimo

Figura 2. HEPT versus velocidad promedio lineal Claramente, el valor de N es muy sensible a las condiciones de operacin, y la comparacin de la eficacia de un tipo de cromatografa con otra o incluso una columna con otra, es por ello que se recomienda realizar un estudio mas serio del tema utilizando los libros que se recomienda en la bibliografa.

Resolucin de una Columna

La resolucin RS de una columna constituye una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos, en este trmino si se toma en cuenta el ensanchamiento de los picos, as que la magnitud de este valor si permite asegurar la separacin de dos picos. 2[(t R )B (t R )A ] ec. 10 RS = WA + WB donde WA y WB son los anchos de banda de las bandas A y B respectivamente. Estadsticamente se puede demostrar que una resolucin de 1,5 permite una separacin esencialmente completa de los dos componentes, mientras que no es as con una resolucin de 0,75, por supuesto siempre y cuando las bandas sean gausseanas, es decir simtricas en ambos lados. As con una resolucin de 1,0; la zona de A contiene aproximadamente 4% de B, y la zona B contiene una cantidad similar de A. Con una resolucin de 1,5, el solapamiento es del orden de un 0,3% La resolucin expresada en trminos tericos se presenta a continuacin: RS = N 4 1
2

1 + kB k ec. 11 B

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA
Anlisis Cualitativo
Un anlisis cromatogrfico puede dar una amplia informacin cualitativa si se escoge el sistema de deteccin adecuado para determinar y evaluar los analitos separados, as si se utiliza un detector que permita obtener un espectro de cada compuesto separado y a su vez contenga una base de datos que pueda realizar su comparacin con una biblioteca de espectros se podra, de una forma muy precisa, establecer la identidad de los componentes de una muestra, de hecho esto se logra fcilmente con cromatgrafos que contienen sistema de deteccin como el Infrarrojo (IR), el de Resonancia Magntica Nuclear (RMN) o el espectrmetro de Masas (MS). Sin embargo, estos sistemas son muy costosos, es por ello que la mayora de los laboratorios cuentan con cromatografos con sistemas de deteccin sencillos como el detector de ionizacin a la llama (siglas en ingles, FID) o el detector de conductividad trmica (siglas en ingles (TCD) en el caso de cromatografa de gases o detectores de absorbancia o ndice de refraccin para los casos de cromatografa de lquidos. La nica informacin cualitativa que pueden ofrecer estos sistemas es el tiempo de retencin del analito, el cual, solo puede ser usada controlando bien las condiciones cromatogrficas como: flujo, temperatura, tipo de fase estacionaria en el caso de gases o composicin qumica de la fase mvil adems de las otras variables mencionadas anteriormente para el caso de cromatografa de liquida, adems de que se debe tener conocimiento de los posibles compuestos de la muestra y una amplia variedad de patrones para realizar comparaciones. Sin embargo, se puede dar el caso que dos compuestos tengan el mismo tiempo de retencin, lo que imposibilita su identificacin. Por supuesto que, a partir de cromatogramas obtenidos con diferentes fases mviles (para cromatografa liquida) y estacionarias y a diversas temperaturas de elusin (para cromatografa gaseosa), se puede obtener datos adicionales.

Anlisis Cuantitativo
El uso de la cromatografa se ha extendido en todo el mundo, en las ultimas cuatro dcadas, no solo por su capacidad de separar compuestos sino porque se puede realizar un anlisis cuantitativo de las especies proporcionadas. En la cromatografa en columna, el anlisis cuantitativo se basa en la comparacin de la altura, o del rea, del pico del analito con la de uno o ms patrones inyectados bajo las mismas condiciones cromatogrficas. El uso de una u otro termino depender de las caractersticas de la banda obtenida, aunque en la actualidad con el uso de sistemas de integracin de rea computarizados, la precisin es muy alta para el calculo de rea, sin embargo siempre es importante conocer las otras herramientas a utilizar para calcular el rea de una banda y en que momento es mejor usar altura en vez de rea por si llega a faltar el sistema computarizado. Para lograr un anlisis cuantitativo de los componentes separados de una muestra existe una gran variedad de mtodos de anlisis entre los que se pueden mencionar: 1. Calibracin absoluta

2. Mtodo del estndar interno. 3. Normalizacin de rea (con y sin factor de respuesta) Cada mtodo tiene sus ventajas y desventajas.

Calibracin absoluta
Para realizar el clculo de composicin, se inyecta masas exactas del componente puro al cromatgrafo y se determina el rea. Se realiza un grafico relacionando el rea de pico con la masa (figura 2), se obtendr entonces una curva de calibracin que debe ser lineal y pasar por el origen.

Figura 3.- Calibracin absoluta La ecuacin de esta curva vendr dada entonces por A = mW ec. 12 Entonces se inyecta una masa exacta de la muestra (Winj) y se determina el rea del componente a analizar, por ejemplo el componente A, de la curva extrapolando la masa de A por WA= AA/m y despus se aplica la siguiente ecuacin:

%WA =

WA * 100 ec. 13 Winj

Las desventajas de este mtodo son que la inyeccin de la muestra debe ser exacta y que las condiciones del sistema no deben cambiar de una inyeccin a la otra. Las inyecciones exactas se logran mas con un sistema automatizado de inyeccin o con el uso de vlvulas de inyeccin manuales con lazo de volmenes exactos como el caso de cromatografa liquida de alta resolucin

Mtodo del estndar interno

Este mtodo es conocido como calibracin relativa o indirecta. Para ello, relacin de masas conocidas de un patrn de la muestra y de un estndar deber ser preparadas e inyectadas al cromatgrafo para luego determinar las relaciones de rea. Estas relaciones de reas son graficadas en funcin de la relaciones de masa, como se muestra en la figura 3.

Figura 4.- Calibracin relativa. De esta curva se obtiene la ecuacin lineal y = mx. Entonces se adiciona una masa conocida del estndar interno a una masa conocida de muestra y esta mezcla se inyecta al cromatgrafo. Del cromatgrama se obtienen las reas de analito y del estndar y luego con la ecuacin de calibracin y conociendo la masa del estndar se puede obtener la masa del analito en la muestra.
patrn * Westandar estandar ec. 14 Wanalito = m A partir de esta masa se puede calcular el % de este componente en la muestra como sigue Area

%Wanalito =

Wanalito *100 ec. 15 Wmuestra

La ventaja de este mtodo es que es independiente del volumen de inyeccin de muestra lo que es sumamente importante para aquellas tcnicas cromatografas que utilizan un metodo de introduccin de muestra no automatizado como por ejemplo el uso de jeringas de inyeccin en cromatografa gaseosa. Requerimientos para un buen estndar interno: Debe ser resuelto de los otros picos Debe eluir cercano al pico de inters Debe usarse una concentracin similar al pico de pico de inters. Debe ser de las mismas caractersticas estructurales.

Normalizacin de rea
La normalizacin de rea es un medio para establecer el porcentaje de cada componente en la muestra. Se calcula dividiendo el rea de cada componente entre el rea total y multiplicando por 100%, es decir: Area de A %A = * 100 ec. 16 Area total Este trmino es independiente del volumen de inyeccin de muestra y debe cumplirse que todos los picos deben estar separados. Sin embargo, esta ecuacin solo se puede aplicar

para una serie homologa de compuestos de punto de ebullicin muy parecidos y con similares respuestas del detector, algo mas acorde con la realidad es usar el factor de respuesta. Sin embargo el factor de respuesta depende del tipo de detector utilizado el clculo mas sencillo se aplica para el factor de respuesta cuando se utiliza en cromatografa de gases un detector de ionizacin a la llama y este es el que se explicara a continuacin.
Factor de Respuesta (clculos para el FID): Cada detector tiene su forma particular de respuesta para cada analito, es por ello, que la composicin de cada componente en la muestra no se puede relacionar directamente a menos que se unifique la respuesta del detector para cada componente. La respuesta de un detector de ionizacin a la llama (FID) es independiente de la temperatura, del flujo de gas de arrastre y de la velocidad de flujo. Esto hace ms sencillos los clculos, ya que se puede realizar relaciones directas de peso de muestra, lo cual contribuye a que este sea el detector ideal para el anlisis cuantitativo. El clculo de factor de respuesta se realiza experimentalmente de la siguiente forma. Se pesa una cantidad exactamente conocida del patrn del analito a estudiar, se determina su rea en el cromatgrafo y luego se realiza el clculo, (FR )A = WA ec. 17 AA As sucesivamente para todos los componentes en la muestra. Una vez conocido el factor de respuesta de cada componente en la muestra, se puede realizar el clculo de normalizacin de rea con factor de respuesta.

%A A =

A (F )
n n

A A * (FR )A

ec. 18

R n

Es de hacer notar, que en algunos libros se utiliza el factor de correccin o la sensibilidad del detector para realizar estos clculos, en ese caso observara las siguientes ecuaciones. (FC )A = A A ec. 15 WA y para rea:

%A A =

A / (F )
n n

A A / (FR )A

ec.19

R n

Note que al final las reas corregidas sern iguales, solo se invierte los dividendos y productos. Eso si es sumamente importante que no mezcle las dos ecuaciones o se confunda en los calculas, ya que los resultados sern errneos.

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
1.- Anlisis Instrumental Rubinson y Rubinson 2001 Editorial Pretice Hall 2.- Anlisis Qumico Cuantitativo Daniel Harris 3era edicin 2007 Editorial Revert 3.- Principios de Anlisis Instrumental Skoog Holler Nieman