A utilizao de tcnicas de biologia molecular na gentica forense: uma reviso*

The use of molecular biology techniques in foresinc genetis: a review

Analara Koch1 & Fabiana Michelsen de Andrade2
RESUMO - Os avanos nas tecnologias de DNA surtiram um enorme impacto no campo da cincia forense. Com uma incrvel sensibilidade e um alto poder de discriminao, a anlise de DNA tem sido uma poderosa ferramenta para a identificao humana e investigaes criminais. O presente estudo far uma reviso sobre as tcnicas de Biologia Molecular mais significativas RFLP, VNTR, PCR e STR que foram desenvolvidas nas ltimas dcadas, tendo como princpio o estudo de diferentes polimorfismos de DNA para a identificao precisa de indivduos. Por um longo tempo, estes polimorfismos foram detectados por tcnicas que possuam como base a eletroforese. Outra tcnica que tambm ser exposta, Southern Blotting, visa a identificao de uma seqncia de bases especficas do DNA, que foi por muito tempo aplicada tanto na deteco de SNPs como de VNTRs e STRs. Alm disto, ser descrita a reao em cadeia da polimerase (PCR), um mtodo laboratorial capaz de copiar milhes de vezes um segmento do DNA, que se destaca perante outras tcnicas por ser um procedimento relativamente simples e fcil de realizar em laboratrio, gerando resultados precisos e satisfatrios, em um curto espao de tempo. Por fim, sero descritos os mtodos automatizados que, a partir de PCR, permitem a deteco rpida de marcadores moleculares, a fim de facilitar e tornar mais precisa a identificao forense. PALAVRAS-CHAVE - Tcnicas de biologia molecular, Gentica forense, Tipagem de DNA, Perfil de DNA, Investigaes criminais, RFLP, VNTR, PCR, STR. SUMMARY - The advent of DNA-based technologies promoted significant impact in the field of forensic science. According to its high sensibility and powerful discrimination, the DNA analyses have been a powerful tool to human identification and criminal investigations. The present study will be taken to produce a review about the most important techniques of molecular biology developed in recent decades, such as RFLP, VNTR, PCR and STR. These techniques are based in the study of different polymorphisms in the DNA and it could be used in the precise subjects identification. For a period, these polymorphisms were detected through techniques based in electrophoresis. Besides, other procedures will be explained, like Southern Blotting that aims to identify specific DNA sequences and could be applied in the research of SNPs, VNTRs and STRs. It will be also described the Polimerase Chain Reaction (PCR), a laboratorial method able to amplify millions of a short DNA segment. This technique has some advantages through the others because it is a simple and easy procedure to be done in laboratories, and could offer accurate and satisfactory results in a short period of time. Concluding, automated techniques based in PCR will be present that permit fast detection of molecular evidences in order to facilitate and promote reliable forensic identification. KEYWORDS - Molecular Biology Techniques, Forensic Genetic, DNA typing, DNA profiling, Criminal investigation, RFLP, VNTR, PCR, STR.

INTRODUO

avano da cincia e tecnologia a nvel forense teve seu ponto culminante em meados dos anos 80, quando as tcnicas de identificao, fundamentadas na anlise direta do cido desoxirribonuclico (DNA), tornaram-se uma das mais poderosas ferramentas para a identificao humana e investigaes criminais (BENECKE, 1997). A determinao de identidade gentica pelo DNA pode ser usada para demonstrar a culpabilidade dos criminosos, exonerar os inocentes, identificar corpos e restos humanos em desastres areos e campos de batalha, determinar paternidade com confiabilidade praticamente absoluta, elucidar trocas de bebs em berrios e detectar substituies e erros de rotulao em laboratrios de patologia clnica (PENA, 2005). O primeiro mtodo de utilizao da anlise do DNA para identificar indivduos foi desenvolvido em meados da dcada de 1980 por Sir Alec Jeffreys, da Universidade de Leicester e, apesar do seu enorme poder potencial, houve srias reservas quanto o seu uso real, pois no incio, havia muitas dvidas quanto reprodutibilidade e confiabilidade dos mtodos (DUARTE et al., 2001; BROWN, 2001). Com o conhecimento atual, ao menos duas grandes vantagens devem ser citadas sobre a tipagem molecular: o DNA possui uma alta estabilidade qumica mesmo aps um longo perodo de tempo e est presente em todas as clulas nucleadas do organismo humano, o que facilita a obteno do mesmo (MALAGHINI et al., 2006).

As primeiras tcnicas forenses de identificao humana eram convenientes apenas para anlise de DNA de evidncias biolgicas que contivessem clulas nucleadas. Atualmente, com a implementao do seqenciamento do DNA mitocondrial, essa limitao tem sido superada (LEE e LAAD, 2001). Se antes, impresses digitais e outras pistas eram usadas para desvendar crimes; hoje, so inmeros os espcimes biolgicos dos quais o DNA pode ser extrado. Podemos encontr-lo em pequenas amostras de sangue, ossos, smen, cabelo, dentes, unhas, saliva, urina, entre outros fluidos, e anlises cuidadosas desse material ajudam a identificar criminosos (BENECKE, 2002). As aplicaes da Biologia Molecular no laboratrio criminal centralizam-se, em grande parte, na capacidade da anlise do DNA em identificar um indivduo a partir de cabelos, manchas de sangue e fluidos corporais, entre outros itens recuperados no local do crime. Essas tcnicas so conhecidas como datiloscopia gentica (genetic fingerprinting), embora o termo mais preciso e utilizado para design-las seja perfil de DNA (BROWN, 2001). O perfil de DNA se baseia no fato de que gmeos idnticos so os nicos indivduos que possuem cpias idnticas do genoma humano, mas este, em indivduos diferentes, contm muitos polimorfismos, que so posies onde a seqncia de nucleotdeos difere em cada membro da populao. Para ser considerado um polimorfismo, o alelo raro de um determinado loco deve estar presente em mais de 1% dos indivduos da populao. Assim, com esta grande variao no nmero e no

Recebido em 27/12/2006 Aprovado em 18/10/2007 *Instituto de Cincias da Sade, Centro Universitrio Feevale, Novo Hamburgo, Rio Grande do Sul, Brasil 1 Aluna formanda do curso de Biomedicina do Centro Universitrio Feevale 2 Doutora em Gentica e Biologia Molecular, Professora Titular de Gentica Humana, Curso de Biomedicina do Centro Universitrio Feevale

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tipo de variaes, fica possvel identificar uma pessoa com base no seu padro de polimorfismos (BROWN, 2001). A tipagem do DNA para finalidades forenses se baseia nos mesmos princpios fundamentais e usa as mesmas tcnicas que so rotineiramente empregadas em uma ampla variedade de situaes mdicas e genticas, tais como: o diagnstico e o mapeamento gentico (DUARTE et al., 2001). O DNA resistente a muitas condies que destroem a maioria dos outros compostos biolgicos, como as protenas. Alm disso, somente poucas clulas nucleadas, que contenham pequenas quantidades de DNA, so necessrias para a identificao de um indivduo. Por essas razes, as anlises diretas do DNA freqentemente do resultados teis em situaes em que os mtodos mais antigos, como os que empregavam grupos sangneos e enzimas, fracassavam (DUARTE et al., 2001; SCHNEIDER, 1997). Com uma incrvel sensibilidade e poder de discriminao, a anlise de DNA tem sido a figura-chave e promete grandes progressos no campo da cincia forense (LEE e LAAD, 2001). Por possuir um alto poder de discriminao, a tipagem do DNA tem fornecido aos investigadores uma grande chance de excluir suspeitos que no esto relacionados cena do crime (BAECHTEL e COMEY, 1996). O nmero de tribunais que tm aceitado evidncias baseadas no DNA cresce a cada dia, levando-nos a crer que, em um futuro no muito distante, esta tecnologia ser empregada em todo o Sistema Legal (PRIMORAC et al., 2000). Porm, para que no ocorra nenhum tipo de erro e para a preciso dos resultados, regras rgidas de coleta e processamento das amostras devem ser adotadas (LEE e LAAD, 2001). Nas ltimas dcadas, muitas tcnicas foram desenvolvidas, objetivando a identificao gentica precisa de indivduos. Dentre elas, as mais significativas so: RFLP, VNTR, PCR e STR (ALBUQUERQUE, 2004). Assim, o objetivo deste artigo descrever estas e outras tcnicas relacionadas investigao forense, ao mesmo tempo em que uma reviso de suas aplicaes em diferentes situaes ser realizada. COLETA E PRESERVAO DE EVIDNCIAS BIOLGICAS A capacidade de introduzir achados de DNA no tribunal sofre um grande impacto pela coleta das provas e mtodos de preservao. Do ponto de vista tcnico e criminalista, o DNA pode ser coletado da maioria dos espcimes biolgicos, pois sendo uma molcula estvel em ambiente seco e frio, se armazenado em tais condies, tem grandes chances de resultados confiveis (BENECKE, 2005). Protocolos de coleta de amostras detalhados tm sido previamente descritos. O mtodo de coleta especfico depender do estado e condio da evidncia biolgica. Em geral, uma quantidade significativa de material deve ser coletada para garantir a extrao de DNA suficiente para os testes. No entanto, importante preservar a coleta de sujeira adicional, gorduras, fluidos e outros materiais que possam afetar o processo de tipagem de DNA (LEE e LAAD, 2001). Devese, tambm, levar em conta que o material biolgico recuperado na cena do crime pode sofrer alteraes ambientais (luz, altas temperaturas, reativos qumicos, etc) que podero ocasionar quebras e alteraes da cadeia de nucleotdeos e, como conseqncia, modificar a composio e a estrutura normal do DNA, impossibilitando a anlise (BONACCORSO, 2004). Cada espcime biolgico deve ser recolhido de acordo com as prticas forenses estabelecidas. Uma vez que as amostras foram coletadas, elas devem ser imediatamente entre18

gues ao laboratrio forense e, para minimizar a deteriorao da amostra e os itens, devem ser guardados em ambiente frio e seco at que sejam submetidos testagem (BENECKE, 2005). Em casos de justia, se a evidncia no for documentada, coletada, embalada e preservada com muito cuidado, ela pode no preencher os requisitos legais e cientficos para serem admitidos num tribunal, pois, se ela no foi apropriadamente documentada antes da coleta, sua origem pode ser questionada e se tiver sido mal coletada ou embalada, a possibilidade de contaminao aumentar, levando a uma maior possibilidade de discordncia nos resultados da anlise do DNA. Na perspectiva dos desafios legais, para uma confiabilidade nos resultados dos mtodos aplicados, essencial que medidas estritas de cuidados com contaminao sejam seguidas (LEE e LAAD, 2001). Toda a atividade humana est associada a algum tipo de erro. Existem fontes potenciais de erro durante todo o estgio do processamento da prova fsica, desde a coleta em campo, passando pela anlise no laboratrio, at a interpretao dos resultados dessa anlise. Nem todos os erros tm conseqncias prejudiciais; muitos nem tem conseqncias. Muitos so prontamente identificados e podem ser corrigidos. Os lapsos que mais preocupam, so aqueles que possam levar a uma falsa semelhana. Falsas excluses so importantes, mas improvvel que levem a falsas condenaes. Para conseguir resultados precisos, cuidados e ateno a detalhes, devem ser utilizados em todos os estgios do processo de identificao pelo DNA (DUARTE et al., 2001). MARCADORES MOLECULARES PARA A IDENTIFICAO HUMANA Nos testes de determinao de identidade gentica so estudadas regies genmicas em que h variao entre pessoas normais. Essas regies so chamadas de polimorfismos de DNA ou marcadores de DNA. Nos ltimos anos foram desenvolvidas diversas tcnicas para estudo de diferentes tipos de polimorfismos de DNA, formando assim um verdadeiro cardpio, no qual os cientistas e laboratrios podem escolher o mtodo mais adequado para solucionar o problema em mos (PENA, 2005). O mtodo mais usado hoje em dia o estudo de regies repetitivas de DNA, chamadas de minissatlites (VNTRs) e microssatlites (STRs). A chave da diversidade nessas regies que o nmero de repeties varia entre indivduos e pode ser estudada com sondas de DNA, ou atravs de PCR, como vem sendo feito em maior escala atualmente (PENA, 2005). VNTRs: (do ingls variable number of tandem repeats ou nmero varivel de repeties em tandem): tambm denominados de minissatlites, so polimorfismos de DNA que consistem numa srie de comprimento de repeties de fragmentos de DNA. Uma regio VNTR tpica consiste de 500 a 1000 pb, compreendendo principalmente unidades repetidas em seqncia, cada qual com cerca de 15 a 35 pb de comprimento. Os locos VNTR so particularmente convenientes como marcadores para a identificao humana, pois possuem um nmero muito grande de alelos diferentes e, sendo assim, provvel que no existam dois indivduos no aparentados que compartilhem o mesmo gentipo (THOMPSON, 1993; DUARTE et al., 2001; KASHYAP et al., 2004). STRs (do ingls short tandem repeats ou repeties curtas em tandem): STRs ou microssatlites so polimorfismos muito similares aos VNTRs, mas diferindo em seu tamanho (em geral no ultrapassam 200pb) e no comprimento das
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unidades de repetio em tandem, que variam de 2 a 7 nucleotdeos. Estes locos so muito abundantes no genoma humano (KASHYAP et al, 2004), e cada um deles possui um grande nmero de diferentes alelos, inclusive maior do que o encontrado em VNTRs, o que os torna ainda mais til para identificao humana. Marcadores bi-allicos: alm dos minissatlites e microssatlites h dois grandes grupos de polimorfismos no genoma humano - os polimorfismos de substituio de nucleotdeos nicos (single nucleotide polymorphisms, ou SNPs) e os polimorfismos de insero ou deleo de um ou mais nucleotdeos (polimorfismos de insero - deleo; ins/del). Ambos polimorfismos apresentam a grande vantagem de que podem ser estudados em produtos de amplificao muito curtos (50 pb ou menos) e, assim, apresentam distintas vantagens sobre os microssatlites no estudo de DNA extremamente degradado (PENA, 2005). Os mais abundantes e os melhor estudados desse grupo so os SNPs. Cerca de 5,3 milhes deles foram encontrados no genoma humano, o que corresponde a um SNP a cada 600pb (XIAO J et al, 2006). Recentemente, vrias publicaes tm analisado a possibilidade de que SNPs marcadores ins/del possam vir a substituir os STRs na identifcao de criminosos. Porm, embora estes marcadores possam oferecer algumas vantagens, os bancos de dados j foram montados com microssatlites e, portanto, a facilidade de comparaes entre um dado biolgico e uma seqncia armazenada muito maior para marcadores STRs. Alm disto, a tipagem dos SNPs relativamente complexa mas por outro lado, os ins/del so muito mais fceis de serem tipados porque seus alelos diferem somente em tamanho (PENA, 2005). Na rea de identificao humana, estes marcadores apresentam a desvantagem de possurem somente dois alelos, o que torna muito maior a possibilidade de dois indivduos compartilharem o mesmo gentipo, mesmo sem serem aparentados ou relacionadas cena do crime. Uma maneira de superar esta desvantagem seria a tipagem de um nmero maior de marcadores ins/del, de maneira que fosse possvel uma identificao precisa. Por muito tempo, estes polimorfismos foram detectados por tcnicas que possuam como base a eletroforese, cujos fundamentos permitiram o desenvolvimento de mtodos automatizados que sero discutidos mais adiante. Assim, a primeira tcnica a ser descrita neste trabalho a de eletroforese. Logo aps uma tcnica que foi utilizada por um longo tempo, denominada de southern blotting, ser brevemente descrita, tanto na deteco de SNPs como de VNTRs ou STRs. Com o advento da reao em cadeia da polimerase (PCR), todos os tipos de marcadores moleculares passaram a ser detectados a partir de quantidades menores de amostras, com um tempo menor e, assim, uma ateno especial ser dada para esta tcnica. E, por ltimo, uma apresentao ser feita sobre os mtodos automatizados, que a partir do PCR detectam um grande nmero de marcadores em um pequeno espao de tempo.

nho e forma. Quando submetido a um campo eltrico, as molculas de DNA migram para o plo positivo, pois so carregadas negativamente, e como fora oposta migrao existe o atrito com o suporte (gel). Quanto maior a molcula, maior o atrito e mais lenta a migrao; portanto, molculas de tamanhos diferentes tero migrado uma distncia diferente depois de algum tempo. A distncia que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicao comparada com a distncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel (VIEIRA, 2006). O DNA pode ser visualizado na presena de compostos intercalantes, sendo que o mais utilizado o brometo de etdio. Em presena desse composto, o DNA emite fluorescncia por exposio luz UV e, assim, molculas de um mesmo tamanho so visualizadas em um mesmo ponto do gel, formando uma faixa fluorescente (ZAHA et al., 2003). Se na amostra submetida corrente eltrica existir mais de um tamanho de molcula, estas sero separadas na migrao e, ento, sero visveis bandas em diferentes localizaes do gel. Basicamente, duas matrizes slidas so utilizadas atualmente para eletroforese: gis de agarose e gis de acrilamida. A escolha do tipo de gel depende do tamanho do fragmento e da diferena de tamanho de diferentes fragmentos de DNA que se quer visualizar. As duas substncias formam tramas de poros de tamanhos variveis, possibilitando a separao dos fragmentos, que ter sua eficincia dependente da concentrao do polmero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicadas. Em qualquer um dos casos, estas substncias so dissolvidas numa soluo-tampo eletroltica, obrigatoriamente a mesma que recobrir o gel na cuba de eletroforese e possibilitar a passagem de corrente eltrica (Tampo de Corrida). Para eletroforese de DNA, normalmente utiliza-se o TBE (Tris-Borato EDTA) e o TAE (TrisAcetato EDTA). Quanto aplicao das amostras no gel, importante ressaltar que antes disso elas so misturadas a uma outra soluo (Tampo de amostra), que tem como funo aumentar a viscosidade da amostra e assim impedir que esta comece a flutuar no tampo de corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema. Alm disso, o tampo de amostra possui um corante que possibilita a visualizao do andamento da corrida. Usualmente, pode-se utilizar uma mistura de Azul de Bromofenol (corante), Xileno-Cianol e Glicose (aumentam a viscosidade) dissolvidos no tampo de corrida apropriado para cada reao (VIEIRA, 2006). Para agarose so utilizadas concentraes de 0,5 a 4% no gel. Quanto maior a concentrao maior a sua capacidade de distinguir fragmentos de tamanhos prximos. J para acrilamida, normalmente, utiliza-se gis com concentraes de 4 a 25%. Estes ltimos apresentam uma definio muito maior do que a agarose: um gel de 10% pode, em certas condies, separar fragmentos de DNA diferentes em tamanho por apenas um par de bases (VIEIRA, 2006). Apesar de sua versatilidade e relativo baixo nvel de dificuldade de realizao, a eletroforese convencional tem a desvantagem de identificar os fragmentos apenas quanto ao tamanho e no quanto seqncia (VIEIRA, 2006). SOUTHERN BLOTTING: O DNA com uma seqncia de bases especfica pode ser identificado por um procedimento desenvolvido por Edwin Southern, conhecido como Southern blotting. Esse procedimento utiliza a capacidade de a nitrocelulose ligar-se fortemente ao DNA fita simples, mas no fita dupla. O primeiro passo a realizao de uma eletroforese com o DNA genmico total, geralmente aps a clivagem com uma ou mais enzimas de restrio. Aps a eletroforese do DNA fita
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TCNICAS UTILIZADAS PARA A GENOTIPAGEM DE MARCADORES GENTICOS ELETROFORESE: Por meio dessa tcnica possvel separar molculas em funo da sua massa (tamanho), forma e compactao. Trata-se de uma tcnica rpida, sensvel e precisa. A molcula em questo, por exemplo o DNA, migra em suportes (gis de agarose ou acrilamida) por ao de uma corrente eltrica, com diferentes velocidades, dependendo do seu tamaRBAC, vol. 40(1): 17-23, 2008

dupla, o gel embebido em NaOH para converter o DNA sua forma de fita simples. O gel ento recoberto por uma folha de nitrocelulose. As molculas no gel so foradas a deslocarem-se para a nitrocelulose por capilaridade que retira o lquido usando uma pilha de papel absorvente pelo outro lado da nitrocelulose. O DNA de fita simples liga-se membrana de nitrocelulose na mesma posio em que estava no gel. Aps a secagem a 80 C, que fixa o DNA permanentemente no lugar, a membrana de nitrocelulose umedecida com uma quantidade mnima de uma soluo contendo uma sonda de DNA de fita simples. Esta sonda consiste de uma seqncia de DNA conhecida, que pode incluir uma parte de um gene de interesse para alguma patologia ou, simplesmente, uma regio polimrfica se a intenso for somente a discriminao entre indivduos. Outra caracterstica desta sonda que a molcula de DNA fita simples est ligada a um istopo radioativo. A nitrocelulose umedecida mantida em uma temperatura adequada por algumas horas para permitir a renaturao, isto , a hibridizao da sonda (s) seqncia(s) alvo. A membrana lavada para remover a sonda radioativa no-ligada, secada, e feita uma autoradiografia pela exposio a um filme de raio X. A posio das molculas complementares sonda radioativa indicada pelo surgimento de manchas escuras no filme revelado (VOET et al., 2002). A tcnica de Southern Blotting pode ser utilizada na identificao de polimorfismos que determinam a alterao do padro de clivagem (devido a mutaes pontuais em stios de restrio) obtido a partir de uma determinada regio do DNA (Restriction fragment length polymorphism RFLP). Esses diferentes padres so detectados utilizando-se a prpria regio potencialmente polimrfica como sonda. Padres de RFLP obtidos com uma determinada sonda (usualmente de uma regio de DNA repetitivo) podem ser utilizados no estabelecimento de uma impresso digital de DNA, que permite a diferenciao entre dois indivduos quaisquer (ZAHA et al., 2003). Os primeiros testes usados para a deteco de minissatlites eram baseados em Southern e conhecidos como MLPs (multi lcus probes), capazes de identificar polimorfismos de mltiplos locos simultaneamente. Estes testes utilizavam como sondas seqncias de repetio em tandem e, quando hibridizados por Southern, detectavam uma famlia de minissatlites, onde todos compartilham a mesma seqncia de repetio, gerando impresses digitais de DNA especficas para cada pessoa. No entanto, os padres gerados eram complexos e essas provas no podiam ser usadas para detectar alelos de diferentes locos. Isto marcou o advento de SLPs (single lcus probes, sonda de um nico locos), que compreendia uma nica seqncia de DNA flanqueadora de um VNTR. Assim, dependendo do nmero de repeties do VNTR, era possvel determinar o alelo do indivduo. Diversos SLPs usados em uma srie, poderiam gerar perfis individuais e especficos (KASHYAP et al., 2004). REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) A reao em cadeia da DNA-polimerase (do ingls Polimerase Chain Reaction) revolucionou a gentica molecular por permitir a rpida clonagem e a anlise do DNA. um mtodo in vitro rpido e verstil para a amplificao de seqncias-alvo de DNA definidas, presentes em uma preparao de DNA. Geralmente, o mtodo programado para permitir a amplificao seletiva de uma seqncia-alvo de DNA especfica a partir de DNA total previamente extrado. Para permitir tal amplificao seletiva, alguma informao prvia, a respeito das seqncias-alvo, necessria.
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Essa informao utilizada para desenhar dois oligonucleotdeos iniciadores, denominados primers, os quais so especficos para a seqncia-alvo e apresentam cerca de 15 a 25 nucleotdeos de extenso. Aps os primers terem sido adicionados ao DNA-molde desnaturado, eles se ligam especificamente s seqncias de DNA complementares ao seu stio-alvo, flanqueando e delimitando a regio a ser analisada. Na presena de uma DNA-polimerase termoestvel apropriada e dos quatro desoxirribonucleosdeos trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), iniciada a sntese de novas fitas de DNA, que so complementares a cada uma das fitas de DNA do segmento-alvo de DNA, formando, desta maneira, um fragmento de DNA com seqncia idntica do DNA a ser analisado, e previamente selecionado pelo par de primers (STRACHAN et al., 2002). Uma vez que este ciclo de duplicao molecular repetido vrias vezes, a PCR uma reao em cadeia porque as fitas de DNA, recentemente sintetizadas, iro atuar como moldes para mais uma sntese de DNA nos ciclos subseqentes. Aps cerca de 25 ciclos de sntese de DNA, os produtos da PCR iro incluir, alm do DNA que iniciou a reao, cerca de 105 cpias da seqncia-alvo especfica, uma quantidade que facilmente visualizada como uma banda distinta de tamanho especfico quando submetida eletroforese em gel de agarose (STRACHAN et al., 2002). O processo relativamente simples e fcil de realizar em laboratrio. Os resultados podem ser obtidos em um espao curto de tempo, freqentemente menos do que 24 horas, em contraste com uma anlise do genoma total com Southern, que exige at mesmo semanas. Principais vantagens da tcnica de PCR Velocidade e facilidade de utilizao: a clonagem de DNA por PCR pode ser realizada em poucas horas usando-se um equipamento relativamente simples, cuja funo fundamental a variao de temperatura em cada passo da tcnica. Uma reao de PCR consiste de 30 ciclos contendo as etapas de desnaturao, sntese e pareamento, com cada ciclo individual levando em geral 3 a 5 minutos em um termociclador automatizado, o que totaliza menos de trs horas para todo o processo. Evidentemente, algum tempo tambm necessrio para a construo e a sntese dos oligonucleotdeos que serviro como primers, mas isso foi simplificado pela disponibilidade de programas de computador para projetar primers e pela sntese comercial rpida dos oligonucleotdeos desejados (STRACHAN et al., 2002). Sensibilidade: a PCR capaz de amplificar seqncias a partir de quantidades nfimas do DNA-alvo e, at mesmo, do DNA de uma nica clula. Esta vantagem torna a tcnica particularmente til na anlise forense, quando, em muitos casos, a quantidade de material biolgico, e portanto de DNA extrado de algumas amostras, muito pequena, como em fios de cabelo ou traos de saliva em tocos de cigarro. Desta maneira, a tcnica possibilita a tipagem do DNA em amostras de prova que no poderiam ser analisadas atravs de outras tcnicas, como por exemplo o Southern, uma vez que esta tcnica necessita de uma grande quantidade de DNA total. Alm disso, a pequena quantidade de DNA, necessria para a PCR, torna mais fcil guardar pores de amostras para repetir os testes no mesmo ou em outro laboratrio (DUARTE et al., 2001). Tal sensibilidade excelente tem fornecido novos mtodos para o estudo da origem molecular de doenas e tem encontrado numerosas aplicaes na cincia forense, no diagnstico, na anlise de ligaes genticas, utilizando a classificao de um nico tipo de esperma, e nos estudos
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paleontolgicos em que as amostras podem conter um nmero insignificante de clulas. No entanto, a sensibilidade extrema do mtodo implica que enormes cuidados devem ser tomados para evitar a contaminao da amostra com DNA de outras fontes (STRACHAN et al., 2002). Robustez e possibilidade de anlise de amostras degradadas: a PCR pode permitir a amplificao de seqncias especficas a partir de material no qual o DNA est gravemente degradado ou embebido em um meio onde o isolamento de DNA problemtico. Como o Southern utiliza DNA genmico total, necessrio que este DNA esteja em bom estado, ou seja, que as molculas estejam intactas. Mas em gentica forense, nem sempre as amostras biolgicas so novas e se encontram em um bom estado de conservao, o que compromete a integridade do genoma da clula a ser analisada. Uma vez que somente um fragmento do DNA isolado e amplificado pela PCR, uma enorme vantagem desta tcnica permitir a utilizao, com sucesso, de amostras que contenham DNA degradado. Assim, atravs da PCR, possvel a tipagem do DNA em amostras que de outra maneira no poderiam ser analisadas, como amostras antigas e j decompostas, restos mortais de vtimas de incndios ou acidentes e corpos em decomposio, por exemplo (DUARTE et al., 2001). Principais limitaes da tcnica de PCR Apesar de sua enorme popularidade, uma limitao da tcnica de PCR a questo da contaminao. Se o DNA contaminante estiver presente em nveis comparveis aos do DNA alvo, sua amplificao pode confundir a interpretao dos resultados da tipagem, possivelmente levando a uma concluso errnea (DUARTE e cols, 2002). Com o objetivo de minimizar esta possibilidade, algumas providncias devem ser tomadas, como utilizao de um controle negativo, no qual feita a mesma reao de PCR, mas nenhuma amostra colocada, e a separao fsica das reas do laboratrio destinadas para o trabalho com PCR e com produto j amplificado (BOROVIK et al., 2006). RFLP, VNTR e STR associados PCR A tipagem de RFLP foi a primeira tecnologia usada em testes de DNA forense, sendo adotada para uso em diversos pases. Devido necessidade de uma grande quantidade de DNA no-degradado, a tecnologia RFLP no mais o protocolo de escolha dos laboratrios que realizam testes de DNA forense. O mtodo de PCR tem uma significante vantagem sobre a tcnica anterior de RFLP, baseada em Southern, pois necessita de uma quantidade bem menor de DNA para anlise e, alm disto, um teste muito mais rpido, podendo utilizar amostras muito degradadas, tendo a certeza de resultados satisfatrios (SHULLER et al., 2001). Assim, todos os polimorfismos descritos anteriormente so, atualmente, investigados atravs de PCR. Quando a tipagem de DNA atravs de PCR avaliada, uma srie de vantagens so percebidas. A mais importante delas a de que amostras com alto grau de degradao podem ser analisadas, uma vez que no necessrio que as molculas de DNA estejam intactas, pois a extenso de DNA a ser investigada pequena. Alm disto, outras vantagens so tambm importantes como a possibilidade de utilizao de pequenas quantidades de DNA, a avaliao concomitante de um grande nmero de locos, garantindo um maior poder de discriminao, e a rapidez do procedimento. Enquanto que, na anlise de STRs atravs de PCR, apenas a regio de interesse ser amplificada: com o SouRBAC, vol. 40(1): 17-23, 2008

thern, se fazia necessrio que o DNA genmico inteiro estivesse no gel (KASHYAP et al., 2004). Com o advento dos mtodos automatizados, uma srie de kits comerciais para tipagem de STRs esto disponveis, o que demonstra a importncia destes marcadores na gentica forense. SEQENCIAMENTO MANUAL DE DNA O DNA pode ser seqenciado produzindo-se fragmentos pela interrupo controlada da replicao enzimtica. A DNA polimerase utilizada para copiar uma determinada seqncia de um DNA unifilamentar, como em uma reao de PCR comum. A diferena destas reao que, alm dos quatro desoxirribonucleosdeos (dATP, dTTP, dCTP, dGTP, marcados com radioatividade), a mistura de incubao contm um anlogo 2, 3-didesoxi de um deles. A incorporao desse anlogo bloqueia o posterior crescimento da nova cadeia porque ele no tem a hidroxila 3 terminal necessria para formar a ligao fosfodister seguinte. Assim, so produzidos fragmentos de vrios comprimentos, nos quais o anlogo didesoxi est na ponta 3. A mesma amostra submetida esta reao em quatro eppendorfs diferentes e em cada eppendor existe um dos quatro nucleotdeos modificados diferentes. O resultado final em cada reao so fragmentos de diferentes tamanhos, devido parada da reao a cada vez que o nucleotdeo amplificado incorporado. Estes conjuntos de fragmentos (um para cada anlogo didesoxi) so ento submetidos eletroforese e a seqncia de bases do novo DNA lida na auto-radiografia (STRYER, 1996). MTODOS AUTOMATIZADOS Seqenciamento automtico de DNA Com o crescimento do interesse em desvendar a totalidade dos genomas de diferentes organismos, incluindo o homem, tcnicas mais sofisticadas para o seqenciamento do DNA tiveram que ser desenvolvidas. Os seqenciadores de DNA analisam automaticamente as fitas de DNA previamente amplificadas, cujos didesoxirribonucleotdeos (dNTPs) incorporados na PCR foram previamente marcados com compostos fluorescentes, de diferentes cores para cada dNTP. O produto da PCR aplicado em um gel no interior de um capilar, e assim, a migrao do DNA acontece at passar pelo detector do equipamento. Um feixe de laser rastreia o gel, excitando os marcadores, que emitem luz em um comprimento de onda especfico, de acordo com o corante utilizado. A luz detectada e o padro do espectro analisado com ajuda de programas que permitem gerar as seqncias de DNA (VOET et al., 2002). Usando detectores de fluorescncia controlados por computador, os sistemas automticos podem identificar aproximadamente 10 mil bases por dia, bem mais do que as 50 mil bases por ano obtidas pelos mtodos manuais (VOET et al., 2002). Em gentica forense, o seqenciamento do DNA utilizado principalmente para DNA mitocondrial, que extremamente rico em SNPs, e sem polimorfismos do tipo VNTRs ou STRs. Genotipagem de STRs utilizando o seqenciador automtico Atualmente, entre as tcnicas de tipagem de DNA usadas na identificao humana, a genotipagem automatizada de DNA com STR Multiplex, baseada em fluorescncia , sem dvida, a mais informativa, precisa, robusta e de maior rapidez (KASHYAP et al., 2004). Nesta metodologia, vrios STRs so amplificados utilizando-se vrios pares de primers (PCR multiplex) que compe um kit comercial. O produto da reao de amplificao dos STRs pode ser facilmente detectado atravs de seus res21

pectivos tamanhos, atravs da migrao em gel de eletroforese de alta resoluo, localizado dentro de um capilar, como ocorre no seqenciamento automtico. Quando utilizada a tecnologia de colorao fluorescente com deteco por laser, possvel inclusive avaliar STRs de mesmo tamanho, bastando para isto que cada um seja marcado com uma colorao diferente. Cada kit de PCR multiplex utiliza diferentes coloraes, e amplifica diferentes STRs, como os kits comerciais Profiler PlusTM que analisa simultaneamente 10 marcadores, o kit Power Plex para 16 STRs, e o IdentifilerTM para 16 marcadores (KASHYAP et al., 2004). A tcnica para a anlise de STRs utilizando laser significativamente mais sensvel em comparao a outras metodologias padro. Geralmente necessrio apenas entre 0,5 e 2 ng de DNA para a genotipagem. Somente 1 a 2% dos produtos de 28 ciclos PCR so necessrios para a tipagem allica, o que significa que o material amplificado pode ser estocado para uma nova anlise, quando necessrio. Essas metodologias que utilizam fluorescncia so aproximadamente 200 vezes mais sensveis do que qualquer outra tcnica de colorao (KASHYAP et al., 2004). O DNA MITOCONDRIAL NA IDENTIFICAO HUMANA Embora a grande maioria dos genes se localize no ncleo, um subgrupo pequeno, mas importante, reside no citoplasma, especificamente nas mitocndrias. So eles os genes mitocondriais que exibem herana exclusivamente materna. Todas as clulas humanas possuem centenas de mitocndrias, cada uma contendo vrias cpias de uma pequena molcula circular, o cromossomo mitocondrial (THOMPSON et al., 1993). A principal vantagem do DNA mitocondrial, em comparao com o DNA nuclear, que ele est presente num total aproximado de 500 a 2.000 cpias por clula. Nesse contexto a anlise do DNAmt particularmente til em investigaes criminais, uma vez que esta abundncia oferece uma maior chance de algumas cpias suportarem a degradao das amostras obtidas para a anlise forense. Apesar de o DNA nuclear possuir um timo poder para as identificaes criminais, ele aparece com uma freqncia de apenas duas cpias por clula diplide (ALBUQUERQUE, 2004; PARSONS e COBLE, 2001). Uma caracterstica importante do DNA mitocondrial que ele herdado uniparentalmente, pois apenas as mitocndrias do gameta materno esto presentes no embrio e conseqentemente no indivduo adulto. Sendo assim, as relaes familiares pela linhagem materna so reconhecidas facilmente (ALBUQUERQUE, 2004; SCHULLER et al., 2001). Os alvos do seqenciamento do DNA mitocondrial so duas regies especficas do cromossomo, denominadas de regies hipervariveis I e II (HV1/HV2). A taxa de mutao nestas regies de cinco a dez vezes maior em comparao com o DNA nuclear. Espcimes biolgicos so analisados comparando o polimorfismo encontrado nas regies HV1 e HV2 com aqueles encontrados na linhagem materna, ou a partir de um banco de dados evolucionrio, biolgico ou antropolgico da populao, quando se deseja enquadrar um suspeito em algum grupo tnico, por exemplo, uma vez que cada populao de origem distinta possui um conjunto especfico de SNPs nesta regio (KASHYAP et al., 2004; PARSONS e COBLE, 2001). Entretanto, deve-se levar em conta que a tipagem de DNA mitocondrial s dar um resultado correto e definitivo se a variao do DNA do indivduo em questo for concordante com a de seus parentes maternos (PARSONS e COBLE,
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2001), pois uma vez que a taxa de mutao muito alta, uma diferena de seqncia no significa necessariamente que os indivduos comparados no sejam relacionados. O CROMOSSOMO Y NA IDENTIFICAO HUMANA Assim como a anlise do DNAmt muito utilizada em questes relacionadas linhagem materna, a anlise de STRs do cromossomo Y tem sido uma excelente tcnica usada em identificaes humanas para solucionar disputas de paternidade de filhos do sexo masculino, uma vez que o mesmo caracterstica nica da linhagem paterna. O cromossomo Y presente no DNA nuclear, encontra-se com uma freqncia de apenas uma cpia por clula e transmitido para todos os descendentes masculinos. Investigaes de STRs do cromossomo Y tem sido teis, por exemplo, em casos de estupro, onde so encontradas misturas de secreo vaginal com smen (KASHYAP et al., 2004). Kits comerciais para tipagem STR-Y tornaram-se recentemente disponveis pela empresa Relia Gene tecnologies, Inc. Uma caracterstica particularmente til destes kits a escala allica que permite a identificao de alelos em amostras com comparao direta. Os kits Y-PLEXTM6 e YPLEXTM5, fazem a tipagem de 6 e 5 locos de STR-Y respectivamente. O Instituto nacional de Padronizao e Tecnologia (NIST) U.S.A. tambm desenvolveu um sistema de 20PLEX p/ tipagem STR-Y que permite a amplificao simultnea de 20 STRs em uma nica reao (KASHYAP et al., 2004; WALSH, 2004). BANCOS DE DADOS DE DNA FORENSE Em termos de aplicaes forenses especficas, de tecnologias moleculares, nada teve um efeito mais profundo do que a implementao global dos bancos de dados de DNA forense. Eles tm alterado a paisagem do sistema de justia criminal e remodelado o campo da cincia forense, principalmente por fornecerem a chance da identificao de indivduos e resoluo de casos em que no existem suspeitos, e portanto, no existem amostras para serem comparadas com o material coletado na cena do crime. Com o fornecimento de novos desafios de mecanismos pelos quais as provas forenses podem ser utilizadas, o nus de responsabilidade daqueles que administram seu uso, tem aumentado. Os bancos de dados necessitam de um nvel apropriado de sofisticao e tambm um bom suporte legislativo, poltico e financeiro (WALSH, 2004). O primeiro banco de dados de perfis genticos de criminosos foi criado na Inglaterra mas, sem dvida, o banco mais importante, criado pelo FBI nos Estados Unidos, o Sistema de ndice de DNA Combinado (Codis). Ele comeou como um projeto piloto em 1990 e ganhou impulso com o DNA Identification Act de 1994, que deu ao FBI a autoridade de estabelecer um banco de dados em nvel nacional para fins de investigao criminal. O sistema estruturado em laboratrios estaduais com uma coordenao central. Existem dois arquivos diferentes de perfis genticos com objetivos complementares. O ndice Forense (Forensic Index) contm atualmente 96.473 perfis genticos obtidos a partir de cenas de crimes e o ndice de Criminosos (Offender Index) contm 2.072.513 perfis genticos de criminosos condenados por crimes sexuais e outros crimes violentos. At dezembro de 2004, o Codis havia permitido 19 mil identificaes de suspeitos, demonstrando sua grande utilidade (PENA, 2005). O Brasil deveria estabelecer como uma prioridade nacional implementao de um programa eficiente de determiRBAC, vol. 40(1): 17-23, 2008

nao de identidade gentica que possa ajudar em investigaes criminais e aumentar a segurana pblica. De acordo com Pena (2005), as seguintes etapas seriam de grande importncia: montar uma rede eficiente de laboratrios de DNA forense; fazer treinamento da polcia para coleta correta da evidncia em cenas de crime; fazer treinamento dos profissionais que atendem nas delegacias e nos servios de urgncia mdica para que possam providenciar de maneira correta a coleta de evidncia de vtimas de estupro; fazer treinamento de juzes de vara criminal e promotores para entenderem os princpios da tipagem de DNA com fins forenses; montar um banco nacional de perfis gentico semelhante ao Codis do FBI. LIMITAES QUANTO AO USO DO DNA Quando gmeos idnticos so suspeitos de crime em que o autor deixou vestgios, o DNA em nada poderia colaborar para a elucidao do delito, uma vez que no consegue distingu-los por serem geneticamente idnticos. Neste caso a datiloscopia convencional seria til, se dentre os vestgios deixados, existissem impresses digitais (BONACCORSO, 2004). As condies de preservao do material biolgico de um cadver carbonizado ou que tenha ficado por muito tempo submerso no mar, muitas vezes no permitem, atravs da anlise do DNA, que se alcancem dados com significncia estatstica para que se possa afirmar sua identidade, ao passo que neste sentido seria mais significativo o exame de sua arcada dentria (BONACCORSO, 2004). Outro ponto importante a ser abordado sobre as limitaes do DNA, principalmente na rea criminal, diz respeito a peculiaridades da anlise. Muitas vezes, qualquer vestgio de roupas coloridas, que possa ser encontrado nas evidncias biolgicas, acabam inibindo a reao de PCR (BONACCORSO, 2004). Apesar de certas limitaes da anlise de DNA, deve-se acima de tudo enfatizar sua importncia como prova extremamente poderosa, se realizada segundo as recomendaes tcnicas exigidas (BONACCORSO, 2004). CONCLUSO A anlise do DNA um dos maiores progressos tcnicos da investigao criminal desde a descoberta das impresses digitais. Mtodos para determinar o perfil do DNA esto firmemente embasados na tecnologia molecular. Quando a determinao do perfil feita com cuidados adequados, os resultados so altamente reprodutveis (DUARTE et al., 2001). Os mtodos baseados na PCR so imediatos, requerem apenas uma pequena quantidade de material e podem fornecer identificao no-ambgua de alelos individuais. Assim, vrios mtodos de PCR, particularmente os que usam os STRs, esto sendo cada vez mais usados. (DUARTE et al., 2001; GOES et al., 2002). A tecnologia do perfil e os mtodos relacionados anlise de DNA progrediram a ponto de no colocar em dvida a admissibilidade dos dados sobre o DNA quando adequadamente coletados e analisados (DUARTE et al., 2001). No futuro, espera-se que as tcnicas de biologia molecular existentes sejam aprimoradas e que novos e melhores mtodos para anlise sejam desenvolvidos, a fim de que a grande maioria dos casos de investigaes forenses cveis e criminais tenham um desfecho que no possa ser questionado nos tribunais.
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