VALIDACIN Y CONFIRMACIN DE MTODOS 2011 Versin 1 Introduccin El objetivo final de la validacin de un mtodo analtico es asegurar que los resultados

s de las mediciones en los anlisis de rutina se encuentran lo suficientemente cerca del valor verdadero (desconocido) del contenido del analito en la muestra. El laboratorio elige los mtodos de ensayo de acuerdo con las reglamentaciones vigentes (cuando es pertinente), de acuerdo con los requisitos del usuario final (cliente), o a requerimiento de ste. Una vez elegido el mtodo existen tres posibilidades: a) Que el mtodo sea normalizado y se aplique tal cual dice la norma. b) Que el mtodo sea una modificacin de un mtodo normalizado. c) Que el mtodo se haya desarrollado en el laboratorio o se haya obtenido de bibliografa. Segn el caso elegido, el alcance de la validacin ser diferente: Mtodo a) Normalizado Parmetros de Validacin repetibilidad, veracidad, incertidumbre, lmite de deteccin (si aplica), carta de control (material de referencia), participacin en ensayos de aptitud. Dependiendo de la modificacin, se evalan que parmetros deben ser verificados. Evaluar todos los parmetros posibles, dependiendo del mtodo.

b) Modificacin de un mtodo normalizado c) mtodo propio

2) Parmetros de validacin. Selectividad Linealidad Lmite de deteccin, Nivel crtico. Lmite de cuantificacin Precisin (repetibilidad y precisin intermedia) Veracidad Rango de trabajo Robustez Incertidumbre de medicin Sesgo Repetibilidad

Parmetro Selectividad Linealidad L.de deteccin L.de cuantific. Precisin Veracidad Rango Robustez Incertidumbre

Parmetros a validar segn el mtodo (caso c) Tipo de mtodo Componentes Cualitativo Trazas mayoritarios x x x x depende x x x x x x x x x x x x x x

Propiedad fsica depende x x x x x

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Efecto de las modificaciones al mtodo de ensayo sobre los parmetros de validacin (caso b) Mtodo de extraccin Selectividad, veracidad Matriz de la muestra Selectividad, veracidad, precisin, LD, LQ Extensin del rango Linealidad, precisin Cambios en el pH Robustez Cambio de operador Repetibilidad, veracidad Sistema de deteccin Selectividad, linealidad, rango de trabajo

3) Determinacin de los parmetros de validacin. 3.1) Selectividad especificidad. Segn la tcnica analtica utilizada, se harn estudios de selectividad teniendo en cuenta lo siguiente: Como es impracticable considerar todas las interferencias posibles, se aconseja estudiar los casos ms importantes (que produzcan ms interferencia) y probables. La selectividad de un mtodo puede expresarse cuantitativamente por medio de la razn mxima tolerada (maximum tolerated ratio - Trmx), que es la relacin entre la concentracin de interferencia (Cint) respecto del analito (Ca), que produce un desvo en la respuesta analtica que produce un sesgo en la estimacin de la concentracin del analito que cae fuera del intervalo de confianza que deriva del clculo de la incertidumbre expandida. Esto no siempre es aplicable ya que previamente hay que conocer la naturaleza de las posibles interferencias para poder realizar el ensayo. Llevar a cabo anlisis de: a) Blanco de reactivos. b) Soluciones de analito en el solvente adecuado segn la tcnica y en concentraciones similares a las presentes en las muestras de ensayo. c) Matriz libre de analito. (de ser necesario, preparar una matriz sinttica a partir de los conocimientos previos de la muestra). d) Matriz con agregado de analito (usar concentraciones similares a b). 3.2) Linealidad Si corresponde, segn el mtodo analtico, realizar curva de calibracin de acuerdo a lo siguiente. a) El analista determina el mbito lineal en funcin de los conocimientos previos de la magnitud a medir. Este debe ser tal que en la medida de lo posible caiga aproximadamente en el centro de la curva. b) Analizar al menos seis puntos de la curva, incluido el blanco. c) Los puntos debern estar igualmente espaciados. d) Hacer tres replicados de cada punto, en lo posible de manera aleatoria. Evaluar la linealidad del mtodo por medio de una inspeccin visual de la recta, grfico de residuos y estadstica de la regresin. En funcin de los resultados obtenidos y de las caractersticas de la muestras, se determinar posteriormente la estrategia a seguir en las mediciones de rutina, es decir, el uso de un solo punto, algunos o todos los puntos de la calibracin.

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Estimacin de los parmetros de la regresin: Medir las respuestas analticas de los patrones de concentracin conocida, por triplicado (n=3). Para el caso en que se miden 6 patrones por triplicado, el nmero de niveles de diferentes concentracin (p) es 6, y el nmero total de puntos de la recta de calibrado (m) es 18. El anlisis de los datos, implica el clculo de la pendiente A y la ordenada al origen B de la recta de regresin, ajustada a la ecuacin y = A x + B . Los valores estimados de A y B se calculan mediante:

A=

Qxy Qxx

( x x)( y y)
i =1 i i

( x x)
i =1 i

(1)
2

B = y A x

(2)

donde xi es la concentracin de cada uno de los m patrones, x es el promedio de las concentraciones de calibrado, yi es la respuesta en cada punto e y es el promedio de las respuestas de los patrones de calibrado. Adems de A y B, se calcula el desvo estndar de estos parmetros, mediante las siguientes frmulas:
sA = sy/ x Qxx

(3)

sB = s y / x

1 x + m Qxx

(4)

siendo el desvo estndar de los residuos de la regresin:

sy / x =

y) (y 
i =1 i

m2

(5)

y i representa la respuesta estimada en donde yi es la respuesta experimental a cada patrn e  y = Ax + B . cada punto, o sea, 
i i

Estos parmetros dan una idea de la bondad de la regresin. Es deseable que s y / x sea lo ms pequeo posible, a pesar que su valor est limitado por el ruido instrumental. La distribucin de y ) debe ser analizada, hacer un grfico los residuos, es decir el modo en que los valores ( yi  para ver la adecuacin de los datos al modelo lineal. Observacin: el coeficiente de correlacin, a pesar de su amplio uso como indicador de linealidad, resulta engaoso e inapropiado para este fin, y no debe ser usado (ref 2 A3)

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3.3) Lmites de deteccin y cuantificacin. El lmite de deteccin que es la mnima concentracin detectable de manera confiable por la tcnica, se calcula en funcin del desvo estndar de la concentracin predicha para una muestra blanco (s0). Para estimar este valor, se usa la siguiente ecuacin: s0 = sy / x A 1 1 x + + n m Qxx
2

(6)

usualmente se usa n=3, como ya se mencion antes. El lmite de deteccin es igual a: LOD = 2 t 0,05;m-2 s0 El valor t, se obtiene de la tabla de distribucin Student:
TABLA 1 Dist t 1 cola alfa=0,05 GL t GL t 1 6,31 13 1,77 2 2,92 14 1,76 3 2,35 15 1,75 4 2,13 17 1,74 5 2,02 18 1,73 6 1,94 20 1,72 7 1,89 23 1,71 8 1,86 27 1,70 9 1,83 32 1,69 10 1,81 39 1,68 11 1,80 52 1,67 12 1,78 77 1,66 infinito 1,64

El lmite de cuantificacin LOQ, que es la mnima concentracin cuantificable en forma confiable, se toma como la concentracin correspondiente a 10 veces el desvo estndar: LOQ = 10 s0 Por lo que se asegura que el desvo estndar relativo (DSR) para una concentracin igual al LOQ sea del 10%, el que se toma como el mximo DSR aceptable para cuantificar.

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3.4) Precisin y precisin intermedia. Es conveniente (en caso que sea posible) utilizar tres niveles de concentracin (bajo, medio, alto) cubriendo el rango de trabajo con un nmero n de replicados en cada nivel de concentracin m. Es conveniente que n se encuentre entre 2 y 5. Se analizan n replicados de cada muestra de nivel m durante un mnimo de 5 das ( p). No es necesario que sean das seguidos. Con estos datos se realiza un anlisis de la varianza (ANOVA) del cual se puede obtener una estimacin de la repetibilidad (precisin) y precisin intermedia, y compararlas, considerando los diferentes das como principal fuente de variacin. Clculo de la varianza de repetibilidad:

S r2 =

( z
i =1 j =1

ij

zi ) 2

p (n 1)

(7)

siendo z i =

z
j =1

ij

la varianza entre das se calcula:

2 = SB

(z
i =1

z )2
n

p 1
p i =1 j =1

S r2 n

(8)

siendo z =

z
pn

ij

y la varianza de precisin intermedia se calcula:

2 2 S Ri = S r2 + S B

(9)

Calcular los desvos estndar de las varianzas mencionadas, obteniendo la raz cuadrada de las mismas. Calcular los desvos estndar relativos para cada parmetro:
RSDr = RSDRi = SDr z SDRi z

(10) (11)

Para comparar la variabilidad entre das con la repetibilidad, se hace un test de Fischer: 2 Se calcula la varianza entre das ( sE ) pero sin corregir por la repetibilidad ( sr2 ):

2 SE Sr2 p 1 el valor F, se compara con el de la tabla F para =0.05 con p-1 grados de libertad en el numerador y pn-p grados de libertad en el denominador.(Tabla 2). 2 SE =

(z
i =1

z )2

ni

y se calcula es estadstico F: F =

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Tabla 2 GL Num GL Den 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 30 35 40 50 60 80 100 1 Tabla de Fischer 2 3 4 199 19,0 9,55 6,94 5,79 5,14 4,74 4,46 4,26 4,10 3,98 3,89 3,81 3,74 3,68 3,63 3,59 3,55 3,52 3,49 3,47 3,44 3,42 3,40 3,39 3,32 3,27 3,23 3,18 3,15 3,11 3,09 216 19,2 9,28 6,59 5,41 4,76 4,35 4,07 3,86 3,71 3,59 3,49 3,41 3,34 3,29 3,24 3,20 3,16 3,13 3,10 3,07 3,05 3,03 3,01 2,99 2,92 2,87 2,84 2,79 2,76 2,72 2,70 225 19,2 9,12 6,39 5,19 4,53 4,12 3,84 3,63 3,48 3,36 3,26 3,18 3,11 3,06 3,01 2,96 2,93 2,90 2,87 2,84 2,82 2,80 2,78 2,76 2,69 2,64 2,61 2,56 2,53 2,49 2,46 5 230 19,3 9,01 6,26 5,05 4,39 3,97 3,69 3,48 3,33 3,20 3,11 3,03 2,96 2,90 2,85 2,81 2,77 2,74 2,71 2,68 2,66 2,64 2,62 2,60 2,53 2,49 2,45 2,40 2,37 2,33 2,31 alfa = 0,05 6 7 234 19,3 8,94 6,16 4,95 4,28 3,87 3,58 3,37 3,22 3,09 3,00 2,92 2,85 2,79 2,74 2,70 2,66 2,63 2,60 2,57 2,55 2,53 2,51 2,49 2,42 2,37 2,34 2,29 2,25 2,21 2,19 237 19,4 8,89 6,09 4,88 4,21 3,79 3,50 3,29 3,14 3,01 2,91 2,83 2,76 2,71 2,66 2,61 2,58 2,54 2,51 2,49 2,46 2,44 2,42 2,40 2,33 2,29 2,25 2,20 2,17 2,13 2,10 8 239 19,4 8,85 6,04 4,82 4,15 3,73 3,44 3,23 3,07 2,95 2,85 2,77 2,70 2,64 2,59 2,55 2,51 2,48 2,45 2,42 2,40 2,37 2,36 2,34 2,27 2,22 2,18 2,13 2,10 2,06 2,03 9 241 19,4 8,81 6,00 4,77 4,10 3,68 3,39 3,18 3,02 2,90 2,80 2,71 2,65 2,59 2,54 2,49 2,46 2,42 2,39 2,37 2,34 2,32 2,30 2,28 2,21 2,16 2,12 2,07 2,04 2,00 1,97 10 242 19,4 8,79 5,96 4,74 4,06 3,64 3,35 3,14 2,98 2,85 2,75 2,67 2,60 2,54 2,49 2,45 2,41 2,38 2,35 2,32 2,30 2,27 2,25 2,24 2,16 2,11 2,08 2,03 1,99 1,95 1,93

161 18,5 10,13 7,71 6,61 5,99 5,59 5,32 5,12 4,96 4,84 4,75 4,67 4,60 4,54 4,49 4,45 4,41 4,38 4,35 4,32 4,30 4,28 4,26 4,24 4,17 4,12 4,08 4,03 4,00 3,96 3,94

Este mismo estudio de comparacin de varianzas, puede realizarse utilizando las herramientas estadsticas de Excel Anlisis de la varianza de un factor. Si el valor F calculado es mayor que el F de tabla, quiere decir que hay diferencia significativa entre las varianzas y esto requiere un estudio para analizar las causas de tal diferencia y su posterior eliminacin.

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3.5) Veracidad Se puede estimar a partir de estudios interlaboratorios, materiales de referencia certificados, o sobre material fortificado (Spike). En caso que se cuente con un material de referencia certificado (MRC) se realizan un nmero n de determinaciones del mencionado material. Cada determinacin incluye todo el proceso analtico. Si no se cuenta con el MRC, se realiza un fortificado sobre una matriz sin analito, o sobre una muestra que contiene analito, pero deber realizarse el anlisis antes y despus del fortificado. Se determina el sesgo de la siguiente forma:
Sesgo = X X ref

(12)
X X ref

o expresado como recuperacin: R =

(13)

Se evala mediante una prueba t si la diferencia es estadsticamente significativa (=0,05)

t= X X ref s (uref ) + ( ) 2 n
2

(14)

siendo: Xref: Valor del MRC X : promedio de las determinaciones experimentales. Uref: incertidumbre estndar del valor de referencia. S: desviacin estndar de las determinaciones experimentales. N: nmero de determinaciones experimentales. El valor de t, se compara con el valor tabulado para n-1 grados de libertad y nivel de significacin =0,05. (TABLA 3)

TABLA 3 GL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Dist t 2 colas alfa=0,05 t GL t 12,71 13 2,16 4,30 14 2,14 3,18 15 2,13 2,78 16 2,12 2,57 17 2,11 2,45 18 2,10 2,36 19 2,09 2,31 20 2,09 2,26 21 2,08 2,23 22 2,07 2,20 23 2,07 2,18 24 2,06

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Si el valor del t calculado es menor que el t de la tabla, se concluye que no hay diferencia significativa. Si existiera diferencia significativa, los resultados de las mediciones se corregirn por el factor correspondiente o si se decide no corregir, el sesgo se contemplar en el clculo de la incertidumbre de la medicin. Ver el procedimiento de clculo de incertidumbre, para la inclusin de estos datos en su clculo, como as tambin los datos obtenidos de estudios interlaboratorios. Muestras fortificadas: Proceder de manera similar, aunque en este caso, hay que calcular la incertidumbre de la muestra fortificada que se calcula combinando la incertidumbre del certificado del fabricante, y la incertidumbre debida al procedimiento de fortificado. Ver procedimiento de clculo de incertidumbre. Recordar que se pueden combinar incertidumbres que tengan las mismas unidades, caso contrario hay que transformarlas en incertidumbres relativas, hacer la combinacin de las incertidumbres, y luego volver a transformarla en incertidumbre estndar para aplicar la frmula (14). 3.6) Rango de trabajo El rango de trabajo queda definido en funcin del intervalo de valores de la magnitud que fue evaluado en los puntos precisin y veracidad. 3.7) Robustez Personal responsable del laboratorio, establecer qu parmetros del mtodo de ensayo podran ser crticos y se realizarn ensayos con dichos parmetros modificados. Se realizar una cantidad n de ensayos (mnimo 3) en las condiciones habituales del mtodo y una cantidad igual de ensayos con los parmetros modificados. Se calcularn las medias y los desvos estndar de ambos grupos de mediciones y se realizar una prueba t para diferencia de medias. Si el valor del estadstico t es mayor que el valor crtico para un =0.05 y 2(n-1) grados de libertad, se considerar que el parmetro modificado afecta la medicin. t= X1 X 2

(15) 2 s12 + s2 n t: estadstico t, se compara con el valor de la tabla 3 para 2(n-1) GL. Si el t calculado es mayor que el t de la tabla, se considera que el factor modificado afecta a la medicin. Alternativamente, si existieran varios factores a considerar, se podr realizar un anlisis de la varianza de dos o ms factores, utilizando un diseo factorial. En este ltimo caso, deber intervenir personal con los conocimientos estadsticos adecuados. 3.8) Incertidumbre de medicin Ver clculo de incertidumbre por separado en otro documento. 3.9) Sesgo ver 3.5 3.10) Repetibilidad ver 3.4
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4) Informe de validacin Se realiza un informe de validacin, en el que se indicar la siguiente informacin: Alcance de la validacin: Parmetro a medir (analito, propiedad fsica o qumica, ndice, etc), matriz de la muestra y rango de validacin. Instrumental utilizado. Detallar los equipos utilizados y su identificacin. Detallar otros materiales como ser matraces, buretas, etc y su correspondiente identificacin. Muestras utilizadas, materiales de referencia y reactivos indicado el lote siempre que sea posible. Personal involucrado en las mediciones y que realiz el informe de validacin (nombre y apellido). Las mediciones realizadas incluyendo los registros que correspondan (por ej cromatogramas). En caso de utilizar equipos similares, especificar en qu equipo se hizo cada medicin. Los resultados obtenidos y las conclusiones. Fecha, firma y aclaracin del personal responsable de aprobar el informe. Referencias (1) Gua para validacin de mtodos de ensayo. DC-LE-05 V.2 11/06/2008 O.A.A. (2) Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis. Pure Appl. Chem., Vol. 74, No. 5, pp. 835-855, 2002 M. Thompson et al. (3) A practical guide to analytical method validation, including measurement uncertainty and accuracy profiles. A Gustavo Gonzlez, M. ngeles Herrador. Trends in Analytical Chemistry, Vol. 26, No. 3, 2007.

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INFORME DE VALIDACIN 1) Alcance: Parmetro a medir: Rango: Matriz: 2) Instrumental utilizado: Equipos: Otro instrumental:

3) Muestras patrn, estndares y/o materiales de referencia.

4) Reactivos: Droga: 5) Mediciones:

Fabricante:

Lote:

6) Resultados:

7) Conclusiones:

8) Personal involucrado

9) Elaborado por:

Fecha:

10) Aprobado por:

Fecha:

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