Ambil darah (WBC) dari vena 3 mL, masukkan dalam tabung reaksi yang sudah berisi sedikit EDTA,

kocok hingga homogen untuk mencegah penggumpalan. Simpan dalam lemari es (bukan freezer) atau termos berisi es batu. ISOLASI DNA Gunakan/siapkan 2 tabung untuk 1 sampel

1) 2) 3) 4)

5) 6) 7)

8) 9) 10) 11) 12)

13)

Masukan 450 l cell lysis solution ke dalam tabung microcentrifuge steril Tambahkan 150 l darah dan tabung diputar bolak-balik 5-6 kali untuk homogenesi & Inkubasi campuran di atas selama 10 menit dalam suhu ruang dengan steerer Sentrifugasi 13.000 rpm selama 1 menit, buang supernatant (dituangkan saja keluar) Tambahkan 150 l nuclei lysis solution ke pellet. Pipet larut 5-6 kali untuk melisiskan sel darah putih dan inti sel. Larutan harus benar-benar jadi kental,inkubasi campuran tersebut pada suhu 37 C sampai 2-3 menit (butiran tersebut hilang). Tambahkan 0,75 l RNase solution dan campurkan dengan cara membolak balik tabung, inkubasi campuran pada suhu 37 C selama 15 menit Tambahkan 50 l protein precipitation solution dan vortex selama 20 detik Sentrifugasi 13.000 rpm 3 menit . Pindahkan supernatant kedalam tabung microcentrifuge bersih (diruangkan saja ke dala) yang sudah berisi 500 l 2-propanol/isopropanol. Bolak balik tabung secara perlahan sampai terlihat benang-benang putih halus (DNA). Sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 2 menit. Akan terlihat pellet putih.Buang supernatant (dituangkan saja keluar) Cuci pellet dengan 200 l alcohol 70% dingin. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm 2-3 menit, buang supernatant (dituangkan + mengunakan mikropipet untuk sisanya) kering anginkan pellet DNA pada suhu ruang 5-10 menit Larutan DNA dengan 50 l rehydration solution, sempurnakan rehidrasi dengan vortex hingga larut atau inkubasi 65 C selama 1 jam (bervariasi, yang penting DNA larut dan tak terlihat benangnya) Simpan DNA pada suhu -20 C.

PCR 1. Siapkan tabung PCR 0,2 mL untuk setiap sampel dimasukkan dalam pemegang (holder) mini sentrifuge, posisikan pada pecahan es batu halus, agar suhu terjaga dingin. 2. Masukkan ke setiap tabung 1,25 l Primer Forward secara benar tepat di dasar tabung

(tidak perlu mengganti pipet untuk setiap pengisian tabung) 3. Masukkan ke setiap tabung 6,25 l GoTaq Green Master Mix secara benar tepat di atas Primer Forward (tidak perlu mengganti pipet untuk setiap pengisian tabung) 4. Masukkan ke setiap tabung 2 l sampel DNA secara benar tepat di atas GoTaq Green Master Mix (harus mengganti pipet untuk setiap pengisian

tabung/sampel) 5. Masukkan ke setiap tabung 16,5 l campuran Buffer pH 8+MgCl2+Water+Primer Reverse secara benar tepat di atas sampel DNA (harus mengganti pipet untuk setiap pengisian tabung/sampel)

6. Siapkan mesin PCR serta laptop yang sudah membuka software (pilih menu

salt

rendah 40 x cycle pada window yang muncul, cari di bawah)

7. Segera tanpa membuang waktu, masukkan sample pada PCR 36-well serta pasang

pengaman tutup tabung dan tempatkan kembali ke dalam wadah pecahan es batu

(yakinkan campuran PCR menyatu dan berada didasar tabung, bila tidak maka ketuk-ketuk kecil, jangan disentrifus)
8. Segera tanpa membuang waktu masukkan PCR 36-wel yang sudah berisi sampel ke

dalam mesin PCR dan jalankan PCR (beri nama sampel sesuai pengisian sampel DNA)
ELEKTROFORESIS 1. Siapkan marker dengan mencampur 5 L marker + 1 L lading dye (sentrifus 20 detik) 2. Siapkan PAGE pada chamber dengan possisi kaca melengkung menghadap buffer atas (klem pakai klem kecil), semprotkan 1 mL buffer dari chamber atas ke dalam setiap kolom masingmasing 2x semprot hingga setiap kolom terhubung dengan buffer atas dengan genangan buffer 3. Isikan setiap kolom dengan marker 6 L serta hasil PCR 10 L (pastikan terisi dengan rapi dan berada di dasar kolom) 4. Jalankan elektroforesis dengan tegan 100 V selama 60 menit (arus 20 mA, 120 watt)

STAINING 1. Buka kaca PAGE hati-hati agar gel tidak robek, lepas gel yang menempel pada 1 sisi kaca menggunakan stick hitam sedikit demi sedikit dengan setiap pembukaan ditumpukkan ke atas sehingga semua terlepas dengan posisi gel seperti bergulung. 2. Tempatkan pada wadah staining, isi fixator (asam asetat+methano)l 100 mL, Steering selama 30 menit 3. Buang larutan, cuci dengan aquadest 200 mL steering 10 menit, buang aquadest dan cuci kembali dengan aquadest baru 200 mL, steering 3 menit 4. Buang Aquadest, masukkan 100 mL perak (AgNO3) steering 20-30 menit 5. Buang Perak (AgNO3), cuci dengan aquadest 250 mL steering 20 detik. 6. Buang aquadest, masukkan Pengembang (Na2CO3) 100 mL, goyang-goyang menggunakan tangan 3-5 menit perlahan-lahan akan tampak pita DNA, masukkan kertas seukuran gel ke dalam larutan tepat dibawah gel, angkat jika sepenuhnya kertas telah menjadi alas sepenuhnya bagi gel (hentikan/buang larutan sebelum warna gel

7.

semakin gelap, namun pastikan pita DNA target yaitu alel dan semua marker sudah tampak, targer antara pita 1-4 marker) Ukur secara tepat panjang lintasan dari dasar kolom-garis pita hingga akurasi 0,05 cm
(misal 2,85 cm), demikian juga pita tiap marker.

OPTIONAL 1. Masukkan 100 mL Stopper, steering 10 menit 2. Pindahkan Stopper (jangan dibuang, bisa digunakan lagi) tambahkan Completing dan steering 10 menit (Completing jangan dibuang, bisa dipakai lagi) REAGEN I. PRIMER FORWARD & REVERSE 10 M 10 L stock prmier 100 uM + 90 L nuclease free water BUFFER pH 8 0,0242 gr tris Tambahkan 16 mL aquadest Sedikit demi sedikit titrasi HCl dengan pengaduk meter, tambahkan aquadest 4 mL III. CAMPURAN BUFFER Ph 8 + MgCl2 + WATER + PRIMER REVERSE (untuk 20 reaksi) 250 L BUFFER Ph 8 42,5 L nuclease free water 12,5 L MgCl2, 50 mM 25 L primer reverse 10 uM TBE 10x Buat EDTA 0,5 M 0,9305 gr EDTA + 0,1 gr NaOH (ditumbuk) tambahkan aquadest hingga 4 mL (pastikan larut sempurna) 10,8 gr tris 5,5 gr asam borat 4 mL EDTA 0,5 M

II.

dicelupkan (sebelum dicelup ke buffer, HCl dipercikkan dengan ayunan tangan) hingga pH 8 pakai pH

IV.

(pastikan larut sempurna)

TBE 5x Encerkan stock 10x dengan pengenceran 2x TBE 1x Encerkan stock 10x dengan pengenceran 10x V. Acrilamid-bisakrilamid 30% 29 gr acrilamid 1 gr bis-acrilamid Tambahkan aquadest hingga 100 mL Ammonium Peroxy Sulfat 10% 2 gr Amonium Peroxy Sulfat Tambahkan aquadest hingga 20 mL

VI.

MEMBUAT PAGE I. Casting/cetakan Buat 2 cetakan dengan lempeng kaca segiempat utuh dipinggirnya ditempelkan ketat karet pada 3 sisi (2 sisi samping, 1 sisi bawah) tahan dengan tangan kiri (jika

anda pengguna tangan kanan/bukan kidal) pada jari jempol dan manis di kedua sisi samping, tempatkan stick pipih pada kedua sisi samping
tepat bersentuhan dengan karet (bagian yang karetnya menyembul). Tumpukkan lempeng kaca bertekuk dengan sisi tekuk sebagai atas terhadap lempeng kaca yang sebelumnya telah disusun (bagian yang tidak tertutup karet adalah atas), pastikan simetris (dengan mengaturnya pada bidang datar keramik). Klem ketiga sisi (dengan klem besar) yang tertutup karet. Membuat Gel 20 mL untuk 2 gel 4 mL TBE 5x 3,33 mL acrilamid-bisacrilamide 30% 200 L Ammonium Peroxy Sulfat 10% Tambahkan aquadest hingga 20 mL, pindahkan pada gelas beker Siapkan secara pasti kedua cetakan (casting) dalam posisi siap diisi, pipet ukur 10 mL serta campuran di atas. 17 L TEMED dimasukkan dalam campuran aduk segera dan segera ambil dengan pipet ukur sebanyak 10 mL segera masukkan dalam cetakan pertama, bila ada lebihnya maka masukkan ke cetakan kedua. Segera Ambil lagi 10 mL sisanya dan masukkan ke cetakan kedua. Segera kosongkan isi pipet ukur yang tersisa ke beker glass agar tidak tersumbat nanti. Segera masukkan sisir pencetak kolom hingga batasnya yang menonjol. Pastikan kembali pipet ukur dibersihkan dengan menghisap air biasa kemudian disemprotkan minimal 2x pembilasan (SEMUANYA DILAKUKAN

II.

DALAM WAKTU SESINGKAT-SINGKATNYA, KARENA SETELAH PENAMBAHAN TEMED AKAN SEGERA TERJADI POLIMERISASI MEMBENTUK GEL YANG APABILA TELAT MAKA TAK BISA DIHISAP PIPET UKUR)
Tunggu 30-45 menit gel akan terbentuk kokoh, cabut sisir, lepaskan ketiga klem dan karet (yang tersisa adalah gel dan kedua stick pipih didalam kedua lempeng kaca. LARUTAN STAINING I. Fiksator 500 mL 250 mL methanol 50 mL Acetat Acid 100% Tambahkan aquadest hingga 500 mL II. Staining Perak 500 mL 500 L formaldehyde 37%

0,5 gr AgNO3 Tambahkan aquadest hingga 500 mL

III. Pengembang Staining 500 L formaldehyde 37%

12,5 gr Na2CO3 (Natrium Carbonat) 0,0010 gr Na2S2O3.5H2O (Na-Thiosulfat pentahydrate)

Tambahkan aquadest hingga 500 mL Simpan dalam kulkas (bukan freezer), bila hendak digunakan keluarkan agar seseaui dengan suhu ruang (bila masuk Lab dan berniat

menggunakannya keluarkan saja dari awal agar tidak kelupaan dan seiring waktu berjalan, larutan siap pakai)
IV. Stopper 10 gr glycine 2,5 gr EDTA Tambahkan aquadest hingga 500 mL Completing 28,75 mL glycerol 87% Tambahkan Aquadest hingga 500 mL (akhir Glycerol 5%)

V.