RESUMEN

Colombia es un pas tropical con una gran diversidad microbiana que puede
ser aprovechada en la produccin de numerosos compuestos de amplia
aplicacin mdica y comercial. Entre estos productos se encuentra el xilitol,
un edulcorante natural que ofrece un gran potencial como sustituto de la
sacarosa, debido a sus propiedades qumicas y a los beneficios que ofrece
a la salud. En el presente trabajo se aislaron cepas nativas de levaduras
potencialmente productoras de xilitol, a partir de diversas fuentes propicias
para su desarrollo. Los aislamientos se realizaron utilizando un medio
selectivo con xilosa como nica fuente de carbono. De un total de 78 aisla-
dos, se preseleccionaron 25 cepas nativas de levaduras. Se utiliz el kit API
20C-AUX para la identificacin bioqumica de los microorganismos selec-
cionados, con el cual fue posible identificar el 84% de las levaduras aisla-
das. Se seleccionaron tres aislados para la evaluacin de la produccin de
xilitol a partir de xilosa en ensayos preliminares a escala de laboratorio, para
lo cual se utiliz la tcnica de cromatografa en capa fina.
ABSTRACT
Colombia is a tropical country that offers a great microbial diversity, this fact
can be taken advantage of to produce new substances with a variety of
medical and commercial applications. Among these products is xylitol, a
natural sweetener with a great potential as sucrose substitute, due to its
chemical properties and healt beneficts. In this work, native yeast stocks
BSQUEDA DE CEPAS COLOMBIANAS DE
LEVADURAS PRODUCTORAS DE XILITOL
SEARCH OF COLOMBIAN YEASTS
STOCKS PRODUCING XILITOL
ISLENY ANDREA VANEGAS C.
1
, MARIA DEL SOCORRO YEPES P.
1
, CLARA MARA DUQUE R.
2
PALABRAS CLAVE:
Xilitol, xilosa, levaduras, Candida
kefyr, C. tropicalis, C. Parapsilosis.
KEY WORDS:
Xylitol, xylose, yeast, Candida kefyr,
C. tropicalis, C. Parapsilosis.
____________
Recibido para evaluacin: Diciembre 1 de 2003. Aprobado para publicacin: 27 de febrero de 2004.
1 Universidad Nacional de Colombia, Sede Medelln
2 Colegio Mayor de Antioquia
Correspondencia: Isleny Andrea Vanegas. e_mail: iavanegas@gmail.com
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with potential to produce xylitol were isolated from diverse sources. The isolates were carried out using a selective
culture media, which contained xylose as the only carbon source. From 78 isolates, it was selected 25 native yeast
strains. The biochemical identification was made with the kit API 20C-AUX, which allowed the identification of 84%
of the total of yeasts isolated. To evaluate the xylitol production from xylose, three yeast strains were selected. The
evaluation was carried out with thin layer chromatography technique.
INTRODUCCIN
La generacin de grandes cantidades de desechos ve-
getales y agroindustriales producto de la actividad hu-
mana, constituye uno de los mayores problemas de con-
taminacin ambiental. A pesar de su composicin or-
gnica, su perodo de vida media degradativa y los vo-
lmenes en los cuales se producen son tan grandes,
que su acumulacin en el ecosistema se ha vuelto inevi-
table. En Colombia, aproximadamente el 65% de los
residuos slidos provienen de la materia orgnica (1).
Como un intento para reducir o solucionar este proble-
ma, se han desarrollado tcnicas tendientes a la utiliza-
cin de desechos con alto contenido orgnico como
fuentes alternativas para la produccin de energa, de
metabolitos de inters comercial e industrial, e incluso
para ser sometidos a pretratamientos con el fin de incor-
porarlos en procesos de compost.
La materia orgnica est constituida principalmente por
celulosa y en segundo lugar por hemicelulosa, cuyos
porcentajes varan dependiendo de la procedencia y de
la especie vegetal considerada (2). La hemicelulosa es
un polmero heterogneo constituido por diversos tipos
de hexosas y pentosas y en ocasiones contiene resi-
duos de cidos urnicos. Se clasifican de acuerdo con
el tipo de radical azucarado mayoritario: los xilanos cons-
tan de aproximadamente 200 unidades de xilosa unidas
por enlaces -1,4, los arabinogalactanos poseen
arabinosas unidas a galactosas por -1,3 -1,6 y los
glucomananos, que se forman por glucosa y manosa
unidas al azar por -1,4 (3). Como producto de la
hidrlisis qumica o enzimtica, se obtiene una mezcla
de D-xilosa, L-arabinosa y D-glucosa. La D-xilosa es el
principal componente con un 65 - 76%, seguido por la
glucosa 4 - 17% y arabinosa 1,6 - 13% (4, 5, 6).
Los residuos agrcolas de madera de abedul y eucalip-
to, paja de trigo, fibra y tallos de maz, semilla de algo-
dn, cascos de man, bagazo de caa y pulpa de made-
ra son fuentes importantes de xilanos. Su contenido es
variable dependiendo de la procedencia. As por ejem-
plo, al realizar la hidrlisis es posible obtener desde un
89.3% de xilosa en madera de abedul, hasta un 46% en
cascarilla de arroz (4, 5, 6).
La D-xilosa as obtenida se constituye en el principal
sustrato para la produccin de xilitol, un edulcorante
natural que se usa como sustituto del azcar en la indus-
tria de alimentos, farmacutica y en productos de salud
oral. El xilitol posee un agradable sabor, no deja gusto
residual amargo, presenta rpida dilucin en agua, no
sufre pardeamiento de Maillard y sus soluciones son
altamente estables. Sin embargo, su importancia radica
en sus numerosas aplicaciones en el rea de la salud,
principalmente el hecho de poder ser consumido de for-
ma segura por diabticos y aquellas personas deficien-
tes en glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. Igualmente,
no produce caries y su consumo frecuente contribuye a
la prevencin de la otitis media aguda y de la
osteoporosis (7, 8, 9).
MATERIALES Y MTODOS
Toma de muestras
Para el aislamiento de las cepas de levaduras nativas se
eligieron diversas fuentes naturales como bagazo de
caa de azcar, el compost y la cscara de tomate. Tam-
bin se evaluaron muestras que estuvieran en contacto
directo con materia orgnica de diversa procedencia,
como los suelos de sembrado de caa, de zonas
arborizadas y del trapiche. Estas fuentes se caracterizan
por su alto contenido hemicelulsico. Finalmente, se
utiliz el guarapo de caa, que contiene una gran canti-
dad de carbohidratos libres.
De todas las fuentes elegidas se tom un total de 124
muestras, de las cuales el mayor nmero se obtuvo de
diversas zonas arborizadas de la ciudad de Medelln,
que correspondi a 70 muestras.
Tratamiento de las muestras
Muestras de tierra, compost y guarapo: Se prepara-
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ron soluciones madre de cada muestra al 10% en
agua peptonada estril. Posteriormente, se realiza-
ron diluciones sucesivas a par tir de la solucin ma-
dre hasta 10-8 (10).
Bagazo de caa: Se tomaron 10 g de bagazo y se sem-
braron directamente en tubos de ensayo estriles, que
contenan el medio de cultivo sabouraud lquido modi-
ficado con antibitico.
Cscara de tomate en descomposicin: Se rasp te-
jido de la cscara de tomate en descomposicin, el cual
se sembr directamente en medio sabouraud agar con
antibitico.
Medios de cultivo y siembra de las muestras
Para el aislamiento se utiliz el medio de cultivo
sabouraud en agar y lquido esterilizado, al cual se adi-
cion gentamicina al 10%, con el fin de evitar el creci-
miento bacteriano.
Se tom un mililitro de cada una de las muestras y se sem-
br por duplicado en cajas de petri con agar sabouraud
modificado con antibitico, siguiendo el mtodo de plaqueo
en superficie. En el caso del tomate, el tejido en des-
composicin se sembr directamente sobre el agar
sabouraud. Las cajas se incubaron por 24 horas a 35C.
Preseleccin y purificacin
La preseleccin se hizo con base en el crecimiento y la
morfologa: aquellos aislados que crecieron ms rpi-
damente en el medio de cultivo selectivo y que presen-
taron una morfologa tpica de levaduras, se purificaron
mediante repiques sucesivos.
Evaluacin cualitativa del metabolismo de la xilosa
Para la seleccin de las cepas promisorias, se utiliz
como indicador cualitativo la capacidad de los
microorganismos para metabolizar xilosa. Se utiliz un
medio de cultivo mnimo, con xilosa como nica fuente
de carbono. La composicin en % p/v del medio fue:
xilosa 1,5%, (NH4)2SO4 0,5%, KH2PO4 0,5%, Agar
Agar 2,0%. Igualmente, se evalu el efecto de la
suplementacin del medio con 0,1% de glucosa.
Se inocularon las cepas y se incubaron por 24 horas a
35C. Las cepas que presentaron capacidad de creci-
miento en este medio fueron seleccionadas como po-
tenciales productoras de xilitol.
Identificacin de las cepas
Las cepas seleccionadas por su capacidad para
metabolizar xilosa, se identificaron bioqumicamente
utilizando el kit de asimilacin de azcares para levadu-
ras API 20C-AUX.
Preservacin
Para la preservacin, las cepas puras fueron sembra-
das en tubos con agar sabouraud en bisel. Una vez
obtenido el crecimiento microbiano, se procedi a se-
llar cada tubo con aceite mineral estril y luego se refri-
geraron a 4C.
La viabilidad de los microorganismos se evalu un mes
despus de su preservacin, tomando de cada tubo
una asada y sembrndola en estra en cajas de petri con
el mismo medio de cultivo, incubando a las condicio-
nes mencionadas y evaluando el crecimiento al final de
la incubacin.
Cromatografa de capa fina
La evaluacin cualitativa de la produccin de xilitol por
las cepas de levaduras seleccionadas se realiz por
cromatografa de capa fina, utilizando los estndares de
xilosa, glucosa y xilitol. La combinacin de solventes
utilizada fue cloroformo-acetona-etanol-agua en pro-
porcin 37:37:23:3. Se utiliz como revelador el
permanganato de potasio alcalino (11).
Las evaluaciones preliminares se realizaron en matraces
de 50 mL, con un volumen de medio de 20 mL, a 35C
y con una velocidad de agitacin de 200 rpm. La com-
posicin del medio de cultivo utilizado para la evalua-
cin preliminar de la capacidad para producir xilitol fue:
xilosa 20,0 g/L, glucosa 2,0 g/L, KH2PO4 15,0 g/L,
(NH4)2SO4 3,0 g/L, MgSO4.7H2O 1,0 g/L (12).
RESULTADOS Y DISCUSIN
Aislamiento de microorganismos
De un total de 124 muestras, se aislaron y purificaron
78 cepas de levaduras, de las cuales 25 mostraron ca-
pacidad para degradar la xilosa, lo cual se consider
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como un indicativo de su potencialidad para la produc-
cin de xilitol. Una elevada proporcin de ellas proce-
da del guarapo de caa de azcar (Figura 1).
En sntesis, a partir del guarapo de caa se obtuvo el
mayor porcentaje de levaduras aisladas, correspondien-
te al 44% del total, seguido del 28% procedentes del
bagazo de caa, 12% de suelos arborizados y el 16%
restante, se distribuy homogneamente entre compost,
suelo de trapiche, suelo de sembrado y de tomate de
alio (4% cada uno). Es importante resaltar que el gua-
rapo es una fuente rica en carbohidratos disponibles
para el crecimiento y aprovechamiento directo por parte
de una amplia variedad de microorganismos, no slo
levaduras, sino tambin otros hongos y bacterias que
fueron eliminados por no corresponder al objeto de esta
investigacin.
Evaluacin cualitativa
Los microorganismos que crecieron apreciablemente
en el medio de cultivo con xilosa como nica fuente de
carbono procedan de fuentes diversas, en su mayora
del bagazo de caa.
En el medio suplementado con glucosa se present
mayor crecimiento, inclusive de aquellas levaduras que
poco lo hicieron en el medio con xilosa nicamente: 19
cepas crecieron notablemente en el medio con xilosa y
en glucosa mejor su crecimiento, mientras que 6 ce-
pas que no presentaron crecimiento apreciable en el
medio sin glucosa, mejoraron cuando se suplement el
medio de cultivo con ella.
De lo anterior se infiere que la glucosa tuvo una in-
fluencia apreciable en el crecimiento de los microor-
ganismos durante sus etapas iniciales. No es posible
sin embargo, afirmar que esta fue la nica fuente de
carbono utilizada por las levaduras, puesto que con el
tiempo el crecimiento contina; de hecho, a las 36
horas, tres cepas que inicialmente presentaron poco
crecimiento, mejoraron. El nivel de concentracin de
glucosa es muy bajo y se podra presumir que su pa-
pel es el de estimular el metabolismo de la xilosa y el
crecimiento de los microorganismos (12,13), evitan-
do que se consuma la xilosa para crecimiento y as
favorecer la produccin ms eficiente de xilitol.
Identificacin bioqumica
Los resultados de la identificacin bioqumica de las
cepas seleccionadas mediante el kit de asimilacin de
azcares se presentan en la Tabla 1.
Como resultado de las identificaciones, se encontr que
la levadura ms difundida entre las fuentes elegidas para
el aislamiento y que presentaron capacidad para
metabolizar xilosa fueron del gnero Candida, entre las
cuales Candida glabrata fue la levadura ms ubicua con
una proporcin del 16% del total. Esta especie fue ais-
lada a partir de muestras provenientes del compost,
guarapo y bagazo de caa. De otro lado, C. pelliculosa,
C. famata y C. kefyr ocuparon el segundo lugar de aisla-
mientos, con un 12% cada una, Cryptoccocus laurentii
con un 8% y finalmente, Rhodotorula minuta, C.
lipolytica, C. inconspicua, C. parapsilosis y C. tropicalis,
con un 4% cada una.
De las 25 cepas seleccionadas, no fue posible identifi-
car cuatro de ellas, procedentes de muestras de suelo,
guarapo de caa y dos de ellas, del bagazo de caa.
Seleccin de levaduras
Las cepas que mostraron una gran habilidad para
44%
28%
12%
4%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
Guarapo Bagazo
SucIos arborizados Compost
SucIo trapichc SucIo scmbrado
Tomatc dc aIio
Figura 1. Proporcin de las levaduras nativas segn la
fuente de aislamiento.
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metabolizar xilosa en el medio mnimo durante las prime-
ras 24 horas, evidenciada por su rpido crecimiento, fue-
ron Candida tropicalis, aislada de suelos de zonas
arborizadas, Candida kefyr, aislada del suelo de trapiche
y Candida parapsilosis aislada de la cscara de tomate
(Figura 2). Estas fueron seleccionadas entre las 25 como
las ms promisorias para la produccin del edulcorante.
Figura 2. Levaduras seleccionadas para la produccin
de xilitol (a) Candida kefyr, (b) C. tropicalis y (c) C.
parapsilosis, observadas en microscopio (objetivo 100X).
Cromatografa de capa fina
Los resultados indicaron que bajo las condiciones de
operacin evaluadas, las tres cepas de levadura selec-
cionadas presentaron capacidad para producir xilitol a
partir de xilosa.
Este mtodo se eligi para hacer el seguimiento de los
cultivos celulares por ser econmico, prctico y rpido,
ofreciendo resultados en tiempo real.
CONCLUSIONES
Las levaduras nativas del gnero Candida adems de
ser los microorganismos de mayor difusin en las fuen-
tes elegidas, tambin fueron las que presentaron mejor
capacidad para metabolizar la xilosa.
Candida glabrata se aisl de fuentes tan diversas como el
compost, bagazo y guarapo de caa de azcar, constitu-
yndose en la levadura nativa de ms amplia distribucin.
Las cepas nativas Candida kefyr procedente del suelo
de trapiche, C. tropicalis, aislada de suelos de zonas
arborizadas y C. parapsilosis, nativa de la cscara de
tomate de alio (Lycopersicum esculentum Miller) fue-
ron las levaduras que presentaron la mayor potenciali-
dad en cuanto a la produccin de xilitol.
La tcnica de TLC es una alternativa econmica que
permiti monitorear de manera rpida y efectiva, el pro-
Tabla 1. Identificacin bioqumica de levaduras selec-
cionadas.

(a) (b) (c)
1RPEUH &HSDV
DLVODGDV
)XHQWHGH
DLVODPLHQWR
Baga/o do caua
Nuosl|a do suo|o &DQGLGD
IDPDWD
8
Suo|o somo|ado
do caua
Baga/o do caua
(2)
0ua|apo do caua
&DQGLGD
JODEUDWD
4
Composl
&DQGLGD
LQFRQVSLFXD
1 0ua|apo do caua
0ua|apo do caua
(2)
&DQGLGD
NHI\U
8
Suo|o do l|ap|cHo
&DQGLGD
OLSRO\WLFD
1 0ua|apo do caua
&DQGLGD
SDUDSVLORVLV
1
Tomalo
(/\FRSHUVLFXP
HVFXOHQWXP
N|||o|)
&DQGLGD
SHOOLFXORVD
8 0ua|apo do caua
&DQGLGD
UXJRVD
1 0ua|apo do caua
&DQGLGD
WURSLFDOLV
1 Nuosl|a do suo|o
&U\SWRFRFFX
VODXUHQWLL
2 Baga/o do caua
5KRGRWRUXOD
PLQXWD
1 0ua|apo do caua
Baga/o do caua
(2)
Nuosl|a do suo|o
lovadu|as
uo
|doul|l|cadas
4
0ua|apo do caua
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greso de la fermentacin a travs del seguimiento cualita-
tivo de la produccin de xilitol y el consumo de xilosa y
glucosa, parmetros que se utilizaron para seleccionar
las levaduras de mayor produccin en el menor tiempo.
Igualmente, con esta tcnica se puede establecer el me-
dio de cultivo ms adecuado, es decir, aquel que por su
composicin estimule una mejor produccin de xilitol.
Con el kit comercial API 20C-AUX se identific
bioqumicamente el 80% de las levaduras aisladas.
La variedad de cepas de levadura que presentaron efec-
tivamente potencial para la produccin de xilitol, se ais-
laron de fuentes naturales muy diversas. Colombia brin-
da l a opor tuni dad de ai sl ar numerosas cepas
microbianas nativas, potencialmente productoras de
gran cantidad de metabolitos de inters industrial. Se
requiere entonces seguir contando con el apoyo logstico
y econmico para poder implementar las tcnicas y
metodologas necesarias en el aislamiento de los
microorganismos y su produccin a gran escala.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a la Direc-
cin de Investigaciones de la Universidad Nacional de
Colombia Sede Medelln, DIME, por la financiacin de
esta investigacin.
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