ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA APLICADA AL SOPORTE DE DIAGNSTICO MDICO DE PRECNCERES DE TEJIDOS DE CUELLO UTERINO

BELARMINO SEGURA GIRALDO, MSc.

FACULTAD DE INGENIERA Y ARQUITECTURA DEPTO DE ELCTRICA, ELECTRNICA Y COMPUTACIN DOCTORADO EN INGENIERA MANIZALES 2009

ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA APLICADA AL SOPORTE DE DIAGNSTICO MDICO DE PRECNCERES DE TEJIDOS DE CUELLO UTERINO

BELARMINO SEGURA GIRALDO, MSc.

TESIS
PARA OPTAR AL TTULO DE

DOCTOR EN INGENIERA
LINEA DE INVESTIGACIN EN AUTOMTICA

Director ANDRS ROSALES RIVERA, PhD.

FACULTAD DE INGENIERA Y ARQUITECTURA DEPTO DE ELCTRICA, ELECTRNICA Y COMPUTACIN DOCTORADO EN INGENIERA MANIZALES 2009

< < A mis padres por haberme ofrecido la maravillosa oportunidad de tener vida y por ensearme a vivirla. A mi esposa Mara del Rosario y a mis hijos Sebastin y Natalia por su amor, comprensin y apoyo incondicional.

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AGRADECIMIENTOS
Ofrezco mis ms sinceros agradecimientos a: La Universidad Nacional de Colombia y en especial a la sede Manizales, a COLCIENCIAS y a la Direccin Territorial de Salud por sus grandes aportes en el desarrollo de la tesis doctoral. Los profesores de la Universidad Nacional de Colombia sede Manizales de las diferentes reas del conocimiento involucradas en esta tesis de doctorado, que hicieron sus grandes contribuciones en su momento oportuno. Los integrantes del grupo de Investigacin en Magnetismo y Materiales Avanzados de la Universidad Nacional de Colombia sede Manizales, a los integrantes del grupo de Investigacin en Cncer de Cuello Uterino y Cncer de Mama de la Universidad de Caldas y a los integrantes del grupo de Investigacin en Automtica de la Universidad Autnoma de Manizales por las valiosas discusiones en torno a los diferentes temas tratados en esta investigacin.

Agradezco muy especialmente al Doctor Germn Olarte Echeverri, gestor de la idea central de esta tesis de doctorado, por su gran y desinteresada colaboracin.

TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ............................................................................................................. xii ABSTRACT ........................................................................................................... xiii INTRODUCCIN .................................................................................................... 1 1. GENERALIDADES DE PRECNCERES DE CUELLO UTERINO ................... 4 MTODOS ACTUALES DE DIAGNSTICO DE PRECNCERES DE CUELLO UTERINO ....................................................................... 5 1.2 CARCINOGNESIS DEL CUELLO UTERINO .................................... 7 REFERENCIAS .............................................................................................. 10 2. ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA ................................... 12 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 INTERACCIN DE LA RADIACIN ELECTROMAGNTICA ........... 12 FORMAS DE INTERACCIN DE LA RADIACIN ELECTROMAGNTICA CON MATERIAL BIOLOGICO ................... 16 ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA EN EL ANLISIS DE TEJIDOS BIOLGICOS ............................................. 22 1.1

COMPORTAMIENTO PTICO DE LOS TEJIDOS BIOLGICOS .... 23 ANLISIS BIOQUMICO DE ESPECIES INDIVIDUALES ................. 26 LOS FLUORFOROS EN EL ANLISIS DE ESTADOS PATOLGICOS ................................................................................. 27 REFERENCIAS ............................................................................................. 28 3. SIMULACIN DEL ESPECTRO DE FLUORESCENCIA ............................... 29 REFERENCIAS .............................................................................................. 33 4. SIMULACIN DE CLULAS BIOLGICAS A TRAVS DEL MODELO CELULAR DE POTTS .................................................................................... 34 MODELO CELULAR DE POTTS PARA SIMULAR CELULAS BIOLOGICAS ..................................................................................... 36 4.1.1 ADHESIN ........................................................................................ 36 4.1.2 TAMAO DE LA CLULA ................................................................. 37 4.1.3 FLUCTUACIONES DE FORMA ......................................................... 38 4.2 GENERALIDADES DEL MODELO CELULAR DE POTTS ................ 40 REFERENCIAS ............................................................................................. 41 5. METODOLOGA ............................................................................................. 42 6. DESARROLLO E IMPLEMENTACIN DE LA TCNICA DE ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA ................................... 43 4.1

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7. SIMULACIN DEL ESPECTRO DE FLUORESCENCIA Y DE CLULAS BIOLOGICAS ................................................................................................. 46 7.1 MODELAMIENTO Y SIMULACIN DE LOS ESPECTROS DE FLUORESCENCIA ............................................................................ 46

7.1.1 ESTRUCTURA DEL PROGRAMA ..................................................... 49 7.1.2 GENERALIDADES ............................................................................ 52 7.2 SIMULACIN DE LA ORGANIZACIN DE CELULAS BIOLGICAS ..................................................................................... 52 7.2.1 MODELO MATEMTICO .................................................................. 55 7.2.2 PROGRAMA ...................................................................................... 56 7.2.3 ESTRUCTURA DEL PROGRAMA ..................................................... 56 7.2.4 GENERALIDADES ............................................................................ 57 7.3 VISUALIZACIN................................................................................ 57 7.4 RESULTADOS Y DISCUSIN .......................................................... 58 7.4.1 ORGANIZACIN CELULAR PARCIAL ............................................. 62 7.4.2 MNIMOS LOCALES DE ENERGA ................................................... 65 7.4.3 MEDIO EXTRACELULAR QUE CRECE ........................................... 67 7.5 CONCLUSIONES .............................................................................. 69 REFERENCIAS .............................................................................................. 70 8. PROCESAMIENTO DIGITAL DE LA INFORMACIN ESPECTRAL DE FLUORESCENCIA ......................................................................................... 71 REFERENCIAS .............................................................................................. 79 9. APLICACIN DE LA TCNICA DE ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA EN EL SOPORTE AL DIAGNSTICO MDICO DE PRECNCERES DE TEJIDOS BIOLGICOS ............................................... 80 9.1 ESTUDIO DE PRECANCERES EN TEJIDOS DE CUELLO UTERINO EN VIVO A TRAVS DE LA TCNICA DE ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA ...................... 80

9.1.1 METODOLOGA ................................................................................ 81 9.1.2 RESULTADOS Y DISCUSIN .......................................................... 82 9.1.2.1 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD .................................................. 83 9.1.2.2 CORRELACIN DE RESULTADOS ENTRE LAS DIFERENTES TCNICAS ......................................................................................... 86 9.1.3 CONCLUSIONES .............................................................................. 87 9.1.4 RECOMENDACIONES ...................................................................... 88 9.2 ESTUDIO DE PRECNCERES EN BIOPSIAS DE MAMA A TRAVS DE LA TCNICA DE ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA ............................................................................ 88 9.2.1 METODOLOGA ................................................................................ 90 9.2.2 RESULTADOS................................................................................... 91 9.2.3 CONCLUSIONES .............................................................................. 93 REFERENCIAS .............................................................................................. 93 vii

10. PROPUESTA DE METODOLOGA PARA EL SOPORTE AL DIAGNSTICO MDICO EN VIVO DE PRECANCERES DE TEJIDOS DE CUELLO UTERINO ........................................................................................ 95 10.1 10.2 10.3 10.4 PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMGENES DE TEJIDO CUELLO UTERINO OBTENIDAS POR COLPOSCOPIA .................. 96 METODOLOGA ................................................................................ 97 RESULTADOS Y ANLISIS .............................................................. 99 CONCLUSIONES ............................................................................ 102

REFERENCIAS ............................................................................................ 102 CONCLUSIONES GENERALES ........................................................................ 103 TRABAJOS CONCLUIDOS ................................................................................ 104 CONTRIBUCIONES ........................................................................................... 105 PROYECCIONES ............................................................................................... 106 GRUPOS QUE APOYARON LAS INVESTIGACIONES ..................................... 107

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LISTA DE FIGURAS
Figura 2-1. Esquema general de los primeros niveles de energa de una molcula orgnica. ............................................................................. 14 Figura 2-2. Mecanismos de excitacin y emisin de fluorescencia....................... 16 Figura 2-3.Espectros de absorcin y emisin de fluorescencia de fluorforos endgenos. ........................................................................................ 27 Figura 4-1.Organizacin celular lograda por el CPM, (a) Condicin inicial, (b) Organizacin celular, (c) Ordenamiento de clulas en forma de mosaico, (d) engullimiento. ................................................................ 35 Figura 4-2. (a) Puntos escogidos para realizar el cambio en una red hexagonal; b) Nueva configuracin si el cambio se acepta. ................................. 40 Figura 6-1 Esquema de componentes bsicos de un instrumento usado para espectroscopa ptica de fluorescencia de tejidos ............................. 43 Figura 6-2 Montaje de la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia ....... 44 Figura 7-1 espectros de absorcin y emisin de los fluorforos (colgeno, elastina, NADH y FAD). ..................................................................... 49 Figura 7-2 Las tensiones superficiales determinan la configuracin de equilibrio con mnima energa global (a) Las clulas de un solo tipo se disocian, (b) las clulas se agregan, (c) y (d) Las clulas de dos tipos no se agregan, (e) configuracin de tablero de ajedrez, (f) y (g) cell sorting tpico (h) otro tipo de organizacin, (i) condicin de Young. ............................................................................................... 54 Figura 7-3 Interfaz grafica CPM ............................................................................ 58 Figura 7-4 Organizacin celular en 3D y evolucin de los espectros de fluorescencia. (a) Red Inicial, (b) Red en 4MCS, (c) 8 MCS, (d) 20 MCS ................................................................................................... 60 Figura 7-5 Organizacin celular en 2D. (a) Red Inicial, (b) Red en 2MCS, (c) 4 MCS, (d) 6 MCS, (e) 8 MCS, (f) 10 MCS, (g) 20 MCS, (h) 40 MCS, Red Final ........................................................................................... 61 Figura 7-6 Evolucin de una sola clula escogida aleatoriamente, (a) clula en su estado inicial, (b) luego de 4 MCS, (c) luego de 10 MCS, (d) configuracin final de la clula. .......................................................... 62 Figura 7-7 Evolucin de una sola clula escogida aleatoriamente, (a) clula en su estado inicial, (b) clula en su estado final .................................... 63 Figura 7-8 Organizacin celular parcial en 2D y evolucin de los espectros de fluorescencia. (a) Red Inicial, (b) Red en 4MCS, (c) 8 MCS, (d) 10 MCS. .................................................................................................. 64 Figura 7-9 Red que se congela, Proyecciones en 2D y evolucin de los espectros de fluorescencia. (a) Red Inicial, (b) 10 MCS, (c) 80 MCS, (d) 1000 MCS, Red Final. ....................................................... 66 ix

Figura 7-10 Una sola clula tipo 2 que disminuye de tamao, (a) clula en su estado inicial, (b) la misma clula luego de 2 MCS............................ 68 Figura 7-11 Clulas que disminuyen de tamao y evolucin de los espectros de fluorescencia, (a) Red Inicial, (b) Red en 2 MCS. .............................. 68 Figura 8-1 Promediado conjunto de la informacin espectral de fluorescencia .... 71 Figura 8-2 Espectro filtrado a travs del filtro Savitzky-Golay de octavo orden, 30 puntos ........................................................................................... 73 Figura 8-3 Ajuste de la informacin espectral de fluorescencia ............................ 74 Figura 8-4 Contribucin representada en bandas Gaussianas de cada uno de los fluorforos .................................................................................... 75 Figura 8-5 Espectros caractersticos de fluorescencia de normalidad y patologa 76 Figura 8-6 Informacin espectral de fluorescencia a longitudes de onda de 330 nm y 350 nm ...................................................................................... 76 Figura 8-7 Grfica de los eigenvalores ................................................................. 78 Figura 8-8 Grficas de la representacin de los individuos en el primer plano principal ............................................................................................. 79 Figura 9-1 Imagen de los puntos de anlisis en el tejido de cuello uterino ........... 82 Figura 9-2 Informacin espectral de fluorescencia de muestras de biopsias de mama ................................................................................................. 91 Figura 9-3 Informacin espectral de fluorescencia normal y patolgica ............... 93 Figura 10-1 Metodologa para el diagnstico de precnceres de cuello uterino ... 95 Figura 10-2 Diagrama de flujo de la metodologa usada ...................................... 97 Figura 10-3 Algoritmo utilizado para la segmentacin de la zona de transformacin ................................................................................... 98 Figura 10-4 Proceso de segmentacin. a) Imagen original en RGB. b) Endocervix. c) Tejido normal. d) Tejido patolgico. e) Zonas de iluminacin no uniforme ..................................................................... 99 Figura 10-5 Proceso de segmentacin. a) Imagen original en RGB. b) Endocervix. c) Tejido Normal. d) Tejido anormal. e) Zonas de iluminacin no uniforme. Fuente: Manual para la deteccin visual de neoplasias cervicales .................................................................. 100 Figura 10-6 Imagen original. Cluster etiquetado como Normal. Cluster etiquetado como patolgico. ............................................................ 101 Figura 10-7 Imagen original. Cluster etiquetado como Normal. Cluster etiquetado como patolgico. ............................................................ 101 Figura 10-8 Imagen Original e Imagen clasificada .............................................. 101 Figura 10-9 Imagen Original e Imagen clasificada .............................................. 101 Figura 10-10 Imagen Original e Imagen clasificada ............................................ 102 Figura 10-11 Imagen Original e Imagen clasificada ............................................ 102

LISTA DE TABLAS
Tabla 1-1 Tipos ms frecuentes (con mayor incidencia) de cnceres en mujeres . 4 Tabla 2-1 Escala de tiempo para los procesos de fluorescencia .......................... 15 Tabla 2-2 Longitudes de onda de excitacin y emisin de algunos fluorforos .... 22 Tabla 6-1 Especificaciones del sistema laser de gas nitrgeno ............................ 44 Tabla 6-2 Especificaciones del espectrmetro USB2000 ..................................... 45 Tabla 7-1 Caractersticas de los picos de absorcin y emisin de cada uno de los fluorforos presentes en el tejido de cuello uterino obtenidas por ajuste gaussiano. ................................................................................. 49 Tabla 7-2 Datos para la simulacin 1 de organizacin celular .............................. 59 Tabla 7-3 Datos para la simulacin 2.................................................................... 63 Tabla 7-4 Datos para la simulacin 3.................................................................... 65 Tabla 7-5 Datos para la simulacin 4 ................................................................... 67 Tabla 9-1 Informacin pacientes analizadas por los diferentes mtodos.............. 82 Tabla 9-2 Fluorescencia vs. Citologa ................................................................... 83 Tabla 9-3 Estudio de la capacidad predictiva de una prueba diagnstica fluorescencia /citologa......................................................................... 84 Tabla 9-4 Fluorescencia vs. Colposcopia ............................................................. 84 Tabla 9-5 Estudio de la capacidad predictiva de una prueba diagnstica fluorescencia / colposcopia .................................................................. 84 Tabla 9-6 Fluorescencia vs. Biopsia ..................................................................... 84 Tabla 9-7 Estudio de la capacidad predictiva de una prueba diagnstica fluorescencia/biopsia............................................................................ 85 Tabla 9-8 Colposcopia vs. Citologa...................................................................... 86 Tabla 9-9 Colposcopia vs. Biopsia ........................................................................ 86 Tabla 9-10 Anlisis Estadstico de la informacin espectral de fluorescencia en biopsia de mama................................................................................ 92 Tabla 10-1 Centroides figura 10-3 ........................................................................ 99 Tabla 10-2 Centroides figura 10-4 ..................................................................... 100

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RESUMEN
En este trabajo de tesis se desarroll e implement la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia con el objetivo de analizar los cambios bioqumicos y morfolgicos que presentan los tejidos biolgicos al evolucionar de estados de normalidad a estados de patologa. Con el fin de procesar digitalmente la informacin espectral de fluorescencia de los tejidos biolgicos, se desarroll un modelo matemtico que permiti simular los espectros de fluorescencia obtenidos de dos formas distintas: a) simulacin de espectros de fluorescencia en clulas biolgicas (obtenidas por el modelo celular de Potts); y b) mtodo analtico de la informacin espectral de fluorescencia en tejidos biolgicos de cuello uterino y mamario. Los resultados de la aplicacin de este proceso matemtico permitieron desarrollar algoritmos computacionales para plantear una metodologa basada en la espectroscopa ptica de fluorescencia en el soporte al diagnstico mdico de precnceres de cuello uterino in vivo y ex vivo. Conjuntamente se desarrollo un algoritmo computacional para procesar digitalmente las imgenes de los tejidos de cuello uterino obtenidas por colposcopia. Finalmente, se plante una metodologa para el soporte al diagnstico mdico en vivo de precnceres de cuello uterino basada en la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia, procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia y del procesamiento digital de imgenes de cuello uterino.

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ABSTRACT
In this thesis was developed and implemented the optical fluorescence spectroscopy technique, in order to analyze the biochemical and morphological changes presented on biological tissues in the evolution from normality states to pathological states. In order to process digitally the spectral information of fluorescence of biological tissues, was developed a mathematical model that allowed to simulate the spectrums of fluorescence obtained in two different ways: a) simulation of fluorescence spectrums of biological cells (obtained from Potts cellular model); b) analytic method of spectral information of fluorescence of biological tissues, as cervix tissue and breast tissue. The results of use this mathematical process allowed to develop computed algorithms to expose a methodology based on the optical fluorescence spectroscopy technique in support of medical diagnostics of cervix pre cancer in vivo and ex vivo. Together, was developed a computed algorithm to processing digitally the images of cervix obtained by colposcopy. Finally, was exposed a methodology for support the medical diagnostic of precancer cervix in vivo based on the optical of fluorescence spectroscopy, digital processing development of spectral information of fluorescence and the digital process of cervix tissue images.

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INTRODUCCIN
En los ltimos aos se ha presentado un notable incremento en el diseo e implementacin de tcnicas para la medicin de bioseales, las cuales han permitido el estudio del comportamiento o evolucin de patologas en algunos rganos del cuerpo humano. Por lo tanto, se hace cada vez ms indispensables estas tcnicas en el soporte al diagnstico mdico de enfermedades, ofreciendo al profesional de la salud ms herramientas de anlisis ms profundo y certero al momento de la entrega de resultados. El objetivo de este trabajo es desarrollar una metodologa basada en la espectroscopa ptica de fluorescencia que permita realizar un anlisis de los cambios bioqumicos presentes en los estados de normalidad y patologa de algunos tejidos biolgicos y as, poder ofrecer soporte al diagnstico mdico de enfermedades comunes en las mujeres, como son los precnceres de cuello uterino. Esta tesis Doctoral involucra varias experiencias tanto en el desarrollo e implementacin de la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia, como del procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia, de imgenes colposcpicas y de muestras de biopsia de los tejidos de cuello uterino. Estas diferentes experiencias permiten proponer una metodologa para dar soporte al diagnstico mdico de presencia de precnceres en los tejidos de cuello uterino. De acuerdo a diversas investigaciones la segunda causa de mortalidad de la poblacin femenina es el cncer de cuello uterino, y una deteccin a tiempo podra mejorar la calidad de vida de miles de mujeres. Existen diversos mtodos para su deteccin, algunos de estos son la colposcopia, la citologa y la biopsia que son diagnosticados por especialistas. Los avances tecnolgicos en lseres, fibra ptica y espectrgrafos controlados por computador, han permitido el desarrollo e implementacin de la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia, para la caracterizacin de tejidos biolgicos, que junto con el procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia plantea una metodologa para el soporte al diagnstico mdico de precnceres de cuello uterino. La informacin proporcionada por los espectros caractersticos de fluorescencia que reflejan los cambios bioqumicos y morfolgicos de los tejidos del cuello uterino, son analizadas a travs de mtodos estadsticos, que al relacionar estos resultados con la informacin proporcionada

por el cuadro clnico (antecedentes, colposcopia, etc.) contribuyan en la toma de la decisin del diagnstico de los tejidos del cuello uterino normales o patolgicos en vivo. En esta tesis Doctoral estudi, analiz y desarroll la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia como una herramienta no invasiva, rpida y segura para el soporte al diagnstico mdico, de la presencia de precnceres en tejidos biolgicos tanto in vivo como ex vivo. El objetivo final y gran contribucin de esta investigacin es plantear una Metodologa para el soporte en el diagnstico mdico de patologas de tejidos de cuello uterino basada en las tcnicas de espectroscopa ptica de fluorescencia, procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia y el procesamiento digital de las imgenes obtenidas por colposcopia. Esta tesis doctoral se desarrolla en diez captulos de la siguiente forma: En el CAPITULO I se presentan algunas generalidades de los precnceres de cuello uterino. En el CAPITULO II se hace una gran resea sobre la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia, y en especial en la aplicacin de esta en el anlisis de tejidos biolgicos. En los CAPITULOS III y IV contemplan las bases tericas de las simulaciones del espectro de fluorescencia y de las clulas biolgicas. En el CAPITULO V se cita de una forma breve cada una de las experiencias investigativas involucradas en el desarrollo de esta tesis. En el CAPITULO VI se presenta el desarrollo e implementacin de la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia. En el CAPITULO VII trata sobre la simulacin de los espectros de fluorescencia y de las clulas biolgicas. En los CAPITULOS VIII y IX se presenta una metodologa basada en el procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia y la aplicacin de est en el anlisis de tejidos biolgicos. En el CAPITULO X se plantea una metodologa para el soporte al diagnstico mdico en vivo de precnceres de tejidos de cuello uterino basada en las tcnicas 2

de espectroscopa ptica de fluorescencia, de procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia y del procesamiento digital de las imgenes obtenidas por colposcopia.

1. GENERALIDADES DE PRECNCERES DE CUELLO UTERINO

El cncer invasivo del cuello uterino es el segundo ms frecuente entre las mujeres en todo el mundo, con aproximadamente 500.000 nuevos casos al ao. Representa el 10% de todos los tumores femeninos. Pero hay grandes diferencias entre los pases ms y menos desarrollados; mientras en estos ltimos es la segunda neoplasia maligna en frecuencia, despus del cncer de mama, en los pases desarrollados su frecuencia ha disminuido drsticamente en las ltimas dcadas. En muchos pases en desarrollo, el cncer del cuello uterino es la primera causa de mortalidad por cncer entre las mujeres, tabla 1.1 [1, 2].
Tabla 1-1 Tipos ms frecuentes (con mayor incidencia) de cnceres en mujeres Incidencia estimada anual Tasa cruda Casos TAE(*)(**) (**) 5.936 24.9 36.8 4.677 23.2 30.0 3.179 15.7 20.7 2.158 10.7 13.9 1.463 7.3 9.9 cnceres 33.504 165.9 212.9 Mortalidad corregida anual Tasa cruda Casos TAE(*)(**) (**) 2.853 14.1 18.4 1.905 9.4 12.4 2.440 12.1 15.9 1.121 5.6 7.2 1.455 7.2 9.9 18.773 93.0 121.7

Localizacin Cuello uterino Mama Estmago Colon y recto Pulmn Todos los excepto piel

Estimaciones del Instituto Nacional de Cancerologa 1995-1999 (*) TAE: Tasa Ajustada por Edad. Datos ordenados para incidencia estimada anual. (**) Este clculo se realiz por 100.000 personas-riesgo/ao.

El cncer del cuello uterino es un tumor propio de las edades medias de la vida. La mayora de los casos se diagnostican entre los 35 y los 50 aos, con un mximo entre los 40 y los 45. Hay un nmero significativo de casos desde los 30 aos. Entre el 85-95% de los casos son carcinomas escamosos (o epidermoides), el resto son adenocarcinomas y carcinomas adenoescamosos. Entre el 80 y el 85% de los casos se registran en pases en vas de desarrollo; las campaas de diagnstico precoz han jugado un papel esencial en la disminucin de la incidencia de este tumor en los pases desarrollados. Antes de las campaas de tamizaje, la incidencia era similar en todos los pases [1].

El cncer del cuello uterino ocupa el tercer lugar de todos los cnceres, siendo responsable del 9,8% de los nuevos casos alrededor del mundo [3]. En los pases en desarrollo ocupa el segundo lugar en frecuencia, en las mujeres con una proporcin del 12 - 15% [4], mientras en los pases desarrollados ocupa el quinto lugar con una frecuencia relativa de 4,4% [5]. Esto lleva a que el cncer del cuello uterino sea la primera causa de mortalidad en mujeres en los pases del tercer mundo, puesto que ha sido una enfermedad propia de las comunidades pobres y no se han ejercido las suficientes presiones polticas para mejorar la situacin de estos grupos [6]. En nuestro pas uno de los problemas fundamentales para disminuir la mortalidad son los modelos utilizados para abordar el problema, debido a que se realizan acciones centralizadas con una inspiracin biologista, centrados en el trabajo alrededor del dao, esto no ha mostrado un verdadero impacto en la mortalidad [7,8] . Actualmente, en Colombia se mueren 9 mujeres diariamente por esta patologa, segn datos presentados en el Seminario Internacional sobre virus del papiloma humano (Medelln Colombia 23 al 25 de mayo de 2007). La deteccin precoz del cncer mediante citologa slo alcanza el 36% en los grupos de riesgo (Ministerio de Proteccin Social), lo que explicara la alta mortalidad, en Colombia; existen bajas coberturas citolgicas y falsos negativos, que alcanzan hasta 20-44%, en cncer invasivo en ms del 50% [9]. En Caldas esta patologa tiene alta morbilidad y mortalidad, con un impacto grande en el desarrollo social. El grupo de registro poblacional de Caldas report 117 casos nuevos en el ao 2003, correspondiendo 41 casos a la ciudad de Manizales con 27 defunciones en la misma [10]; para el 2004 report 118 casos nuevos en Caldas, de ellos 50 en Manizales con 21 muertes en la misma [11].

1.1 MTODOS ACTUALES DE DIAGNSTICO DE PRECNCERES DE CUELLO UTERINO

Son diversos los mtodos de diagnstico de precnceres de cuello uterino utilizados a travs del tiempo y ellos han estado ligados a los avances que se han tenido sobre el conocimiento de la fisiopatologa, en la carcinognesis del cuello uterino.

CITOLOGA. La citologa vaginal fue introducida por Papanicolaou desde 1928, su contribucin fue honrada dndole el nombre de PAP, al nuevo mtodo para el diagnstico del cncer de cervical, sin embargo otros autores como el patlogo Rumano Babes y el gineclogo Italiano Viana, sugirieron el uso de la citologa vaginal antes que el mismo Papanicolaou, la comunidad cientfica no di crdito por lo que los autores suspendieron los estudios los que se reiniciaron en 1939 mediante los extendidos vaginales realizados con el gineclogo Herbert Traut, en 1943 publicaron sus hallazgos y conclusiones en la famosa monografa titulada diagnstico del cncer uterino por extendido vaginal [12]. La aplicacin de este mtodo masivamente a la poblacin ha disminuido en un 80% la mortalidad por esta enfermedad en los pases industrializados [13], sin embargo en nuestro medio las bajas coberturas y las condiciones de pobreza de la poblacin explica la alta mortalidad por esta patologa [14]. Actualmente se usa el sistema Bethesda para el diagnstico citolgico, que hace nfasis en la descripcin morfolgica y clasifica las lesiones escamosas en LEI de bajo grado (LEI - BG), que comprende las lesiones por VPH y NIC I y LEI de alto grado (LEI - AG), que abarca NIC II y NIC III [15]. COLPOSCOPIA. La colposcopia fue introducida en 1925 por el profesor Hinnselman, de origen Alemn, esta es la parte clnica en el anlisis de las alteraciones epiteliales e invasivas del cuello uterino. El colposcopio es un microscopio de bajo poder, al cual se le ha adicionado un filtro verde, para el anlisis de los vasos del cuello uterino; este procedimiento estima las alteraciones de los vasos terminales del cuello, donde se reflejan desde una etapa muy temprana los cambios en los tejidos de la neoplasia y valora la extensin clnica de la lesin en el cuello uterino, facilitando la toma de biopsia del sitio ms patolgico con el fin de planear el tratamiento de una manera individualizada [16,17]. El mtodo consiste en la visualizacin del cuello uterino mediante la colocacin de un espculo, seguido de una limpieza del mismo con solucin salina normal, al cual permite un mejor estudio de los vasos sanguneos, inmediatamente se coloca cido actico al 4 o al 5%, el cual produce una deshidratacin reversible del epitelio, que comienza a los 10 segundos y termina a los 40 segundos; en los sitios donde hay un crecimiento celular anormal, se van a encontrar unos patrones que se denominan epitelio acetoblanco, que indica un aumento de la densidad nuclear; mosaico y punteado, significando una neovascularizacin del cuello en respuesta a la produccin del factor de angiognesis tumoral que tiene como objetivo aumentar el riego sanguneo a las clulas tumorales que estn proliferando de manera acelerada en la zona de transformacin, estos patrones 6

son compatibles con lesiones intraepiteliales del cuello. El patrn leucoplasico es una lesin blanquecina que se observa a simple vista e indica produccin de queratina por parte del tejido, existen por lo tanto, lesiones intraepiteliales e invasivas queratinizantes. Finalmente el patrn de los vasos atpicos, siempre indica carcinoma invasivo. La colposcopia permite analizar la extensin clnica de la lesin que es el elemento ms importante para el tratamiento de las lesiones intraepiteliales del cuello uterino [9]. HISTOLOGA. La histologa se ha utilizado como el diagnstico definitivo de las lesiones cervicales y es indispensable para realizar el tratamiento y seguimiento de las pacientes; sta consiste en el anlisis microscpico de una porcin de tejido que ha sido extrada bajo el examen colposcpico, en este tejido se observa el epitelio y estroma, donde se ubican las diferentes alteraciones que servirn para el diagnstico de las alteraciones patolgicas. Las lesiones intraepiteliales NIC se encuentran slo en el epitelio y a travs de los aos, 10 a 15 evolucionan a cncer invasivo, donde ya hay compromiso del estroma. El NIC I muestra alteracin de las clulas del tercio inferior del epitelio y se correlaciona con las lesiones citolgicas de bajo grado; el NIC II incluye lesiones que muestran alteracin de las clulas de los tercios inferior y medio del epitelio y el NIC III comprende aquellas lesiones que afectan todo el espesor del epitelio, estas dos ltimas se correlacionan con las lesiones citolgicas de alto grado [18]. Cuando se rompe la membrana basal del epitelio las clulas tumorales entran al estroma, produciendo el cncer invasivo; en estados avanzados hay masas tumorales que reemplazan el cuello uterino y se observa macroscpicamente. En estos estados existen etapas tempranas que pueden ser diagnosticadas mediante la histologa y la colposcopia Tambin se ha utilizado el estudio del legrado endocervical mediante la cureta de Novack, en los casos de encontrar atipias en clulas endocervicales en la citologa previa, estas reas no se observa con el anlisis colposcpico. Derivado de este enfoque, otros centros utilizan el cubo endocervical para obtener material histolgico que corresponde al tercio inferior del canal, este se practica con radiofrecuencia y asa en forma de u [19].

1.2 CARCINOGNESIS DEL CUELLO UTERINO

Las teoras fundamentales sobre el origen del cncer a nivel del tejido uterino, hace nfasis en el hecho de que esta enfermedad se inicia en el epitelio por varias 7

noxas descritas que es lo que se denomina fase preclnica en un periodo evolutivo de 10 aos (neoplasia intraepitelial cervical, NIC), si esta etapa no es alterada en su evolucin, pasa a lo que se denomina el cncer invasivo que es ms comn en el epitelio escamoso entre el 85 y 95% y en el epitelio columnar de un 5 al 14 % [20] . Modernamente se sostiene que el virus del papiloma humano de tipo oncognico (16, 18, 31, 33, 39, 45 y 56) son los responsables del inicio de la carcinognesis, por el otro lado existe el tipo 6 y 11 responsables de las verrugas genitales (condiloma acuminado, plano, endoftico y atpico) [21]. Los virus oncognicos, abren la doble hlice del genoma en los puentes disulfuro e intercambian el contenido del ADN con la clula basal del epitelio escamoso, el resultado es una clula con un contenido aneuploide de cromosomas es lo que se denomina una clula neoplsica, es decir clulas inmaduras, con gran capacidad proliferativa y que en cualquier momento, dependiendo de la agresividad del clon celular y de la respuesta inmune del husped, puede localizarse, revertir espontneamente por mecanismos inmunolgicos o producir ruptura de la membrana basal generando el cncer invasivo [22]. Una vez ocurren estos cambios, la neoplasia intraepitelial comienza a crecer a manera de cua desde la membrana basal [23]. En la medida en que este grupo celular comienza a multiplicarse necesita nutrientes aceleradamente para lo cual el estroma responde a estas necesidades mediante la produccin del factor de angiognesis tumoral, con lo cual se forman nuevos vasos para dar respuesta a los requerimientos nutritivos, de esa nueva raza de clulas. El mecanismo mediante el cual se nutren es por inhibicin a causa de las diferencias en las presiones osmticas y oncticas [24]. Las clulas inmaduras se abren paso en el epitelio no contaminando a las clulas escamosas vecinas, sino que lo hacen a travs de la enzima metaloproteinasa que destruye los puentes intercelulares, daando la polaridad celular y permitiendo la diseminacin de las clulas que estn proliferando. Cuando comprometen el tercio inferior del epitelio se denomina lesin de bajo grado y corresponde a NIC I y/o VPH; estas lesiones, se caracterizan citolgicamente por un aumento del tamao del ncleo e irregularidad de la cromatina, y por la binucleacin o multinucleacin con una cavidad citoplsmica, esto se denomina atipia coiloctica. Desde el punto de vista colposcpico se ven lesiones acetoblancas con un fino punteado en su interior de color brillante y que no tiene una definicin exacta con el tejido adyacente, dichas lesiones tienen 8

fuerte capacidad de rehidratacin y pueden perderse rpidamente de la visin colposcpica (tipo 6 y 11) y toman parcialmente el lugol [25]. Cuando las clulas inmaduras comprometen ms del 50% del espesor del epitelio se denomina lesin de alto grado, correspondientes a NIC II o NIC III. Citolgicamente se caracteriza por prdida de la relacin entre ncleo y citoplasma con hipercromatismo nuclear [26], en la colposcopia se observa un severo compromiso de la trama vascular terminal del cuello uterino, evidenciado por lo que se denomina punteado y mosaico; en la apariencia clnica son lesiones que alteran la superficie del epitelio, se demarcan muy bien frente al tejido vecino, son opacas y no toman el lugol, mostrando un severo disturbio en el glucgeno celular. Es a partir de la glucogenlisis que la clula realiza su metabolismo [27]. Desde el punto de vista colposcpico, en las fases tempranas se aprecian los vasos atpicos en tirabuzn, en coma, que son expresiones del cncer infiltrante [28] . Finalmente en el cncer invasivo temprano, donde en la citologa hay severa atipia e hipercromatismo nuclear con prdida del citoplasma e histolgicamente se pierden los puentes intercelulares con ruptura de la membrana basal en las fases inciales (invasin estromal mnima y microinvasin), hasta la desaparicin de sta en el cncer invasivo profundo con masas evidenciadas clnicamente. A medida que las lesiones progresan, el colgeno y la elastina se van disminuyendo hasta desaparecer en el cncer invasivo profundo. Todos estos cambios en la carcinognesis comienzan por alteraciones bioqumicas y fisiolgicas, hasta tornarse estructurales; a nivel bioqumico lo primero que se altera es la trama vascular que consiste en vasodilataciones segmentarias, para nutrir el clon celular que est proliferando (VPH, NICI), y son observados desde la Colposcopia, pero no estructuralmente desde la citologa o la histologa. Hay unos requerimientos energticos aumentados en las reas que estn proliferando y que bsicamente se hace a travs de la va de la glucogenlisis, a partir del glucgeno (forma de almacenamiento de la glucosa en los tejidos), una vez se liberan las molculas de glucosa (C6H12O6) entra a la fase anaerbica del ciclo de krebs a travs de la nicotinamida dinucletido (NADH+), en la cual se producen dos moles de ATP (energa biolgicamente activa) y dos moles de NAD; este proceso requiere una mol de ATP. Las dos molculas de NAD al unirse a la glucosa forman la acetil coenzima A iniciando el ciclo aerbico o tricarboclico, el cual convierte un mol de glucosa en 36 moles de ATP. 9

En las lesiones preneoplsicas, el patlogo alemn Walter Schiller, hacia 1933, lanz la hiptesis, que las lesiones acetoblancas no tomaban el lugol (yodo), debido a la ausencia del glucgeno, lo cual fue comprobado posteriormente por la ciencia con estudios mediante la reaccin en cadena de polimerasa (PCR). Los epitelios acetoblancos de origen viral (VPH/NIC I) a pesar de las alteraciones nucleares, producen algo de glucgeno, razn por la cual, las lesiones toman parcialmente el lugol y en la colposcopia tienen apariencia de color naranja; sin embargo en las lesiones de alto grado (NIC II/NIC III) y cncer invasivo temprano no hay glucgeno, por esto las lesiones son blancas y opacas en la colposcopia. A medida que se compromete el tejido desde lesiones bien diferenciadas a mal diferenciadas, los requerimientos energticos para la proliferacin celular se hacen cada vez ms intensos y se producen, por un lado, dficit de glucosa para la produccin del ATP, esta glucosa se desdobla en ADP y AMP cclico, siendo ste segundo el mensajero encargado de llevar la informacin al ncleo para la sntesis de las protenas, mecanismo fortalecido por el NADH que ingresa aceleradamente la glucosa a la fase aerbica; razn por la cual esta coenzima (fluorforo endgeno) se encuentra elevada en los procesos de oxido-reduccin[15], que son objeto actualmente, de los anlisis a travs de la espectroscopa ptica de fluorescencia.

REFERENCIAS
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2. ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA

La espectroscopa ptica de fluorescencia, como mtodo de anlisis, mide la radiacin electromagntica que emana de la materia o que interacta con ella; su aplicacin a la biomedicina se encuentra en la regin del espectro electromagntico, entre el ultravioleta (UV) y el infrarrojo cercano (NIR). Las nacientes tecnologas, como la espectroscopa ptica de fluorescencia, para el anlisis de los cambios bioqumicos y morfolgicos de los tejidos in vivo y ex vivo, contribuyen al diagnstico mdico de enfermedades como los precnceres de cuello uterino, los cuales tienen altos ndices de morbilidad y mortalidad en nuestro pas. En diferentes investigaciones cientficas, tcnicas de espectroscopa ptica de fluorescencia se han presentado con una alta sensibilidad y especificidad cuando es comparada con la histopatologa de los tejidos [1,2].

2.1 INTERACCIN DE LA RADIACIN ELECTROMAGNTICA

Debido a los mecanismos de interaccin de la radiacin electromagntica con la materia, se han derivado diferentes mtodos pticos para el anlisis de materiales duros y blandos. Por un lado, mtodos espectroscpicos donde la medida de la intensidad y la longitud de onda de la energa radiante, indican la presencia de transiciones energticas en la materia analizada, y por otro lado, los mtodos no espectroscpicos que se basan en la interaccin entre la radiacin electromagntica y la materia que dan origen a un cambio en las propiedades fsicas de la radiacin electromagntica. El modo de propagacin de una onda electromagntica en cualquier ambiente, depende de constantes pticas como el ndice de refraccin (n) y la constante dielctrica (k); las cuales a su vez dependen de las constantes del material como permitividad (), permeabilidad () y conductividad (), que pueden variar en un intervalo de frecuencias. El campo elctrico se relaciona con el campo magntico por medio de las ecuaciones de Maxwell; para medios dispersos donde no hay presencia de fuentes ni corrientes de conduccin, ecuacin 2-1.

 ur . + i E ( ) = 0 0 uu r . H ( ) = 0 ur uu r E ( ) = i 0 H ( ) uu r ur H ( ) = i 0 + i E ( ) 0

2-1

Estas ecuaciones se pueden aplicar a medios heterogneos donde , y varan de un punto a otro y en donde H es el campo magntico inducido. En medios homogneos donde las constantes electromagnticas dependen de la frecuencia y no varan de un punto a otro en el medio. Las ecuaciones de Maxwell se pueden escribir de una forma ms simplificada, ecuacin 2-2.

. E r = 0

() . H (r ) = 0 E (r ) = i H (r ) H (r ) = i E (r )
0 0 gen

2-2

Al aplicar un campo electromagntico a un material este absorbe o emite radiacin electromagntica producindose una transferencia de energa al medio absorbente o procedente de este; para entender el concepto fsico que ocurre en estos fenmenos se debe tratar la radiacin electromagntica, no como onda sino como un flujo de partculas discretas (fotones o cuantos de energa). Cuando un electrn libre colisiona con una partcula (de masa m) en reposo, la energa y el momentum de esta partcula se relacionan con la frecuencia y la longitud de onda de la radiacin electromagntica causando su dispersin. La cantidad de energa y de momentum que se presenta a partir de esta interaccin entre la onda electromagntica y la partcula cargada corresponden a un fotn [3]. Este principio es una de las leyes fundamentales de la fsica y se aplica a todos los procesos radiativos que involucran partculas cargadas y campos electromagnticos; es as, como las interacciones electromagnticas se pueden considerar como el resultado de un intercambio de fotones entre las partculas

13

cargadas interactuantes, las cuales se pueden visualizar a travs de un espectro caracterstico. Desde el punto de vista de la interaccin de la radiacin electromagntica, con la materia, un espectro puede definirse, como una representacin grfica de la distribucin de intensidad de la radiacin electromagntica, emitida o absorbida por una muestra de sustancia, en funcin de la longitud de onda (o frecuencia) de dicha radiacin [3]. Un espectro depende en principio, de la separacin entre los niveles de energa; ahora bien, un sistema molecular, puede tener diferentes tipos de energa, como la energa de rotacin, asociada al movimiento de giro o rotacin de las molculas; energa de vibracin, debida a las oscilaciones peridicas o vibraciones de los tomos alrededor de sus posiciones de equilibrio; energa electrnica, que depende de las posiciones medias de los electrones respecto de los ncleos, etc. Los diferentes tipos de energa de los sistemas atmicos o moleculares son de orden de magnitud bastante diferente, por lo que las transiciones entre los correspondientes niveles de energa, dan lugar a la emisin o absorcin de radiacin en distintas zonas de frecuencia. Por esto, se pueden distinguir distintos tipos de espectros, segn los niveles de energa que intervienen y las tcnicas experimentales utilizadas para su observacin.

Figura 2-1. Esquema general de los primeros niveles de energa de una molcula orgnica.

En la figura 2-1 se puede observar la transicin electrnica inducida por la absorcin de un cuanto de luz, dependiendo de la energa que transforma una molcula de su estado base S0 a alguno de los niveles vibracionales de estados excitados S1, S2, S3, etc. La energa de excitacin del estado S2 o cualquier otro estado de mayor energa, se disipa rpidamente debido a colisiones inelsticas alcanzando la molcula el nivel cero vibracional del estado S1, debido a la 14

relajacin no radiativa. En el proceso de conversin interna, la energa es transferida desde un punto en la hipersuperficie de la energa potencial, de un estado (por ejemplo S2) a la hipersuperficie de energa potencial S1. Despus de esto, el exceso de energa vibracional que posee el estado S1, se disipa a travs de una relajacin vibracional y el sistema alcanza un estado en equilibrio S1, de la molcula. La fluorescencia se genera a partir de transiciones radiativas en una molcula, entre niveles de la misma multiplicidad [4]. La emisin ocurre como resultado de la transicin de la molcula desde S1 al estado S0. En la tabla 2-1 se pueden observar los tiempos en los que ocurren algunos de estos eventos mencionados.
Tabla 2-1 Escala de tiempo para los procesos de fluorescencia

Transicin S (0) => S (1) o S (n) S (n) => S (1) S (1) => S (1) S (1) => S (0) S (1) => T (1) S (1) => S (0) T (1) => S (0) T (1) => S (0)

Proceso Absorcin (excitacin) Conversin interna Relajacin vibracional Fluorescencia Cruce entre sistemas Relajacin no radiativa Enfriamiento rpido Fosforescencia Relajacin no radiativa Enfriamiento rpido

La constante de velocidad Instantnea k (ic) k (VR) k (f) o k (pT) k (NR), K (q) k (p) k (nr), K (QT)

Escala de tiempo (Segundos) 10-15 10-14 a 10-10 10-12 a 10-10 10-9 a 10-7 10-10 a 10-8 10-7 a 10-5 10-3 a 100 10-3 a 100

El fenmeno de fluorescencia puede dar valiosa informacin en el estudio de una molcula biolgica en particular, figura 2-2: 1. Debido a la prdida de energa entre la absorcin y la emisin que ocurre como resultado de transiciones no radiactivas, la fluorescencia ocurre a longitudes de onda mayores que las de excitacin. 2. Las longitudes de onda de excitacin son independientes de las de emisin. Desde el punto de vista molecular, cuando la radiacin electromagntica incide sobre las clulas, stas absorben radiacin, es decir, las molculas que constituyen las clulas absorben la radiacin electromagntica y se excitan (figura 2-2, espectros de excitacin). La mecnica cuntica nos dice que se produce una 15

transicin entre los niveles de energa de algunas de estas molculas, dependiendo de la longitud de onda de la radiacin electromagntica. Una vez que algunas de las molculas que constituyen las clulas se han excitado, puede ocurrir algn proceso de desexcitacin, radiativo o no radiativo. En la espectroscopa ptica de fluorescencia se trabaja en los procesos de desexcitacin radiativos y en particular en el fluorescente (figura 2-2, espectros de emisin).

Figura 2-2. Mecanismos de excitacin y emisin de fluorescencia

2.2 FORMAS DE INTERACCIN DE LA ELECTROMAGNTICA CON MATERIAL BIOLOGICO

RADIACIN

Cuando la radiacin electromagntica interacciona con un tejido biolgico produce fenmenos como: polarizacin, refraccin, transmisin, reflexin, dispersin, absorcin y emisin. Polarizacin. Es una caracterstica de las ondas transversales, la cual es causada por la simetra y orientacin de los vectores de momento elctrico y la funcin de onda involucrada en las transiciones electrnicas, y consiste en permitir el paso de una onda en determinada direccin. Los tomos por presentar una simetra esfrica, no tienen momentos elctricos permanentes, pero si son expuestos, a un campo electromagntico, se polarizan, logrando de esta manera momentos bipolares elctricos, inducidos en la direccin del campo; consecuencia que se debe a la perturbacin del movimiento de los electrones ocasionada por el campo elctrico aplicado. En el caso de las molculas que tienen momentos bipolares elctricos permanentes, cuando se les aplica un campo electromagntico, estas se orientan paralelamente a l, experimentando un torque. 16

De esta forma, cuando un material es expuesto a la presencia de un campo electromagntico se polariza, haciendo que los momentos bipolares elctricos de sus tomos y de sus molculas se orienten en la direccin del campo elctrico. La polarizacin es empleada en varios mtodos biofotnicos, donde se usa la luz polarizada para excitar y detectar luminiscencia en el tejido [5]. Refraccin. Este fenmeno se presenta, cuando la radiacin electromagntica incide con un ngulo determinado, sobre la interfaz de separacin de dos medios con distintos ndices de refraccin (n).El rayo vara la direccin o se refracta al atravesar el segundo medio, debido a la diferencia de la velocidad de la radiacin existente en los dos medios de propagacin (medios con diferentes densidades), la cual es determinada por el ndice de refraccin (n) [5]. La velocidad de la radiacin electromagntica en un medio determinado depende de su longitud de onda, por lo tanto, para poder encontrar el valor del ndice de refraccin (n) con un criterio absoluto, debe especificarse la longitud de onda y el medio de referencia [6] . El ndice de refraccin para un medio, determina la velocidad de la luz en ste y el cambio debido al ndice de refraccin puede ser continuo o abrupto y muestra la dispersin, la refraccin y la reflexin. Para determinar el ndice de refraccin (n) de un tejido el cual es heterogneo, se hace necesario conocer el ndice de refraccin de los diferentes componentes presentes en este, y as poder prescribir un valor promedio del ndice de refraccin del tejido en conjunto; tambin se indica el promedio del volumen y del peso de los valores de los componentes del tejido. El componente principal de la mayora de los tejidos es el agua, esta tiene un ndice de n=1,33 y representa el mnimo valor para los componentes lquidos y suaves del tejido. Las partculas de melaninas encontradas generalmente en la capa epidrmica de la piel, estn en el lmite superior de los valores, con un ndice de refraccin con valores mayores a 1,6. Los ndices de refraccin para tejidos completos se encuentran en el rango de 1,36 y 1,40. Los fluidos extracelulares e intracelulares, como el citoplasma, estn en el rango de 1,35 a 1,38. El ndice de refraccin para tejido graso es alrededor de 1,45 y para tejidos duros el ndice es alrededor de 1,62 [5]. Reflexin. Este fenmeno se muestra en la interfaz del medio en que se propaga la luz, y se presenta cuando el haz de luz, incide sobre materiales que tienen diferentes ndices de refraccin, haciendo que el haz perturbe o no su transmisin y los rayos cambien su direccin haciendo que se produzca una reflexin. Este 17

suceso depende del ngulo de incidencia y del tipo de superficie donde est llegando. Dependiendo de la naturaleza del material se pueden considerar dos tipos de reflexin: Reflexin especular: el ngulo de reflexin y el de incidencia tienen el mismo valor y el haz de luz reflejado tiene una trayectoria muy definida y concreta. Este tipo de reflexin se puede ver en superficies muy lisas o pulidas, donde la dimensin de la longitud de onda de la radiacin es mayor a las irregularidades de la superficie de incidencia. Reflexin difusa: se puede observar en superficies estriadas, donde los rayos de luz llegan y se dirigen aleatoriamente en mltiples direcciones, es decir, la longitud de onda de la radiacin, es menor que las irregularidades de la superficie [7]. En el caso de los tejidos biolgicos, cuando interactan con la radiacin electromagntica se produce una reflexin difusa, irradiando parte de los fotones en todas las interfaces presentes en el tejido; la menor reflexin que se logra conseguir, para evitar perdida de energa en un tejido es cuando el ngulo de incidencia del haz, sobre la superficie, es de 90. Transmisin. Fenmeno que tiene lugar cuando un haz de luz incide sobre un medio de espesor determinado. La transmisin es la proporcin de flujo radiante que atraviesa el medio es T = I I 0 , donde, I 0 es la intensidad de luz incidente y
I es la intensidad emergente del medio.

A lo largo del espectro ptico, la transmisin vara intensamente para cada longitud de onda. Adems, las caractersticas de transmisin del medio se modifican enormemente con la naturaleza de ste. La luz transmitida que emerge del tejido depender, de los fenmenos de absorcin y dispersin, as como de la reflexin en la interfaz del medio. La radiacin transmitida est en funcin inversa de la atenuacin realizada por el medio. Puede considerarse que la atenuacin tiene dos componentes: la dispersin, que distrae los fotones del medio y la absorcin, que produce la extincin real de dichos fotones. Tanto la dispersin como la absorcin dependen de la longitud de onda de la radiacin y de las caractersticas del medio considerado (tipo de partculas que lo componen, distribucin, etc.) [5]. 18

El estudio de la transmisin de fotones est basado en las variaciones espaciales de los ndices de refraccin en la muestra de tejido. Sin embargo, este fenmeno no es de relevancia ya que la mayora de los tejidos son altamente dispersivos y la radiacin electromagntica, que alcanza a entrar en la muestra, es rpidamente absorbida por alguna especie molecular [5]. Dispersin. Cuando el haz de luz llega a un material, este se descompone en diferentes longitudes de onda, originndose el fenmeno conocido como dispersin, el cual se refiere a la proporcin de flujo radiante que se distrae dentro del tejido; siendo este tambin la suma de la energa que se refleja y se refracta, aunque atena la transmisin y da paso a la absorcin. La causa de que se produzca un fenmeno de dispersin es debido a que la velocidad, de la onda de radiacin electromagntica, depende de la frecuencia de la misma, es decir, que a frecuencias altas los campos elctrico y magntico varan haciendo que la polarizacin de la materia y la magnetizacin no sigan estas variaciones. La descripcin ms simple de la dispersin se puede hacer considerando la luz incidente, como una onda plana, onda que es de amplitud uniforme y que se encuentra perpendicular al plano de la direccin de propagacin. Cuando una onda plana monocromtica, que tiene una intensidad dada I 0 , se encuentra con un objeto dispersor, una parte de su potencia P es redirigida espacialmente [5]. En tejidos biolgicos, la dispersin es el mecanismo de interaccin dominante en la propagacin de la luz. La dispersin es clasificada por la relacin del tamao del objeto dispersor y la longitud de onda de la luz incidente: El lmite Rayleigh: Este tipo de dispersin da lugar a una distribucin de las intensidades de la radiacin dispersada, que es relativamente simtrica en todas las direcciones alrededor de la partcula. Las estructuras celulares, que hacen dispersar la luz en este lmite, o sea, que tienen un tamao menor que la longitud de onda de la luz incidente, son componentes celulares como membranas y componentes extracelulares compuestos en su mayora por fibras de colgeno. El rgimen Mie: La teora de Mie, describe la dispersin de la luz con objetos esfricos, la cual es aplicable a cualquier proporcin entre la longitud de onda y el objeto dispersor. En el rango intermedio de esta proporcin donde las aproximaciones de Rayleigh y la geomtrica no son vlidas, se usa esta teora, es decir, la regin donde la longitud de onda es comparable con el tamao del dispersor, es el rgimen Mie. Varias estructuras celulares, como la mitocondria y el ncleo y componentes extracelulares, como fibras de colgeno, poseen tamaos 19

de cientos de nanmetros y unos cuantos micrmetros, que son comparados con las longitudes de onda utilizadas para aplicaciones biomdicas. La dispersin ocurre, cuando hay variaciones espaciales de los ndices de refraccin, ya sean continuos o abruptos. En un tejido biolgico, los dispersores ms importantes son las organelas celulares, debido a que estas muestran una alta anisotropa, variabilidad en su forma y tamao, dando origen a fenmenos de este tipo. La mitocondria, es la organela encargada de la respiracin y la produccin de energa en las clulas, adems, es uno de los dispersores mas dominantes; estas estructuras son un poco cilndricas y varan en tamao dependiendo del tipo de clula, con dimensiones que oscilan entre 0.5 hasta 2m, este organelo, adems de estar encapsulado en una membrana lipdipica, contiene lpidos internos, estas estructuras lipdicas tienen un gran contraste ptico a travs del citoplasma y produce efectos de dispersin fuertemente observables. El rgano celular ms grande es el ncleo celular con un dimetro entre 4-6m. La clula vara de forma y tamao dependiendo del tipo de tejido. Una clula aislada puede ser un fuerte dispersor, pero en un tejido el fenmeno de dispersin es de origen subcelular. En la piel, los melaninosomas, son estructuras muy importantes en la dispersin y tienen un tamao de 100 nm a 2m. En la sangre, los eritrocitos son los dispersores ms fuertes, estos tienen un espesor de 2m aproximadamente y un dimetro entre 7 y 9m; las propiedades de dispersin de la sangre dependen del hematocrito o sea del volumen de eritrocitos y de su grado de aglomeracin. Los tejidos de soporte, estn conformados por protenas celulares y extracelulares, como la elastina y el colgeno, que proveen potencia mecnica y durabilidad. Las propiedades dispersivas de esta clase de tejidos, depende, a pequea escala, de un conjunto de heterogeneidades y a gran escala, de variaciones en la forma de las estructuras; los tamaos caractersticos tenidos en cuenta en la pequea escala son de orden de magnitud ms pequeos que la longitud de onda de excitacin [5]. Absorcin. La absorcin, es un proceso por el cual, una especie molecular extrae energa de la luz incidente. Este fenmeno tiene lugar cuando la frecuencia de la onda electromagntica, coincide con la frecuencia del espectro de emisin de un tomo o molcula; as, cuando la luz atraviesa un material, ciertas frecuencias se 20

eliminan selectivamente por la absorcin, y este proceso, brinda un medio para caracterizar los componentes de la muestra [5]. Este proceso, es la transicin de una especie (molcula o tomo) de un nivel de menor energa a uno mayor, esta transicin requiere de la absorcin de energa, que permita, el cambio de nivel y est dada por h = E , donde, h es la cantidad de energa del fotn y E es la diferencia de energa entre los dos niveles. Este tipo de transiciones se dan en regiones del espectro llamadas bandas de absorcin, las cuales, atienden a una especie atmica o molecular en particular. Existen tres procesos de absorcin: Absorcin entre niveles electrnicos es cuando un grupo de molculas que estn en equilibrio, tienen una distribucin trmica en el nivel vibracional y rotacional, en el estado base (S0). Cuando una molcula absorbe energa de excitacin, esta es elevada desde el estado base hasta algn nivel vibracional de uno de los estados excitados del singulete (Sn), ver figura 2-2. La intensidad de la absorcin (fraccin de molculas en el estado base promovidas a un estado electrnico excitado), depende de la intensidad de la radiacin de excitacin (nmero de fotones) y la probabilidad de la transicin de la energa de los fotones. Absorcin que involucra los diferentes estados vibracionales son determinados por los niveles vibracionales de los tomos presentes en las molculas, estas vibraciones a diferentes grados de libertad se encuentran cuantizadas, dando una serie de niveles de vibracin para cada modelo vibracional de una molcula. Una transicin vibracional, ocurre cuando una molcula pasa de un estado vibracional a otro. Absorcin que envuelve los diferentes estados de rotacin de una molcula, son representados por los niveles rotacionales, estos niveles de energa estn cuantizados y corresponden a energas fotnicas, desde el infrarrojo a longitudes de onda menores al milmetro. Los niveles de energa electrnicos, de las molculas, estn asociados con los orbitales moleculares que describen la distribucin de electrones en la molcula. Cuando una molcula sufre una transicin electrnica, un electrn, es transferido desde un orbital molecular a otro. Hay casos para los cuales la excitacin es considerada localizada, para un enlace particular o para grupos de tomos [5].

21

2.3 ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA ANLISIS DE TEJIDOS BIOLGICOS

EN

EL

La complejidad de los tejidos biolgicos, sugiere que las tcnicas y estudios estn basados en especies individuales de niveles bioqumicos fundamentales. El anlisis de las propiedades de absorcin y de emisin de fluorescencia de varios fluorforos, explican mejor las interacciones complejas, que pueden ocurrir en muestras de tejido. En un estudio, por un mtodo ptico, como la espectroscopa ptica de fluorescencia, se puede obtener informacin significativa, acerca de varios fluorforos presentes, como tambin de su ambiente local. Una de las razones ms comunes para investigar especies fluorescentes, es la deteccin de enfermedades, sin necesidad de utilizar marcadores o fluorforos exgenos. Esto se debe a que la clula en estados de enfermedad, generalmente tiene velocidades de metabolismo diferentes o estructuras alteradas, por lo tanto hay variaciones en los espectros de emisin de fluorescencia. Estas diferencias en los espectros estn marcadas por la concentracin de fluorforos o su distribucin a lo largo del tejido, el ambiente local que rodea el fluorforo, la arquitectura particular del tejido y la atenuacin de la luz, que depende de la longitud de onda, debido, a la cantidad de los cromforos que no emiten fluorescencia. En la tabla 2-2 se listan algunos fluorforos endgenos que juegan un rol fundamental, en las transformaciones que ocurren en los tejidos durante la carcinognesis [1].
Tabla 2-2 Longitudes de onda de excitacin y emisin de algunos fluorforos Fluorforos Triptfano (Aminocido) Colgeno y elastina (Estructuras protenicas) NADH y FAD (Coenzimas) Porfirinas Longitud de onda de excitacin 280nm 325nm y 320nm respectivamente. 365nm y 440nm respectivamente 400 y 450nm Longitud de onda de emisin 350nm 390nm y 410nm, respectivamente. 470nm y 520nm respectivamente 630nm y 690nm

La espectroscopa ptica de fluorescencia para el anlisis de tejidos biolgicos, depende especficamente, de la concentracin y distribucin de fluorforos presentes en los mismos, como tambin, del entorno bioqumico / biofsico, el cual puede alterar la cantidad de fluorescencia cedida y el tiempo de vida de los fluorforos. El tejido epitelial o escamoso tiene cuatro capas de clulas primarias que estn sobre la membrana basal y por debajo esta el estroma; los fluorforos como tambin su concentracin y distribucin pueden variar significativamente 22

entre estas capas de tejido. La espectroscopa de fluorescencia en tejidos tambin depende de la absorcin y dispersin que resulta de la concentracin y distribucin de la no fluorescencia absorbida y dispersada respectivamente, dentro de las diferentes capas del tejido, todos estos efectos de las variables sealadas en la espectroscopa ptica de fluorescencia de tejidos son dependientes de la longitud de onda de excitacin. Los fluorforos endgenos del cuello uterino sern excitados y de all emitirn fluorescencia. Las propiedades de absorcin y distribucin de la luz, en los tejidos, afectarn tanto las longitudes de onda de excitacin, como las de emisin, por consiguiente, solo los fluorforos contenidos en las capas de los tejidos del cuello uterino, en la cual la luz de excitacin penetra y de la cual la luz de emisin puede escapar de la superficie del tejido, producir fluorescencia medible. La espectroscopa ptica de fluorescencia, proporciona caractersticas discriminantes, en el anlisis de los cambios bioqumicos y estructurales en materiales biolgicos; adems, de la observacin de cambios en vivo, mediante espectros caractersticos de los estados de normalidad y patologa, de los tejidos biolgicos. Es por ello que esta tcnica, puede contribuir al diagnstico mdico a travs de la observacin en vivo, de enfermedades como los precnceres de cuello uterino. Una revisin de los fluorforos responsables de la fluorescencia de las clulas, se encuentra en S. Andersson- Engels et al [8], quienes mencionan como fluorforos mejor conocidos en tejido biolgico que contribuyen a la seal de fluorescencia bajo excitacin de luz, en el cercano ultravioleta al triptfano (emisin a 350 nm), al colgeno (a 390 nm), a la elstina (a 410 nm), NADH (a 470 nm), a las flavinas (a 520 nm), a la melanina (a 540 nm) y finalmente, a las porfirinas (en la regin roja del espectro). R. R. Alfano et al midieron la fluorescencia de clulas normales y clulas cancerosas de rin de rata, encontrando diferencias sustanciales en los espectros [9]. Ellos proponen a las flavinas, como responsables de la fluorescencia (a nivel mitocondrial), en especial al dinucletido de adenina y flavina (FAD). Usaron como longitud de onda de excitacin = 488 nm del lser inico de argn.

2.4 COMPORTAMIENTO PTICO DE LOS TEJIDOS BIOLGICOS

Los tejidos biolgicos considerados como material ptico, se comportan como organismos turbios, que por el contrario a los materiales pticos clsicos no poseen superficies planas, estructuras cristalinas o un ndice de refraccin simple. 23

Los tejidos estn compuestos por una enorme variedad de molculas, habitualmente de tamao menor que la longitud de onda de la luz visible, la cual no tiene patrones geomtricos rgidos y repetitivos de un punto a otro de su ambiente. Por encima de esta escala, se encuentran las unidades celulares, con escasos patrones de regularidad en su distribucin. Estas unidades celulares s pueden ser de un tamao prximo a las longitudes de onda de la luz. Cuando se irradian estructuras inhomogneas, como los tejidos, se producen conjuntamente absorcin y dispersin en ellos. La forma como se realizan ambos fenmenos, depende de la longitud de onda de la radiacin o del tamao de las partculas del tejido; en la absorcin tiene importancia un factor adicional: la presencia de determinados pigmentos, elementos cromforos (elementos que actan como cuerpos negros) como la melanina, hemoglobina y la mioglobina [7]. La clula se considera la unidad estructural y funcional de la vida; es la unidad ms pequea de materia viva capaz de realizar todas las actividades inherentes a los seres vivos: tipo preciso de organizacin, metabolismo, homestasis, movimiento, irritabilidad, crecimiento, reproduccin y adaptacin al cambio ambiental [10]. La teora celular es una de las generalizaciones ms amplias y fundamentales de la biologa y establece que: 1) todos los seres vivos estn formados por clulas y productos celulares; 2) slo se forman nuevas clulas por divisin de clulas preexistentes; 3) existen similitudes fundamentales en los constituyentes qumicos y las actividades metablicas de todas las clulas. Las clulas de las plantas y animales presentan una gran variedad de tamaos, formas, colores y estructuras internas, que guardan relacin con las funciones especficas que stas deben efectuar, pero todas exhiben ciertas caractersticas en comn. Casi todas las clulas contienen un ncleo y otras estructuras internas llamadas organelos. Adems, las clulas vivas, estn integradas por molculas inanimadas [11]. Cuando se examinan individualmente, estas molculas aisladas se ajustan a todas las leyes fsicas y qumicas que rigen el comportamiento de la materia inerte. Los seres vivos poseen estructuras internas intrincadas que contienen muchas clases de molculas complejas y se presentan, adems, en una variedad asombrosa de especies diferentes. La mayor parte de los componentes qumicos de los organismos, son compuestos orgnicos de carbono en los que este elemento se halla relativamente reducido o hidrogenado, muchas biomolculas orgnicas contienen tambin nitrgeno. Los principales grupos moleculares que componen las clulas, son los lpidos, las protenas, los cidos nucleicos y los carbohidratos. Los organismos vivos tienen la capacidad de extraer y transformar la energa de su entorno a partir de materias 24

primas sencillas y de emplearla para edificar y mantener sus propias e intrincadas estructuras. El metabolismo puede definirse, como la suma total de todas las reacciones enzimticas que tienen lugar en la clula. Las funciones especficas del metabolismo son principalmente [12]: 1) la obtencin de energa qumica de las molculas combustibles o de la luz solar absorbida, 2) el ensamble de sillares de construccin para formar protenas, cidos nucleicos, lpidos y otros componentes celulares y, 3) la formacin y degradacin de las biomolculas necesarias para las funciones especializadas de las clulas. El metabolismo se divide en dos fases principales: catabolismo y anabolismo. El catabolismo es la fase degradativa del metabolismo, en la cual las molculas nutritivas complejas y relativamente grandes (glcidos, lpidos y protenas) que provienen, o bien del entorno o bien de sus propios depsitos de reserva, se degradan para producir molculas ms sencillas tales como cido lctico, cido actico, CO2, amonaco o rea. El anabolismo constituye la fase constructiva o biosinttica del metabolismo, en la cual tiene lugar la biosntesis enzimtica de los componentes moleculares de las clulas, tales como cidos nucleicos, protenas, lpidos y polisacridos a partir de sus precursores sencillos. Las enzimas son protenas especializadas en la catlisis de las reacciones biolgicas. Se encuentran entre las ms notables de las biomolculas conocidas debido a su extraordinaria especificidad y a su poder cataltico, mucho mayor que la de los catalizadores hechos por el hombre. La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como protenas, mientras que otras necesitan adems, uno o ms componentes no proteicos, llamados cofactores; stos pueden ser un ion metlico, o una molcula orgnica llamada coenzima, aunque algunas enzimas necesitan de ambos. Por lo general, las coenzimas actan como transportadores intermediarios de grupos funcionales, de tomos especficos o de electrones, los cuales son transferidos en la reaccin enzimtica global. Un proceso metablico determinado puede necesitar varias enzimas o inclusive todo un sistema enzimtico, para llevarse acabo. Los diferentes enzimas y sistemas enzimticos estn localizados, en uno u otro organelo o en alguna parte de la estructura del citoplasma. Las enzimas de xido-reduccin actan en el centro del metabolismo celular energtico. La energa liberada en la oxidacin o reduccin por compuestos orgnicos es capturada con eficiencias variables en formas muy diversas, tales como ATP, potenciales de membrana, o coenzimas reducidas. 25

Las deshidrogenasas, enzimas de xido-reduccin, necesitan como coenzimas al NAD (dinucletido de adenina y nicotinamida) o al NADP (dinucletido de adenina y nicotinamida fosfato). Las deshidrogenasas NAD-dependientes, intervienen de manera primordial en la transferencia de electrones desde los sustratos hasta el oxgeno, en la respiracin metablica, proceso a travs del cual obtiene energa la clula La utilidad del NAD+ (+ por su forma oxidada) y del NADP+ para propsitos de anlisis enzimtico depende de algunas de sus inusuales propiedades [12]. 1) Sirven como agentes naturales de oxidacin o reduccin en una amplia variedad de sistemas enzimticos especficos. Con la enzima apropiada como catalizador, pueden oxidar o reducir selectivamente un sustrato particular en presencia de otros muchos compuestos. 2) Las formas reducidas NADH y NADPH, adems de absorber luz en el cercano UV, tienen propiedades de emitir luz fluorescente, mientras las formas oxidadas no lo son. NADH y NADPH tienen bandas de absorcin idnticas, con el mximo en 340 nm, NAD+ y NADP+ no absorben a esta longitud de onda. De esta forma, los cambios en el estado de oxidacin o reduccin son medidos por espectroscopa ptica de fluorescencia.

2.5 ANLISIS BIOQUMICO DE ESPECIES INDIVIDUALES

Los anlisis bioqumicos, se basan en estudios fundamentales o generales de la base constituyente de los sistemas biolgicos, los cuales, son compuestos bioqumicos individuales como el triptofano, colgeno, la forma reducida del nicotinamida adenina diniclotida (NADH), flavinas (FAD) y hemoglobina entre otros. Tales estudios permiten determinar y caracterizar las propiedades fluorescentes de estas especies que se denominan fluorforos y pueden ser endgenos o exgenos. Fluorforos endgenos. Son especies fluorescentes en sistemas biolgicos, la mayora de estos estn asociados con la matriz estructural de los tejidos o con varios procesos metablicos celulares, pueden ser aminocidos, estructuras protenicas, enzimas, coenzimas, vitaminas, lpidos y porfirinas y cada uno tiene un nico espectro de emisin [12]. En el caso de las matrices estructurales, los fluorforos ms comunes son el colgeno y la elastina; la fluorescencia de estos compuestos se debe principalmente al entrecruzamiento de varios aminocidos en su estructura [5]. Algunos de los fluorforos endgenos en los sistemas biolgicos humanos y animales se relacionan con el metabolismo celular. Las especies predominantes en esta categora incluyen NADH, FAD y lipopigmentos fluorescentes fuertes 26

(lipofuscin y ceroides). Adems de estos, existen muchos otros fluorforos endgenos que emiten a varias longitudes de onda y cubren rangos del ultravioleta y visible del espectro electromagntico. Estos fluorforos incluyen aromticos, aminocidos como triptofano, tiroxina y fenilamina, varias porfirinas (hemoglobina y la mioglobina). La figura 2-3, muestra los espectros de absorcin y de emisin de fluorescencia de varios fluorforos endgenos presentes en los tejidos biolgicos [16]. Como estas especies fluorescentes son generalmente estructurales y metablicas, pueden dar informacin sobre alteraciones en los tejidos.

Figura 2-3. Espectros de absorcin y emisin de fluorescencia de fluorforos endgenos.

Fluorforos exgenos. Son sustancias que al ser suministradas al tejido se acoplan a un cierto tipo de molcula y tienen propiedades de fluorescencia. Adems del gran nmero de fluorforos endgenos utilizados en el diagnstico biomdico, se han estudiado y creado fluorforos exgenos para diferentes propsitos y aplicaciones, como el monitoreo de la funcin celular, marcacin de tumores, para determinar la viabilidad de las clulas o la permeabilidad de sus membranas entre otros. La ventaja de usar fluorforos exgenos es que se pueden seleccionar las propiedades fotofsicas y farmacocinticas de acuerdo a su aplicacin, adems de emitir con mayor intensidad que los endgenos [13].

2.6 LOS FLUORFOROS PATOLGICOS

EN

EL

ANLISIS

DE

ESTADOS

El cambio en la concentracin de fluorforos, puede ser atribuido a varios eventos, en ciertos casos algunos qumicos pueden dejarse de producir o al contrario producirse ms en estados de enfermedad. Del mismo modo, la distribucin o la forma del fluorforo puede variar a lo largo del tejido, por ejemplo NADH es una 27

molcula fluorescente en su forma reducida y no es fluorescente en su forma oxidada. El cambio en la microestructura (ambiente local) que rodea al fluorforo puede tener efectos importantes en las propiedades de fluorescencia, como la eficiencia cuntica, la posicin espectral del mximo de la emisin fluorescente, el ancho de su lnea espectral y el tiempo de vida de la fluorescencia. Todos estos factores tienen un impacto significativo en la emisin de fluorescencia del tejido ya que varan sus propiedades pticas. Un factor importante en las diferencias asociadas con los estados de enfermedad del tejido, es la presencia de cromforos no fluorescentes como la hemoglobina, ya que varan en concentracin, dependiendo del estado y tipo de la enfermedad y pueden absorber la luz a las longitudes de onda de la fluorescencia emitida por el tejido o tambin absorber longitudes de onda de la luz de excitacin empleada en el anlisis. Un ejemplo es el incremento de la vascularizacin del tejido tumoral debido a la angiognesis, esto incrementa la hemoglobina que absorbe en el rango visible del espectro electromagntico.

REFERENCIAS
1 2

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

N. Ramanujan. Spectroscopy fluorescence in vivo, Encyclopedia of analytical chemistry, Ed. Meyers (2000). T. Breslin, F. Xu, G. Palmer, C. Zhu, K. Gilchrist, N. Ramanujam. Autofluorescence and Diffuse Reflectance Properties of Malignant and Benign Breast Tissues. Annual surgery Oncology. 11 (2004) 65-70. Alonso y Finn. Fsica Volumen III. Fundamentos Cunticos y Estadsticos. Ed. Addison-Wesley Iberoamericana. J. R. Lakowicvz, Principles of fluorescence spectroscopy, Plenum Press (1983) T. Vo-Dinh. Biomedical Photonics. Handbook. CRC (2003). Eugene D. Olsen. Mtodos pticos de Anlisis. Revert (1986). F. Sendra Portero. Fototerapia: Propiedades fsicas de la luz - interaccin con los tejidos. S. Andersson-Engels et al., Photochem. Photobiol., 53 (1991) 807-814. R. R. Alfano, et al., IEEE Journal of Quantum Electronics 20 (1984) 1512-1515. C. A. Ville, E. Peal Solomon, P. William Davis, Biologa. Nueva editorial interamericana (1987). A. L. Lehninger, Bioqumica, Ediciones Omega S.A. (1982). G. Palmer, N. Ramanujam, et al. Autofluorescence and diffuse reflectance properties of malignant and benign breast tissues. Ann Surg Oncol 11 (2004) 65-70.

28

3. SIMULACIN DEL ESPECTRO DE FLUORESCENCIA

Para el anlisis de medios turbios como el tejido biolgico, la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia se basa en la Ley de Beer Lambert. Para observar detalladamente el desarrollo de esta ley comenzaremos por describir la ley de Lambert Bouger que relaciona la absorcin de la luz de un medio homogneo pticamente diluido y el espesor del medio [1].
dI = a dl I
3-1

La ecuacin 3-1 describe como cada capa sucesiva dl del medio absorbe la misma fraccin dI I de la intensidad de luz incidente I por la constante

a (coeficiente de absorcin). La intensidad de luz transmitida I a travs de la

distancia l es I = I 0 e a l . El coeficiente de absorcin puede as ser interpretado como la probabilidad de que un fotn sea absorbido por el medio por unidad de longitud. El reciproco del coeficiente de absorcin, conocido como la longitud de absorcin, es la distancia requerida por la intensidad de haz de luz para de crecer en e 1 de la intensidad de luz inicial, quedando I = I 010 Kl , donde, K es el coeficiente de extincin, entonces la absorbancia A = Kl , y es representada como,
I A = log10 0 I

3-2

En 1852 Beer, determina que el coeficiente de absorcin de una sustancia es linealmente relacionado con la concentracin c de la sustancia diluida en un medio no absorbente, a = c , donde, es el coeficiente de absorcin especifico. La ley de Lambert Bouger se puede escribir entonces como, I = I 0 e cl I = I 010 cl , conocida como la Ley de Beer Lambert, donde es el coeficiente de extincin especfico [1].

En una solucin que contiene n sustancias, el total de la absorbancia es la suma individual de los coeficientes de extincin K multiplicados por l ,

A = ( K1 + K 2 + ... + K n ) l equivalente a decir que

A = ( 1c1 + 2 c2 + ... + n cn ) l .

Para modelar la fluorescencia de un tejido biolgico, el tejido es representado como una sola capa, la cual es infinitamente profunda con respecto a la capacidad de penetracin de la luz incidente. Este supuesto es ms apropiado para longitudes de onda de excitacin, para la cual e 1 de profundidad de penetracin es menor que el espesor de la capa superior. Adicionalmente se realizan otras suposiciones [2]: 1. La intensidad de luz se atena exponencialmente en el tejido biolgico, debido a la absorcin y la dispersin. Esta atenuacin es total, ya que no se trata la dispersin y la absorcin separadamente. 2. Los fluorforos son distribuidos homogneamente en todo el tejido biolgico. 3. El haz de luz de excitacin se asume uniforme tanto de perfil como infinito de lado. Estas suposiciones son equivalentes a restringir el modelo a una sola dimensin en la interaccin de la luz incidente, con el tejido biolgico. La intensidad de fluorescencia F ( x , m ) es funcin de la longitud de onda de excitacin x y de la longitud de onda de emisin m y puede ser escrita de la siguiente forma,

F (x , m ) = k P ( x ) e
0

t ( x ) z

a ( x )

( x , m )
2

t ( m ) z

dz

3-3

P ( x ) :

Potencia de la luz incidente a la longitud de onda de excitacin. Atenuacin total del tejido. Coeficiente de absorcin del tejido.

t ( ) : a ( ) :

( x , m ) : Rendimiento cuntico, definido como el total de la energa fluorescente

emitida a m sobre el total de la energa absorbida a x .
z:

Distancia de penetracin de la luz en el tejido.

Debido a la dispersin, la mxima intensidad de luz justo adentro de la superficie del tejido puede ser mayor que la intensidad de la luz incidente. Este efecto se incluye en la ecuacin 3-3 como k (factor de proporcionalidad que depende del 30

ndice de refraccin del tejido, la longitud de onda de la luz incidente y de la eficiencia del detector). La ecuacin 3-3 tiene una simple interpretacin fsica [2], donde,

P ( x ) e
a ( x )

t ( x ) z

, representa la atenuacin de la luz incidente. , es la conversin de la luz incidente en fluorescencia.

( x , m )
2

t ( m ) z

dz , representa la atenuacin de la luz en el tejido dirigida a fluorescencia.

Integrando la ecuacin 3-3 se obtiene que,

F (x , m ) =

kP ( x ) a ( x )

( x , m )
2
3-4

t ( x ) + t ( m )

Los trminos a y t contienen contribuciones individuales de todos los fluorforos presentes en el tejido biolgico. Es esta informacin la que se desea separar, lo que nos impulsa a proponer una forma ms general de expresar la ecuacin a y t como una suma sobre todos los N fluorforos presentes en el tejido biolgico [2].

F (x , m ) = kP ( x )

( , ) ( ) 2
N i x m

( ( ) + ( ))
i =1 ti x ti m

i =1 N

ai

3-5

Recordando que los fluorforos presentes en el tejido del cuello uterino, que contribuyen a la seal de fluorescencia bajo excitacin de luz, a una longitud de onda de 337.1 nm son el colgeno (emisin a 393 nm), la elastina (emisin a 410 nm), el NADH (a 470 nm) y las flavinas (a 520 nm) [3]. Usando esta informacin en la ecuacin 3-5 y a una longitud de onda de excitacin de 337.1 nm, la forma ms general de representar la contribucin de todos los fluorforos presentes en los tejidos de cuello uterino es, 31

F ( 337.1, m ) =

C ( 337.1, m ) + E ( 337.1, m ) + NADH ( 337.1, m ) + FAD ( 337.1, m ) C1 + C2 + C3 + C4

3-6

Donde,
C ( 337.1, m ) = aCol ( 337.1)

Col ( 337.1, m )
2

, contribucin del colgeno.

E ( 337.1, m ) = aElas ( 337.1)

Elas ( 337.1, m )
2

, contribucin de la elastina.

NADH ( 337.1, m ) = aNADH ( 337.1)

NADH ( 337.1, m )
2

, contribucin del NADH.

FAD ( 337.1, m ) = aFAD ( 337.1)

FAD ( 337.1, m )
2

, contribucin del FAD.

C1 = tCol ( 337.1) + tCol ( m ) , Atenuacin debida al colgeno presente en el tejido. C2 = tElas ( 337.1) + tElas ( m ) , Atenuacin debida a la elastina presente en el tejido. C3 = tNADH ( 337.1) + tNADH ( m ) , Atenuacin debida al NADH presente en el tejido. C4 = tFAD ( 337.1) + tFAD ( m ) , Atenuacin debida al FAD presente en el tejido.
Estas ecuaciones modeladas por medio de gaussianas permiten reconstruir el espectro de fluorescencia, el cual es obtenido por la suma de las contribuciones individuales de cada uno de los fluorforos presentes en los tejidos biolgicos, como son los del cuello uterino y mama. As, de esta forma se puede obtener el modelo matemtico que permite simular el espectro de fluorescencia cuando interacta la radiacin electromagntica con los tejidos biolgicos. La simulacin de los espectros de fluorescencia permite el anlisis de los diferentes fenmenos que ocurren cuando varan las contribuciones individuales de cada uno de los fluorforos presentes en el medio de estudio, buscando obtener espectros caractersticos de normalidad y patologa de tejidos biolgicos.

32

Adems, el modelo matemtico obtenido para los espectros de fluorescencia puede ser usado tambin, en el procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia de los tejidos biolgicos, como mtodo de ajuste por mnimos cuadrados de los espectros, con la finalidad de extraer caractersticas discriminantes que permitan diferenciar entre estados patolgicos y normales de estos tejidos.

REFERENCIAS
1 2

Skoog, Holler y Nieman: Principios de Anlisis Instrumental. McGraw-Hill (2001). R. Richards-Kortum et al. A one layer model of laser induced fluorescence for diagnosis of disease in human tissue: applications to atherosclerosis. Journal biomedical optics 9 (2004) 511522. N. Ramanujam .Spectroscopy Fluorescence in Vivo, Encyclopedia of Analytical Chemistry, Ed. Meyers (2000).

33

4. SIMULACIN DE CLULAS BIOLGICAS A TRAVS DEL MODELO CELULAR DE POTTS

Existen una gran variedad de modelos para simular fenmenos celulares biolgicos, sin embargo stos se pueden clasificar en tres grandes grupos segn el manejo que se d a las variables espacio-temporales: modelos discretos, continuos e hbridos [1]. Los modelos discretos en procesos biolgicos, son usados cuando el inters es el comportamiento de clulas individuales y sus interacciones con otras clulas y con el medio. Se consideran las clulas como puntos de una red que se mueven de acuerdo a ciertas reglas. En particular, modelos basados en individuos son relativamente nuevos en biologa celular, tienen aplicaciones en ecologa, formacin de patrones, crecimiento de tumores y angiognesis asociada con malignidad, entre muchos otros. Entre estos modelos se encuentra el modelo celular de Potts. Los modelos continuos, emplean ecuaciones diferenciales que describen las variaciones espacio temporales de un campo (concentraciones o campo de fuerza), y se basan en la densidad de las clulas y no en las clulas discretas. Los modelos continuos, involucran frecuentemente, el desarrollo de una ecuacin de reaccin - difusin. Son tiles cuando la escala de longitud sobre la cual se quiere investigar el fenmeno es mucho mayor que el dimetro de los componentes individuales. Estos modelos efectivamente describen efectos globales como diferenciacin o movimiento celular en respuesta a un campo qumico. En los modelos hbridos se modelan las clulas como entidades discretas, pero sus movimientos estn influenciados por campos espaciales continuos, as que el tejido se modela como una densidad continua. Se encuentran entonces modelos celulares de Potts hbridos, donde las clulas siguen estando en una red singular pero se utilizan ecuaciones diferenciales acopladas para simular fenmenos como la quimiotaxis, la difusin de qumicos, entre otros. El modelo Potts fue presentado en 1952 como una extensin del modelo de Ising, el cual ha sido usado para simular fenmenos de un tipo de partculas fsicas que

modifican su comportamiento a travs de la interaccin con las partculas vecinas. Una aplicacin clsica de este modelo es el estudio de propiedades magnticas. En este modelo las etiquetas son asociadas a los elementos i de una red. Cada etiqueta puede tomar uno de dos valores +1 -1, significando la orientacin magntica de los elementos de la red. Si existen N elementos en una red, entonces el sistema puede estar en 2N estados. Una configuracin particular de un microestado es especificado por el conjunto de etiquetas de todos los elementos de la red { (i1) , (i 2 ) ,..., (iN )}. La energa de un estado en particular est representada por el Hamiltoniano de Ising, ecuacin 4-1:

H = J (i ) ( j ) B (i )
ij i =1

4-1

Donde J es la energa de interaccin entre los vecinos ms prximos y B es un campo magntico externo. El modelo original de Potts se us para describir las propiedades termodinmicas y fsicas de dominios magnticos en los materiales. Con el transcurso de los aos estos modelos se han ido aplicando a una variedad de fenmenos tanto fsicos como biolgicos. El primer intento por desarrollar el modelo de Potts, como un modelo celular, se di a principios de los aos 80 con Anderson, Grest y Srolovitz [1] , quines usaron el modelo de Potts de q estados para estudiar los patrones celulares en granos metlicos. Se demostr la utilidad del modelo para simular el crecimiento del grano conducido por la energa de superficie. En 1992, Franois Graner y James A. Glazier [2], modifican el modelo de Potts de q estados, con adhesividad diferencial, para simular la organizacin de una mezcla de dos tipos de clulas biolgicas, figura 4-1. Graner y Glazier desarrollan una extensin en la cual se restringe el tamao de la clula y permite diferentes energas de superficie (conocido como adhesividad diferencial o DAH) entre diferentes tipos de clulas.

Figura 4-1. Organizacin celular lograda por el CPM, (a) Condicin inicial, (b) Organizacin celular, (c) Ordenamiento de clulas en forma de mosaico, (d) engullimiento.

35

4.1 MODELO CELULAR DE POTTS PARA SIMULAR CELULAS BIOLOGICAS

El modelo de Potts, trata las interacciones de los elementos de la red con sus vecinos, en trminos de las energas de interaccin entre ellos. En el caso de aplicaciones biolgicas, se estudian las clulas desde el punto de vista de la interaccin de ellas con sus vecinas y el tejido circundante cuantificando, en trminos de energas de la adhesin que sufren entre ellas y el tejido. Especficamente el costo de energa de las interacciones se cuantifica en los coeficientes de acoplamiento. El modelo celular de Potts (CPM) incorpora el comportamiento celular fenomenolgicamente observado usando restricciones matemticas y expresando estas restricciones en trminos de la energa efectiva total del tejido. Desde un punto de vista matemtico, podemos representar cualquier comportamiento repetitivo de una clula en forma de una respuesta consistente con una restriccin. La divergencia de las respuestas demanda una penalizacin de energa. Las dinmicas escogidas, reducen la penalizacin. Gradualmente, relajando el patrn con uno consistente con la restriccin [3]. El mtodo tiene la gran ventaja que puede introducir mecanismos adicionales por medio de restricciones adicionales. As se introducen fenmenos como la quimiotaxis, la polaridad celular o la mitosis.

4.1.1 ADHESIN
Se modelan las interacciones de las superficies de las clulas con las dems clulas definiendo unas constantes de acoplamiento Jij,ij, las cuales cuantifican la fuerza de la interaccin entre puntos de la red adyacentes con diferentes valores de ij. En el sentido fsico, las J corresponden a la energa total involucrada en la interaccin especfica, la cual es proporcional al nmero de receptores en la superficie de la clula involucrada en la interaccin y la energa de unin de los ligaduras involucrados con sus receptores. Por lo tanto, la energa contenida en las interacciones entre clulas puede ser definida por el Hamiltoniano representado en la ecuacin 4-4:

H = J ij , i ' j '
ij i' j'

4-2

36

Donde los trminos (i,j) describen los puntos en la red: la primera sumatoria va sobre los puntos de red, la segunda sobre los ocho prximos vecinos de (i,j). Si ij =ij entonces los dos puntos de red (i,j) y (i,j) estn dentro de la misma clula, y su contribucin a la energa de interaccin de la superficie es cero, por lo tanto, en este caso, Jij,ij=0. Un valor de J grande implica que las uniones requieren mayor energa y por lo tanto son menos probables. a) Adhesin Diferencial. El modelo de Potts permite introducir la hiptesis de la adhesin diferencial (DAH) de Steinberg, bajo la cual la fuerza de unin entre dos clulas, depende de su tipo, donde la afinidad de las molculas de adhesin celular en las membranas celulares, determinan la energa de adhesin [4]. Por lo tanto los coeficientes de acoplamiento son dependientes del tipo de clula. Se introduce en el modelo una etiqueta adicional a la clula, la cual determina su tipo: (ij), (por ejemplo: clulas del endotelio, endometrio...). Para cada punto de la red (i,j) tenemos entonces dos etiquetas: ij, etiqueta que identifica la clula, y (ij), que identifica el tipo de esa clula en particular. El Hamiltoniano se modificara entonces:

H = J ( ij ), ( i ' j ' ) {1 ij , i ' j ' }

ij i' j'

4-3

El trmino delta Kronecker, asegura que Jij,ij=0 para ij =ij; lo que significa que uniones entre clulas del mismo tipo tienen energa cero, o sea que la energa dentro de la clula es cero. b) Medio Extracelular. El medio extracelular puede simularse como otro tipo de clulas, sin restriccin de rea. Por lo tanto, las interacciones entre clulas y el medio son modeladas de la misma forma que las interacciones clula-clula, usando un coeficiente de acoplamiento Jclula-ECM. La interaccin entre las clulas y la ECM (matriz extracelular) que dan origen al movimiento haptotctico son tratadas por separado.

4.1.2 TAMAO DE LA CLULA

Fsicamente, tanto el crecimiento como la deformacin mecnica de las clulas requieren energa. Si la simulacin se hace en dos dimensiones se tiene en cuenta 37

los cambios de rea, si es en tres dimensiones se tendrn en cuenta cambios de volumen. Modelos ms aproximados incluyen restricciones para cambio del volumen, rea y permetro [5]. En general, el modelo tiene estas restricciones en cuenta incluyendo un trmino elstico (-VT)2: en este trmino, VT es el volumen de relajacin de la clula (el volumen al cual se relaja en la ausencia de fuerzas externas), y las deformaciones que expanden o comprimen la clula por encima o por debajo de este valor: debido a cambios en la presin osmtica, movimiento, crecimiento, divisin, etc., requerirn energa. Por lo tanto, el trmino de la energa total ahora es un Hamiltoniano que incluye las restricciones para el volumen:

H = J ( ij ), ( i ' j ' ) {1 ij , i ' j ' } + ( V ) 2

ij i' j'

4-4

Donde la sumatoria es sobre y corre sobre el nmero total de clulas en la red.

4.1.3 FLUCTUACIONES DE FORMA

A fin de simular la organizacin de las clulas que estn interactuando energticamente de acuerdo al anterior Hamiltoniano, se usa el algoritmo Metropolis, se selecciona un sitio (i,j) al azar, luego se selecciona un prximo vecino (i,j) tambin al azar. Si (i,j) y (i,j) yacen en la misma clula (es decir: ij =ij) se tiene que repetir la seleccin. Sin embargo, si los dos puntos yacen en diferentes clulas, se calcula el cambio de la energa producto de la sustitucin del sitio (i,j) con la informacin de (i,j). Si el cambio resultante en la energa de superficie total H es negativo, se acepta la copia y se cambian los valores para (i,j) adecuadamente, sin embargo, si el cambio en la energa es positiva, se tiene una probabilidad de que se d el cambio, aunque sea un cambio energticamente desfavorable. Se describen estas fluctuaciones estadsticamente usando la dinmica de Boltzmann- Monte Carlo, donde T define el tamao de fluctuacin tpica [6]. Las fluctuaciones conducen a la configuracin de las clulas a un mnimo en la energa global, en vez de conducirla a uno de los mltiples mnimos locales que pueden coexistir. Por lo tanto:
1, p ( ij i ' j ' ) = H / k T B , e si H 0; si H > 0.

4-5

38

El parmetro T, influencia la probabilidad de que tomen lugar eventos energticamente desfavorables: a mayor T, ms fuera del equilibrio est el sistema. Adems, mayor ser la movilidad aleatoria y mayor ser el rea a travs de la cual las clulas se movern en un espacio de tiempo. Por lo tanto el parmetro T es fsicamente anlogo al coeficiente de difusin D, en la ecuacin de difusin. En las aplicaciones del modelo de Potts en fsica, T es la temperatura, kB es una constante para convertir T en unidades de temperatura, denominada constante de Boltzmann. El algoritmo Metrpolis es el ms usado para simular el modelo de Potts y es apropiado para sistemas conservativos, como un magneto, pero no, para las clulas, donde la formacin y la destruccin de las uniones es altamente disipativa. As que se puede hacer el modelo ms realista fijando un umbral H0 para cambios de etiqueta mayor que cero para reflejar la disipacin [5]. As:
si H < H 0 ; 1, p( ij i ' j ' ) = ( H + H ) / k T 0 B , si H H 0 . e

4-6

El modelo anterior describe el fenmeno de clasificacin u ordenamiento de las clulas (cell-sorting), el cual ha sido estudiado extensivamente. Se puede aplicar este modelo para simular el fenmeno de la invasin maligna, extendindolo para incluir la haptotaxis y la secrecin proteoltica de enzimas [7,8]. Con todas las extensiones anteriores, el modelo se conoce como Modelo Celular de Potts, CPM. La energa total es representada en la ecuacin 4-7:

H = J ( ij ), ( i ' j ' ) {1 ij , i ' j ' } + ( VT ) 2

ij i' j'

4-7

El primer trmino es la energa de adhesin dependiente del tipo de clula. El segundo trmino involucra todas las propiedades de volumen de la clula, como la elasticidad de membrana, las propiedades del citoesqueleto y la presin osmtica. Y teniendo en cuenta las restricciones de volumen y de rea:
H = J ( ij ), ( i ' j ' ) {1 ij , i ' j ' } + ( VT ) 2 + (a AT ) 2
ij i' j'

4-8

39

En algunos modelos representa la resistencia a la compresin y representa la resistencia de la membrana al alargamiento [9]. El modelo celular de Potts permite simular tambin el crecimiento, divisin y muerte celular.

Crecimiento celular: se puede incluir el crecimiento celular por medio de un sub-modelo que aumente el volumen de relajacin, VT, con el tiempo. Divisin Celular: ocurre cuando la clula alcanza un tamao fijo, dependiente del tipo de clula. Para incorporar la divisin celular o mitosis en el modelo, se aumenta el tamao de la clula hasta el doble y luego se divide en dos a travs de su centro de masa, a lo largo del eje de mnima longitud. Cada clula hija asume una nueva identidad . Muerte Celular: Se puede modelar tambin la muerte celular fijando el volumen de relajacin igual a cero.

4.2 GENERALIDADES DEL MODELO CELULAR DE POTTS

Las clulas se posicionan en una red. A cada clula se le asigna una identificacin nica. Una clula puede ocupar ms de un sitio de red. Las simulaciones Monte Carlo del modelo de tradicionalmente, algoritmos como el de Metrpolis. Potts han empleado,

Figura 4-2. (a) Puntos escogidos para realizar el cambio en una red hexagonal; b) Nueva configuracin si el cambio se acepta.

En general se puede decir que el modelo de Potts busca por medio del algoritmo de Montecarlo minimizar la energa de una configuracin funcional inicial, siguiendo una serie de pasos: 1. Se escoge un sitio de red al azar, entre los q posibles, que tenga sus vecinos 40

2. 3. 4. 5. 6.

con diferentes clulas. Se escoge al azar un vecino. Se resuelve el Hamiltoniano para el nuevo sitio basado en cambiar ese sitio para que sea parte de la clula original (como se muestra en la figura 2). Si el cambio de energa es favorable, se hace el cambio. Si no es favorable se aplica la estadstica de Boltzmann. Se actualiza la red difundiendo las sustancias qumicas, dividiendo las clulas o segn las consideraciones tomadas.

Se mide el tiempo en pasos Monte Carlo (MCS), que comnmente est definido como tantos intentos de sustitucin (pasos de tiempo de simulacin) como tantos sitios de red [10].

REFERENCIAS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

M. S. Alber et al. On cellular automaton approaches to modeling biological cells. Mathematical systems theory in biology, communication, and finance, Springer-Verlag 134 (2002) 1-40. F. Graner and J. Glazier. Simulation of biological cell sorting using a two-dimensional extended potts model. Physical review letters 69 (1992). J. A. Izaguirre et al: CompuCell, a multi-model framework for simulation of morphogenesis. Bioinformatics 20 (2004) 1129-1137. Y. Jiang et al: Possible cooperation of differential adhesion and chemotaxis in mound formation of dictyostelium. Biophysical 75 (1998) 26152625. R. Chaturvedi et al: On multiscale approaches to three dimensional modeling of morphogenesis. Journal of the royal society interface 2 (2005) 237-253. J. Glazier, A. Uphadyaya. First steps towards a comprehensive model of tissues. Dynamical networks in physics and biology, Springer Verlag (1998) 149-160. S. Turner, J. A. Sherrat. Intercellular Adhesion and Cancer Invasion: A Discrete Simulation Using the Extended Potts Model. J. Theor. Biol. 216 (2002) 85-100. S. Turner et al. From a discrete to a continuous model of biological cell movement. Physical review 69 (2004). M. H. Merks, J. Glazier. A cell-centered approach to developmental biology. Roeland. Physica A 352 (2005) 113130. E. Borenstein, E. Cline. Cellular automata model of cystogenesis and tubulogenesis. Proceedings of the Santa-Fe Institute Complex Systems Summer School (2004).

41

5. METODOLOGA
La metodologa se presenta de manera individual en cada una de las experiencias investigativas desarrolladas en esta tesis. Entre ellas estn:

Desarrollo e implementacin de la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia. Modelamiento y simulacin de los espectros de fluorescencia que reflejan la interaccin de la radiacin electromagntica con sistemas biolgicos. Adems, se presenta la simulacin a travs del modelo celular de Potts del crecimiento de clulas normales y cancerosas en un ordenamiento celular. Procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia de los tejidos de cuello uterino, con la finalidad de determinar los espectros caractersticos de tejidos normales y patolgicos de cuello uterino. Aplicacin de la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia en el soporte al diagnstico mdico de precnceres de tejidos de cuello uterino y en tejidos en biopsias de mama. Considerando las anteriores experiencias se plantea una metodologa basada en los resultados del procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia y el procesamiento digital de las imgenes obtenidas por colposcopia de tejidos de cuello uterino, ofreciendo as a los profesionales de la salud una nueva herramienta como soporte al diagnstico mdico de estas patologas. Adems, se desarrollo una metodologa para el procesamiento digital de imgenes de placas de biopsia, que permite a los mdicos patlogos procesar en su totalidad la muestra de biopsia de tejidos de cuello uterino y mama.

42

6. DESARROLLO E IMPLEMENTACIN DE LA TCNICA DE ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA

Un esquema de los componentes bsicos para el desarrollo e implementacin de la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia en el anlisis de tejidos biolgicos, se representa en la figura 6-1; este consiste de una fuente de luz, un conducto flexible que contiene la fibra ptica para la iluminacin y recoleccin de la luz, un elemento de dispersin que separa la luz emitida entre las respectivas longitudes de onda y un detector que mide las intensidades a estas longitudes de onda; en este escenario, la emisin de fluorescencia, es medida en una reemisin geomtrica en la cual la iluminacin y recoleccin de la luz son representadas en la misma superficie del tejido biolgico.

Figura 6-1 Esquema de componentes bsicos de un instrumento usado ptica de fluorescencia de tejidos

para espectroscopa

Despus de varios estudios sobre la espectroscopa ptica de fluorescencia y de la presentacin de diferentes proyectos de investigacin, se cont con la colaboracin de diferentes entidades que aportaron para la adquisicin de los elementos y equipos que permitieron el desarrollo de una tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia porttil. Esta tcnica se desarroll, para el anlisis bioqumico de tejidos biolgicos en pacientes de diferentes municipios de Caldas, en la figura 6-2 se pueden visualizar la mayora de los elementos y equipos que la componen: Fuente de excitacin, lser de gas N2 (pumped dye), la cual permitir tener la radiacin electromagntica de excitacin a una longitud de onda fundamental de 43

337.1 nm, por medio de las cubetas de tintes para obtener las longitudes de onda de 380 nm y 460 nm. Estas longitudes de onda de acuerdo a la literatura, se han utilizado para excitar los fluorforos presentes en los tejidos biolgicos (aminocidos, estructuras protenicas, enzimas, coenzimas, lpidos y porfirinas), que puedan emitir luz fluorescente en diferentes longitudes de onda [1].

Figura 6-2 Montaje de la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia Tabla 6-1 Especificaciones del sistema laser de gas nitrgeno
Longitud de onda de salida: 337.1 nm Ancho de banda: <0.1 nm Ancho del pulso: 5 ns Energa / pulso: >300 J a 15 Hz Estabilidad pulso a pulso: <3% Potencia pico: 60 Kw Potencia mxima promedio: 15 mW a 50 Hz Modulo de tintas: Sintonizable de 360 a 750 nm, segn el tipo de tinta utilizado.

Fibra ptica, a travs de ella se iluminara el tejido del cuello uterino y se recolectar la fluorescencia que escapa de la superficie del tejido, la cual es una funcin de las propiedades de absorcin y dispersin del medio a esa longitud de onda. Una de las sondas de fibra ptica, es de dimetro 220 m, con rea de contacto de aproximadamente 0.34 mm2 y se compone de tres fibras para la iluminacin y cuatro para la recoleccin de la luz en la superficie del tejido. Adems, se tiene otra sonda de fibra ptica, de dimetro 650 m, con rea de contacto de aproximadamente 2.98 mm2 y se compone de una fibra para la iluminacin y seis para la recoleccin de la luz en la superficie del tejido. Espectrgrafo UV/VIS con un rango de longitud de onda de 200 850 nm, resolucin de 1.5 nm. Este equipo se compone de una rendija de entrada que proporciona una imagen ptica rectangular, un filtro para producir bandas 44

estrechas de radiacin, bloqueando efectos de segundo y tercer orden, un lente colimador que produce un haz paralelo de radiacin, una rejilla que dispersa la radiacin entre sus longitudes de onda individuales, un elemento que focaliza la banda de radiacin de primer orden, en el plano del detector y un detector CCD que mide las intensidades a estas longitudes de onda. El espectrgrafo trae incluida la tarjeta de adquisicin de datos y trabaja con los sistemas operativos Windows 98/Me/2000/XP.
Tabla 6-2 Especificaciones del espectrmetro USB2000
Dimensiones: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Rango Detector: 200-1100 nm Detector: 2048 pxeles, tamao pxel 14 m x 200 m, Sony ILX511 arreglo CCD lineal Rejilla: 14 Apertura de entrada (slit): 25 mm Filtros: filtros instalados pasabandas y pasalargos Longitud focal: f/4, 42 mm (entrada); 68 mm (salida) Resolucin ptica: ~0.3-10.0 nm Sensibilidad (estimada): 400 nm 90 fotones/cuentas Conector fibra ptica: SMA 905 para fibra ptica (0.22 NA) Velocidad de transferencia de datos: 13 milisegundos Tiempo de integracin: 3 milisegundos a 65 segundos Sistema operativo Windows 98/Me/2000/XP cuando se usa interfase USB

Control, se desarroll un modulo para controlar y sincronizar los tiempos de integracin del espectrgrafo y el nmero de pulsos del lser, que permite adquirir y almacenar la informacin espectral de fluorescencia de los diferentes tejidos biolgicos analizados. El algoritmo computacional, para el modulo de control, fue desarrollado en C++, el cual permite realizar 30 disparos de duracin de 1 milisegundo y con un tiempo de espera de 45 milisegundos. En cada seal de disparo, a travs del puerto paralelo de un computador porttil, se activan al mismo tiempo el sistema lser de gas nitrgeno y el espectrgrafo USB2000, este ltimo se toma alrededor de 13 milisegundos para enviar a travs de un puerto USB la informacin al software de adquisicin de datos, con un tiempo de integracin de 3 milisegundos para la recoleccin de la informacin espectral, en un rango de longitudes de onda de 179.54 a 875.85 nanmetros, con un paso de 0.29 nanmetros. Con este sistema se obtienen 30 espectros de la informacin de fluorescencia de cada punto de anlisis de los tejidos de cuello uterino.
1

N. Ramanujam .Spectroscopy fluorescence in vivo, Encyclopedia of analytical chemistry. Ed. Meyers (2000).

45

7. SIMULACIN DEL ESPECTRO DE FLUORESCENCIA Y DE CLULAS BIOLOGICAS

Para tener un modelo matemtico de la interaccin de la radiacin electromagntica con material biolgico, se debe considerar tanto los modelos para la radiacin electromagntica como para los tejidos y las clulas con las que sta va a interactuar. Considerando que la tcnica empleada para el diagnstico de precnceres, en este trabajo, contiene elementos pticos y con el fin de lograr una buena aproximacin desde el punto de vista terico, tanto para la tcnica, como la simulacin, se usa el desarrollo de un mtodo analtico para el modelo basado, en la ley de Beer Lambert, del cual se obtuvo caractersticas de los espectros de fluorescencia en vivo, esto permiti construir la simulacin de los espectros de la informacin de fluorescencia, desde la simulacin celular basada en el modelo Potts para estudiar los estados de normalidad y patologa de los tejidos de cuello uterino.

7.1 MODELAMIENTO Y SIMULACIN DE LOS ESPECTROS DE FLUORESCENCIA

En el estudio del espectro de fluorescencia de un conjunto de fluorforos presentes en un tejido biolgico, deben ser considerados la totalidad de los fotones emitidos, cualquiera que sea su energa. El anlisis que se presenta en esta experiencia de investigacin, se centra en el estudio de la distribucin de energa de los fotones emitidos, por lo tanto, es conveniente expresar la intensidad de fluorescencia, por cada fotn que absorbe el medio como una funcin de la longitud de onda de los fotones emitidos, determinada por F (F ) y satisface la ecuacin 7-1,

F ( )d
F 0

= F

7-1

46

Donde F es el rendimiento cuntico de fluorescencia, F ( F ) , representa el espectro de fluorescencia o espectro de emisin, el cual refleja la distribucin de probabilidad de las diferentes transiciones de niveles vibracionales ms bajos de S1 a los diferentes niveles vibracionales de S0. El espectro de emisin es caracterstico de cada uno de los fluorforos presentes en el tejido biolgico. En la prctica, la intensidad de fluorescencia I F ( F ) medida a una longitud de

onda de emisin F es proporcional a F (F ) y al nmero de fotones que son absorbidos a la longitud de onda de excitacin E . Es conveniente reemplazar

que se define como la diferencia entre la intensidad de la luz incidente I 0 (E ) y la intensidad de luz transmitida I T (F ) , es decir,

este nmero de fotones que son absorbidos por la intensidad de absorcin I A (E ) ,

I A (E ) = I 0 (E ) I T (E )
La intensidad de fluorescencia puede as ser escrita como,

7-2

I F (E , F ) = kF (F )I A (E )

7-3

El factor de proporcionalidad k , depende de varios parmetros en particular de la configuracin ptica de observacin y del ancho de banda del monocromador. Adems, la intensidad de la luz transmitida puede ser expresada usando la ley de Beer Lambert como,

I T (F ) = I 0 (E ) exp[ 2.3 (E )lc ]

7-4

Donde (E ) es el coeficiente de absorcin molar de los fluorforos a la longitud de onda E

(mol L ) . La cantidad (E )lc representa la absorbancia A(E ) a la longitud de onda E . Esto quiere decir que I F (E , F ) puede expresarse como,
I F (E , F ) = kF (F )I 0 (E )(1 exp[ 2.3 (E )lc ])
7-5

(L

mol.cm ) , l es la longitud de la cubeta (cm ) y c la concentracin

47

una longitud de onda de excitacin fija, refleja las variaciones en F ( F ) y as proporciona el espectro de fluorescencia. Debido a que el factor de proporcionalidad k es generalmente desconocido, el valor numrico de la intensidad I F no tiene ningn significado, en trminos generales, I F se expresa en unidades arbitrarias. En el caso de bajas concentraciones la siguiente expansin puede usarse, 1 exp[2.3lc ] = 2.3lc (2.3lc ) + ...
2

En la prctica, la medida de las variaciones en I F como una funcin de F , para

En soluciones altamente diluidas, los trminos de orden superior son insignificantes, por lo tanto solamente se tiene en cuenta el primer trmino de la expansin, entonces,

I F (E , F ) = kF (F )I 0 (E )(2.3 (E )lc )
Es decir,

7-6

I F (E , F ) = 2.3kF (F )I 0 (E )A(E )

7-7

Esta relacin permite observar que la intensidad de fluorescencia es proporcional a la concentracin, a una baja absorbancia, por lo tanto, la variacin lineal se pierde con el aumento de la absorbancia. Es decir, cuando la concentracin de los fluorforos es alta, provocan efectos de filtro interior en la muestra reduciendo la intensidad de fluorescencia, lo que puede depender de las condiciones de observacin. En particular, los fotones emitidos a longitudes de onda correspondientes que coinciden en los espectros de absorcin y emisin pueden ser reabsorbidos (transferencia radiativa). Consecuentemente, cuando la espectroscopa ptica de fluorescencia es usada para evaluar cuantitativamente la concentracin de fluorforos, se debe tener en cuenta que la intensidad de fluorescencia es proporcional a la concentracin solo para soluciones diluidas [1]. Este anlisis de la intensidad de fluorescencia se presenta con el objetivo de de comparar con la ecuacin 3-3, capitulo 3. La intensidad de fluorescencia representada de esta manera permite desarrollar la simulacin del espectro de fluorescencia por medio de un modelo matemtico basado en bandas gaussianas. El espectro de fluorescencia obtenido de la simulacin, permite visualizar y estudiar las contribuciones de cada uno de los fluorforos presentes en los tejidos biolgicos.

48

7.1.1 ESTRUCTURA DEL PROGRAMA

En la figura 7-1 se muestran los espectros de absorcin y emisin de fluorescencia de cada uno de los fluorforos presentes en los tejidos de cuello uterino (colgeno, elastina, NADH y flavinas) [2]. Al realizar un ajuste gaussiano a cado uno de los espectros de absorcin y emisin de los fluorforos se obtuvieron caractersticas como el ancho medio a la altura media (FWHM), intensidades de los picos y la longitud de onda central, estas caractersticas se presentan en la tabla 7-1.

Figura 7-1 espectros de absorcin y emisin de los fluorforos (colgeno, elastina, NADH y FAD). Tabla 7-1 . Caractersticas de los picos de absorcin y emisin de cada uno de los fluorforos presentes en el tejido de cuello uterino obtenidas por ajuste gaussiano. Absorcin fluorforos Colgeno Elastina NADH (pico 1) NADH (pico 2) Flavinas (pico 1) Flavinas (pico 2) Flavinas (pico 3) Longitud de onda (kx) (nm) 336.35 352.03 262.61 345.51 260.17 387.2 457.57 Intensidad (akx) (u.a.) 1 1 1 0.45 1 0.45 0.5 FWHM (wkx) (nm) 34.85 46.40 25.8 54.41 28.77 112.29 100.58 Longitud de onda (km) (nm) 393.85 405.48 474.58 557.44 Emisin Intensidad (akm) (u.a.) 1 1 1 1 FWHM (wkm) (nm) 60.69 73.08 55.42 65.51

Con base en los datos de la tabla 1 se obtienen los factores de contribucin de cada uno de los fluorforos a la longitud de onda de excitacin (x= 337.1 nm) ( CFkx ), empleando la ecuacin 7-8 y los factores de contribucin de cada uno de

49

los fluorforos a la longitud de onda de emisin (m= 457.8 nm) ( CFkm ) empleando la ecuacin 7-9.
x kx 2 w kx
2

CFkx = a kx * e

7-8

2

CFkm = akm * e

x km 2 w km

7-9

k depende de cada uno de los fluorforos (k=1-colageno, k=2-elastina, k=3-NADH y k=4-flavinas). A partir de estos factores se halla la absorcin debida a la longitud de onda de excitacin ( Ax ), ecuacin 7-10 y a la longitud de onda emisin ( Am ), ecuacin 7-11.
Ax = ( ak * ck * CFkx )
k =1 4

7-10

Am = ( ak * ck * CFkm )
k =1

7-11

ck representa las contribuciones de cada uno de los fluorforos, que son variables

desconocidas dentro del modelo y que deben calcularse para aportar en el estudio de la normalidad y la patologa de los tejidos de cuello uterino. Posteriormente se calcula la transmisin debido a la longitud de onda de excitacin (Tx), ecuacin 712 y debido a la longitud de onda de emisin (Tm), ecuacin 7-13.

Tx = 10 Ax Tm = 10 Am

7-12

7-13

A continuacin se calcula la absorbancia y la transmisin totales en un rango de longitudes de onda de 200 700 nm, con un paso de aproximadamente 0.3 nm, que concuerda con la resolucin del espectrgrafo empleado en las medidas en vivo. Con este fin se calculan los factores de contribucin como una funcin de la longitud de onda CFk , ecuacin 7-14.

50

CFk = akx * e

kx 2 w kx

7-14

Empleando estos nuevos factores, se calculan la absorbancia, ecuacin 7-15 y la transmitancia total, ecuacin 7-16.

A = ( ak * ck * CFk )
k =1

7-15

T = 10 A

7-16

A partir de estas contribuciones se calcula la intensidad de emisin de fluorescencia (Im) debida a cada uno de los fluorforos presentes en los tejidos de cuello uterino, utilizando la ecuacin 7-17:
k 2 w k I m = Tx * T * ak * e * ck * CFkx I rr k =1
2

7-17

Siendo ak , k , wk las intensidad, la longitud de onda central y el FWHM de los picos de emisin de cada uno de los espectros de cada uno de los fluorforos, presentes en la informacin espectral de fluorescencia obtenida de los tejidos de cuello uterino en vivo. Irr es una banda de dispersin Raman del agua y es otra variable de ajuste dentro del sistema
rr 2 w rr
2

I rr = Tx * T * arr * e

* crr

7-18

arr , rr , wrr y crr las intensidad, la longitud de onda central, el FWHM y la

contribucin de la banda de dispersin. En la experimentacin en vivo para obtener las variables ak , k ,

wk y

ck (k=1,2,3,4) y arr , rr , wrr y crr , se emplea el mtodo de mnimos cuadrados

para ajustar cada uno de los espectros de emisin de fluorescencia obtenidos de cada punto de anlisis de los tejidos de cuello uterino en vivo.

51

7.1.2 GENERALIDADES
Basados en las anteriores consideraciones se desarroll la simulacin de los espectros de fluorescencia a temperatura ambiente de los cuatro fluorforos que interactan en solucin diluida. Se puede sugerir que los componentes de esta solucin son los fluorforos presentes en los tejidos biolgicos que son estudio de esta tesis, como son el colgeno + elastina, el NADH y la FAD. La simulacin incluye un pico de dispersin relacionado con las dispersiones de Rayleigh y Raman, este pico est relacionado con el disolvente (agua), el cual slo existe una banda Raman observable. El pico de la dispersin Rayleigh se fija en amplitud, pero la banda Raman varia inversamente en altura con la 4 potencia de la longitud de onda excitacin y emisin utilizadas para la simulacin [3]. La simulacin tambin incluye la auto-absorcin (filtro-interior), para el efecto de haz de excitacin y la emisin de fluorescencia. Adems de la visualizacin de la intensidad, tambin se puede realizar una lectura de la absorbancia, obtenida a la longitud de onda de excitacin, para comparar la medicin de fluorescencia con la absorcin, y como un indicador de la presencia de auto-absorcin.

7.2 SIMULACIN DE LA ORGANIZACIN DE CELULAS BIOLGICAS

En este aparte se presentan diferentes condiciones necesarias para simular el ordenamiento celular a travs del modelo celular de Potts (CPM). Tambin se presenta, cmo evolucionan las clulas patolgicas, al favorecer estas a partir de una energa de interaccin adecuada, hasta el punto de ser las clulas de mayor presencia en la simulacin. En agregados de 2 tipos de clulas biolgicas disociadas se pueden exhibir organizacin normal, organizacin parcial, engullimiento o mezcla. Se ha demostrado que un modelo simple que incluya solo adhesin diferencial y fluctuaciones de membrana, puede reproducir estos comportamientos [4]. La organizacin celular no involucra divisin celular ni diferenciacin, solo reorganizacin espacial de las posiciones celulares [5]. La adhesividad diferencial celular puede dirigir el movimiento de las clulas [6]. Las clulas se unen unas a otras por medio de las molculas de adhesin distribuidas en sus membranas y tienen una energa libre asociada con los contactos clulaclula, los cuales se pueden crear o destruir reversiblemente durante la

52

organizacin celular. La energa libre de adhesin, F(A)-F(0), es el trabajo mecnico integrado entre el estado adherido, con rea de contacto, A, y el estado separado. La energa libre de superficie, J, entre dos superficies est definida como la energa libre de adhesin por unidad de rea de contacto: F/A, este es equivalente al trabajo reversible requerido para incrementar la superficie en una unidad de rea. Una energa libre de superficie tambin puede definirse con un medio externo, como la matriz extracelular o el medio de cultivo. A partir de las energas libres de superficie, se pueden definir las tensiones superficiales, : J + J ll ld = J ld dd , 2 J lM = J lM ll , 2 J dM = J dM dd . 2 7-19 Donde las J, representan los coeficientes de acoplamiento entre dos clulas: Jld=Jdl: clula blanca (light) o menos cohesiva y una clula negra (dark) ms cohesiva; Jdd: negra-negra ; Jll: blanca-blanca; JdM=JMd: negra-medio (ECM); JlM=JMl: blanca-medio; JMM=JMM: medio-medio. Las tensiones de superficie representan la diferencia en energa entre interfaces heterotpicas y homotpicas por unidad de rea de membrana. Durante la organizacin celular, las clulas no se mueven directamente haca el mnimo en gradientes de energa, para alcanzar la minimizacin de la energa global, las clulas y los grupos de clulas deben moverse a travs de estados transitorios que tienen una configuracin de energa mayor que la del estado previo. Las clulas tienen que atravesar mnimos locales en la energa para poder alcanzar un mnimo global [5]. Las energas de superficie determinan la irregularidad local de la energa interna y las dinmicas, las tensiones de superficie describen las configuraciones con energa mnima absoluta, es decir los estados de equilibrio estables [5]. La figura 71 muestra ejemplos esquemticos de cada caso tpico.

53

Figura 7-2 Las tensiones superficiales determinan la configuracin de equilibrio con mnima energa global (a) Las clulas de un solo tipo se disocian, (b) las clulas se agregan, (c) y (d) Las clulas de dos tipos no se agregan, (e) configuracin de tablero de ajedrez, (f) y (g) cell sorting tpico (h) otro tipo de organizacin, (i) condicin de Young.

Para un solo tipo de clulas en contacto con un medio, dos casos pueden ocurrir: dispersin o cohesin, (a) y (b). Cuando dM y lM son negativas, las clulas no se agregan, (c) y (d). Cuando dl es negativa, las clulas negras y blancas se mezclan formando un patrn similar a un tablero de ajedrez, (e). En la mayora de los casos las tensiones superficiales son positivas. El mnimo de energa ocurre cuando las clulas se organizan formando dos dominios homotpicos, (f)-(i). Los dos dominios estn en contacto entre ellos y con el medio. En el caso de la Condicin de Young, (i), las tres interfaces se encuentran a lo largo de una lnea de triple contacto. Un punto en esta lnea est sometido a fuerzas (debido a las tensiones superficiales) mostradas en la figura 7-2 [7], cuya suma se anula. Si una de las tensiones superficiales es mayor a las suma de las otras dos, no se puede establecer una triple interseccin y la interfaz de mayor costo energtico desaparece, (f)-(h). Si dM > dl + lM , la interfaz de las clulas negras y el medio desaparece, las clulas blancas rodean un solo dominio de clulas negras, un caso tpico de organizacin celular (cell sorting) [8,5]. Para una organizacin celular (cell sorting) tpica las tensiones superficiales deben cumplir la relacin dM > dl + lM , por lo tanto, las energas de superficie (segn la ecuacin 79) deben cumplir [5]:

54

0 < J dd <

J dd + J ll < J dl < J ll < J lM = J dM 2

7-20

Para el caso de las clulas normales que se vuelven tumorales, los valores de las energas de interaccin, J, se alteran, y puede ocurrir que las interaccin entre las clula y el medio sean ms favorables energticamente que las interacciones clula-clula, es decir Jdd>JdM o Jll>JlM, lo que lleva a que las clulas se separen de las otras clulas y penetren en el medio generando metstasis. Las clulas se mueven con la ayuda de las deformaciones de membrana, las cuales les permiten escapar de los mnimos locales [5]. La temperatura T, corresponde a la amplitud de las fluctuaciones de membrana, por lo tanto es una temperatura de fluctuacin efectiva y no tiene nada que ver con la temperatura del tejido [5]. Las oscilaciones de membrana tienen una amplitud aproximada del 10% del dimetro celular, lo que corresponden en las simulaciones a un sitio de red [7]. Se ha estudiado el efecto de inhibir las fluctuaciones de membrana en la organizacin celular por medio de experimentos y simulaciones [9]. En los experimentos se logra inhibir las deformaciones de membrana por medio de la droga Cytochalasin B, y en las simulaciones se logra esto fijando una temperatura, T, baja. Los estudios han demostrado que no se logra una organizacin celular completa en ausencia de fluctuaciones.

7.2.1 MODELO MATEMTICO

Basados en las consideraciones anteriores se define la energa total de la configuracin celular como la suma de las energas de adhesin, las restricciones de volumen y las restricciones de superficie:
H = J ( ij ), ( i ' j ' ) 1 ij , i ' j ' + ( VT ) 2 + '( a AT ) 2
ij i' j '

7-21

Tambin es posible usar solo un trmino de restriccin para el cambio de tamao de la clula [5,3], entonces la ecuacin 7-10 quedara como:
H = J ( ij ), ( i ' j ' ) 1 ij , i ' j ' + ( VT ) 2
ij i' j '

7-22

55

A partir de este modelo celular de Potts se desarrolla el programa CPM.exe, basado en la hiptesis de Adhesin Diferencial de Steinberg (DAH), para simular la organizacin celular, en el cual no se tiene en cuenta otras propiedades de conjunto como la quimiotaxis, la haptotaxis, diferenciacin celular o la proliferacin.

7.2.2 PROGRAMA
Los algoritmos del programa se desarrollaron en lenguaje C++ en base a las siguientes referencias: [10,11,12,13]. En el desarrollo del los algoritmos para el programa CPM se definen algunos parmetros [9], haciendo la analoga entre los trminos del modelo de Potts y programacin orientada a objetos (OO):

Tipo de clula (): se considera la clase en OO. Las clulas del mismo tipo tienen las mismas propiedades por ejemplo el mismo valor para los parmetros. Esta clase puede tener valores diferentes para cada instancia, pero el conjunto de propiedades en general son las mismas. Red: cuadrcula de nxn (dos dimensiones) o n*n*n (tres dimensiones) usada como marco fsico del modelo. Sitio de Red: punto en la red, tambin se refiere como un pixel o un voxel (volume pixel). Spin () o clula: en OO se refiere a la instancia u objeto de la clase. Puede estar ocupando uno o ms puntos de red.

7.2.3 ESTRUCTURA DEL PROGRAMA

Inicializar red() Do for n pasos Monte Carlo: while (un sitio no tenga vecinos extraos): sitio=EscogerSitioDeRedAleatorio() vecino=EscogerVecinoAleatorio(sitio) E=CalcularEnergiaParaElCambio(vecino, tipo(sitio)) if E<0 cambiar(sitio, vecino) else if aleatorio()<exp(-E/T): // Paso de Metropolis cambiar(sitio, vecino)

56

7.2.4 GENERALIDADES
Se tiene una red cbica de 100*100*100, con tres tipos de clulas, ={1,2,3}, el nmero de clulas es variable. Las clulas tipo 1 corresponden a la ECM o medio, M en notaciones anteriores (color). Las clulas tipo 2 corresponden a las clulas negras o dark (d) y las tipo 3 son las clulas blancas o light (l) (en la visualizacin de CPM.exe estas clulas se grafican de color verde). Los pasos Monte Carlo se definen como un mltiplo entero, de la totalidad de los sitios de red, por lo tanto el tiempo de simulacin medido en el nmero de iteraciones del programa est dado por: 100*100*100*MCS.

La red de la simulacin es inicialmente una red de matriz extracelular, luego se pasan a crear las clulas tipo 2 y 3, en posiciones aleatorias restringidas por los valores que introduzca el usuario. Debido a que se est tratando con una red cbica, la energa de superficie por unidad de longitud de frontera depende fuertemente de la orientacin. La relacin entre la mayor energa de superficie y la menor como funcin de la orientacin, miden la anisotropa, por lo tanto, al aumentar el rango de interaccin entre vecinos se puede reducir esta relacin entre energas [5,14]. Para reducir la anisotropa investigadores como Upadhyaya, tienen en cuenta la interaccin con los terceros prximos vecinos [5]; Knewitz reporta interaccin con cuartos prximos vecinos [7] y Mombach reporta simulaciones donde se consideran interacciones con los octavos prximos vecinos, es decir los 116 sitios adyacentes a un sitio dado en una red cbica [15]. Por lo tanto, en CPM el rango de interaccin puede ser escogido desde los primeros vecinos cercanos hasta los octavos vecinos cercanos.

7.3 VISUALIZACIN
La visualizacin de los resultados de la simulacin se realiza por medio del programa CPM.m, en MATLAB, el cual permite recolectar la informacin obtenida en la simulacin del ordenamiento celular que comprende la ubicacin espacial en 57

tres dimensiones, volumen y rea. Luego de la simulacin es posible visualizar el estado inicial, el estado final y varios estados intermedios de la red. Adems, se simula el espectro de fluorescencia de la interaccin de la radiacin electromagntica a una longitud de onda de 337.1 nm con las clulas simuladas a travs del modelo celular de Potts. En la simulacin de los espectros de fluorescencia se tiene en cuenta que:

Los fluorforos NADH y FAD que se relacionan con el metabolismo celular se ubicaron en la parte interior de las clulas simuladas por el modelo de Potts. Los fluorforos colgeno y la elastina que hacen parte de la estructura celular se ubicaron en la parte exterior de las clulas simuladas por el modelo de Potts. Adems, se sumaron en una sola figura, por lo tanto solo se representara con un solo pico en el espectro.

Figura 7-3 Interfaz grafica CPM

7.4 RESULTADOS Y DISCUSIN

Usando los datos de la tabla 7-2 se logra una organizacin celular tpica luego de 20 MCS: una capa de clulas verdes, menos cohesivas (se relacionan con las

58

clulas normales), rodea un solo dominio de clulas negras, ms cohesivas (se relacionan con las clulas patolgicas). En la figura 7-4 se presenta la evolucin del agregado de clulas en tres dimensiones, sin embargo, es en la proyeccin de sta grfica en dos dimensiones (figura 7-5), donde se puede ver el patrn de organizacin celular y se puede observar la evolucin de estados de normalidad, a estados de patologa, en los espectros de fluorescencia a medida que se logra la organizacin celular, con la premisa que el agregado busca disminuir las fronteras negra-medio y negra-verde, debido a que son ms costosas energticamente que las fronteras negra-negra, por lo tanto, las clulas negras tienen mayor presencia y se van uniendo en un solo dominio, rodeadas por una capa de clulas verdes separadas del medio: las fronteras negra-verde son ms favorables que las negramedio.
Tabla 7-2 Datos para la simulacin 1 de organizacin celular Parmetro MCS Volumen inicial clulas tipo 2 Volumen inicial clulas tipo 3 Volumen target clulas tipo 1 Volumen target clulas tipo 2 Volumen target clulas tipo 3 J(1,1) J(2,2) J(1,2)=J(2,1)=J(1,3)=J(3,1) J(2,3)=J(3,2) J(3,3) Valor 40 91 91 0 580 100 16 2 8 5 7 =1/T Nmero clulas tipo 2 Nmero clulas tipo 3 rea target clulas tipo 1 rea target clulas tipo 2 rea target clulas tipo 3 Rango de Interaccin Regin inicializacin de la Red = para tipo 1 para tipo 2 y 3 para tipo 2 y 3 Parmetro Valor 32 20 20 0 200 170 3 0.333 0 1 1

La evolucin de los estados de normalidad a estados de patologa que se representan en los espectros de fluorescencia se debe a que las clulas negras (patolgicas en esta simulacin) presentan mayor cohesin, por lo tanto en reas muy pequeas se pueden encontrar un gran nmero de elementos de red, lo que permite a la simulacin del espectro de fluorescencia, encontrar mayor informacin o molculas que pueden ser excitadas a la longitud de onda 337.1 nm y emitir luz fluorescente a una determina longitud de onda que depende del tipo de molculas.

59

Figura 7-4 Organizacin celular en 3D y evolucin de los espectros de fluorescencia. (a) Red Inicial, (b) Red en 4MCS, (c) 8 MCS, (d) 20 MCS

60

Figura 7-5 Organizacin celular en 2D. (a) Red Inicial, (b) Red en 2MCS, (c) 4 MCS, (d) 6 MCS, (e) 8 MCS, (f) 10 MCS, (g) 20 MCS, (h) 40 MCS, Red Final

61

Sin embargo, en esta simulacin las clulas crecen de forma descontrolada, alcanzando volmenes muy grandes, como se muestra en la figura 7-6. El crecimiento descontrolado de las clulas a pesar de las restricciones de superficie y volumen del modelo se puede dar debido a que las clulas tienen un volumen inicial muy alejado del volumen target, especialmente las clulas tipo 2, y de acuerdo a la ecuacin 7-21 contribuyen con grandes fluctuaciones en las relaciones de energa y as se tendra un sistema muy inestable.

Figura 7-6 Evolucin de una sola clula escogida aleatoriamente, (a) clula en su estado inicial, (b) luego de 4 MCS, (c) luego de 10 MCS, (d) configuracin final de la clula.

7.4.1 ORGANIZACIN CELULAR PARCIAL

En la figura 7-7 se muestra la evolucin de una sola clula, puede verse que la clula aumenta su tamao, sin salirse de los lmites del crecimiento normal, el cual llega hasta que la clula alcance el doble de su volumen target, tamao en el cual debe dividirse. 62

Figura 7-7 Evolucin de una sola clula escogida aleatoriamente, (a) clula en su estado inicial, (b) clula en su estado final Tabla 7-3 Datos para la simulacin 2 Parmetro MCS Volumen inicial clulas tipo 2 Volumen inicial clulas tipo 3 Volumen target clulas tipo 1 Volumen target clulas tipo 2 Volumen target clulas tipo 3 J(1,1) J(2,2) J(1,2)=J(2,1)=J(1,3)=J(3,1) Valor 10 116 20 0 174 30 3.2 0.4 1.6 T Nmero clulas tipo 2 Nmero clulas tipo 3 Rango de Interaccin Regin inicializacin de la Red para tipo 1 para tipo 2 y 3 J(2,3)=J(3,2) J(3,3) Parmetro Valor 32 20 160 3 0.333 0 1 1.0 1.4

Usando los valores de la tabla 7.3 y solo con restricciones para cambio de volumen, se logra una organizacin celular parcial, lo cual se puede observar en la figura 7-8 donde se muestra las proyecciones de la evolucin de la red hasta 10 MCS. Adems, se presenta la evolucin de los espectros de fluorescencia. Se puede observar como de la figura (a) a la figura (b) logra una disminucin de la frontera negra-medio, debido a que son ms favorables energticamente las fronteras negra-verde y negra-negra. En la figura (d) puede verse como las clulas negras buscan unirse en un solo dominio, inclusive dejando unas clulas verdes en su interior.

63

Figura 7-8 Organizacin celular parcial en 2D y evolucin de los espectros de fluorescencia. (a) Red Inicial, (b) Red en 4MCS, (c) 8 MCS, (d) 10 MCS.

64

Todas estas consideraciones pueden ser observados tambin en la evolucin de los espectros de fluorescencia que presentan cambios en las figuras gaussianas de cada uno de los fluorforos. A partir del paso 4, el agregado deja de buscar la minimizacin de las fronteras mencionadas y no evoluciona ms hacia una organizacin completa. Se cree que no se logra una organizacin completa porque casi dos terceras partes de la red estn ocupadas por matriz extracelular o clulas tipo 1, lo que puede influenciar fuertemente en la energa global del agregado, llevando a que la configuracin logre un mnimo de energa del cual no le es fcil salir.

7.4.2 MNIMOS LOCALES DE ENERGA

Otra de las posibles razones de las configuraciones que se quedan atrapadas en mnimos locales, en vez de alcanzar un mnimo global, puede ser el hecho de comenzar con cierta organizacin parcial inherente. En la figura 7-9 se muestran los resultados obtenidos a partir de los datos de la tabla 7-4.

Tabla 7-4 Datos para la simulacin 3

Parmetro MCS Volumen inicial clulas tipo 2 Volumen inicial clulas tipo 3 Volumen target clulas tipo 1 Volumen target clulas tipo 2 Volumen target clulas tipo 3 J(1,1) J(2,2) J(1,2)=J(2,1)=J(1,3)=J(3,1) J(2,3)=J(3,2) J(3,3) Valor 1000 120 21 0 160 28 16 2 8 5 7 =1/T Nmero clulas tipo 2 Nmero clulas tipo 3 rea target clulas tipo 1 rea target clulas tipo 2 rea target clulas tipo 3 Rango de Interaccin Regin inicializacin de la Red = para tipo 1 para tipo 2 y 3 para tipo 2 y 3 Parmetro Valor 32 60 420 0.0 143 45 3 0.333 0.005 1 1

En la figura 7-9(a) se puede observar cmo la configuracin inicial tiene cierto grado de ordenamiento, a pesar de haberse formado aleatoriamente.

65

Figura 7-9 Red que se congela, Proyecciones en 2D y evolucin de los espectros de fluorescencia. (a) Red Inicial, (b) 10 MCS, (c) 80 MCS, (d) 1000 MCS, Red Final.

66

En la figura 9 (b), el agregado de clulas ha evolucionado muy poco, se han disminuido algunas fronteras negra-medio, en esa configuracin se congela la evolucin del ordenamiento celular y permanece sin cambios significativos hasta la red final luego de 1000 MCS. El ordenamiento celular de las clulas biolgicas simuladas aparentemente no presenta cambios, contrario a los resultados de los espectros de fluorescencia que en un anlisis la forma de los espectros, parecen no evolucionar, pero las contribuciones de cada uno de los fluorforos presentes en la simulacin si cambian. Esto quiere decir, que aunque existan pequeos cambios en los elementos de la red de cada clula, no se visualiza una promocin del conjunto clulas de estados normales a patolgicos, hecho que se ve representado en cada uno de los espectros de fluorescencia.

7.4.3 MEDIO EXTRACELULAR QUE CRECE

Cuando la energa de interaccin o adhesin entre las clulas tipo 1 es cero, o sea en el medio extracelular, se ve un fenmeno muy particular, en donde las clulas tipo 2 y 3 reducen su tamao significativamente y el medio extracelular crece. En la figura 7-11 se puede observar ste comportamiento, generado con los valores de la tabla 7-5.

Tabla 7-5 Datos para la simulacin 4

Parmetro MCS Volumen inicial clulas tipo 2 Volumen inicial clulas tipo 3 Volumen target clulas tipo 1 Volumen target clulas tipo 2 Volumen target clulas tipo 3 J(1,1) J(2,2) J(1,2)=J(2,1)=J(1,3)=J(3,1) J(2,3)=J(3,2) J(3,3) Valor 2 8 8 0 20 20 0 2 16 11 14 =1/T Nmero clulas tipo 2 Nmero clulas tipo 3 rea target clulas tipo 1 rea target clulas tipo 2 rea target clulas tipo 3 Rango de Interaccin Regin inicializacin de la Red = para tipo 1 para tipo 2 y 3 para tipo 2 y 3 Parmetro Valor 5 300 300 0.0 16 16 3 0.5 0.0 1 0.5

67

Figura 7-10 Una sola clula tipo 2 que disminuye de tamao, (a) clula en su estado inicial, (b) la misma clula luego de 2 MCS

En la figura 7-10 se muestra la evolucin de una sola clula tipo 2 escogida aleatoriamente. La clula est compuesta inicialmente por 18 puntos de red como se puede observar en la figura (a), luego de 2 MCS, solo est compuesta por 4 elementos de red, figura (b).

Figura 7-11 Clulas que disminuyen de tamao y evolucin de los espectros de fluorescencia, (a) Red Inicial, (b) Red en 2 MCS.

68

De acuerdo a los resultados obtenidos, se podra concluir que se observa un fenmeno parecido a la apoptosis o muerte celular, donde la matriz extracelular ECM, debido a sus caractersticas representadas en esta simulacin, presenta una energa de interaccin con ella misma, que limita el crecimiento de las clulas e inclusive las lleva a disminuir su tamao considerablemente.

En el anlisis de este fenmeno a partir de los espectros de fluorescencia, se puede considerar que debido a que no se encuentran elementos de red, en un nmero razonable, con los que se puedan interactuar, el espectro de fluorescencia no se produce, figura 7-11 (b). Lo cual, afirma que se hace necesario que en el medio analizado se presenten suficientes molculas (para esta simulacin elementos de red) que interacten con la radiacin electromagntica para obtener una fluorescencia medible.

7.5 CONCLUSIONES
El programa permite al usuario tener una gran flexibilidad en el momento de simular y de experimentar variando parmetros como volmenes, reas, energa de interaccin entre clulas entre otros, para obtener comportamientos celulares, ya que se tiene un amplio rango de valores para configurar el programa. Adems, las variadas opciones de visualizacin y los reportes de los estados intermedios de la red, le permiten al usuario analizar los resultados desde varios puntos de vista tanto grficos como a nivel de informacin sobre las clulas y la red. Las simulaciones donde se obtuvo una organizacin celular parcial, pueden sugerir que todos los valores para los parmetros del programa deben ser concordantes y en los rangos permitidos por el programa en el momento de simular las clulas biolgicas, es decir, el usuario debe disponer de todos y cada uno de los valores para los parmetros en la configuracin inicial y adaptados adecuadamente en el programa. Se pudo comprobar la evolucin de la no enfermedad a la enfermedad de los tejidos biolgicos a travs del anlisis de los espectros de fluorescencia de las clulas simuladas. En cada uno de los casos en donde se presentaron cambios o evoluciones de estados normales a estados patolgicos, se represent los cambios en las contribuciones de cada uno de los fluorforos presentes en el anlisis, que de acuerdo a la literatura, en la evolucin de la normalidad a la

69

patologa se presenta debido a las contribuciones de colgeno-elastina disminuyen y aumentan las del NADH. En los resultados obtenidos en la simulacin 4 se encontr que por medio de los valores para la energa de interaccin de la matriz extracelular con ella misma, se puede controlar indirectamente el crecimiento y/o muerte de las clulas. Evento que tambin se representa en los espectros de fluorescencia.

REFERENCIAS
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5 6 7 8

9 10 11 12 13 14 15

B. Valeur, Molecular fluorescence, principles and applications. Wiley-Verlag GmbH (2002). T. Vo-Dinh. Biomedical Photonics. Handbook. CRC (2003). T. O'Haver. Interactive computer models for analytical chemistry instruction, Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Maryland at College Park (2001-2009). J. Glazer et al. The energetics of cell sorting in three dimensions. Interplay of genetic and physical processes in the development of biological form. World Scientific Publishing Company (1995)54-61. A. Gierer et al. Regeneration of hydra from reaggregated cells. Nature (London), New Biol. (1972) 239, 98. A. Upadhyaya. Thermodynamic and fluid properties of cells, Tissues and Membranes. Ph.D. dissertation. Arpita Upadhyaya. University of Notre Dame (2000). F. Graner y Y. Sawada. Can surface adhesion drive cell-rearrangement? Part II: A geometrical model. J. Theo. Biol. 164 (1993) 477-506. M. A. Knewitz, Um Modelo Para Investigao Do Crescimento E Da Morfologia De Tumores. Dissertao de mestrado em computao aplicada: Computao Cientfica. Universidade do Vale do Rio Dos Sinos. So Leopoldo (2002). M. Mombach et al,Quantitative Comparison between Differential Adhesion Models and Cell Sorting in the Presence and Absence of Fluctuations. Physical Review Letters 75 (1995). C. Mueller. Potts Model 2.0 Collaboration Requirements. CompuCell (2003). CompuCell. Laboratory for Computational Life Sciences: www.nd.edu/~lcls/compucell/ J. A. Izaguirre y T. Cickovski. COMPUCELL3D Version 2.1.0 - User Guide (2005). http://www.nd.edu/lcls/compucell. J. A. Izaguirre et al, COMPUCELL, a multi-model framework for simulation of morphogenesis. Bioinformatics 20 (2004)11291137. Y. Jiang, Cellular Pattern Formation. Ph.D. dissertation. University of Notre Dame (1998). M. Mombach, Simulation of embryonic cell self-organization: A study of aggregates with different concentrations of cell types. Physical Review E. 59 (1999).

70

8. PROCESAMIENTO DIGITAL DE LA INFORMACIN ESPECTRAL DE FLUORESCENCIA

La metodologa para el anlisis de las alteraciones de los estados bioqumicos y morfolgicos de los tejidos del cuello uterino en vivo y ex vivo, se basa en el desarrollo de un algoritmo computacional para el procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia. Este procesamiento digital se compone de los siguientes pasos:

Figura 8-1 Promediado conjunto de la informacin espectral de fluorescencia

Paso 1: Adquisicin. La informacin espectral de fluorescencia de cada punto de anlisis de cada una de las pacientes es adquirida y registrada individualmente en archivos de texto. Despus de tener esta informacin espectral guardada como archivo de texto a travs de los disparos consecutivos, se leen en MatLab, para generar una matriz de datos en donde se guarda la informacin de las mediciones tomadas por paciente. La matriz de datos tiene un nmero de columnas igual al nmero de puntos de medida multiplicado por treinta ms una columna que contiene la informacin de las longitudes de onda, que servir de referencia para las otras columnas que representan la intensidad de la medida de fluorescencia. Adems, tiene 2048 filas que representan el rango de longitudes de onda desde 179.54 nm a 875.85 nm con un paso de 0.29 nm.

71

De esta manera queda un archivo que contiene las mediciones de todos los puntos de una paciente. Paso 2: Promediado conjunto. Con el objetivo de asegurar la medida de la informacin espectral de fluorescencia de los tejidos biolgicos en cada uno de los puntos de anlisis, se tomaron 30 espectros, de los cuales se eliminan los 3 primeros y los 3 ltimos, quedando un total de 24 espectros, los cuales son promediados, figura 8-1. El promediado conjunto de los espectros. Sucesivas series de datos almacenados en memoria como matrices, se recogen y se suman punto por punto, los datos se promedian dividiendo la suma para cada punto por el nmero de barridos realizados, para aumentar de forma eficaz la relacin seal/ruido. Para comprender por qu el promediado conjunto aumenta de forma eficaz la relacin seal/ruido, se realizan n medidas repetidas de S y se calcula el valor medio de la seal mediante la ecuacin 8-1

Sx =

S
i =1

8-1

Donde S, i= 1,2, 3...n son las medidas individuales de la seal, incluyendo el ruido. En cada medida el ruido es, por tanto, Sx - S. Si se elevan al cuadrado y se suman las desviaciones de la seal con respecto de la media, Sx, y se divide entre el nmero de medidas n, se obtiene el ruido cuadrtico medio que viene dado por la ecuacin 8-2

Ruido cuadrtico medio =

(S
i =1

Si )

8-2

El ruido cuadrtico medio se denomina normalmente a la varianza de la seal, y el ruido eficaz, o rms, es su desviacin estndar, la cual viene dada por la ecuacin 8-3

Ruido eficaz =

(S
i =1

Si )

8-3

72

La relacin seal/ruido para la medida es el valor medio de la seal dividido por su desviacin estndar, ecuacin 8-4.

S = R

Sx

(S
i =1

Si )

8-4

n
Si se multiplica en la ecuacin 8-4 el numerador y el denominador por n se obtiene,

S = R

nS x

(S
i =1

Si )

8-5

La ltima expresin muestra que la relacin seal/ruido es proporcional a la raz cuadrada del nmero de datos recogidos para determinar el promediado conjunto. Paso 3: Filtrado. Cuando se est tomando la informacin espectral de fluorescencia de los tejidos biolgicos a travs de la espectroscopa ptica de fluorescencia, se est filtrando anlogamente las seales espectrales de segundo y tercer orden, por medio de un filtro de absorcin y de un espejo focalizador, los cuales estn instalado en la parte interna del espectrgrafo. Adems, la informacin espectral de fluorescencia promediada, se filtra por medio de un filtro digital FIR (Respuesta de Impulso Finito), filtro de Savitzky-Golay, el cual opera directamente en el dominio de la distancia, y tiene la ventaja que minimiza el error cuadrtico al ajustar con un polinomio los datos [15].

Figura 8-2 Espectro filtrado a travs del filtro Savitzky-Golay de octavo orden, 30 puntos

73

El mtodo de Savitzky-Golay, consiste en que cada dato promediado es sustituido por una combinacin lineal de este y puntos cercanos. Para cada punto promediado (fi), se ajusta un polinomio por mnimos cuadrados a los puntos nL + nR +1 y luego se obtiene gi, ecuacin 8-6, como el valor del polinomio en la posicin i. Al moverse a la posicin i+1 se realiza otro ajuste por mnimos cuadrados para obtener un nuevo polinomio, y as sucesivamente.
gi =

n = nL

nR

fi +n

8-6

Donde nL es el nmero de puntos a la izquierda del dato i, mientras que nR es el nmero de puntos a la derecha. Los coeficientes cn dependen del ancho de la ventana (2m+1, m=30).

Figura 8-3 Ajuste de la informacin espectral de fluorescencia

Paso 4: Ajuste de los espectros. Cada espectro promediado y filtrado es ajustado por medio de un modelo matemtico desarrollado en esta tesis doctoral, el cual permite simular el espectro caracterstico de fluorescencia, ecuacin 7-8, a travs de cada una de las bandas gaussianas que representan las contribuciones de los fluorforos en los procesos de absorcin, excitacin, emisin y transmisin presentados en el desarrollo del modelo matemtico. El ajuste se desarrolla a travs del mtodo no lineal de los mnimos cuadrados para extraer un conjunto de caractersticas de la informacin espectral de fluorescencia como las intensidades de fluorescencia, los anchos medios, longitudes de onda centrales, las contribuciones, entre otras, de cada uno de los diferentes fluorforos endgenos (como colgeno, elastina, NADH y Flavinas) presentes en los tejidos de cuello uterino. Este procedimiento se realiza por cada punto de anlisis obtenido de las medidas de la informacin espectral de fluorescencia en el tejido de cuello uterino. 74

Despus de realizar un ajuste, por un mtodo grafico, se calcula el coeficiente de correlacin R y R2, que son la medida normalizada de la relacin de las variables representativas del espectro promediado y filtrado, con el espectro ajustado. A partir de estos valores se descartan los espectros de los puntos de anlisis cuyo ndice de correlacin este por debajo de 0.9. Si, ningn punto de anlisis pasa la condicin, no se procesa esta informacin y se muestra una ventana diciendo que ningn punto de la paciente ha superado el ajuste y se termina el proceso, si en cambio, existen puntos de anlisis que superan el umbral de 0.9, se indica cuales puntos no superaron el ajuste y se contina el proceso. Debido a que los modelos no lineales son ms difciles de ajustar que los modelos lineales, se requiere un acercamiento iterativo que comienza con una estimacin inicial, para cada coeficiente, producindose un ajuste de la curva para el conjunto de coeficientes actuales y el ajuste, lo cual responde al valor de, ecuacin 8-7:

= f (X , ) y

8-7

Donde y es un vector de repuesta de n*1, f es una funcin de y X, es un vector de coeficientes de m*1, X es la matriz diseada para el modelo de n*m. Se ajustan los coeficientes y se determina si el ajuste mejora utilizando el algoritmo de Gauss-Newton, que asume los valores residuales cercanos a cero e itera el proceso volviendo a producir un nuevo ajuste de la curva hasta que se alcancen los criterios de convergencia especificados por la ecuacin 3-6.

Figura 8-4 Contribucin representada en bandas Gaussianas de cada uno de los fluorforos

75

La primer banda gaussiana se atribuye a la informacin proporcionada por dispersin (Raman y/o Rayleigh) del agua, por tal motivo se la restamos al ajuste obtenido. De esta forma se analiza la informacin espectral obtenida a tiempo, ofrecindose un diagnstico de normalidad o patologa a los tejidos de cuelo uterino.
N o r m a l id a d P a to lo g a

Intensidad de fluorescencia (u.a.)

0

320

400

480

560

640

L o n g itu d d e o n d a ( n m )

Figura 8-5 Espectros caractersticos de fluorescencia de normalidad y patologa

Mahadevan et al, (1993) muestran en la figura 8-6, la informacin espectral de fluorescencia a longitudes de onda de 330 nm y 350 nm, se observan diferencias entre tejidos normales (curvas en rea superior) y tejidos con patologa (curvas en la zona inferior), all especifican las del VPH, Inflamacin y NIC; estas curvas son similares a las encontradas en nuestra investigacin, trabajadas en una longitud de onda intermedia (337.1 nm) a las referenciadas [1].

Figura 8-6 Informacin espectral de fluorescencia a longitudes de onda de 330 nm y 350 nm

76

Paso 5: Anlisis de Componentes Principales. Despus de extraer las caractersticas de la seal ajustada, se procede a identificar las variables ms relevantes por medio del anlisis de componentes principales PCA, que tiene por objetivo principal reducir la dimensin de un conjunto de variables, conservando la mayor cantidad de informacin que sea posible. Esto se logra mediante la transformacin a un nuevo conjunto de variables las cuales son no correlacionadas y se ordenan de modo tal que unas pocas (las primeras) retengan la mayor cantidad de variacin presente en el conjunto original de variables. Esto con el fin de hacer el trabajo ms fcil para el clasificador. Tenemos la matriz de datos X, la cual contiene todas las caractersticas de la seal. Se busca la posibilidad de representar adecuadamente la informacin, con un nmero menor de variables que son construidas como combinaciones lineales de las originales. La matriz de datos X es de dimensin n*36 (n filas que representan el nmero de pacientes (individuos) analizados y 36 columnas que son las variables) En primer lugar como las variables tienen unidades o escalas de medida distintas, porque las caractersticas son de diferentes tipos; buscar la maximizacin de la varianza puede generar ambigedades cuando se modifica la escala de medida de una variable cualquiera, por ejemplo, pasar de medir una longitud de onda de la seal a un rea de la seal, tiene efectos directos sobre la varianza de la variable medida, lo cual se refleja en el peso que representan los valores propios, y por consiguiente, sus respectivos vectores propios. Por tal razn, se estandariza las variables antes de calcular las componentes, haciendo que las magnitudes de los valores numricos para las variables de la matriz de datos X sean similares. Luego se centraliza la matriz de caractersticas X, para esto se obtiene la media de cada columna (variable), luego se resta la media a cada componente dentro de esa columna; es decir que cada variable(columna) tenga media cero. Despus se halla la matriz de covarianza dada por la ecuacin 8-8.
S=
1 T X X n

8-8

Se calcula los valores propios i de S , el nmero de valores propios es igual al rango de S . Ordenamos los valores propios de mayor a menor. Se encuentran los vectores propios U k de acuerdo a los valores propios, ecuacin 8-9.

77

 u1k . uk = u jk . u pk
Con los vectores propios se encuentran las componentes principales.

8-9

ck = u jk y j , k = 1,..., p
j =1

8-10

Definimos as p nuevas variable principales, combinaciones lineales de las p variables centradas y llamadas componentes principales, ecuacin 8-11.
p cik = u jk yij , k = 1,..., p, i = 1,..., n j =1

8-11

Al sacar la media de la matriz de componentes principales se verifica que es cero, se analizo que las varianzas de la matriz de componentes principales son los eigenvalores de la matriz de covarianza de los datos originales y las covarianzas de las componentes es igual a cero, dicho de otra forma las componentes principales son centradas, no correlacionadas y sus varianzas son los vectores propios.

Figura 8-7 Grfica de los eigenvalores

La matriz de componentes principales hallada tiene las mismas dimensiones que la matriz original, pero con diferentes propiedades estadsticas. Como el objetivo de PCA es reducir el nmero de variables de anlisis, por tanto, se seleccionan los primeros componentes hasta alcanzar un valor fijo a priori de varianza acumulada, por ejemplo el 80%, el 90% el 100%, para determinar qu y cuntos 78

componentes principales se deben usar en la nueva representacin de los datos. Se realiza un grfico de los valores propios ordenados contra su respectiva posicin ordinal. A travs de esta regla, se seleccionan las componentes asociadas a valores propios superiores a una cota, la cual suele establecerse como la varianza media, que es 1, entonces se selecciona los valores propios mayores que la unidad. Por ejemplo, de acuerdo al criterio de la varianza media, en la anterior representacin, figura 8-7, se seleccionaron 7 componentes principales. Al hacer una representacin de los individuos sobre el primer plano principal se obtiene la siguiente grfica.
Representacin aproximada de los individuos sobre el primer plano principal 6 8 Representacin aproximada de los individuos sobre el primer plano principal

(77)[12]

(77)[3]

0 wc2 -2 wc2

-4

-2

-6

-4

-8 -6

-4

-2

2 wc 1

10

-6 -6

-4

-2

2 wc 1

10

Representacin aproximada de los individuos sobre el primer plano principal 8 6

Representacin aproximada de los individuos sobre el primer plano principal

(77)[9]

2 wc2 0 wc2

(77)[6]

-2

-2

-4

-4

-6

-6 -6

-4

-2

2 wc 1

10

-8 -6

-4

-2

2 wc 1

10

Figura 8-8 Grficas de la representacin de los individuos en el primer plano principal

Se puede ver como se separan los individuos en dos grupos (cluster), mostrando una separabilidad que es de gran utilidad al momento de trabajar con un clasificador.

REFERENCIAS
1

A. Mahadevan, M. Follen, E. Silva, S. Thomsen, R. Richards-Korturn. Study of the fluorescence properties of normal and neoplatic human cervical tissue. Lasers in surgery and medicine 13 (1993) 647-655.

79

9. APLICACIN DE LA TCNICA DE ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA EN EL SOPORTE AL DIAGNSTICO MDICO DE PRECNCERES DE TEJIDOS BIOLGICOS
En el estudio de los tejidos biolgicos la medida de fluorescencia depende de: a) la concentracin de los fluorforos y de su distribucin dentro del tejido; b) el ambiente bioqumico y biofsico en el que estn presentes los fluorforos, el cual altera su rendimiento cuntico y su tiempo de vida; c) la absorcin y dispersin que resulta de la concentracin y distribucin de la no fluorescencia absorbida y dispersada dentro de las diferentes capas del tejido. Todos los efectos anteriores son causa de las variaciones de los espectros de fluorescencia y dependen de la longitud de onda de excitacin. Evidencias en investigaciones cientficas sugieren que la tcnica EOF puede ser usada para discriminar la normalidad y patologa de los tejidos de cuello uterino. Los fluorforos potenciales que contribuyen en la fluorescencia de estos tejidos, son identificados en la literatura como colgeno, elastina, NADH y FAD. El resultado de los anlisis bioqumicos, indica que la contribucin absoluta de la fluorescencia debida al colgeno decrece y la contribucin del NADH se incrementa, cuando el tejido progresa de normalidad a patologa.

9.1 ESTUDIO DE PRECANCERES EN TEJIDOS DE CUELLO UTERINO EN VIVO A TRAVS DE LA TCNICA DE ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA
El cuello uterino est compuesto por tejido fibroso, vascular, muscular y elstico y posee dos clases de epitelios: escamoso y columnar. El contraste de la luz fluorescente del tejido epitelial escamoso estratificado, en lesiones preneoplsicas y cncer depende de la profundidad de la lesin [1], siendo sta determinante en todos los anlisis de espectroscopa ptica de fluorescencia, problema que se controla y soluciona con una distribucin apropiada de las fibras pticas o sondas que envan la radiacin de excitacin y recogen la emisin de fluorescencia. En el

80

cuello uterino la espectroscopa ptica de fluorescencia puede registrar la presencia y contribucin de los fluorforos endgenos como elastina, NADH, FAD y colgeno. Las diferencias de los espectros entre los tejidos patolgicos y normales son atribuidas bsicamente al incremento del NADH y a la reduccin en la concentracin del colgeno. NADH se encuentra en las clulas epiteliales y se asocia al metabolismo celular, el colgeno es un componente estructural de la matriz extracelular. En el anlisis de fluorescencia debe tenerse en cuenta que el tejido del cuello uterino presenta cambios no patolgicos asociados con la variacin hormonal del ciclo menstrual, embarazo o menopausia. Algunos estudios muestran que el NADH y el FAD no tienen cambios significativos con la edad lo que si ocurre con el colgeno2.

9.1.1 METODOLOGA
Se desarroll un estudio sobre el uso de la espectroscopa ptica de fluorescencia en el anlisis de precnceres de tejidos de cuello uterino, de tipo descriptivo, exploratorio en mujeres que asistieron a la consulta con citologa previa normal o anormal. Inicialmente fueron 104 pacientes y por criterios de inclusin y exclusin quedaron 79, revisadas en diferentes unidades de la red de Patologa Cervical y Colposcopia del Departamento de Caldas, las cuales fueron Aguadas, Palestina, Arauca y la unidad central de Manizales correspondientes a nivel I de complejidad. Dado que el nmero de muestras no fue suficiente, el grupo investigador plante que el estudio debe ser considerado como prueba piloto. Para el ingreso al estudio, se les diligenci el consentimiento informado, y el registro de la informacin se consign en la hoja precodificada de la historia clnica de la red, los hallazgos clnicos de la colposcopa se registraron, as como el reporte de citologa, el reporte de biopsias y el de espectroscopa ptica de fluorescencia. Dichos formularios fueron aplicados por los diferentes integrantes del equipo de investigacin y a cada paciente se les asign un nmero consecutivo (cdigo) con el fin de organizar la base de datos. A las pacientes se les aplic la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia en cuatro puntos correspondientes a las 12, 3, 6 y 9 convencin horaria, figura 9-1; las colposcopias fueron realizadas por el gineclogo investigador y tres colposcopistas que apoyaron el trabajo de campo, los hallazgos fueron registrados por cada mdico en la historia clnica; las biopsias fueron tomadas por los mdicos colposcopistas y analizadas por la mdica patloga investigadora. 81

Figura 9-1 Imagen de los puntos de anlisis en el tejido de cuello uterino

La informacin espectral obtenida por la tcnica de Espectroscopa ptica de Fluorescencia fue analizada mediante el clculo de variables cuantitativas relevantes; las cuales permitieron hacer una mejor discriminacin de los datos para poder clasificar los grupos de normalidad y patologa. Estas variables cuantitativas son: anchos medios, concentraciones e intensidades de cada uno de los fluorforos (Colgeno, Elastina, NADH y flavinas) y clculo del ndice de correlacin entre los datos filtrados y ajustados en el caso de fluorescencia. Finalmente se compararon los datos de los 4 mtodos diagnsticos: de la citologa, de la colposcopia y de la espectroscopa ptica de fluorescencia comparndolas con la biopsia, que fue la prueba de oro para evidenciar la capacidad de discriminacin que tienen las diferentes tcnicas en cuanto a la definicin de los conceptos de normalidad y de patologa de los tejidos analizados en el estudio, adems se consider la edad y la procedencia como un referente de la poblacin.

9.1.2 RESULTADOS Y DISCUSIN

Tabla 9-1 Informacin pacientes analizadas por los diferentes mtodos
RESULTADOS PATOLGICA NORMAL SIN DATO TOTAL CITOLOGIA 39 (49.4%) 26 (32.9%) 14 (17.7%) 79 COLPOSCOPIA 37 (46.8%) 42 (53.1%) 0 79 BIOPSIA 48 (60.8%) 22 (27.8%) 9 (11.4%) 79 FLUORESCENCIA 169 (53.5%) 139 (44%) 8 (2.5%) 316

En la tabla 9-1 se observa cmo a travs de las diferentes tcnicas se identifica la normalidad y la patologa en las pacientes analizadas, las tcnicas utilizadas en el

82

100% de las pacientes fueron la colposcopia y la fluorescencia, esta ltima se informa sobre un total de 316 mediciones que corresponden a 4 puntos por paciente. Los anlisis mostrados en el grfico 8-5 se realizaron con 331 espectros, por razones de exclusin de pacientes de la muestra, de manera que en estas tablas se presentan el anlisis de 79 mujeres con un promedio de 4 espectros por paciente para un total de 316 mediciones.

9.1.2.1

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD

Con el objetivo de realizar un primer acercamiento al clculo de sensibilidad y especificidad de la prueba (fluorescencia) el grupo investigador realiza el clculo de estos valores los cuales se presentan a continuacin: Los resultados de la tabla 9-2 muestran una correlacin en 31 pacientes en cuanto a la identificacin del estado patolgico por citologa y fluorescencia, sin embargo en cuanto a la identificacin de normalidad no es tan evidente al cruzar las dos tcnicas.

Tabla 9-2 Fluorescencia vs. Citologa

FLUORESCENCIA CITOLOGA PATOLGICA NORMAL TOTAL PATOLGICA 31 (83.8%) 21(80.8%) 52 NORMAL 6(16.2%) 5(19.2%) 11 TOTAL 37 26 63

Al analizar el total de pacientes diagnosticados por citologa como patolgicas (37 pacientes), el 83.8% fueron identificados tambin como patolgicas a travs de la fluorescencia.

Se resalta cmo el 80.8% de los resultados que fueron dados a travs de citologa como normales, la tcnica de fluorescencia los identifica como patolgicos, lo anterior puede sugerir que la tcnica de fluorescencia dado que identifica cambios bioqumicos, podra identificar de manera temprana, cambios que no son notorios en la morfologa celular, la cual es evaluada a travs de la citologa.

83

Tabla 9-3 Estudio de la capacidad predictiva de una prueba diagnstica fluorescencia /citologa
95 % I.C. Lmite inferior Prevalencia de la enfermedad Pacientes correctamente diagnosticados Sensibilidad Especificidad Valor predictivo positivo Valor predictivo negativo 58,73% 57,14% 83,78% 19,23% 59,62% 45,45% 45,64% 44,09% 67,32% 7,31% 45,13% 18,14% Lmite superior 70,76% 69,32% 93,23% 39,98% 72,69% 75,44%

La relacin entre la colposcopia y la fluorescencia result precisa y coincidente en cuanto a patologa y normalidad en 29 y 33 pacientes que corresponde al 80.5% del total de pacientes respectivamente en cada categora.
Tabla 9-4 Fluorescencia vs. Colposcopia
FLUORESCENCIA COLPOSCOPIA PATOLGICA NORMAL TOTAL PATOLGICA 29(80.5%) 8(19.5%) 37 NORMAL 7(19.5%) 33(80.5%) 40 TOTAL 36 41 77

Tabla 9-5 Estudio de la capacidad predictiva de una prueba diagnstica fluorescencia / colposcopia
95 % I.C. Lmite inferior Prevalencia de la enfermedad Pacientes correctamente diagnosticados Sensibilidad Especificidad Valor predictivo positivo Valor predictivo negativo 46,75% 80,52% 80,56% 80,49% 78,38% 82,50% 35,42% 69,60% 63,43% 64,63% 61,34% 66,64% Lmite superior 58,41% 88,34% 91,20% 90,63% 89,58% 92,11%

Tabla 9-6 Fluorescencia vs. Biopsia

FLUORESCENCIA BIOPSIA PATOLGICA NORMAL TOTAL PATOLGICA 38 (64.4%) 9(42.9) 47 NORMAL 21(35.6%) 12(57.1%) 33 TOTAL 59 21 80

Al comparar la biopsia con la fluorescencia se encuentra que 38 pacientes coinciden en el diagnstico de patologa y 12 pacientes en el diagnstico de normalidad en ambas tcnicas.

84

En cuanto a los resultados de normalidad dados a travs de la biopsia y la colposcopia, ntese en las dos tablas anteriores, cmo continan presentndose en menor proporcin casos identificados como patolgicos a travs de la fluorescencia, lo cual est ms a favor de la hiptesis planteada de que la fluorescencia, puede identificar cambios bioqumicos tempranos de los tejidos de una forma ms precisa, lo que no pueden hacer las otras tcnicas, que evalan cambios morfolgicos y estructurales que se presentan ms tardamente, por tanto el uso de la fluorescencia como mtodo diagnstico beneficiara a la paciente en cuanto a posibilidades de intervencin ms temprana. En las tablas 9-2, 9-4 y 9-6 se observa cmo al comparar la sensibilidad y la especificidad de la prueba (Fluorescencia) con la Citologa, colposcopia y biopsia, la sensibilidad resulta ser mejor con la citologa y la colposcopia, quedando con un menor porcentaje al compararlo con la biopsia. Al respecto es importante resaltar cmo la sensibilidad ha sido definida como la posibilidad de una prueba para clasificar correctamente a un individuo enfermo, o la capacidad de la prueba para detectar la enfermedad. En este sentido se recuerda que el nmero de muestras en este caso se determina como un factor condicionante de estos resultados.
Tabla 9-7 Estudio de la capacidad predictiva de una prueba diagnstica fluorescencia/biopsia
95 % I.C. Lmite inferior Prevalencia de la enfermedad Pacientes correctamente diagnosticados Sensibilidad Especificidad Valor predictivo positivo Valor predictivo negativo 73,75% 62,50% 64,41% 57,14% 80,85% 36,36% 62,52% 50,92% 50,80% 34,44% 66,27% 20,96% Lmite superior 82,67% 72,87% 76,13% 77,41% 90,35% 54,86%

En relacin a la especificidad, sta result ser ms alta al compararla con los resultados de la colposcopia, en segundo lugar con los de la biopsia y el resultado ms bajo result ser con el de la citologa. Es importante recordar que la especificidad es la capacidad de la prueba para detectar a los tejidos sanos, que al compararla con los resultados de la Biopsia o Gold Standard result ser de 57,1%. Si se tiene en cuenta lo que significa el valor predictivo positivo, probabilidad de padecer la enfermedad si se tiene un resultado positivo en el test, este valor en la fluorescencia result ser ms alto al compararlo con la biopsia, en segundo lugar con la colposcopia y en ltimo lugar con la citologa; de igual manera el valor predictivo negativo result ms bajo en la comparacin con los resultados de la biopsia. 85

9.1.2.2

CORRELACIN DE RESULTADOS ENTRE LAS DIFERENTES TCNICAS

Tabla 9-8 Colposcopia vs. Citologa

CITOLOGA COLPOSCOPIA PATOLGICA NORMAL TOTAL PATOLGICA 16 (48.5%) 23(71.9%) 47 NORMAL 17(51.5%) 9(28.12%) 33 TOTAL 33 32 65

Ntese en la tabla anterior, cmo en relacin a la identificacin de patologa existe concordancia en 16 pacientes (48.5%) entre el resultado dado por citologa y Colposcopia y en relacin a la normalidad hay concordancia en 9 pacientes (28.12%). Es bueno aclarar que muchas de las citologas realizadas en la red de patologa cervical y Colposcopia del departamento de Caldas, son realizadas nicamente en endocrvix, debido a la experiencia obtenida a travs de la evaluacin colposcpica que se realiza de rutina en el exocrvix. En la tabla 9-9 se observa cmo al cruzar colposcopia y biopsia existe una concordancia mayor que en el cruce con la citologa, no solo en identificacin de patologa 34 pacientes (94.4%), sino tambin en normalidad 21 pacientes (60%).
Tabla 9-9 Colposcopia vs. Biopsia

BIOPSIA COLPOSCOPIA PATOLGICA NORMAL TOTAL

PATOLGICA 34 (94.4%) 14(40%) 48

NORMAL 2(9.55%) 21(60%) 23

TOTAL 36 35 71

Los anteriores datos sugieren y confirman lo descrito en la literatura por DisaiaCreasman [5], la cual plantea cmo en el diagnstico de patologa a nivel cervical es ms concordante, cuando se usan las tcnicas de biopsia y colposcopia.

86

9.1.3 CONCLUSIONES
Se desarroll la tcnica de la espectroscopa ptica de fluorescencia a travs de la implementacin de hardware y software que permitieron obtener informacin espectral de los tejidos del cuello uterino, para ofrecer soporte al diagnstico mdico y manejo de neoplasias. Se obtuvieron diferentes patrones de la informacin espectral de fluorescencia basados en la acumulacin de gran nmero de datos de las reas analizadas en el cuello uterino, al correlacionar los espectros obtenidos con los resultados de las citologas, colposcopias y las biopsias (prueba de oro para el diagnstico), de manera que se caracterizaron las curvas como patolgicas y normales. Se analiz el pico de NADH y su relacin con el pico colgeno y elastina. En los tejidos normales la relacin NADH/ colgeno-elastina es menor que en los tejidos patolgicos. Si bien se sigui un protocolo estricto en cuanto a los sitios de toma de la seal en el cuello uterino, las mediciones fueron realizadas por 4 mdicos colposcopistas con diferente nivel de entrenamiento, lo que conlleva a subjetividad, esto dificult lograr uniformidad en el reporte de diagnstico colposcpico, adems en la presin aplicada a la sonda para obtener la seal espectral de fluorescencia del tejido; la toma de la biopsia puede no coincidir exactamente con el sitio de obtencin de la seal espectral, adems en la lectura anatomo-patolgica de las muestras se evalan varios cortes a 7 m y los sitios evaluados no necesariamente coinciden con el punto preciso de la informacin espectral. El nmero de la muestra no permiti obtener cifras de sensibilidad y especificidad estadsticamente significativas pero la evidencia obtenida hasta el momento muestra cmo al parecer la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia podra ser sensible y especfica en el diagnstico de lesiones intraepiteliales, el proceso investigativo debe continuar para confirmar sta hiptesis. De acuerdo a los resultados y a la hiptesis planteada de que la fluorescencia, puede identificar cambios bioqumicos de los tejidos de una forma ms precisa y ms temprana, lo que no pueden hacer las otras tcnicas, que evalan cambios morfolgicos y estructurales que se presentan ms tardamente, por tanto el uso de la fluorescencia como mtodo diagnstico beneficiara a la paciente en cuanto a posibilidades de intervencin en fases inciales.

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9.1.4 RECOMENDACIONES
Se propone continuar con el desarrollo de la espectroscopa ptica de fluorescencia como herramienta sensible, especfica y no invasiva, para el diagnstico de las lesiones del cuello uterino, para ello, se propone una siguiente etapa en el desarrollo de una investigacin prospectiva, diseada y controlada a doble ciego en pacientes con NIC I y NICII/NICIII, para determinar la sensibilidad y especificidad de la espectroscopa ptica de fluorescencia, frente al estudio anatomo-patolgico siendo esta la prueba de oro; esta herramienta, ha sido probada por cientficos de varios centros del mundo, no solo en patologa del cuello uterino, sino tambin en patologa de piel, orofaringe y tubo gastrointestinal. El proyecto de investigacin sobre espectroscopa ptica de fluorescencia debe continuar con estudios diseados y controlados, con el objeto de descentralizar el conocimiento y esta tecnologa debe ser utilizada en los grandes municipios, donde est funcionando la red de patologa cervical y colposcopia. Para esto es necesario obtener una tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia ms avanzada, que funcione en la unidad central de patologa cervical y colposcopia de la Universidad de Caldas, que sirva como apoyo en el diagnstico de otras neoplasias del organismo humano. El desarrollo y la aplicacin de la espectroscopa ptica de fluorescencia puede plantearse como una tecnologa portable, no invasiva, ms sensible, de mayor especificidad y de menor costo que la histologa, para el diagnstico y orientacin del tratamiento en precnceres de varios rganos del cuerpo humano.

9.2 ESTUDIO DE PRECNCERES EN BIOPSIAS DE MAMA A TRAVS DE LA TCNICA DE ESPECTROSCOPA PTICA DE FLUORESCENCIA
Como complemento a las experiencias investigativas y con la finalidad de probar la sensibilidad de la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia, en esta experiencia investigativa se presenta el anlisis de la informacin espectral de fluorescencia obtenida de muestras de biopsias de tejido mamario preservadas en una disolucin acuosa al 10% (formol), mediante la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia, en el rango de 360 a 760 nm, la cual permite detectar los

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cambios bioqumicos, que presentan los tejidos de mama en estado normal y patolgico. La informacin espectral se analiz extrayendo las caractersticas presentes en los espectros tales como anchos medios, concentraciones e intensidades de cada uno de los fluorforos (Colgeno, Elastina, NADH y Flavinas) presentes en el tejido mamario. Luego a este estudio, se realizo un anlisis estadstico, el cual permiti obtener medidas de tendencia central que permitieron identificar las diferencias ms significativas que presentan los fluorforos en tejidos de mama normal y en presencia de algn tipo de lesin. En Colombia, durante el ao 2001 se diagnosticaron 4.389 casos nuevos de cncer en el Instituto Nacional de Cancerologa, 333 casos ms que en el ao 2000, lo que represent un incremento de 8,2% en relacin con el ao anterior, siendo el cuello uterino, la mama, la piel y el estmago las cinco zonas de localizacin anatmica ms frecuentes [3]. El cncer de mama es la causa de muerte de aproximadamente 1.700 mujeres cada ao, constituyendo la segunda neoplasia maligna ms frecuente en las mujeres, lo que la convierte en un problema de salud pblica que va en aumento en los ltimos 20 aos [4]. Ante este incremento y teniendo en cuenta que el xito del tratamiento del cncer corresponde a una deteccin temprana de la enfermedad, se ha hecho necesario la bsqueda de estrategias que logren reducir este tipo de problemas, surgiendo soluciones como la de implementar nuevas tcnicas de deteccin de pre-cncer que al ser comparadas con procedimientos comunes permitan realizar un diagnstico ms gil y oportuno, disminuyendo el tiempo entre los procesos de diagnstico y de intervencin [5]. Es por esto que la tcnica de Espectroscopa ptica de Fluorescencia se ha empleado como una herramienta de soporte al diagnstico de lesiones precancerosas en diferentes rganos del cuerpo humano, incluyendo la glndula mamaria. Algunos grupos han utilizado la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia para discriminar entre tejidos de mama normales y malignos. Alfano y colaboradores [6], usando una fuente de excitacin de 300 nm, calcularon la relacin de intensidad de fluorescencia a 340 nm y 440 nm, desde tejidos de mama normales, benignos y malignos. Obteniendo, en sus resultados una relacin de intensidad para las muestras cancerosas, superior a los valores hallados para las muestras de tejido benigno y maligno. Por otra parte, Gupta y su grupo de trabajo [7], adquirieron el espectro de emisin de fluorescencia desde muestras de tejido mamario normal, benigno y canceroso

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usando como fuente de excitacin un lser de gas N2 de 337 nm, encontrando que el espectro promedio de cada muestra se caracterizo por presentar tres picos a 390, 430 y 520 nm, predominando este ltimo en las muestras cancerosas. Estas bandas de fluorescencia, se asociaron a fluorforos como protenas estructurales (Colgeno, Elastina), coenzimas (NADH) y Flavinas. En otros estudios realizados, se caracteriz la informacin espectral de fluorescencia de tejidos de mama normal y maligno a diferentes longitudes de onda de excitacin en el rango de 300 nm a 460 nm, encontrandose que estas longitudes permiten caracterizar fluorforos como colgeno, NADH y FAD [8].

9.2.1 METODOLOGA
Esta prueba piloto del estudio de la informacin de fluorescencia de muestras de biopsias de mama, se realiz sobre muestras de tejido mamario, suministradas por el Instituto Caldense de Patologa y provenientes de mujeres que presentaron anormalidades en el examen mamogrfico. Una vez obtenidas de la paciente las muestras de tejido, se preservaron en una disolucin acuosa al 10 % (formol), y se estudiaron en estas los estados de normalidad o patologa a travs de la histopatologa y de la tcnica de Espectroscopa ptica de Fluorescencia. Para realizar las medidas de fluorescencia, se ilumin el tejido mamario con un lser de gas nitrgeno de 337.1 nm a travs de una sonda de fibra ptica, esta presenta un arreglo de siete fibras, seis para la recoleccin de la informacin de fluorescencia y una para iluminar la superficie del tejido mamario. La informacin espectral obtenida, se registr en el intervalo que va desde los 179 nm hasta los 900 nm, por medio de un espectrgrafo USB 2000, el cual se compone de un elemento de dispersin que se encarga de separar la luz, emitida por el tejido a las respectivas longitudes de onda y de un detector que mide las intensidades a estas longitudes de onda. Por ltimo, se uso un software desarrollado por el Grupo de Magnetismo y Materiales Avanzados de la Universidad Nacional-Sede Manizales, el cual controla el funcionamiento del equipo de fluorescencia y registra la informacin espectral obtenida por la tcnica a travs de algoritmos (uno para el anlisis de la informacin espectral de fluorescencia y otro para el sistema de disparo, que controla y sincroniza los tiempos de integracin del espectrgrafo y los pulsos del lser). El algoritmo encargado de analizar la informacin espectral de fluorescencia promedia, filtra, ajusta, segmenta y adems, caracteriza los datos obtenidos utilizando una solucin numrica de la ecuacin de Beer-Lambert para medios turbios, ecuacin 1. Los parmetros caractersticos de la medida de fluorescencia de estos tejidos son intensidad normalizada, longitud de onda, 90

anchos medios, composicin, background, y coeficiente de correlacin entre otros, para cada uno de los fluorforos (Colgeno, Elastina, NADH y FAD) presentes en el tejido.

9.2.2 RESULTADOS
En la Figura 1 se presenta un esquema alusivo a la manera como se adquiri la informacin espectral de fluorescencia en muestras de tejido mamario, las cuales presentaban una forma de cubo con dimensiones 5 mm de espesor y un rea de la cara superior de 1cm2. Las medidas de fluorescencia, se realizaron solo en la cara superior de la muestra, posicionndose la sonda de fibra ptica en nueve diferentes puntos de la superficie del tejido mamario, medidos de izquierda a derecha e iniciando en la parte superior de la cara. Los espectros obtenidos por la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia fueron seleccionados estimando un valor para el coeficiente de correlacin mayor al 90 % despus de ser analizados y otros simplemente fueron excluidos del estudio porque presentaban artificios en el perfil espectral, hecho que pudo presentarse por la presencia de luz parasita proveniente de las lmparas de mercurio, presentes en el lugar donde se realizaron las medidas de fluorescencia. La figura 9-2, muestra los resultados de la medida de fluorescencia en la superficie del tejido mamario, que evidencia los espectros de fluorescencia de los tejidos patolgicos respecto a los tejidos normales. Esta clasificacin se apoy en diagnsticos histopatolgicos.

Figura 9-2 Informacin espectral de fluorescencia de muestras de biopsias de mama

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El anlisis estadstico que presenta en la tabla 9-10 sugiere que valores de las caractersticas como la media de la intensidad y de las contribuciones relativas de cada uno de los fluorforos son estadsticamente significativos, esto permite una discriminacin entre los grupos de normalidad y patologa. La media de las muestras patolgicas, presenta una intensidad para el Colgeno, Elastina y NADH (0.97, 0.96 y 0.97) mayor a los valores encontrados para el grupo de normalidad (0.95, 0.24 y 0.80). De igual forma, el parmetro de concentracin, evidencia valores de la media para los mismos tres fluorforos mayor en el grupo patolgico (33.13, 38.23 y 53.49), comparado con en el grupo de normalidad (6.11, 5.13 y 17.17).
Tabla 9-10 Anlisis Estadstico de la informacin espectral de fluorescencia en biopsia de mama
PARAMETROS Colgeno Intensidad normalizada Elastina NADH Flavinas Colgeno Longitud de onda Elastina NADH Flavinas Colgeno FWHM Elastina NADH Flavinas Colgeno Contribuciones Elastina NADH Flavinas Background Coeficiente de Correlacin MEDIA N 0,95 0,24 0,80 0,85 378,79 410,20 437,69 470,74 34,03 54,68 21,80 68,45 6,11 5,13 17,17 26,25 6,60 0,99 P 0,97 0,96 0,97 0,70 387,95 433,77 477,03 533,80 35,83 34,54 54,19 40,75 33,13 38,23 53,49 21,08 8,62 0,99 N 0,04 0,41 0,04 0,17 4,80 32,64 1,57 2,32 8,55 36,15 1,04 10,52 3,68 6,96 6,05 3,57 0,37 SD P 0,02 0,08 0,05 0,31 1,36 1,68 15,52 37,72 2,81 10,62 10,93 15,92 10,92 17,92 17,12 18,23 0,77 MEDIANA N 0,97 0,06 0,82 0,89 380,12 410,96 437,11 471,46 36,96 55,14 21,65 69,21 4,69 2,89 15,34 25,57 6,70 P 0,98 0,98 0,99 0,75 388,22 433,58 477,95 537,82 34,88 32,86 53,39 39,28 32,53 40,56 53,01 16,02 8,71

Las diferencias encontradas en los valores de la media para el parmetro de la longitud de onda de emisin para los fluorforos como Colgeno, Elastina y NADH en el grupo patolgico (387.95, 433.77 y 477.03) y normal (378.79, 410.20 y 477.03), puede darse por la presencia de centros dispersores dentro del tejido, siendo este corrimiento mucho mayor para la Elastina y NADH. La dispersin en los tejidos biolgicos se asocia principalmente a la presencia de organelas celulares. Por otra parte, se tiene un valor para la media de las flavinas (533,80) mayor en el grupo patolgico comparado con el grupo normal (470,74), lo cual se 92

debe a que esta molcula presenta una amplia banda de emisin de fluorescencia desde los 460 a 520 nm. De acuerdo a los anlisis histopatolgicos de las biopsias de mama y a los resultados obtenidos a travs de la espectroscopa ptica de fluorescencia, se sugiere que la forma de los espectros de fluorescencia para tejido normal y tejido patolgico encontrados en este estudio son los que se pueden observar en la figura 9-3. Se presenta dos ndices tanto para la normalidad como para la patologa, esto se debe a la presencia de la luz parasita de las lmparas de mercurio, y sugiere que aunque exista otra perturbacin externa, no se presenta modificacin en la informacin espectral de fluorescencia.

Figura 9-3 Informacin espectral de fluorescencia normal y patolgica

9.2.3 CONCLUSIONES
En este estudio se analiz la informacin espectral de fluorescencia obtenida de las biopsias de tejido mamario con el fin de identificar las caractersticas ms significativas en el estudio de los fluorforos presentes en estos tejidos. Se observ que las molculas como colgeno, elastina y NADH juegan un rol importante en el anlisis de los estados de patologa y normalidad de los tejidos mamarios, debido a que estos presentan valores relevantes en el anlisis estadstico, lo cual concuerda con resultados similares reportados en la literatura.

REFERENCIAS
1

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10. PROPUESTA DE METODOLOGA PARA EL SOPORTE AL DIAGNSTICO MDICO EN VIVO DE PRECANCERES DE TEJIDOS DE CUELLO UTERINO
De acuerdo a cada uno de los resultados obtenidos, en las diferentes experiencias investigativas, relacionadas con el anlisis de los tejidos biolgicos a travs de la espectroscopa ptica de fluorescencia, basados en el procesamiento digital, de la informacin espectral de fluorescencia, permitieron visualizar el potencial que ofrece esta tcnica en la caracterizacin de estados de normalidad y patologa de los tejidos del cuello uterino. Estas consideraciones y cada uno de los resultados desde la simulacin, hasta la aplicacin permiten PLANTEAR una nueva Metodologa para el soporte en el diagnstico mdico de patologas de tejidos de cuello uterino, basada en las tcnicas de espectroscopa ptica de fluorescencia, procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia y el procesamiento digital de las imgenes obtenidas por colposcopia, figura 10-1.

Figura 10-1 Metodologa para el diagnstico de precnceres de cuello uterino

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Esta metodologa propone a los profesionales de la salud, que al ingresar pacientes que a su criterio requieran el anlisis de colposcopia, que adquiera una o varias imgenes. Estas imgenes sern procesadas inmediatamente, para obtener las regiones patolgicas y sanas, y se realice como paso seguido un anlisis a travs de la espectroscopa ptica de fluorescencia, con el fin de confirmar el estado de estas regiones obtenidas. El diagnstico final estar soportado por el resultado de las tres tcnicas: la colposcopia, el procesamiento de la informacin espectral obtenida por la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia y por el procesamiento digital de las imgenes de cuello uterino. Se plantea que esta metodologa de diagnstico permita tener mayor sensibilidad, especificidad, confiabilidad y reproducibilidad que las tcnicas convencionales para el anlisis de los tejidos biolgicos, disminuir el tiempo en el proceso de diagnstico y ofrecer a las pacientes tratamiento oportuno, minimizando as los costos en la deteccin temprana de precnceres de los tejidos de cuello uterino, y buscando llegar de esta forma a mucha ms poblacin, beneficiando a un mayor nmero de mujeres en forma asertiva.

10.1PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMGENES DE TEJIDO CUELLO UTERINO OBTENIDAS POR COLPOSCOPIA

Como una herramienta complementaria del estudio de los tejidos de cuello uterino en vivo, se realiz una investigacin tipo experimental sobre el procesamiento digital de imgenes obtenidas por colposcopia de los tejidos de cuello uterino. La colposcopia es un examen visual especializado del crvix, la vagina, y de los labios vaginales externos o la vulva. Este examen es empleado para evaluar pacientes con citologas o prueba de Papanicolaou anormales. Y requiere de un instrumento llamado colposcpio el cual ayuda a identificar cambios, muchas veces leves, en el crvix y la vagina [1,2]. Los resultados del examen colposcpico se clasifica en tres grupos: (a) Hallazgos colposcpicos normales: Epitelio escamoso original, epitelio columnar o cilndrico y zona de transformacin tpica. (b) Hallazgos colposcpicos anormales: Zona de re-epitelizacin atpica, zona de transformacin atpica, epitelio acetoblanco, leucoplasia, punteado de base, mosaico, vasos atpicos y sospecha de carcinoma francamente invasivo y (c) Hallazgos colposcpicos no directamente relacionados con malignidad: cambios inflamatorios, cambios distrficos, entre otros.

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Se puede decir que la colposcopia es satisfactoria cuando se observan los lmites de la zona de transformacin en toda su extensin, y no satisfactoria Cuando no se visualiza totalmente la zona de transformacin (unin escamo-columnar) o si slo se visualiza una parte [3]. El rea de procesamiento y anlisis de imgenes digitales posee la ventaja de tener una amplia gama de aplicaciones en diferentes sectores, que involucran desde la academia y la ingeniera hasta la industria y la medicina, donde la obtencin de informacin, a partir de imgenes permite ofrecer soporte a las decisiones con base en modelos de patrones establecidos desde las mismas. Esto implica la realizacin de pruebas para lograr un procedimiento idneo que permita caracterizar las imgenes de los tejidos de cuello uterino, para determinar los rasgos que establezcan diferencias en el momento de hacer una clasificacin entre normalidad y patologa [4]. En este trabajo se presentan los resultados de la aplicacin de la tcnica de procesamiento y anlisis digital de imgenes obtenidas por el mtodo de colposcopia, como recurso para la clasificacin de normalidad y patologa de los tejidos del cuello uterino.

10.2METODOLOGA
Adquirir la imagen colposcpica del cuello uterino

Segmentacin aplicando K-means

Caracterizacin Anlisis PCA Clasificacin (normalidad y/o patologa)

Figura 10-2 Diagrama de flujo de la metodologa usada

Es prueba piloto de carcter investigativo exploratorio presenta la segmentacin de las imgenes colposcopicas de cuello uterino usando, el algoritmo K-means, que separa la imagen obtenida en 4 Clusters, y luego muestran los resultados de la extraccin de las caractersticas seleccionadas como relevantes para el anlisis, posteriormente, se realiza el Anlisis de Componentes Principales (PCA) usando

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las matrices de correlacin, y as obtener las componentes principales que representarn mejor el conjunto de datos original y por ltimo presenta los resultados de la clasificacin de los tejidos en normalidad y patologa. En la primera etapa del proceso mostrado en la figura 10-3, se adquiere la imagen del cuello uterino en formato JPG, esta es redimensionada a un tamao de 256 filas por 250 columnas, la siguiente etapa de la metodologa es la segmentacin en donde se obtienen las zonas de importancia por medio de la aplicacin del algoritmo de agrupacin K-means. En el espacio de color cartesiano Lab, se obtienen 4 clusters con las diferentes zonas inters en el estudio: fondo, zonas de iluminacin no uniforme, tejido de cuello uterino normal y tejido cuello uterino patolgico, segn el anlisis mdico. Para este caso en particular, se escogieron automticamente a travs del algoritmo de K-means 4 medias, es decir, se agrupan en 4 clusters, los pixeles que presentan caractersticas similares, ver figura 10-4.
Leer Imagen RGB Conversin al modelo L*A*B

Bsqueda de caractersticas similares usando K-means. Separacin en 4 clusters las caractersticas similares

Figura 10-3 Algoritmo utilizado para la segmentacin de la zona de transformacin

Despus de obtener los 4 clusters de cada imagen, se procede a caracterizar cada uno de ellos, para esto se seleccionaron caractersticas dentro de las cuales se encuentran la varianza, desviacin estndar, media y contraste. Cada una se obtiene por medio de ventanas de 8 filas por 10 columnas que recorren cada cluster, siendo guardada cada caracterstica en una matriz individual. Antes de realizar el anlisis por PCA, se obtiene la matriz observaciones/variables, en la cual las filas (observaciones) son cada ventana de 8*10 que recorre cada cluster y las columnas (variables) son todas las caractersticas extradas anteriormente. La siguiente fase consiste en la aplicacin del anlisis de componentes principales (PCA), usando las matrices de correlacin aplicadas a la matriz observaciones - variables anteriormente obtenidas, encontrandose los eigen-valores y eigen-vectores correspondientes, y seleccionando los eigenvalores mayores a 1 y su respectivo eigen-vector, porque estos valores explican la mayor varianza del conjunto original. Finalmente se multiplican los eigen-vectores 98

escogidos, por la matriz observaciones -variables, para poder realizar el anlisis de comportamiento de cada componente principal frente a los datos originales.

10.3RESULTADOS Y ANLISIS
En la segmentacin se agrup en 4 clusters, los pixeles que presentaban caractersticas similares en la imagen y haciendo uso de la distancia Euclidiana en el algoritmo K-means, como distancia de bsqueda, se obtienen 4 centroides con las siguientes posiciones:
Tabla 10-1 Centroides figura 10-4 Centroides Cluster 1 Cluster 2 Cluster 3 Cluster 4 Posicin x 177.3731 157.2111 137.8379 164.2141 Posicin y 166.5111 141.1539 134.0579 147.9911

Figura 10-4 Proceso de segmentacin. a) Imagen original en RGB. b) Endocervix. c) Tejido normal. d) Tejido patolgico. e) Zonas de iluminacin no uniforme

En el proceso de segmentacin en algunas de las imgenes procesadas, se observ que en el cluster en el cual quedaban agrupadas las zonas con iluminacin no uniforme, tambin existan zonas consideradas portadoras de patologas. Esto se debe a que las regiones con falta de compensacin de iluminacin, afectan en gran medida estas zonas y al momento de hacer la separacin en los 4 clusters, la media del cluster de iluminacin no uniforme se centra en estas regiones, afectando as, la seleccin optima de las tonalidades, trayendo consigo perdida de informacin. Las imgenes que presentan problemas de iluminacin no uniforme se procesaron sin tener en cuenta la informacin que

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no se poda recuperar en condiciones ptimas y por lo tanto estas zonas se excluyeron del anlisis aplicado al cluster.
Tabla 10-2 Centroides figura 10-5 Centroides Cluster 1 Cluster 2 Cluster 3 Cluster 4 Posicin x 171.0042 135.2538 160.2251 177.4163 Posicin y 146.1944 129.4687 138.5710 153.7808

Figura 10-5 Proceso de segmentacin. a) Imagen original en RGB. b) Endocervix. c) Tejido Normal. d) Tejido anormal. e) Zonas de iluminacin no uniforme. Fuente: Manual para la deteccin visual de neoplasias cervicales

Para cada clusters segmentado fue aplicado un muestreo por ventanas de 8*10, en las cuales para cada posicin i,j, exista una ventana M , de la cual se extraan las caractersticas como medias, desviacin estndar, entropa, varianzas y homogeneidad. Estas caractersticas sugirieron una separabilidad entre el tejido considerado normal, el tejido considerado patolgico, el endocervix y las zonas de iluminacin no uniforme. Se observ como las medias ms altas, son de las zonas de iluminacin no uniformes, debido a que la media de tonalidad tiende a ser cercana a un valor de 255 en escalas de grises, y la ms baja, la presentaba el endocervix. Estos resultados permitieron diferenciar entre los clusters, zonas consideradas con patologas y normales. Por otro lado analizando las entropas se observ que las ms bajas las presentan las zonas consideradas como patolgicas. Estos dos criterios permitieron analizar y etiquetar los 4 clusters segmentados, con el fin que el anlisis PCA solo sea realizado a los dos clusters de inters y as ahorrar tiempo computacional y hacer ms eficiente el proceso. A continuacin se presentan los resultados del etiquetamiento en las figuras 6 y 7 usando los criterios anteriormente expuestos.

100

Figura 10-6 Imagen original. Cluster etiquetado como Normal. Cluster etiquetado como patolgico.

Figura 10-7 Imagen original. Cluster etiquetado como Normal. Cluster etiquetado como patolgico.

El criterio de clasificacin usado, fue el promedio de las medias del total de la base de datos, presentando resultados muy satisfactorios en la discriminacin de las zonas consideradas como patolgicas. Fue escogida esta caracterstica debido a que present mayor relevancia visual con respecto a las otras cuatro. En las figuras 10-8, 10-9, 10-10 y 10-11 se presentan algunos de los resultados de la clasificacin de las imgenes obtenidas por colposcopia de tejido cuello uterino. La zona seleccionada como patologa est marcada con un color naranja:

Figura 10-8 Imagen Original e Imagen clasificada

Figura 10-9 Imagen Original e Imagen clasificada

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Figura 10-10 Imagen Original e Imagen clasificada

Figura 10-11 Imagen Original e Imagen clasificada

10.4CONCLUSIONES
El uso de modelos de color distintos del RGB, permiten tener una independencia de los dispositivos con los que sean capturadas las imgenes, siendo el modelo Lab, una buena herramienta para la segmentacin de estas imgenes. Se comprob que el algoritmo de agrupacin K-means, funciona de una manera eficiente, en cuanto al proceso de segmentacin de los 4 clusters de inters, siendo este aplicado a la imagen convertida al modelo de color Lab con una distancia de bsqueda Euclidiana. Las condiciones de iluminacin en la toma de las imgenes por colposcopia afectan en gran medida el proceso de segmentacin, ya que dificultan la extraccin de las zonas con alguna patologa.

REFERENCIAS
1 2 3 4

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CONCLUSIONES GENERALES
Se desarroll la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia a travs de la implementacin de un hardware y software, que permitieron obtener informacin espectral de los tejidos biolgicos. Se determinaron caractersticas discriminantes a travs del procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia, de los tejidos de cuello uterino y mama, que permitieron plantear metodologas para ofrecer soporte en el diagnstico mdico de precnceres. Se desarrollaron algoritmos computacionales para el procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia, con el objeto de ofrecer soporte al diagnstico mdico en vivo, en el manejo de los precnceres de los tejidos de cuello uterino. Se comprob a travs de la simulacin, la evolucin de la no enfermedad a la enfermedad de los tejidos biolgicos, a travs del anlisis de los espectros de fluorescencia de las clulas obtenidas por el modelo celular de Potts. En los casos en donde se presentaron cambios o evoluciones de estados normales, a estados patolgicos, se logr representar los cambios en las contribuciones de cada uno de los fluorforos presentes en el anlisis, acercndose a lo expuesto en la literatura. Se plante una metodologa para el soporte en el diagnstico mdico en vivo de precnceres de cuello uterino, basada en la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia, procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia y del procesamiento digital de imgenes de cuello uterino obtenidas por colposcopia. De acuerdo a los resultados y a la hiptesis planteada, que la fluorescencia, puede identificar cambios bioqumicos de los tejidos, de una forma ms precisa y estados ms tempranos (lo que no pueden hacer las otras tcnicas, que evalan cambios morfolgicos y estructurales que se presentan ms tardamente), el uso de la fluorescencia como mtodo diagnstico beneficiara a la paciente en las posibilidades de intervencin en fases inciales.

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TRABAJOS CONCLUIDOS
1. Implementacin de la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia para el diagnstico de precnceres de cuello uterino. 2. Uso de la tcnica EOF para el diagnstico de precnceres de cuello uterino. 3. Modelo matemtico y simulacin del espectro de fluorescencia en sistemas biolgicos. 4. Correlacin de las tcnicas EIE y EOF para el diagnstico de precnceres de cuello uterino. 5. Deteccin automtica de anomalas celulares en muestras de biopsia. (Artculo en revisin, Revista Ingeniera y Ciencia - ISSN 1794-9165). 6. Soporte al diagnstico mdico de precnceres de cuello uterino a travs del uso del tratamiento digital de imgenes obtenidas por colposcopia. (Artculo en revisin, Revista Colombiana de Fsica - ISSN 0120-2650). 7. Estudio de precnceres en biopsias de mama a travs de la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia. (Artculo en revisin, Revista Colombiana de Fsica - ISSN 0120-2650). 8. Mathematical model for analyzing the fluorescence emission of biological tissue. (Artculo en revisin, Revista Computer Methods and Programs in Biomedicine ELSEVIER - ISSN: 0169-2607).

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CONTRIBUCIONES
1. Se desarroll e se implement la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia. 2. Se desarrollaron diferentes algoritmos, para el procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia y de las imgenes de los tejidos de cuello uterino. 3. Se logr simular los espectros de fluorescencia que representan la interaccin de la radiacin electromagntica con tejidos biolgicos. 4. Se simul ordenamiento celular y promocin de estados de normalidad a patologa de conjuntos de clulas biolgicas a travs del modelo celular de Potts. 5. Se desarroll y aplic una metodologa para el soporte al diagnstico mdico de precnceres de cuello uterino y mama, basada en la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia. 6. Se plante una metodologa para el soporte en el diagnstico mdico de precnceres de cuello uterino, basada en las tcnicas de espectroscopa ptica de fluorescencia, procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia y del procesamiento digital de imgenes de cuello uterino obtenidas por colposcopia.

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PROYECCIONES
1. Continuar con el estudio y mejoramiento del modelo matemtico utilizado para simular, como herramienta de anlisis de los espectros de fluorescencia de tejidos biolgicos. 2. Usar la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia en otros tipos de tejidos biolgicos, como el tejido mamario. 3. Desarrollar a travs de un software libre los algoritmos computacionales, para el procesamiento digital de la informacin espectral de fluorescencia, de las imgenes obtenidas por colposcopia y de las imgenes de muestras de biopsia. 4. Realizar nuevas experiencias investigativas, con el objeto de incrementar la relacin costo beneficio, del uso de la tcnica de espectroscopa ptica de fluorescencia en el soporte en el diagnstico mdico de precnceres.

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GRUPOS QUE APOYARON LAS INVESTIGACIONES

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