27/05/2009

SISTEMAS VIRALES PARA EXPRESIN DE GENES 2009

daniela capiati

EXPRESIN DE GENES: APLICACIONES * Produccin de protena pura - Determinacin de estructura - Estudios bioqumicos (actividad enzimtica) - Produccin de anticuerpos - Usos teraputicos (insulina rec.)

* Caracterizacin funcional de genes - Sobreexpresin/silenciamiento (hairpin siRNA): fenotipos - Estudios de localizacin subcelular, interacciones, etc.
bacterias, levaduras, eucariontes sup (transfeccin).

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Vectores virales para expresin de genes * En clulas de mamferos -Adenovirus -Retrovirus -Virus adeno-asociados * En clulas de insectos -Baculovirus Anlisis de la funcin de un gen (sobreexpresin/ silenciamiento, localizacin) Principalmente: Obtener cantidades de protena pura

Vectores virales para expresin de genes:

Genomas virales modificados convertidos en vectores portadores del gen que se quiere expresar.
Modificaciones para que el virus sea no-replicativo y no mate la clula donde se quiere expresar la protena deleciones de genes necesarios para la replicacin viral. (Excepto Baculovirus)

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Vectores virales Ventajas : -elevada eficiencia de transfeccin (infeccin) y expresin -se pueden expresar genes en muchos tipos celulares difciles de transfectar con otros mtodos (cultivos primarios) Desventajas : - laborioso - riesgo biolgico

Mecanismo general (adeno-retro-AAV) 1. Clonado del gen de inters en el vector viral (PLSMIDO) 2. Produccin de virus rec en cls empaquetadoras 3. Obtencin de partculas virales 4. Infeccin de la clula target
Virus: no-replicativo complementar genes deficientes en la cl empaquetadora (plsmido o genoma)

Cl empaquetadora

Infectar cl target

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Vectores basados en Adenovirus * Expresar protenas en una gran variedad de clulas humanas y de mamferos (mitticas y no mitticas). * Expresin transitoria (virus rec no se integra al genoma). Altos niveles de expresin. Adenovirus: -Virus sin envoltura -Genoma: DNA doble cadena lineal -Infecciones respiratorias benignas en humanos -Subgrupo C (serotipos 2 y 5): vectores -No se integra al genoma del husped (virus wt se replica como episoma en el ncleo)

ADENOVIRUS

Ciclo de vida

ADENOVIRUS

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ADENOVIRUS
se desensambla la cpside y el DNA viral entra al ncleo Ncleo: DNA viralepisoma transcripcin, replicacin y ensamblado Viriones hijos salen de la clula (la clula muere)

Genoma: 35 kb

ADENOVIRUS

ITR

ITR

ITR: origen replicacin

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Construccin del vector viral

ADENOVIRUS

delecin E1 (A yB) y E3 espacio para clonar DNA/hacerlo no-replic

ITR

ITR

ITR

E1A y B: necesarios para replicacin viral. Deben ser aportado por la clula empaquetadora E3: evacin de la rta. inmune no es necesario para la replicacin

Promotor (CMV) pA: seal de poliadenilacin

ADENOVIRUS Vectores virales basados en adenovirus *AdEasy XL (Stratagene) *Adeno-X (Clontech) *ViraPower Ad Expression System (Invitrogen)
Genoma Ad: grandegen se clona en vector shuttle (MCS-pCMV) y se transfiere al pADEasy (genoma Ad E1E3 por rec homloga en E. coli.

pBR322 ori pBR322 ori

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ADENOVIRUS pShuttle -pCMV: prom const fuerte para cls eucariontes sup -MCS -SV40 polyA: sitio de poliadenilacin del virus SV40 -Tag (FLAG o HA) -ES (enhancer) - ITRs
IRES-GFP IRES: Internal Ribosome Entry Site mRNA bicistrnico: expresar la prot de inters y GFP (verificar expresin) -ori/Kana: clonado en Coli -seq para rec homloga (PmeI)

pBR322 ori

1. cDNA vector shuttle* 2. Linealizar con PmeI

PmeI
polyA

ADENOVIRUS

PmeI

3. Cotransformar E. coli (Rec+) con vector shuttle lineal y pAdEasy-1 4. Recombinacin homloga 5. Seleccin de bacterias con vector recombinado por kana (screening, secuenciacin) 6. Plsmido adenoviral recombinate PacI

7. Transfectar HEK293 (gen E1A Infectar cl y B) partculas virales recombinantes target

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Vector Ad + GOI

ADENOVIRUS

E1A y B replicacin viral

Sin E1 no hay replicacin ni lisis. EXPRESIN DEL GOI

HEK293 (microcarriers) transfectadas con vector adeno/GFP

AdenoX Expression System2 (Clontech)

E1/E3

ADENOVIRUS

ViraPower Ad (Invitrogen): Gateway recombinacin att del fago

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Vectores basados en Retrovirus * Expresar genes en clulas humanas, de mamferos y otras * Expresin estable (integracin en el genoma). Retrovirus: -Virus con envoltura -Genoma: RNA cadena simple -Se integra al genoma de la clula (previa transcripcin reversa) -Vectores retrovirales: 1. Moloney murine leukaemia virus (MMLV): clulas mitticas 2. HIV-1 (lentivirus): mitticas y no mitticas 3. MESV (Murine Embryonic Stem Cell Virus): stem cells y cels hematopoyticas

RETROVIRUS

Ciclo de vida

RETROVIRUS

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RETROVIRUS

LTR

LTR

Genoma: aprox. 10kb Genes gag, pol y env gag: protenas de la cpside pol: transcriptasa rev env: protenas de la envoltura Long terminal repeats (LTRs): promotor/seq involucradas en la integracin/sitio de poliadenilacin : seal de empaquetamiento

Construccin del vector viral

RETROVIRUS

Expresin del cDNA: -promotor 5' LTR viral (o pCMV)

Capacidad: 7.5 kb

Vectores: gag, pol, env espacio para clonar DNA/hacerlo no replicat. Queda : seq de empaquetamiento

gag, pol, env: plsmidos en clulas empaquetadoras

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Vectores virales basados en MMLV * ViraPortTM (Stratagene) * Retro-X (Clontech)

RETROVIRUS

Ampr

env
pUC ori Ampr

Transfeccin cl empaq con los 3 vectores Produccin de retrovirus recombinante Infeccin de clula target

3LTR

gag-pol-env
5LTR Ampi r

pBR322ori

gag-pol

RETROVIRUS
pFB -prom LTR 5viral + seal de empaq (gag truncado: parte del ) - LTR 3: seal de poliadenilacin -MCS para gen de inters -Ampi r/ori de E Coli -IRES-neo: seleccin x G418 (mRNA bicistrnico): para generar lneas de clulas empaq estables productoras de virus / para seleccionar cls target que expresan el gen de inters

3LTR

gag-pol-env
5LTR Ampi r

pBR322ori

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env prot de la env (sup del virus) Infeccin: interaccin env-receptores especficos Definir rango de clulas husped del virus eligiendo el vector env para transformar la clula empaquet. Ecotropic, amphotropic y 10A1: MMLV.
Ampr pUC ori

RETROVIRUS

VSV-G: glicoprot G del virus de la estomatitis vesicular.

RETROVIRUS
Vectores v-Pack -env y -GP: -prom CMV para gag-pol/env -IRES-gen de resistencia a drogas para generar lneas estables de cel empaq productoras de virus -Ampi r

-ori replicacin en E Coli

Ampr pUC ori

Ampr

poliprotena Gag-Pol cortado por proteasa

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RETROVIRUS

NIH3T3 infectadas con pFB-Neo-GFP

RNA

RT

RNAdsDNA

RETROVIRUS

Clulas empaquetadoras con gag y pol integrados al genoma (GP2-293 cell line) env: se cotransfecta con el vector de expresin retroviral (gen de inters)

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RETROVIRUS
Vectores virales basados en HIV-1 (lentivirus): no mitticas/mitticas * ViraPower Lentiviral Expression System (Invitrogen) * Lenti-X (Clontech) Vector lenti-X: *5LTR y 3LTR del HIV-1 * Seal de empaq *RRE (HIV-1): Rev response element se une la protena Rev: exportacin del RNA genmico del ncleo para empaquetamiento en cit ( virus rec) *cPPT/CTS (HIV-1): tracto de Polypurina /Central Termination Seq importacin del HIV al ncleo. Mejora la integracin y transcripcin *pCMV-MCS (puromicina: lneas estables) *WPRE: (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element): promueve el procesamiento y maduracin del RNA, aumenta la exportacin nuclear del RNA viral: expresin del gen de inters

RETROVIRUS
Para obtener virus rec: transfectar cls empaq con el lenti-X (gen de inters) + Packaging mix *Packaging mix: 3 vectores: -gag-pol -env (elegir el gen env) -rev: codifica para la protena REV que se une al RRE (exportacin del RNA genmico del ncleo)

Infectar cl target

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RETROVIRUS
Vector lentiviral para silenciamiento: pLVX-shRNA1 (Clontech)

Se clona el shRNA (small hairpin) bajo el promotor U6 (promotor para RNA pol III)

Infectar cl target

Vectores basados en virus adeno-asociados (AAV) Expresar protenas en clulas humanas y de mamferos (mitticas y no mitticas). Virus adeno-asociados: -Son parvovirus humanos no patognicos -Sin envoltura -Genoma: DNA de cadena simple -Infecta gran variedad cl (mittica y nomitticas) -Ausencia de virus helper (adenovirus o herpes simple): integra al genoma (no produce viriones: latencia) -Dependen de un virus helper para hacer ciclo ltico y replicar

AAV

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Genoma

AAV

DNA cadena simple, aprox. 4.7 kb rep: protenas para la replicacin (Rep 78-68-52-40) cap: protenas de la cpside (VP1-2-3) ITRs: Inverted terminal repeats: origen de replicacin, seal de empaquetamiento, integracin

Infeccin
Unin del virus a la MP

AAV
Internalizacin del virus por endocitosis
Transferencia del virus desde el endosoma al ncleo Desensamblado: ssDNA viral sntesis de la 2 hebra de DNA dsDNA (forma replicativa)

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En el ncleo
Ausencia de v helper: AAV se integra
Rep78/68

AAV
AAV + v helper replicacin del genoma viral (episoma) viriones

Latencia Infeccin con v helper: rescate genoma viral se replica produccin de viriones

Construccin del vector viral

ITR

AAV
ITR

rep y cap deletados espacio para el gen de inters/hecerlo no replic + promotor + seal de pA
ITR ITR

Para la produccin de AAV recombinantes La cl empaquetadora tiene que aportar: -rep y cap -genes del adenovirus (helper) (E1a, E1b, E2a, E4 y VA RNA)

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Vectores virales basados en AAV * AAV helper-free System (Stratagene)

AAV

-pCMV-MCS: clonar en pCMV-MCS pAAV (Not1) (ITRs: recombinan) -pAAV-RC: rep-cap (genes deletados en AAVrec) -pHelper: genes adenovirus (fase ltica y producir AAVrec en cl emp)

Vector viral pAAV-Gen de inters: -ITR del virus -Gen de inters bajo pCMV/intrn bglobina: + eficiente (expresinestabilidad del mRNA) -sitio de poliA -Ampi r -ori de rep en EColi

AAV

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Produccin de AAVrec en cl empaquetadora: pAAV-gen de inters se co-transfecta en clula empaquetadora HEK293 con pAAV-RC y pHelper

AAV

pAAV-RC: rep y cap deletados pHelper: genes de adenovirus produccin de virus AAV en HEK293 HEK293: genes de adenovirus E1A y E1B (integrados) empaquetamiento de viriones

Infeccin de cl target con AAVrec:

AAV

En condiciones noreplicativas y ttulo de virus: integracin (expresin estable)

HT1080/ pAAV-GFP

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Adenovirus-Retrovirus-AAV
Vectores basados en adenovirus, retrovirus y AAV Expresar genes (protenas) en: -clulas en cultivo (analizar la funcin de un gen)

-in vivo: anlisis funcional en animales fines teraputicos (terapia gnica)

Baculovirus Expresin de Protenas en clulas de Insectos

Baculovirus

Baculovirus obtener grandes cantidades de una protena pura

Ventajas del sistema Baculovirus * Modificaciones postraduccionales -puentes disulfuro -fosforilacin -glicosilacin -oligomerizacin -folding correcto -clivaje proteoltico * Alto nivel de expresin (25-50% del total de prot) * Capacidad para insertos largos (15 kb) * Sitema escalable de mL a L

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Baculovirus Baculovirus Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) -Con envoltua -Virus que infecta insectos -Genoma: 135 Kb - DNA doble cadena circular ccc -154 ORFs Baculovirus (AcMNPV) 2 formas: * Virus ocludo: en
* Virus budded estructura proteica polihedrina (cuerpos de oclusin) Polihedrina proteje

Ciclo de vida

Baculovirus
larva ingiere CO

Virus entran en cls del intestino

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Baculovirus
Sistema de expresin de protenas basado en Baculovirus * AcNPV vector para expresar el gen de inters * Lneas celulares: Sf9-Sf21 (Spodoptera frugiperda)

Sf9 infectadas con baculovirus

Sistemas de Baculovirus * BaculoGold (BD Biosciences) * BacPak (Stratagene): similar al BaculoGold * BaculoDirect (Invitrogen): Gateway

BaculoGold (BD Biosciences)

Baculovirus
Genoma de baculovirus: muy grande para clonar directamente. gentransfer vector entre seq homlogas al genoma de baculovirus para transferirlo al genoma de Baculovirus (BaculoGold) x rec hom. Cotransfectar Sf9 con BaculoGold y tranfer vector+gen. Rec hom genoma baculo + gen de inters -Produccin de prot rec.

-Produccin de partculas virales que pueden re-infectar e infectar otras cls y producir ms virus recombinantes (y protena rec)

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Baculovirus

Baculovirus

BaculoGold:

Gen de polihedrina deletado, incluso su promotor (lineal): no forma cuerpos de oclusin

gen de inters: se clona en el transfer vector bajo el promotor de la polihedrina

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Baculovirus
Transfer Vectors: -Ampi r -Ori EColi -Promotor de polihedrina upstream MCS -Prom/MCS: flanqueado por regiones homlogas al BaculoGold para recombinar Existen otras versiones con otros promotores y tags para purificacin (GST-6xHis)

Baculovirus

Cells infectadas con baculo wt CO

Cells que expresan XylE recombinante amarillas

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BaculoDirect (Invitrogen)

Baculovirus
BaculoDirect: genoma del Baculovirus (lineal) sitio dentro de lacZ

His-V5 en N-term (tambin en C-term; seal para secrecin) Gateway entry clone: clonar gen de inters (rec att fago) BaculoDirect + gen de inters

*Prom polyhedrin (PPH) *Timidina kinasa (TK): seleccin neg de virus no-recombinantes (ganciclovir) *Epitope V5 + (6xHis) para deteccin y purificacin *Sitio para Proteasa de TEV

Baculovirus

Transfeccin de Sf9

Seleccionar con ganciclovir (nuclesido anlogo): TK lo P e incorpora al DNA viral: no puede replicar (Tb se incorpora al DNA celular: letal)
Colectar virus, infectar para amplificar (ganciclovir): test para ver expresin de protena de inters Scaling up

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