PRODUO

UTILIZAO

DE
D E

LCOOL
NA C . G . TEIXEIRA

DE

MANDIOCA
AMIDO

BOLORES

SACARIFICAO D O

Engenheiro

agrnomo,

Seco de Fitopatologia,

Instituto

Agronmico

de Campinas

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10, N. 10

embolorado removido desta sala incubadora e posto a secar. Este produto, depois de seco, vai substituir o malte na destilaria. N o processo amilo, estirpes selecionadas de Rhizopus ou Mucor so cultivadas em goma de amido pr-liquidifiada, cozida e arejada. Dentro de 24-28 horas, quantidade suficiente de enzimas segregada para sacarificar o amido existente na goma. Ambos os processos apresentam certas desvantagens. O preparo d o farelo embolorado um processo trabalhoso, ocupa muito espao e exige equipamento especial. Alm disso, necessrio empregar u m farelo de cereal como substrato. N o processo amilo, todo o mosto deve ser previamente liquidificado e depois arejado durante o crescimento d o fungo, o que encarece e dificulta a operao. Le Mense (4) e outros estudaram a viabilidade de se obterem enzimas sacarificantes segregadas por bolores, que so multiplicados em culturas submersas e suficientemente arejadas. Vrias espcies de Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium e Monilia foram cultivadas e submetidas a teste, quanto ao poder enzimtico. Entre elas, destacou-se uma estirpe de Aspergillus niger van Tieghem, da coleo d o Northern Regional Research Laboratory, Illinois, E E . UU., sob o nmero 337. O prprio Le Mense (5), em colaborao com outros pesquisadores, publicou um trabalho dando detalhes e o preo de custo de uma instalao para produzir cultura submersa de fungos utilizados como agentes sacarificantes d o amido. N o norte d o Brasil, os pequenos agricultores produzem ainda uma espcie de aguardente de mandioca, por um processo bastante primitivo, em que a sacarificao d o amido feita por meio de fungos. A aguardente resultante recebe o nome de tiquira (6). Banzon e outros (2) realizaram experincias utilizando farelo embolorado na sacarificao d o amido de mandioca. Observaram que o farelo embolorado um agente mais ativo que o malte de cevada na sacarificao desse amido. U m rendimento terico, de cerca de 7 0 % , foi obtido pela sacarificao da mandioca com 8-10% de malte de cevada. Pela utilizao de 1 0 % de farelo embolorado, na sacarificao do amido de mandioca, foi obtido u m rendimento terico entre 80-85%. E m vista d o preo elevado do malte de cevada, tem-se usado em nosso meio o malte de milho. Este malte produzido na prpria destilaria. uma operao demorada e que exige muito cuidado, a fim de evitar contaminao por meio de bactrias e bolores existentes no ar. A utilizao de culturas submersas na sacarificao de substncias amilceas, para produo de lcool, resultaria numa simplificao do processo e seria a mais adequada para o nosso pas, onde a temperatura elevada e a umidade d o ar so agentes desfavorveis para a produo de u m bom malte. As experincias realizadas tiveram como objetivo verificar a viabilidade da utilizao, em escala industrial, de cultura submersa de fungos na sacarificao do amido de mandioca. Os resultados experimentais foram bastante satisfatrios. Obtiveram-se rendimentos alcolicos superiores aos que so atualmente conseguidos em nosso pas. Alm disso, o processo o que parece mais adequado para as regies de clima quente e mido.

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2 - CULTURA SUBMERSA D E BOLOR O mais srio empecilho para o desenvolvimento da indstria de lcool de substncias amilceas em nosso meio a escassez de malte e a dificuldade de obt-lo e preserv-lo. Somente as cervejarias usam malte de cevada e a maior parte deste malte importada. E m virtude d o elevado preo d o malte de cevada (cerca de Cr$ 4,00 o quilo), a sua utilizao nas destilarias torna-se impraticvel, por causar a elevao d o custo de produo do lcool obtido. O problema se resume em achar u m substituto para o malte, que redunde em rendimentos alcolicos iguais ou superiores aos obtidos de mostos sacarifiados c o m malte.
2 . 1 - V A N T A G E M DA CULTURA SUBMERSA

Vrias so as vantagens oferecidas pela utilizao de culturas submersas na sacarificao d o amido. Entre elas, podem-se citar as seguintes : a) o custo da operao de sacarificao menor que o da sacarificao c o m o malte ; b) elimina-se uma das operaes mais difceis na destilaria, que a de produo de malte ; c) a operao de fermentao pode ser realizada asspticamente, o que no possvel quando se usa malte na sacarificao ; d) a sacarificao mais eficiente que pelo uso de malte de cevada ; e) substratos simples e de baixo preo podem ser utilizados como meio de cultura para a multiplicao d o fungo ; / ) o rendimento alcolico obtido igual, ou superior, ao de mostos sacarificados c o m malte ; g) no necessria nenhuma modificao na aparelhagem utilizada para a produo de lcool de substncias amilceas, pelo processo clssico da maltagem.
2.2-PREPARO DA CULTURA SUBMERSA

E m experincias realizadas pelo autor (9), obtiveram-se timos resultados na multiplicao de Aspergillus niger estirpe N R R L - 3 3 7 , utilizando o seguinte substrato :
Farelo de vinhaa desidratada ( ) Milho modo Carbonato de clcio
1

5,0% 1,0% 0,5%

Coloca-se uma certa quantidade de gua corrente em um recipiente de vidro onde vai ser preparado o meio de cultura e adiciona-se, a seguir, o farelo de vinhaa. Ferve-se em uma outra vasilha uma quantidade de gua suficiente para produzir uma goma de milho de viscosidade mdia. O milho modo misturado c o m uma pequena poro de gua fria. Quando a gua da vasilha estiver em ebulio, junta-se o milho modo vagarosamente, c o m agitao constante. Aps dez minutos de cozimento, a goma de milho transferida para o vidro onde vai ser preparado o meio de cultura. Junta-se, a seguir, carbonato de clcio. Completa-se o volume com gua corrente. O vidro tamponado c o m algodo e esterilizado em autoclave a 125C, durante trs horas.
( ) Traduo da expresso inglesa distulers'dried solubles.
1

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Os mostos de raspa de mandioca sacarificados c o m culturas de fungo, obtidas neste substrato, apresentaram um alto rendimento alcolico (quadro 1). O meio de cultura na base de vinhaa desidratada timo para a multiplicao do Aspergillus niger. N o s Estados Unidos, onde o farelo de vinhaa
QUADRO 1.Resultados de fermentao de mostos de raspa da mandioca, sacarificados com malte, de cevada e de milho, e com culturas submersas de Aspergillus niger, propagadas em diferentes substratos
Processos de sacarifica D Agente Percentagem usada ( )
1

CoricentraSo do mosto Rendimento alcolico Leitura no refratmetro lcool obtido de 1 000 kg de raspa litros 6,8 416,6 316,0 410,0 450,0

Raspa

Amido

Aproveitamento industrial (rendimento terico)

%
SACARIFICAO COM MALTE

%
13,2

%
74,1

7 Malte de milho **
SACARIFICAO COM FUNGO ( )
2

17,6

13,8 L 16,0

f (substratos) A. niger J vinhaa.-I lorta de algodo l Farinha de soja integral

a r e I d e

10 10 10

17,6 15,3 15,3

13,6 10,5 10,5

8,6 7,2 7,2

485,6 472,4 472,4

90,5 95,5 95,5

Fonte : * = dados obtidos pelo autor (9). ** = dados obtidos por Almeida (1) (}) Para o malte, percentagem gravimtrica e, para o fungo, volumtrica ( ) Os dados referentes aos substratos preparados com torta de algodo e soja integral representam a mdia de 12 fermentadores
2

pode ser adquirido c o m facilidade e a preo razovel, a utilizao deste meio de cultura ideal. E m virtude da dificuldade, entre ns, de obteno de farelo de vinhaa, procurou-se encontrar um outro meio de cultura que o pudesse substituir, onde o fungo se desenvolvesse bem e apresentasse u m alto poder sacarificante. A condio essencial seria a utilizao de substncias de fcil aquisio n o comrcio e de baixo preo, condio primordial para que o processo pudesse ser de valor econmico. Esse substrato deveria ser rico em nitrognio facilmente assimilvel e em complexo vitamnico B . Entre os diversos substratos experimentados, dois foram bastante satisfatrios, e tm a seguinte composio em relao ao peso em gua :
SUBSTRATO 1

Torta de algodo peneirada Raspa de mandioca Farelo de arroz

SUBSTRATO 2

3,0% 2,0% 0,5% 3,0% 2,0%

Farinha de soja integral Arroz integral modo

Essas culturas so preparadas em vasilhames de vidro c o m capacidade para 20 litros, nos quais so colocados 12 litros de meio de cultura. O

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processo de preparao dos meios de culturas constitudos pelos substratos 1 e 2 idntico ao j descrito para o farelo de vinhaa desidratada. O arroz ou a raspa de mandioca devem ser cozidos separadamente. N o foi adicionado aos meios de culturas o carbonato de clcio. Os vidros contendo o meio de cultura so esterilizados e, a seguir, resfriados. Os vidros so semeados c o m 50 cc de cultura submersa de Aspergillus niger estirpe N R R L - 3 3 7 . Esta cultura obtida semeando-se um frasco Erlenmeyer contendo os 50 cc de meio de cultura esterilizado c o m esporos obtidos de tubo c o m cultura pura d o fungo. O frasco Erlenmeyer, aps semeadura, arejado durante 48 horas por meio de agitao (fig. 1).

FIGURA.

1.Agitador para arejamento de culturas submersas de fungos.

Esta cultura, que foi arejada durante 48 horas, vai servir para semear o substrato d o vasilhame de 20 litros. O arejamento da cultura nos recipientes de vidro se faz pela introduo de ar esterilizado e mido, como mostra a figura 2. O fungo multiplicado nos recipientes de vidro temperatura ambiente (25-30C) durante 72 horas. Decorrido esse perodo de arejamento, a cultura se apresenta bastante desenvolvida e c o m alto poder sacarificante. Conserva-se, a seguir, em geladeira, para ser utilizada posteriormente nas experincias de sacarificao da raspa de mandioca.

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3 - PREPARO DO MOSTO O mosto de raspa de mandioca, sacarificado c o m cultura submersa de Aspergillus niger, preparado de acordo com a tcnica preconizada por Stark e outros (7), c o m o segue :

FiGTJEA

2.Recipientes de vidro para multiplicao de fungos em cultura submersa. A ar comprimido; B filtro de algodo; C vidro com gua esterilizada; D cultura submersa do fungo; E tubo para escape do a T .

a) aqueee-se a uma temperatura de 48C uma quantidade de gua igual a cerca de 3/5 d o volume total do mosto a preparar ; b) juntam-se 2 , 5 % da cultura submersa, calculados sobre o volume total d o mosto a ser preparado, para facilitar a liquidificao da goma ; c) eleva-se a temperatura a 54C e junta-se a raspa de mandioca ; d) ajusta-se o p H entre 5,4 e 5,6 com cido sulfrico N / l ; e) a goma, constantemente agitada, mantida temperatura de ebulio do banho-maria durante uma hora e, em seguida, posta em autoclave a 125C, durante uma hora ; / ) a goma resfriada a 60-63C, e 1 0 % de cultura submersa d o bolor, calculados sobre o volume total de mosto a preparar, so adicionados para a sacarificao d o amido ; conserva-se a esta temperatura durante dez minutos, e, a seguir, resfria-se a 30C ; g) ajusta-se o p H a mais ou menos 4,64,8 c o m cido sulfrico N / l e completa-se o volume c o m gua corrente esterilizada, de m o d o que se obtenha um mosto final c o m a concentrao desejada ; os mostos obtidos de cada cozimento so fermentados em trs frascos (fig. 3) e semeados c o m 2 % de p de fermentao de cultura pura de Saecharomyces cerevisiae Hansen, estirpe 1-Y. Os mostos preparados so fermentados durante cerca de 65 horas a uma temperatura constante de 30C. E m seguida, determina-se o teor alcolico dos diferentes mostos preparados e calcula-se o rendimento.

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FIGURA

3.Fermentador para testes em laboratrio. A frasco contendo o mosto a ser fermentado; B proveta com gua para borbulhamento dos gases resultantes da fermentao.

4 - ANLISE DOS MOSTOS F E R M E N T A D O S Os mostos fermentados so analisados a fim de se determinar o teor alcolico, acidez e Brix. Transferem-se 100 cc d o mosto fermentado, medidos em frasco volumtrico, para u m frasco Kjeldhal. Lava-se duas vezes o frasco volumtrico com gua destilada, e essa gua de lavagem adicionada ao mosto existente no frasco Kjeldhal. Destila-se o mosto e recebe-se o destilado em um frasco volumtrico de 100 cc. Recolhem-se no frasco volumtrico aproximadamente 97-98 cc de destilado. Completa-se o volume c o m gua destilada. O teor alcolico d o destilado determinado por meio d o refratmetro de imerso a uma temperatura de 25C. As leituras devem ser feitas quando a temperatura do destilado for exatamente 25C, para evitar erros. Determinado o teor alcolico d o destilado, calcula-se o rendimento. O mosto fermentado, que no foi destilado, filtrado e determina-se a acidez e o Brix d o filtrado. O quadro 1 apresenta os dados comparativos, em relao ao rendimento alcolico, quando se utiliza malte de cevada, malte de milho e cultura submersa de fungo na sacarificao da raspa de mandioca. Os dados referentes ao rendimento alcolico utilizando cultura submersa de fungo e malte de cevada so referentes s experincias realizadas pelo autor nos Estados Unidos (9). Os dados relativos sacarificao d o amido de mandioca c o m malte de milho foram obtidos d o trabalho de Almeida (1). Enquanto se obteve, para mostos sacarificados c o m malte de cevada, um rendimento alcolico de 7 4 % do terico, os mostos sacarificados com cultura

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submersa de Aspergillus niger apresentaram u m rendimento alcolico de 9 1 % d o terico. Os nossos resultados concordam c o m os de Banzon (2), que, tendo trabalhado tambm c o m raspa de mandioca, observou que a sacarificao por meio de culturas de fungos mais eficiente d o que pelo malte de cevada. Preparamos mostos de raspa de mandioca, pela sacarificao c o m culturas submersas desenvolvidas nos substratos na base de torta de algodo e de soja integral. Pelo exame d o quadro 1, verifica-se que ambos os substratos ofereceram culturas submersas c o m alto poder sacarificante e que resultaram em mostos c o m alto teor alcolico. O quadro 2 mostra que a variao da concentrao d o mosto entre 15 e 1 7 % praticamente no resulta em variao alguma no rendimento alcolico. A cultura submersa utilizada na sacarificao foi obtida pela propagao d o fungo no substrato na base de torta de algodo.
QUADRO 2.Resultados analticos de mostos sacarificados com dez por cento de culturas submersas de fungos e propagadas em substratos na base de torta de algodo
Concentrao dos mostos em percentagem ndice de acidez do mosto Numerao dos cozimentos Brix Rendimento alcolico Leitura no refratmetro (b lcool obtido de 1.000 k de rapft

Raspa

Amido

No incio No final No incio No final da ferda ferda ferda fermentao mentao mentao mentao pll pH 4,10 4,15 4,15 4,10 4,05 4,10 4,10 4,10 4,10 11,3 13,1 13,3 13,3 13,3 13,1 13,2 13,6 13,4 0,6 0,7 0,6 0,8 0,3 0,5 0,7

Aproveitamento industrial (rendimento terico)

%
7,03 7,75 7,82 7,84 7,83 7,84 7,72 8,08 8,18

litro
461,3 460,5 464,7 465,8 465,2 465,8 458,7 457,8 463,5

%
96,7 96,8 97,7 97,9 97,8 97,9 96,6 95,9 97,1

CULT 7RAS SUBM] URSAS DE / sperglus niger

15,2

10,1

f 2
3

1 5,05 5,00 4,90 4,85 4,85 4,90 4,85

16,8

11,2

6 1 - 7

0,7 0,7

r
17,6 15,2 16,8 11,7 10,1 11,2 l 9
CULTURAS SUBMERSA s

4,85

/B IS

gillus oryzt DE Asper ie 5,20 10 5,00 4,95 4,65 4,90

4,25 4,25 4,20 4,15 4,20

11,9 12,1 12,6 12,4 13,0

+ 0,9 + 0,9 + 1,1 + 1,1 + 1,1

6,17 6,85 6,57 6,57 6,63

404,9 407,0 390,4 390,4 393,9

84,8 85,2 82,2 82,2 82,8

(1)

Mdias de trs fermentadores

Experincias foram feitas para determinar o poder sacarificante de alguns bolores existentes na coleo d o Instituto Agronmico. Uma estirpe de Aspergillus oryzae, isolada originalmente de dorna de fermentao de saque (vinho de arroz), Fazenda M o n t e Deste, municpio de Campinas, foi a que apresentou maior atividade enzimtica. Este fungo foi multiplicado durante 48 horas no substrato na base de torta de algodo. Aps 48 horas, a cultura tornou-se bastante densa e no foi possvel propagar o

S U M M A R Y It has been shown that cassava starch can be converted into alcohol most efficiently when fungal enzyme preparations from submerged cultures are used to hydrolyze the starch into sugar. The use of barley malt in the process for conversion of cassava starch has resulted in alcohol yields of 70-74% of the theoretical. Cassava mashes converted by submerged fungal cultures (Aspergillus niger van Tieghem, strain NRRL-337) resulted in alcohol yields up to 90% of the theoretical. Substitutes for the distillers'dried solubles-corn medium were tried. Screened cotton seed meal and soybean meal proved to be a satisfactory substitute for distillers'dried solubles. Dehydrated cassava meal was effectively used in place of corn meal.

A comparative study was carried out using several molds from the Collection of the Instituto Agronmico for the purpose of determining their enzyme activity. The mold that presented the highest enzyme potency was found to be the strain of Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn strain F-27 which had been originally isolated from sak (rice wine). Studies of the dehydrated residues ( 7 % moisture) from hydrolized and fermented mash were found to contain approximately 2 5 % protein indicating their possible value in animal feeds. Simple substrates can be used for the propagation of the mold which is a very efficient conversion agent. It is, indeed, the best saccharifying agent for the countries where a good malt is not available at a low price. LITERATURA CITADA 1. Almeida, J. R. Em Fabricao do lcool de mandioca, pg. 1-92, Tipografia Jornal de Piracicaba, Piracicaba. 1943. 2. Banzon, E. I. e outros. Fermentative utilization of cassava. The production of ethanol. Iowa State College Jour. Sci. 23 : 219-235. 1949. 3. Jalavieharana, K. Conversion of rice by submerged culture microbial enzyme preparations. Joseph E. Seagram & Sons, Inc., Res. Lab. Report 1710-E : 1-15, tab. 1-6. 1950. 4. Le Mense, E. H. e outros. Production of mold amylase in submerged culture. Jour. Bact. 54 : 149-159. 1947. 5. Le Mense, E. H . e outros. Grain alcohol fermentations. Submerged mold amylase as a saccharifying agent. Ind. Eng. Chem. 41 : 100-103. 1949. 6. Maia, R. 1949. Tiquira. Aguardente de mandioca. Rev. Tecnol. Bebidas 2 (3) : 9-10.

7. Stark, W . H. e outros. Laboratory cooking, mashing, and fermentation. Ind. Eng. Chem. Anal. Ed. 15 : 443-446. 1943. 8. Takamine, J. Enzymes of Aspergillus oryzae and the application of its amyloclastic enzyme to the fermentation industry. The Jour. Ind. Eng. Chem. 6 : 824-828. 1914. 9. Teixeira, C. e outros. 1950. Ethyl alcohol from cassava. Ind. Eng. Chem. 42 : 1781-1783.